Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie migracji i infiltracji neutrofili u myszy

12.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60543

⸱

6 lutego 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, 2State Key Laboratory of Biocontrol, Department of Biochemistry, School of Life Sciences, Sun Yat-Sen (Zhongshan) University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy trzy metody oceny migracji i infiltracji neutrofili zarówno in vivo, jak i in vitro. Metody te mogą być wykorzystane do odkrycia obiecujących terapii ukierunkowanych na migrację neutrofili

.

Streszczenie

Neutrofile są głównym członkiem wrodzonego układu odpornościowego i odgrywają kluczową rolę w obronie gospodarza przed patogenami i patologicznymi reakcjami zapalnymi. Neutrofile mogą być rekrutowane do miejsc zapalnych pod kierunkiem cytokin i chemokin. Przytłaczający naciekanie neutrofili może prowadzić do masowego uszkodzenia tkanek, takiego jak w reumatoidalnym zapaleniu stawów (RZS). Neutrofile wyizolowane z wysięku otrzewnowego reagują na określony chemoatraktant, N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP), in vitro w testach komorowych Transwell lub Zigmond. Eksperyment z torebką powietrzną można wykorzystać do oceny chemotaksji neutrofili w kierunku lipopolisacharydu (LPS) in vivo. Mysi model zapalenia stawów wywołanego adiuwantem (AA) jest często stosowany w badaniach nad RZS, a barwienie immunohistochemiczne odcinków stawów przeciwciałami przeciwko elieloperoksydazie (MPO) lub elastazie anty-neutrofilowej (NE) jest dobrze ugruntowaną metodą pomiaru nacieku neutrofili. Metody te mogą być wykorzystane do odkrycia obiecujących terapii ukierunkowanych na migrację neutrofili.

Wprowadzenie

Neutrofile są najliczniejszymi białymi krwinkami i stanowią 50−70% całej populacji białych krwinek u ludzi1. Neutrofile są jednym z głównych czynników reagujących podczas ostrego stanu zapalnego. Neutrofile mogą być rekrutowane do miejsc zapalnych poprzez kierowanie cytokinami i chemokinami uwalnianymi przez komórki rezydujące w tkankach2,3,4, w którym pośredniczą interakcje między cząsteczkami adhezyjnymi komórek na powierzchni neutrofili a komórkami śródbłonka naczyniowego5. Neutrofile mają fundamentalne znaczenie dla obrony gospodarza i odgrywają rolę w patologicznych reakcjach zapalnych ze względu na ich potężną zdolność do uszkadzania tkanek poprzez uwalnianie reaktywnych form tlenu (ROS) i innych cząsteczek uszkadzających tkanki3,6.

Poprzednie badania opisywały kilka protokołów izolacji neutrofili od myszy lub ludzi. Oh i wsp. zademonstrowali metodę separacji gradientu gęstości w celu wyizolowania ludzkich neutrofili z krwi całego człowieka7. Jednak wyizolowanie wystarczającej ilości neutrofili z krwi myszy jest trudne ze względu na małą objętość krwi. Alternatywnie, z płynu otrzewnowego myszy można uzyskać dużą liczbę czystych i żywotnych neutrofili myszy, a te oczyszczone neutrofile mogą być używane ex vivo do badania kilku aspektów funkcji komórkowych ex vivo, w tym nacieku neutrofili, migracji, chemotaksji, wybuchu oksydacyjnego, produkcji cytokin i pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET)8. Transwell isories9 lub Zigmond chamber astests10,11 może być używany do oceny migracji neutrofili in vitro. Model torebki powietrznej służy do oceny migracji i infiltracji neutrofili in vivo. Podskórny model torebki powietrznej jest wygodnym modelem zwierzęcym in vivo do badania migracji komórek zapalnych.

Tradycyjnie, neutrofile były uważane za eliminatory patogenów w ostrych fazach zapalenia. Jednak ostatnie odkrycia wykazały, że neutrofile są skomplikowanymi komórkami, które pełnią znaczną różnorodność wyspecjalizowanych funkcji. Neutrofile mogą regulować wiele procesów, takich jak ostre urazy i naprawy, nowotworzenie nowotworów, odpowiedź autoimmunologiczna i przewlekłe stany zapalne12,13. Neutrofile modulują również adaptacyjne odpowiedzi immunologiczne i mogą regulować limfocyty B i limfocyty T14,15. Znaczny niedobór neutrofili prowadzi do śmiertelności lub ciężkiego niedoboru odporności u ludzi, a zubożenie neutrofili u myszy prowadzi do śmiertelności, podczas gdy nadmierna aktywacja lub rekrutacja neutrofili w narządach powoduje kilka chorób immunologicznych, takich jak reumatoidalne zapalenie stawów (RZS) i toczeń rumieniowaty układowy (SLE)6. Neutrofile są najliczniejszymi komórkami w płynie maziowym pacjentów z RZS. Neutrofile wytwarzają nadmierne ilości mieloperoksydazy (MPO) i elastazy neutrofilowej (NE) poprzez degradację, co nasila erozję chrząstki. MPO jest enzymem peroksydazy ulegającym ekspresji głównie w granulkach neutrofili16. NE jest związane ze zniszczeniem chrząstki stawowej17. MPO i NE mogą być wykorzystane do oceny stanu migracji i infiltracji neutrofili w tkankach pacjentów z RZS.

Ten artykuł przedstawia trzy konwencjonalne metody oceny migracji normalnych neutrofili indukowanych zarówno in vivo, jak i in vitro, a także infiltracji patologicznych neutrofili w mysim modelu zapalenia specyficznego dla stawu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Chińskiej Uniwersytetu Pekińskiego.

UWAGA: Użyto myszy C57BL/6 (w wieku 7-8 tygodni).

1. Izolacja neutrofili

  1. Pozyskiwanie komórek wysięku otrzewnej
    1. Przygotuj świeży 10% roztwór peptonu proteozy w ddH2O. Oblicz potrzebną objętość w zależności od liczby myszy.
      UWAGA: Ustaw liczbę myszy jako N, (2N+1) ml roztworu należy wcześniej rozpuścić i przefiltrować.
    2. Spryskaj miejsce pracy 70% etanolem. Użyj wstrzykiwacza insuliny, aby pobrać 1 ml roztworu peptonu i usunąć pęcherzyki.
    3. Przeprowadzić pierwsze wstrzyknięcie dootrzewnowe 1 ml roztworu peptonu na mysz.
      1. Chwyć jedną ręką mysz w pozycji głową w dół. Zdezynfekować miejsce wstrzyknięcia wacikami nasączonymi alkoholem.
        UWAGA: Preferowana pozycja wstrzyknięcia leży w bocznej części lewego lub prawego dolnego kwadrantu brzucha.
      2. Szybko wlej odczynniki. Wstrzyknąć 1 ml do jamy otrzewnej każdej myszy za pomocą wstrzykiwacza insuliny.
        UWAGA: Kąt między igłą a skórą powinien wynosić około 15−30°, aby uniknąć uszkodzenia jelita lub innych narządów.
    4. Pozwól, aby reakcja zapalna rozwinęła się z dnia na dzień. Po 12 godzinach należy wykonać drugie wstrzyknięcie w taki sam sposób, jak pierwsze wstrzyknięcie.
    5. Trzy godziny po drugim wstrzyknięciu należy w pełni znieczulić myszy 5% izofluranem przez 5 minut w komorze znieczulenia gazowego z prędkością 2 l/min. Znieczulone myszy należy usunąć z komory i poświęcić je przez zwichnięcie szyjki macicy.
      UWAGA: Wystarczającą głębokość znieczulenia zapewnia się poprzez ściśnięcie palców u nóg przed przeniesieniem myszy z komory do pojedynczej jednostki oddechowej. Nogi nie powinny się poruszać, gdy palce u nóg są ściśnięte.
      UWAGA: Wszystkie poniższe kroki należy wykonać w kapturze do hodowli tkankowej.
    6. Spryskaj mysz 70% etanolem. Połóż mysz na sterylnej plastikowej podkładce i przymocuj kończyny igłami.
    7. Użyj sterylnego zestawu narzędzi chirurgicznych, aby wykonać poziome nacięcie (~1 cm) na środku podbrzusza. Podnieś skórę górnej części brzucha za pomocą kleszczy i przetnij wzdłuż linii środkowej brzucha i odsłoń nienaruszoną ścianę otrzewnej.
    8. Wstrzyknąć 5 ml sterylnego kompletnego podłoża RPMI-1640 do jamy brzusznej za pomocą igły 30 G x 1/2". Wprowadzić igłę przez ścianę otrzewnej skośną krawędzią igły skierowaną do góry i wstrzyknąć całą objętość.
    9. Potrząsaj podkładką poziomo przez 5 minut. Delikatnie masuj brzuch kilka razy.
    10. Wstrzyknąć igłę 23 G x 1 1/4" w boczną przestrzeń brzucha. Wyekstrahuj płyn brzuszny (~5 ml) i zbierz go do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Umieść probówki na lodzie tak szybko, jak to możliwe w przypadku aktywacji neutrofili.
    11. Wstrzyknąć kolejne 5 ml kompletnego podłoża i powtórzyć procedurę, aby usunąć pozostałe komórki z otrzewnej. Zebrać płyn otrzewnowy w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.
    12. Odwirować zebrany płyn otrzewnowy o sile 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    13. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml kompletnego podłoża RPMI-1640.
      UWAGA: Nie wirować, aby uniknąć aktywacji neutrofili
      14. .
  2. Izolacja neutrofili
    1. Dodaj 4 ml świeżo przygotowanej pożywki o gradinie gęstości 70,2% (np. Percoll) do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    2. Ostrożnie nałóż 4 ml świeżo przygotowanej pożywki o gradinie gęstości 54,8% na pożywkę o gradiencie gęstości 70,2% powoli wzdłuż krawędzi probówki z ostrymi końcówkami pipet w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność, aby nie zakłócać interfejsu między medium o gradiencie gęstości 54.8% a medium o gradiencie gęstości 70.2%.
    3. Ostrożnie nałożyć zawiesinę komórek otrzewnej o pojemności 1 ml na warstwę podłoża o gradinie gęstości 54,8% powoli ostrymi końcówkami pipet (Rysunek 1A).
      UWAGA: Zachowaj ostrożność, aby nie zakłócić interfejsu między zawiesiną ogniwa a medium o gradiencie gęstości 54.8%.
    4. Wirować przy 1 500 x g przez 30 minut w temperaturze 22 °C bez hamowania.
    5. Zbierz neutrofile na granicy warstw ośrodka o gradiencie gęstości 54,8% i warstwy ośrodka o gradiencie gęstości 70,2% (Rysunek 1B) do nowej probówki.
    6. Dodaj 1 ml kompletnej pożywki RPMI-1640 do pobranych komórek i ostrożnie ponownie zawiesić komórki, delikatnie pipetując kilka razy. Wirować przy 100 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i ostrożnie usunąć supernatant.
    7. Powtórz krok prania (krok 1.2.6) jeden raz.
    8. Dodać 0,5 ml pożywki hodowlanej do osadu i ponownie zawiesić komórki, delikatnie pipetując kilka razy. Pobrać porcję o objętości 50 μl, aby policzyć komórki za pomocą automatycznego analizatora hematologicznego.

2. Test migracji neutrofili

  1. Zmierz migrację neutrofili za pomocą testu Transwell9 lub testu komorowego Zigmonda, jak opisano wcześniej10,11.

3. Test z użyciem torebki powietrznej

  1. Pierwszy wtrysk powietrza
    1. W dniu 0 należy w pełni znieczulić myszy 5% izofluranem przez 3 minuty w komorze do znieczulenia gazowego z prędkością 2 l/min i utrzymywać znieczulenie każdej myszy w jednym urządzeniu oddechowym z 2% izofluranem z prędkością 0,5 l/min.
      UWAGA: Wystarczającą głębokość znieczulenia zapewnia się poprzez ściśnięcie palców u nóg przed przeniesieniem myszy z komory do pojedynczej jednostki oddechowej. Nogi nie powinny się poruszać, gdy palce u nóg są ściśnięte.
    2. Użyj filtra 0,22 μm dołączonego do strzykawki o pojemności 5 ml, aby uzyskać 3 ml objętości wysterylizowanego powietrza.
    3. Podnieś tylną skórę znieczulonej myszy za pomocą pęsety i wstrzyknij podskórnie 3 ml wysterylizowanego powietrza za pomocą igły 26 G x 3/8".
    4. Po leczeniu wyjmij myszy z aparatu oddechowego. Monitoruj myszy, aby upewnić się, że żyją, dopóki nie zaczną się poruszać.
  2. Drugi wtrysk powietrza
    1. W dniu 3 wstrzyknąć dodatkowe 3 ml wysterylizowanego powietrza do wcześniej utworzonej kieszeni powietrznej, aby podtrzymać torebkę powietrzną, jak opisano w punkcie 3.1.
  3. leczenie
    1. W 6, 6 godzin przed uśmierceniem należy wstrzyknąć różne leki do worka powietrznego. Wstrzyknąć 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) jako kontrolę ujemną. Wstrzyknąć 1 ml 1 μg/ml LPS jako kontrolę pozytywną w celu wywołania miejscowego stanu zapalnego.
    2. W pełni znieczulić myszy 5% izofluranem przez 3 minuty w komorze do znieczulenia gazowego z prędkością 2 l/min i utrzymywać znieczulenie każdej myszy w jednym aparacie oddechowym z 2% izofluranem z prędkością 0,5 l/min. Przygotować bufor do płukania zgodnie z tabelą materiałów.
      UWAGA: Wystarczającą głębokość znieczulenia zapewnia się poprzez ściśnięcie palców u nóg przed przeniesieniem myszy z komory do pojedynczej jednostki oddechowej. Nogi nie powinny się poruszać, gdy palce u nóg są ściśnięte.
    3. Dla każdej saszetki powietrznej należy ją przemyć 1 ml buforu płuczącego i zebrać wysięk zapalny w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Przemyć woreczek z powietrzem 2 ml buforu do przemywania 2x i zebrać wysięk zapalny do tej samej probówki wirówkowej.
    4. Wirować przy 100 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu do przemywania się. Policz komórki, aby określić ilościowo stosunek neutrofili za pomocą automatycznego analizatora hematologicznego.
      UWAGA: Zobacz reprezentatywne wyniki w Rysunek 2.

4. Indukcja mysiego zapalenia stawów wywołanego adiuwantem (AA)

  1. Zawiesić pełny adiuwant Freunda (CFA) przez wirowanie co najmniej 5 s, a następnie pobrać 100 μl zawiesiny do wstrzykiwacza insuliny.
    UWAGA: Zalecamy stosowanie całkowicie nowego CFA w eksperymentach, aby zapewnić sterylność.
  2. Znieczulić myszy zgodnie z opisem w kroku 3.1.1.
  3. Zaznacz wybraną łapę i wstrzyknij 20 μl CFA w przestrzeń stawu skokowego. Wstrzyknąć 20 μl zawiesiny w cztery okołostawowe miejsca na wybranej łapie (łącznie 80 μl).
  4. Wyjmij myszy z jednostki oddechowej i umieść przetworzone myszy w nowej komorze. Monitoruj myszy, aby upewnić się, że oddychają, dopóki nie odzyskają zdolności poruszania się.
  5. Co 3 dni oceniaj średnicę stawu, mierząc średnicę stawu skokowego za pomocą miernika grubości kieszeni (Rysunek 3A).
  6. Co 3 dni oceniaj nasilenie zapalenia stawów według kryterium punktacji zapalenia stawów (Rysunek 3C): 0, normalny, brak oznak rumienia i obrzęku; 1, najłagodniejsze zapalenie stawów, rumień i łagodny obrzęk ograniczony do stępu lub stawu skokowego; 2, umiarkowane zapalenie stawów, rumień i łagodny obrzęk rozciągający się od kostki do stępu; 3, ciężkie zapalenie stawów, rumień i umiarkowany obrzęk rozciągający się od kostki do stawów śródstopia; 4, Najcięższe zapalenie stawów, rumień i silny obrzęk obejmują kostkę, stopę i palce lub zesztywnienie kończyny.

5. Barwienie immunohistochemiczne odcinków stawów

  1. Izolacja stawów
    1. Ofiarować mysz w sekcji 4 za pomocą zwichnięcia szyjki macicy po znieczuleniu izofluranem. Spryskaj mysz 70% etanolem.
    2. Usuń skórę i część mięśnia z tylnej nogi za pomocą pęsety i nożyczek. Spryskaj staw 70% etanolem i usuń resztę mięśni za pomocą ręcznika papierowego.
    3. Zamocuj staw skokowy w 4% paraformaldehydzie przez 2 dni w RT. Odwapniaj staw w 10% EDTA przez 1 miesiąc w RT i zmieniaj podłoże co tydzień.
    4. Zanurz tkankę w parafinie i przygotuj skrawki tkanek o grubości 4 μm.
      1. Umieść tkankę w zaznaczonej formie z pewną ilością płynnej parafiny. Chłodno krótko.
      2. Ustaw grubość na 4 μm i pokrój plastry na mikrotomie. Sekcje pływakowe w łaźni wodnej o temperaturze 43 °C.
      3. Zamontuj sekcje na szkiełkach i wstaw je do piekarnika w temperaturze 70 °C na 2 godziny. Do wykorzystania w przyszłości należy przechowywać szkiełka w temperaturze -20 °C.
  2. Safranina O i szybkie zielone barwienie odcinków stawów
    UWAGA: W RT przeprowadza się następujące etapy barwienia.
    1. Umieść szkiełka z kroku 5.1.4.3 w stojaku i wykonaj następujące płukania, aby nawodnić w temperaturze pokojowej: ksylen przez 5 min (3x), 100% etanol przez 2 min (2x), 95% etanol przez 2 min (2x), 70% etanol przez 2 min i 50% etanol przez 15 min. Myć pod bieżącą wodą z kranu przez 3 min.
    2. Plamić w 0,1% szybko zielonym roztworze przez 5 min. Płukać w 1% kwasie octowym przez 10 s.
    3. Zabarwić w 0,1% roztworze barwiącym safraninę O przez 20 min. Zanurz szkiełka w następujących washach: 95% etanol przez 2 min (2x), 100% etanol przez 2 min (2x) i ksylen przez 2 min (2x).
    4. Zamontuj skrawki tkanek i obserwuj je pod mikroskopem.
      UWAGA: Zobacz reprezentatywne obrazy w Rysunek 4A.
  3. Barwienie immunohistochemiczne w celu wizualizacji neutrofili
    1. Piecz sekcje parafinowe przez 2 godziny w temperaturze 78 °C. Umieść szkiełka w stojaku i wykonaj następujące prania, aby nawodnić w temperaturze pokojowej: ksylen przez 15 min (2x), 100% etanol przez 5 min (2x), 95% etanol przez 5 min, 80% etanol przez 5 min, H2O przez 3 min i PBS przez 3 min.
      UWAGA: Nie pozwól, aby szkiełka wyschły w żadnym momencie podczas tego kroku.
    2. Dodaj jedną kroplę buforu do przepuszczalności, aby pokryć tkankę. Inkubować sekcje na tacy o kontrolowanej wilgotności w temperaturze 37 °C.
    3. Płukać szkiełka w PBS przez 3 minuty (3x). Unikaj bezpośredniego spłukiwania chusteczek.
    4. Wykonaj pobieranie epitopów antygenu wywołanego ciepłem za pomocą kotła ciśnieniowego.
      1. Ułóż slajdy w stojaku. Zanurzyć szkiełka w kotle ciśnieniowym wypełnionym buforem pobierającym.
      2. Umieść kocioł ciśnieniowy na kuchence mikrofalowej. Ustaw kuchenkę mikrofalową na 600 W i podgrzewaj szkiełka przez 10 minut.
      3. Po ugotowaniu przechowywać szkiełka w kotle do ostygnięcia do 90 °C. Wyjmij szkiełka i płucz je w PBS przez 3 minuty (3x).
    5. Stłumić aktywność endogennej peroksydazy w świeżo przygotowanym 3%H2O2w temperaturze pokojowej przez 15 min. Płukać szkiełka w PBS przez 3 min (3x).
    6. Obrysuj duży okrąg wokół próbki za pomocą hydrofobowego pisaka, unikając dotykania próbki. Blok z 3% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w komorze o kontrolowanej wilgotności w temperaturze 37 °C przez 60 min.
    7. Usuń roztwór blokujący. Szybko dodaj 50 μl rozcieńczonego PBS przeciwciała pierwszorzędowego do każdej sekcji. Następnie inkubować szkiełka na tacy o kontrolowanej wilgotności w temperaturze 4 °C przez noc.
      UWAGA: Dla różnych przeciwciał stosuje się różne proporcje rozcieńczenia (1:25 dla MPO i 1:20 dla NE).
    8. Drugiego dnia wyjmij tackę i odstaw ją na 30 minut w temperaturze RT. Następnie płucz szkiełka w PBS przez 3 minuty (3x).
    9. Dodać 50 μl przeciwciał drugorzędowych rozcieńczonych PBS do tkanki.
      UWAGA: Zastosowano różne proporcje rozcieńczenia: 1:1,000 dla MPO i 1:1,500 dla NE.
    10. Inkubować szkiełka podstawowe na tacy o kontrolowanej wilgotności w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Następnie płucz szkiełka w PBS przez 3 minuty (3x).
    11. Rozwijać w rozcieńczonym roztworze 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) przez 5 minut. Miej oko na reakcję w przypadku rozwoju ciemnego zabarwienia. Opłucz szkiełka w wodzie destylowanej.
    12. Przeciwbarwić szkiełka w hematoksylinie przez 10 s. Płukać szkiełka w wodzie z kranu przez 5 minut.
    13. Płukać w kwasowym roztworze superszybkiego różnicowania alkoholu przez 3 s. Następnie płucz w wodzie z kranu przez 10 minut.
    14. Zanurz szkiełka w następujących praniach w temperaturze pokojowej: 80% etanol przez 5 min, 95% etanol przez 5 min, 100% etanol przez 5 min i ksylen przez 15 min (2x). Zamocuj szkiełko nakrywkowe za pomocą roztworu montażowego. Obserwuj tkankę pod mikroskopem.
      UWAGA: Zobacz reprezentatywne obrazy w Rysunek 4B.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Komórki wysięku otrzewnowego pobrano z płynu z płukania otrzewnej myszy. Komórki zawieszono ponownie w 1 mL pełnej pożywki RPMI-1640, naniesiono na dwustopniowy (54,8%/70,2%) nieciągły gradient gęstości (Rysunek 1A) i wirowano przy 1 500 x g przez 30 min. Neutrofile (≥95%, ~1 x 107 neutrofili/mysz) odzyskano z dolnego interfejsu (Rysunek 1B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Szczegółowe protokoły wysoko oczyszczonych neutrofili z krwi obwodowej7, szpiku kostnego i tkanek18 są dostępne od dawna. Tutaj przyjmujemy metodę izolowania neutrofili z płynu otrzewnowego19 , w której dojrzałe neutrofile pozostają inaktywowane do dalszych badań przeciwzapalnych i przeciwutleniających.

Wykorzystaliśmy eksperyment z torebką powietrzną, aby zbadać infiltrację neutrofili in vivo indukowaną przez LPS. Metoda ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (granty o numerach 81430099 i 31500704), Międzynarodowe Projekty Współpracy i Wymiany (numer grantu 2014DFA32950) oraz program badawczy Pekińskiego Uniwersytetu Medycyny Chińskiej (numery grantów BUCM-2019-JCRC006 i 2019-JYB-TD013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1% Fast Green SolutionSolarbio8348bPrzenieś 20 mg fast grene FCF w jednej fiolce do drugiej zlewki o pojemności 100 ml. Dodać 20 ml H2O do zlewki i rozpuść plamę, mieszając, aby uzyskać 0,1% szybko zielony roztwór, a następnie przefiltruj go za pomocą filtra Nalgene PES 75 mm
0,1% Safranina O, roztwór barwiącySolarbio8348aPrzenieś 20 mg barwnika safraniny O w jednej fiolce do zlewki o pojemności 100 ml. Dodać 20 ml H2O do zlewki i rozpuść plamę, mieszając, aby uzyskać 0,1% roztwór barwiący safraninę O, a następnie przefiltruj go za pomocą filtra Nalgene PES 75 mm
0,5 M roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), pH 8,0Sigma324506Sterylny
100% etanolBeijing Chemical Works
100% metanolBeijing Chemical Works
15 ml stożkowa polipropylenowa probówka wirówkowaFalcon14-959-53A
Igła 23 G x 1 1/4"BD305120
Igła 26 G x 3/8"BD305110
3% albumina surowicy bydlęcej (BSA)Rozpuść 0,3 g BSA w 10 ml PBS
3% H2O2Zmieszaj 1 ml 30% H2O2 z metanolem z 9 ml metanolu
3,3'-diaminobenzydyny (DAB) zestawZSGB-BIOZLI-9018
Igła 30 G x 1/2"BD305106
30% H2O2Beijing Chemical Works
5 mL StrzykawkaBDZ683574
50 ml stożkowa probówka wirówkowa z polipropylenuFalcon14-432-22
50% mieszanka etanolu500 ml 100% etanolu z 500 ml dH2O
54,8% PercollMix 2,74 ml SIP z 2,26 ml 1&razy; PBS, stand still
70% EtanolMix 700 ml 100% etanolu z 300 mL dH2O
70,2% PercollMix 3,51 ml SIP z 1,49 ml 1&razy; PBS, stop
still 80% etanoluMix 800 ml 100% etanolu z 200 ml dH2O
95% Mieszanka etanolu950 ml 100% etanolu z 50 ml dH2O
Alkohol kwasowy Superszybkie rozwiązanie różnicująceBeyotimeC0165S
Przeciwciała
przeciw mieloperoksydazieAbcamab208670
Przeciwciało przeciwko elastazie anty-neutrofilowejAbcamab21595
Automatyczny analizator hematologicznySysmexXS-800i
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)VWR0332-100G
Kompletny adiuwant Freunda, 10 mg/mlsigma1002036152
Szkiełko nakrywkoweCITOGLAS10212432C
Zegarowy miernik grubościMitutoyo7301
Mikroprobówki Eppendorf, 1,5 mlSigmaZ606340
Płodowa surowica bydlęca (FBS) PremiumPANP30-1302
System znieczulenia gazowegoZS DichuangZS-MV-IV
Goat Anti-Rabbit IgG H& L (HRP)PPLYGENC1309Jest to przeciwciało drugorzędowe stosowane w barwieniu immunohistochemicznym.
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Biological Industries, Beth HaEmek, Izrael02-016-1ASterylny
roztwór do barwienia hematoksylinyZSGB-BIOZLI-9609
Lipopolisacharyd (LPS)SigmaL3012
MEDIA I SUPLEMENTY
Zmodyfikowany Safranin O-fast Green FCF Zestaw do barwienia chrząstkiSolarbioG1371
N-formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)Sigma47729
Roztwór streptomycyny penicyliny, 100 razy;Invitrogen1514022
PercollGE Healthcare10245207Gradient gęstości średni
Permeabilization BufferMix 100 μ L Triton X-100 z 1 L dH2O, aby uzyskać 0,01% soli fizjologicznej Triton X-100
Phosphate Buffer Salt (PBS), 1 i razy;Zmieszaj 90% ddH2O z 10% (v/v) 10 razy; PBS, autoklawowany
bufor fosforanowy z solą fizjologiczną (PBS), 10 i razy;Rozpuść 16 g NaCl, 0,4 g KCl, 2,88 g Na2HPO4· 2H2O, 0,48 g KH2PO4 (bezwodny) w 200 ml ddH2O, dostosować pH 7,4, autoklawowane
WYROBY I URZĄDZENIA Z TWORZYW SZTUCZNYCH
W PROSZKU
Proteozowy peptonowyoksoid1865317
bufordo odzyskiwaniaZmieszaj 18 ml buforu pobierającego A z 82 ml buforu pobierającego B, dodaj dH2O do 1000 ml, dostosuj pH do 6,0
Bufor A Zapas do IHCRozpuść 4,2 g kwasu cytrynowego (C6H5O7· H2O) w 200 ml dH2O
Zapas buforowy B dla IHCRozpuść 5,88 g dihydratu cytrynianu trisodowego (C6H5Na3O7· 2H20) w 200 ml dH2O
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 mediumSigmaR8758
RPMI-1640 Complete MediumRPMI-1640 jest uzupełnione o 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny.
Shu Rui U40 Jednorazowa sterylna igła do wstrzykiwań insuliny 1 mlBD328421
SlideCITOGLAS10127105P-G
SOLUTION
Zapas Izotoniczny perkol (SIP)Wymieszaj 90% (v/v) percollu z 10% (v/v) 10 razy; PBS, odstaw nieruchomo na 20 minut
Bufor płuczący w teścieRozcieńcz 0,5 M EDTA do 10 mM za pomocą HBSS
XyleneBeijing Chemical Works
powietrznym

Bibliografia

  1. Klein, C. Genetic defects in severe congenital neutropenia: emerging insights into life and death of human neutrophil granulocytes. Annual Review of Immunology. 29, 399-413 (2011).
  2. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of Neutrophil Chemotaxis. Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. , Humana Press. Totowa, NJ. 23-35 (2007).
  3. Margraf, A., Ley, K., Zarbock, A. Neutrophil Recruitment: From Model Systems to Tissue-Specific Patterns. Trends in Immunology. 40 (7), 613-634 (2019).
  4. Bardoel, B. W., Kenny, E. F., Sollberger, G., Zychlinsky, A. The balancing act of neutrophils. Cell Host & Microbe. 15 (5), 526-536 (2014).
  5. Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49 (9), 1618-1631 (2010).
  6. Thieblemont, N., Wright, H. L., Edwards, S. W., Witko-Sarsat, V. Human neutrophils in auto-immunity. Seminars in Immunology. 28 (2), 159-173 (2016).
  7. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. Journal of Visualized Experiments. (17), e745(2008).
  8. Filippi, M. D. Neutrophil transendothelial migration: updates and new perspectives. Blood. 133 (20), 2149-2158 (2019).
  9. Kouspou, M. M., Price, J. T. Analysis of cellular migration using a two-chamber methodology. Methods in Molecular Biology. 787, 303-317 (2011).
  10. Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5 (12), e15309(2010).
  11. Walheim, C. C., Zanin, J. P., de Bellard, M. E. Analysis of trunk neural crest cell migration using a modified Zigmond chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3330(2012).
  12. Liew, P. X., Kubes, P. The Neutrophil's Role During Health and Disease. Physiological Reviews. 99 (2), 1223-1248 (2019).
  13. Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), eaat4579(2018).
  14. Tillack, K., Breiden, P., Martin, R., Sospedra, M. T lymphocyte priming by neutrophil extracellular traps links innate and adaptive immune responses. Journal of Immunology. 188 (7), 3150-3159 (2012).
  15. Puga, I., et al. B cell-helper neutrophils stimulate the diversification and production of immunoglobulin in the marginal zone of the spleen. Nature Immunology. 13 (2), 170-180 (2011).
  16. Strzepa, A., Pritchard, K. A., Dittel, B. N. Myeloperoxidase: A new player in autoimmunity. Cellular Immunology. 317, 1-8 (2017).
  17. Momohara, S., Kashiwazaki, S., Inoue, K., Saito, S., Nakagawa, T. Elastase from polymorphonuclear leukocyte in articular cartilage and synovial fluids of patients with rheumatoid arthritis. Clinical Rheumatology. 16 (2), 133-140 (1997).
  18. Swamydas, M., Luo, Y., Dorf, M. E., Lionakis, M. S. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 110 (1), 3.20.1-3.20.15 (2015).
  19. Luo, Y., Dorf, M. E. Isolation of Mouse Neutrophils. Current Protocols in Immunology. 22 (1), 3.20.1-3.20.6 (1997).
  20. Carlson, M., et al. Human neutrophil lipocalin is a unique marker of neutrophil inflammation in ulcerative colitis and proctitis. Gut. 50 (4), 501-506 (2002).
  21. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature Reviews Immunology. 6 (3), 173-182 (2006).
  22. Zhang, S., et al. Tanshinone IIA ameliorates chronic arthritis in mice by modulating neutrophil activities. Clinical and Experimental Immunology. 190 (1), 29-39 (2017).
  23. Forster, R., Sozzani, S. Emerging aspects of leukocyte migration. European Journal of Immunology. 43 (6), 1404-1406 (2013).
  24. Hu, L., et al. Neutrophil-Mediated Delivery of Dexamethasone Palmitate-Loaded Liposomes Decorated with a Sialic Acid Conjugate for Rheumatoid Arthritis Treatment. Pharmaceutical Research. 36 (7), 97(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Migracja neutrofilitest z workiem powietrznymzapalenie stawów indukowane adiuwantembarwienie immunohistochemicznebarwienie na mieloperoksydazębarwienie na elastazę neutrofilowąchemotaksja indukowana LPStest fMLPanaliza stanu zapalnego stawówocena stopnia ciężkości zapalenia stawów
Wykrywanie migracji i infiltracji neutrofili u myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.