Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hodowla in vitro komórek nabłonkowych z różnych regionów anatomicznych ludzkiej błony owodniowej

7.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60551

⸱

28 listopada 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Fisiología y Desarrollo Celular, Instituto Nacional de Perinatología, 2Biotecnología Médica y Farmacéutica CONACYT, Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ), 3Departamento de Inmunobioquímica, Instituto Nacional de Perinatología, 4Instituto de Neurobiología, UNAM

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje izolację komórek nabłonkowych z różnych regionów anatomicznych błony owodniowej człowieka w celu określenia ich heterogeniczności i właściwości funkcjonalnych do ewentualnego zastosowania w modelach klinicznych i fizjopatologicznych.

Streszczenie

W literaturze opisano kilka protokołów dotyczących izolacji i hodowli ludzkich komórek nabłonka owodniowego (HAEC). Zakładają one jednak, że nabłonek owodniowy jest warstwą jednorodną. Ludzką owodnię można podzielić na trzy obszary anatomiczne: odbity, łożyskowy i pępowinowy. Każdy region ma inną rolę fizjologiczną, na przykład w stanach patologicznych. W tym miejscu opisujemy protokół preparowania ludzkiej tkanki owodniowej w trzech sekcjach i utrzymywania jej in vitro. W hodowli komórki pochodzące z odbitej owodni wykazywały prostopadłościenną morfologię, podczas gdy komórki zarówno z okolic łożyska, jak i pępowiny były płaskonabłonkowe. Niemniej jednak wszystkie uzyskane komórki mają fenotyp nabłonkowy, o czym świadczy immunodetekcja E-kadheryny. W związku z tym, że łożysko i odbite regiony in situ różnią się składnikami komórkowymi i funkcjami molekularnymi, może być konieczne rozważenie tych różnic w badaniach in vitro, ponieważ mogą one mieć fizjologiczne implikacje dla zastosowania HAEC w badaniach biomedycznych i obiecującego zastosowania tych komórek w medycynie regeneracyjnej.

Wprowadzenie

Ludzkie komórki nabłonka owodniowego (HAEC) powstają we wczesnych stadiach rozwoju embrionalnego, około ośmiu dni po zapłodnieniu. Powstają one z populacji płaskonabłonkowych komórek nabłonka epiblastu, które pochodzą z najbardziej wewnętrznej warstwy błony owodniowej1. W związku z tym HAEC są uważane za pozostałości komórek pluripotencjalnych z epiblastu, które mają potencjał do różnicowania się w trzy listki rozrodcze zarodka2. W ciągu ostatniej dekady różne grupy badawcze opracowały metody izolowania tych komórek z błony owodniowej w okresie ciąży, aby scharakteryzować ich przypuszczalne właściwości związane z pluripotencją w modelu hodowli in vitro3,4.

W związku z tym stwierdzono, że HAEC posiada cechy charakterystyczne dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (HPSC), takie jak antygeny powierzchniowe SSEA-3, SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81; rdzeń czynników transkrypcyjnych pluripotencji OCT4, SOX2 i NANOG; oraz marker proliferacji KI67, sugerujący, że są one samoodnawiające się5,6,7. Co więcej, komórki te zostały poddane próbie wykorzystania protokołów różnicowania w celu uzyskania komórek dodatnich dla specyficznych dla linii markerów trzech listków zarodkowych (ektodermy, mezodermy i endodermy)4,5,8, a także w zwierzęcych modelach chorób ludzkich. Wreszcie, HAEC wyraża E-kadherynę, które pokazują, że zachowują nabłonkową naturę, podobnie jak HPSC5,9.

Oprócz swojego embrionalnego pochodzenia, HAEC mają inne wewnętrzne właściwości, które sprawiają, że nadają się do różnych zastosowań klinicznych, takich jak wydzielanie cząsteczek przeciwzapalnych i przeciwbakteryjnych10,11, czynniki wzrostu i uwalnianie cytokin12, brak powstawania potworniaków po ich przeszczepieniu myszom z niedoborem odporności, w przeciwieństwie do HPSC2i tolerancję immunologiczną, ponieważ wyrażają HLA-G, co zmniejsza ryzyko odrzucenia przeszczepu po przeszczepie13.

Jednak poprzednie raporty zakładały, że ludzka owodnia jest jednorodną błoną, nie biorąc pod uwagę, że można ją anatomicznie i fizjologicznie podzielić na trzy regiony: łożyskowy (owodnia pokrywająca decidua basalis), pępowinowy (część otaczająca pępowinę) i odbita (reszta błony nie przylegająca do łożyska)14. Wykazano, że łożyskowe i odbite obszary owodni wykazują różnice w morfologii, aktywności mitochondriów, wykrywaniu reaktywnych form tlenu15, ekspresji miRNA16 i aktywacji szlaków sygnałowych17. Wyniki te sugerują, że ludzka owodnia jest zintegrowana z heterogeniczną populacją o różnej funkcjonalności, która powinna być brana pod uwagę w dalszych badaniach przeprowadzanych na modelach in situ lub in vitro. Podczas gdy inne laboratoria opracowały protokoły izolacji HAEC z całej membrany, nasze laboratorium opracowało protokół izolacji, hodowli i charakteryzowania komórek z różnych regionów anatomicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół został zatwierdzony przez komisję etyczną Instituto Nacional de Perinatología w Meksyku (numer rejestru 212250-21041). Wszystkie procedury wykonane w tych badaniach były zgodne ze standardami etycznymi Instituto Nacional de Perinatología, Deklaracją Helsińską oraz wytycznymi określonymi w Oficjalnym Standardzie Meksykańskim Ministerstwa Zdrowia.

1. Przygotowanie

  1. Przygotować roztwór 1x PBS z EDTA. Aby to zrobić, dodaj 500 μl 0,5 M EDTA do 500 ml 1x PBS, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 mM EDTA.
  2. Przygotuj pożywkę hodowlaną dla HAEC. Weź 450 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy, uzupełnij go 5 ml pirogronianu sodu (100 mM), 50 ml nieaktywnej termicznie płodowej surowicy bydlęcej zakwalifikowanej do komórek macierzystych, 5 ml aminokwasów endogennych (100x), 5 ml antybiotyku przeciwgrzybiczego (100x), 5 ml L-glutaminy (200 mM) i 500 μL merkaptoetanolu (1000x).
  3. Wysterylizuj pojemniki do transportu i przetwarzania tkanki: pojemnik ze stali nierdzewnej z pokrywką do transportu całego łożyska z sali operacyjnej do laboratorium, taca (20 cm x 30 cm x 8 cm) do mycia i usuwania krwi z całego łożyska przed wycięciem błony owodniowej oraz plastikowa deska do krojenia do oddzielenia błony owodniowej na trzy regiony.
  4. Wysterylizuj narzędzia chirurgiczne (skalpele, nożyczki, kleszcze i zaciski), zlewki o pojemności 500 ml, gazy bawełniane i roztwór soli fizjologicznej.

2. Pobieranie tkanki łożyskowej

UWAGA: Błony owodniowe pobrano od kobiet w czasie ciąży (37−40 tygodni), pod wskazaniem do cesarskiego cięcia, bez żadnych oznak aktywnego porodu i bez mikrobiologicznych cech infekcji. Pełne procedury izolacji i hodowli przeprowadzono w komorze bezpieczeństwa biologicznego w sterylnych warunkach.

  1. Na sali operacyjnej zaciśnij pępowinę, aby zapobiec przepływowi krwi do reszty tkanki. Zebrać całe łożysko za pomocą pępowiny zaciśniętej w sterylnym pojemniku.
  2. Dodaj 500 ml roztworu soli fizjologicznej do pojemnika, aby nawodnić łożysko.
  3. Zamknąć pojemnik i przetransportować tkankę do laboratorium w temperaturze pokojowej.
  4. Umieść pojemnik z łożyskiem w szafie bezpieczeństwa biologicznego.
    UWAGA: W przypadku, gdy sekcja nie zostanie przeprowadzona w ciągu 15 minut od pobrania łożyska, pojemnik z łożyskiem należy przechowywać na lodzie do czasu przetworzenia. Należy unikać więcej niż 1 godziny, czasu między uzyskaniem łożyska a rozpoczęciem sekcji.

3. Separacja mechaniczna według regionu błony owodniowej

UWAGA: Procedura musi być przeprowadzona w komorze bezpieczeństwa biologicznego, w sterylnych warunkach i w temperaturze pokojowej.

  1. Wyjmij całe łożysko z pojemnika i umieść je na tacy z pępowiną skierowaną do góry.
  2. Za pomocą sterylnej bawełnianej gazy oczyść skrzepy krwi z powierzchni błony kosmówkowej, która pokrywa łożysko.
  3. Zidentyfikuj trzy obszary błony: owodnię pępowinową otaczającą pępowinę, owodnię łożyskową pokrywającą podstawkę decidua oraz obszar odbity, który jest resztą owodni, która nie jest przyczepiona do łożyska (Rysunek 1).
  4. Rozwiń obszar owodni pępowinowej (Rysunek 2A).
    1. Za pomocą kleszczy preparacyjnych przytrzymaj część błony owodniowej, która pokrywa połączenie łożyska i pępowiny.
    2. Za pomocą skalpela rozetnij obszar otaczający pępowinę, jednocześnie rozciągając ją, aby oddzielić ją od kosmówki.
    3. Oddzieloną tkankę umieścić w oznakowanej zlewce ze 100 ml roztworu soli fizjologicznej.
  5. Rozwiń obszar owodni łożyskowej (Rysunek 2B).
    1. Za pomocą sterylnej bawełnianej gazy usuń skrzepy krwi z powierzchni kosmówki-owodni pokrywającej łożysko.
    2. Przytrzymaj błonę na granicy między łożyskiem a odbitym obszarem za pomocą kleszczy preparacyjnych.
    3. Przeciąć skalpelem wzdłuż obwodu łożyska.
    4. Oddziel owodnię łożyskową od kosmówki, uważając, aby nie przeciąć żadnych naczyń z łożyska.
    5. Umieść oddzieloną tkankę w innej oznakowanej zlewce z 300 ml roztworu soli fizjologicznej.
  6. Oddziel resztę błony owodniowej, która nie jest przyczepiona do łożyska (tj. część odbitą) od kosmówki (Rysunek 2C).
    1. Zbierz odbity obszar w innej oznakowanej zlewce z 300 ml roztworu soli fizjologicznej.
      UWAGA: Podczas preparacji należy stale dodawać roztwór soli fizjologicznej, aby zapobiec wysychaniu tkanki.

4. Mycie membran

UWAGA: Procedura musi być przeprowadzona w komorze bezpieczeństwa biologicznego w sterylnych warunkach, w temperaturze pokojowej.

  1. Wyrzuć roztwór soli z każdego obszaru membrany osobno.
  2. Dodaj 100 ml świeżego roztworu soli fizjologicznej do okolicy pępowiny.
  3. Dodaj 300 ml świeżego roztworu soli fizjologicznej odpowiednio do łożyska i odbitych obszarów.
  4. Wymieszaj błony za pomocą kleszczy preparacyjnych, aby usunąć pozostałości krwi.
  5. Wyrzuć roztwór soli fizjologicznej.
  6. Powtórz pranie i mieszanie co najmniej 3 razy, aż membrany staną się przezroczyste.
  7. Umieść i rozciągnij membrany na desce, aby oczyścić sterylną gazą skrzepy krwi, które nie zostały usunięte za pomocą washes.
    UWAGA: Bardzo ważne jest usunięcie jak największej liczby erytrocytów, ponieważ ich obecność wpływa na funkcję trypsyny i żywotność kolejnych hodowli komórkowych.

5. Trawienie enzymatyczne błon z różnych regionów

UWAGA: Procedura musi być przeprowadzona w komorze bezpieczeństwa biologicznego w sterylnych warunkach.

  1. Pokrój odbite i łożyskowe obszary na dwie lub trzy fragmenty.
  2. Nie przecinaj okolicy pępowiny.
  3. Umieść fragmenty każdego regionu w probówkach wirówkowych. Dodaj odpowiednio 20 ml 0,5% trypsyny/EDTA do obszaru odbitego i łożyskowego oraz 5 ml 0,5% trypsyny/EDTA do okolicy pępowinowej.
    UWAGA: Ważne jest, aby pociąć odbite i łożyskowe obszary na mniejsze kawałki, ponieważ muszą one być całkowicie zanurzone w roztworze trypsyny.
  4. Lekko potrząsaj probówkami wirówkowymi przez 30 sekund. Wyrzuć trypsynę.
  5. Dodaj 30 ml nowej 0,5% trypsyny/EDTA odpowiednio do obszaru odbitego i łożyskowego oraz 15 ml nowego 0,5% trypsyny/EDTA do okolicy pępowinowej.
  6. Umieść probówki w rotatorze wewnątrz inkubatora.
  7. Inkubować z rotacją (20 obr./min) przez 40 min w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Jeśli obracacz rurek nie jest dostępny, delikatnie potrząsaj rurkami ręcznie co 10 minut.
  8. Przenieś roztwory trypsyny/komórek z każdego regionu do nowych probówek wirówkowych.
  9. Dodać 2 razy objętość pożywki HAEC podgrzanej w temperaturze 37 °C na probówkę, aby dezaktywować enzym.
  10. Przechowuj pierwsze trawienie na lodzie.
  11. Powtórz kroki 5.6−5.8 dla drugiego okresu trawienia.
  12. Dla każdego regionu przytrzymaj jeden koniec części owodni za pomocą kleszczy preparacyjnych, a drugą parą ściśnij wzdłuż tkanki, aby usunąć rzędy komórek nabłonka, które nie odkleiły się całkowicie podczas poprzednich okresów inkubacji.
  13. Zebrać drugą mineralizację do innego zestawu probówek wirówkowych i dezaktywować 2x większą objętością pożywki HAEC.
  14. Wyrzuć strawione błony do pojemnika na zagrożenie biologiczne.

6. Izolacja HAEC

UWAGA: Procedura musi być przeprowadzona w komorze bezpieczeństwa biologicznego w sterylnych warunkach.

  1. Odwirować wszystkie probówki o stężeniu 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Odrzucić sklarowany osad i dodać 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki HAEC (do temperatury 37 °C) na probówkę i delikatnie pipetować w celu rozdrobnienia każdej granulki.
  3. Połącz zawiesiny komórkowe dwóch procesów trawienia w osobnej probówce dla każdego regionu błony.
  4. Przefiltruj zawiesiny komórkowe za pomocą filtrów komórkowych 100 μm, aby usunąć resztki macierzy zewnątrzkomórkowej i uzyskać pojedyncze komórki.
  5. Przygotować trzy porcje z 90 μl błękitu trypanowego w probówce do mikrowirówki.
  6. Dodać 10 μl każdej zawiesiny komórkowej na obszar błony do probówek do mikrowirówek i wymieszać.
  7. Policz komórki za pomocą hemocytometru pod mikroskopem pola świetlnego.

7. Kultura HAEC

  1. Wysiewać HAEC z trzech regionów oddzielnie o gęstości 3 × 104 komórek/cm2 z podgrzanym podłożem HAEC, uzupełnionym 10 ng/ml ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu (EGF).
    1. Zasiej komórki na płytkach o średnicy 100 mm, aby utrzymać je in vitro lub na płytkach 24-dołkowych do analizy immunochemicznej.
  2. Inkubować szalki w temperaturze 37 °C w warunkach normoksyjnych (5% CO2 ) w wilgotnym inkubatorze.
  3. Dodawaj EGF codziennie i zmieniaj podłoże co trzeci dzień.
    UWAGA: Komórki zlewają się po 4−6 dniach.
  4. Użyj komórek do konwencjonalnej immunohistochemii, analizy sortowania komórek, kriokonserwacji, ekstrakcji RNA i białek lub do kontynuowania pasażu.

8. Przejście HAEC

  1. Usunąć pożywkę HAEC i przemyć 2x roztworem PBS/EDTA 0,01M.
  2. Inkubować z roztworem PBS/EDTA 0,01M przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Usuń PBS/EDTA i dodaj 1,5 ml 0,5% trypsyny/EDTA.
  4. Inkubować przez 5-8 minut w temperaturze 37 °C.
  5. Dezaktywować enzym za pomocą dwóch objętości pożywki HAEC.
  6. Zebrać zmieszany roztwór i odwirowywać przez 5 minut przy 200 x g.
  7. Policz komórki i kontynuuj podążanie za fragmentami lub użyj komórek do dalszej analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Komórki HAEC wyizolowano z każdego z trzech obszarów anatomicznych błony owocni i hodowano indywidualnie in vitro. Po 48 h hodowli komórki o fenotypie nabłonkowym przylgnęły do powierzchni płytki, choć w medium znajdowały się również szczątki komórkowe i komórki pływające, które usunięto podczas wymiany pożywki (Rysunek 3).

Podczas przetwarzania hodowli pierwotnej (pasaż zero, P0) mogą wystąpić pewne komplikacje, które mogą zakłócić analizę danych eksperymentalnyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wdrożyliśmy nowy protokół izolacji HAEC od błon terminowych. Różni się od poprzednich doniesień tym, że każda błona została podzielona na trzy regiony anatomiczne przed izolacją w celu analizy komórek z każdego z nich.

Jednym z najbardziej krytycznych kroków w protokole jest umycie błony w celu usunięcia wszystkich skrzepów krwi, ponieważ mogą one zakłócać aktywność trypsyny podczas oddzielania komórek nabłonka. Niewłaściwe wykonanie tego kroku może prowadzić do uzyskania pierwotnej hodowli z ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Nasze badania były wspierane przez granty z Instituto Nacional de Perinatología de México (21041 i 21081) oraz CONACYT (A1-S-8450 i 252756). Dziękujemy Jessice González Norris i Lidii Yuririi Paredes Vivas za wsparcie techniczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Culture odczynniki
2-MercaptoethanolThermo Fisher Scientific/Gibco2198502355 mM
Bezzwierzęcy rekombinowany ludzki EGFPeprotechAF-100-15
Antybiotykowo-przeciwgrzybiczyThermo Fisher Scientific/Gibco15240062100X
Dulbecco's Modified Eagle MediumThermo Fisher Scientific/Gibco12430054Uzupełniony o wysoką zawartość glukozy i HEPES
EDTAThermo Fisher Scientific/AmbionAM9260G0,5 M
Embrionalne komórki macierzyste FBS, kwalifikowaneThermo Fisher Scientific/Gibco10439024
Aminokwasy endogenneThermo Fisher Scientific/Gibco11140050100X
Paraformaldehyddowolnej marki
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiThermo Fisher Scientific/Gibco10010023 1X
Roztwór soli fizjologicznej (chlorek sodu 0,9%)dowolnej marki
Pirogronian soduThermo Fisher Scientific/Gibco11360070100 mM
Trypsyna/EDTA 0,05%Thermo Fisher Scientific/Gibco25300054
Materiał jednorazowego użytku< / mocny>
100 i mikro; m Sitko do komórekCorning/Falcon352360
100 mm Naczynie hodowlane z powłoką TCCorning430167
24-dołkowe przezroczyste płytki wielodołkowe z powłoką TCCorning/Costar3526
6-dołkowe przezroczyste płytki wielodołkowe z powłoką TCCorning/Costar3516
Niepirogenna sterylna probówka wirówkowadowolnej markize stożkiem dolne
Niepirogenne sterylne końcówki 1,000 &mikro; l, 200 i mikro; l oraz 10 &mikro;l.
Sterylne gazy bawełniane
Sterylne pipety serologiczne o pojemności 5, 10 i 25 mldowolnej marki
Sterylne rękawice chirurgicznedowolnej marki
< strong>Equipment< / strong>
Komora
Wirówka
Mikropipety
Zmotoryzowane pipety Napełniacz/dozownik
Sterylne zlewki o pojemności 500 ml
Sterylna plastikowa deska
Sterylne skalpele, nożyczki, kleszcze, zaciski
Sterylny pojemnik
Sterylna taca
Probówka RotatorMaCSmix
Przeciwciała i zestawyPrzeciwciało ID
Anti-E-kadheryna610181RRID:AB_3975
Anti-KI67Santa Cruz23900RRID:AB_627859)
Anty-NANOGPeprotech500-P236RRID:AB_1268274
Anty-OCT4AbcamAB19857RRID:AB_44517
Anty-SOX2MiliporeAB5603RRID:AB_2286686
Sygnalizacja komórkowaanty-SSEA-44755RRID:AB_1264259
Sygnalizacja komórkowaanty-TRA-1-604746RRID:AB_2119059
Kozia anty-mysz Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11029RRID:AB_2534088
Kozia anty-królik Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-11036RRID:AB_10563566
Zestaw testowy tunelAbcam66110
bezpieczeństwa biologicznegodo krojenia ze stali nierdzewnej

Bibliografia

  1. Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18 (6), 700-708 (2016).
  2. Garcia-Lopez, G., et al. Human amniotic epithelium (HAE) as a possible source of stem cells (SC). Gaceta Medica de Mexico. 151 (1), 66-74 (2015).
  3. Gramignoli, R., Srinivasan, R. C., Kannisto, K., Strom, S. C. Isolation of Human Amnion Epithelial Cells According to Current Good Manufacturing Procedures. Current Protocols in Stem Cell Biology. 37, (2016).
  4. Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1E 6 (2010).
  5. Garcia-Castro, I. L., et al. Markers of Pluripotency in Human Amniotic Epithelial Cells and Their Differentiation to Progenitor of Cortical Neurons. PLoS One. 10 (12), 0146082(2015).
  6. Garcia-Lopez, G., et al. Pluripotency markers in tissue and cultivated cells in vitro of different regions of human amniotic epithelium. Experimental Cell Research. 375 (1), 31-41 (2019).
  7. Yang, P. J., et al. Biological characterization of human amniotic epithelial cells in a serum-free system and their safety evaluation. Acta Pharmacological Sinica. 39 (8), 1305-1316 (2018).
  8. Zou, G., et al. MicroRNA32 silences WWP2 expression to maintain the pluripotency of human amniotic epithelial stem cells and beta isletlike cell differentiation. International Journal of Molecular Medicine. 41 (4), 1983-1991 (2018).
  9. Avila-Gonzalez, D., et al. Capturing the ephemeral human pluripotent state. Developmental Dynamics. 245 (7), 762-773 (2016).
  10. Niknejad, H., et al. Properties of the amniotic membrane for potential use in tissue engineering. European Cells & Materials. 15, 88-99 (2008).
  11. Miki, T. Stem cell characteristics and the therapeutic potential of amniotic epithelial cells. American Journal of Reproductive Immunology. 80 (4), 13003(2018).
  12. Wu, Q., et al. Comparison of the proliferation, migration and angiogenic properties of human amniotic epithelial and mesenchymal stem cells and their effects on endothelial cells. International Journal of Molecular Medicine. 39 (4), 918-926 (2017).
  13. Hammer, A., et al. Amnion epithelial cells, in contrast to trophoblast cells, express all classical HLA class I molecules together with HLA-G. American Journal of Reproductive Immunology. 37 (2), 161-171 (1997).
  14. Benirschke, K., et al. Anatomy and Pathology of the Placental Membranes. Pathology of the Human Placenta. , Springer. 268-318 (1995).
  15. Banerjee, A., et al. Different metabolic activity in placental and reflected regions of the human amniotic membrane. Placenta. 36 (11), 1329-1332 (2015).
  16. Kim, S. Y., et al. miR-143 regulation of prostaglandin-endoperoxidase synthase 2 in the amnion: implications for human parturition at term. PLoS One. 6 (9), 24131(2011).
  17. Han, Y. M., et al. Region-specific gene expression profiling: novel evidence for biological heterogeneity of the human amnion. Biology of Reproduction. 79 (5), 954-961 (2008).
  18. Alcaraz, A., et al. Autocrine TGF-beta induces epithelial to mesenchymal transition in human amniotic epithelial cells. Cell Transplantation. 22 (8), 1351-1367 (2013).
  19. Canciello, A., et al. Progesterone prevents epithelial-mesenchymal transition of ovine amniotic epithelial cells and enhances their immunomodulatory properties. Scientific Reports. 7 (1), 3761(2017).
  20. Canciello, A., Greco, L., Russo, V., Barboni, B. Amniotic Epithelial Cell Culture. Methods in Molecular Biology. 1817, 67-78 (2018).
  21. Singh, A. M., et al. Signaling network crosstalk in human pluripotent cells: a Smad2/3-regulated switch that controls the balance between self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 10 (3), 312-326 (2012).
  22. Villa-Diaz, L. G., Kim, J. K., Laperle, A., Palecek, S. P., Krebsbach, P. H. Inhibition of Focal Adhesion Kinase Signaling by Integrin alpha6beta1 Supports Human Pluripotent Stem Cell Self-Renewal. Stem Cells. 34 (7), 1753-1764 (2016).
  23. Bednar, A. D., Beardall, M. K., Brace, R. A., Cheung, C. Y. Differential expression and regional distribution of aquaporins in amnion of normal and gestational diabetic pregnancies. Physiological Reports. 3 (3), 12320(2015).
  24. Avila-Gonzalez, D., et al. Human amniotic epithelial cells as feeder layer to derive and maintain human embryonic stem cells from poor-quality embryos. Stem Cell Research. 15 (2), 322-324 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ludzkie komórki nabłonka owodnidysekcja błony owodniprotokół trawienia enzymatycznegotechnika izolacji komórekwirowanie i filtracjaanaliza fenotypu nabłonkowegoimmunodetekcja E-kadherynymarker proliferacji Ki-67obszary pępowiny łożyskahodowla komórkowa in vitro
Hodowla in vitro komórek nabłonkowych z różnych regionów anatomicznych ludzkiej błony owodniowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.