Uprawa mikroalg i kwantyfikacja biomasy w fotobioreaktorze laboratoryjnym z korozyjnymi gazami spalinowymi

Summary

Uprawa akseniczna na skalę laboratoryjną ułatwia charakterystykę mikroglonów i optymalizację produktywności przed kolejnym zwiększeniem skali procesu. Fotobioreaktory zapewniają niezbędną kontrolę dla wiarygodnych i powtarzalnych eksperymentów z mikroalgami i mogą być przystosowane do bezpiecznej hodowli mikroalg z gazami korozyjnymi (CO₂, SO₂, NO₂) z emisji ze spalania komunalnego lub przemysłowego.

Abstract

Fotobioreaktory to oświetlone systemy hodowli do eksperymentów na mikroorganizmach fototroficznych. Systemy te zapewniają sterylne środowisko do hodowli mikroglonów z kontrolą temperatury, pH i składu gazu oraz natężenia przepływu. W skali laboratoryjnej fotobioreaktory są korzystne dla naukowców badających właściwości mikroglonów, produktywność i optymalizację wzrostu. Na skalę przemysłową fotobioreaktory mogą utrzymywać czystość produktu i poprawiać wydajność produkcji. Film opisuje przygotowanie i użytkowanie fotobioreaktora w skali laboratoryjnej do hodowli mikroglonów, w tym bezpieczne stosowanie gazów korozyjnych, a także szczegółowe informacje na temat odpowiednich pomiarów biomasy i obliczeń wydajności biomasy. W szczególności film ilustruje przechowywanie kultur mikroglonów i przygotowanie do inokulacji, montaż i sterylizację fotobioreaktora, pomiary stężenia biomasy oraz model logistyczny produktywności biomasy mikroglonów wraz z obliczeniami szybkości, w tym maksymalną i ogólną produktywnością biomasy. Ponadto, ze względu na rosnące zainteresowanie eksperymentami mającymi na celu hodowlę mikroalg przy użyciu symulowanych lub rzeczywistych emisji gazów odlotowych, film obejmie adaptacje sprzętu fotobioreaktora niezbędne do pracy z gazami korozyjnymi oraz omówi bezpieczne pobieranie próbek w takich scenariuszach.

Introduction

Fotobioreaktory są przydatne do kontrolowanych eksperymentów i hodowli czystszych produktów z mikroalg, niż można uzyskać w otwartych stawach. Hodowla mikroglonów w fotobioreaktorach na skalę laboratoryjną wspiera rozwój podstawowej wiedzy, którą można wykorzystać do zwiększenia skali procesu. Niewielkie zmiany warunków środowiskowych mogą znacząco wpłynąć na eksperymenty mikrobiologiczne i zakłócić wyniki¹. Sterylny proces z kontrolą temperatury, pH i rozpryskiwania gazu jest korzystny dla badania właściwości i wydajności mikroglonów w różnych warunkach. Ponadto kontrola nad stężeniami gazu wejściowego, temperaturą, siłą ścinającą podczas mieszania i pH podłoża może wspierać różnorodne gatunki, które w innym przypadku byłyby trudne w uprawie. Fotobioreaktory mogą być uruchamiane jako proces wsadowy z ciągłym podawaniem gazu i rozpylaniem lub jako system przepływu chemostatu z ciągłym podawaniem gazu i rozpryskiwaniem oraz dopływem składników odżywczych do ścieków i ścieków. W tym miejscu demonstrujemy proces wsadowy z ciągłym podawaniem gazu i rozpylaniem.

Użycie fotobioreaktorów rozwiązuje kilka wyzwań związanych z hodowlą i produkcją mikroglonów. Dziedzina generalnie zmaga się z obawami o zanieczyszczenie innymi mikroorganizmami, efektywne wykorzystanie substratów (co jest szczególnie ważne w przypadku ograniczania emisji CO₂ lub oczyszczania ścieków)², kontrola pH, zmienność oświetlenia i produktywność biomasy³. Fotobioreaktory umożliwiają naukowcom badanie szerokiej gamy fototrofów w ściśle kontrolowanych systemach wsadowych, w których nawet wolno rosnące gatunki są chronione przed drapieżnikami lub konkurencyjnymi mikroorganizmami⁴. Te systemy wsadowe są również lepsze w ułatwianiu większych wskaźników wykorzystania CO₂ i produktywności biomasy, ponieważ są to systemy zamknięte, które z większym prawdopodobieństwem będą w równowadze z dostarczanymi gazami. Technologia fotobioreaktorów oferuje również kontrolę pH, której brak utrudniał wysoką produktywność biomasy w poprzednich badaniach⁵. W skali laboratoryjnej poziom kontroli oferowany przez fotobioreaktory jest korzystny dla badaczy. W większych skalach przemysłowych fotobioreaktory mogą być wykorzystywane do utrzymania czystości komercyjnych bioproduktów i poprawy wydajności produkcji w zastosowaniach nutraceutycznych, kosmetycznych, spożywczych lub paszowych⁶.

Mikroalgi są bardzo interesujące dla biosekwestracji CO₂, ponieważ mogą szybko związać CO₂ jako węgiel z biomasy. Jednak większość antropogenicznych źródeł CO₂ jest zanieczyszczona innymi i toksycznymi gazami lub zanieczyszczeniami (NO_x, SO_x, CO, Hg), w zależności od źródła paliwa w procesie spalania. Rosnące zainteresowanie zrównoważoną sekwestracją CO₂ skłoniło do opracowania technologii fotobioreaktorów do oczyszczania emisji bogatych w CO₂, takich jak te z elektrowni węglowych (tabela 1). Niestety, istnieje nieodłączne ryzyko narażenia ludzi i środowiska na i toksyczne zanieczyszczenia podczas badań i procesów zwiększania skali. W związku z tym opisanie bezpiecznego montażu i eksploatacji bioreaktorów wykorzystujących gazy korozyjne jest konieczne i pouczające.

Ta metoda jest przeznaczona do użycia 2-litrowego fotobioreaktora do hodowli mikroalg w ściśle kontrolowanych warunkach eksperymentalnych. Protokół opisuje przechowywanie mikroglonów, przygotowanie inokulum oraz konfigurację i sterylizację fotobioreaktora. Poza podstawową obsługą, praca ta opisuje pomiary biomasy mikroglonów i obliczenia produktywności biomasy oraz dostosowanie urządzeń do hodowli mikroglonów za pomocą gazów korozyjnych. Opisany poniżej protokół jest odpowiedni dla badaczy, którzy chcą sprawować większą kontrolę eksperymentalną, zoptymalizować warunki wzrostu mikroglonów lub hodować osiowo szereg mikroorganizmów fototroficznych. Metoda ta nie opisuje odpowiednich materiałów do hodowli mikroorganizmów, które wytwarzają lub zużywają gazy palne (np._CH4,_H2 itp.)⁷.

Protocol

1. Bezpieczne użytkowanie i pobieranie próbek z fotobioreaktora opryskanego gazami

UWAGA: Ta metoda nie opisuje odpowiednich procedur bezpiecznego pobierania próbek kultur mikroglonów, które wytwarzają lub zużywają wysoce łatwopalne gazy.

1. Zarządzanie gazami toksycznymi jako zagrożeniem dla zdrowia ludzkiego.
   UWAGA: Zgodnie z Planem Higieny Chemicznej Uniwersytetu Iowa, autorzy współpracowali z Uniwersyteckim Koordynatorem ds. Bezpieczeństwa Pożarowego i Uniwersyteckim Inspektorem ds. Bezpieczeństwa Środowiskowego i Higieny Przemysłowej w celu opracowania protokołu bezpieczeństwa pracy z toksycznymi gazami.
2. Skonfiguruj system monitorowania gazów toksycznych z czujnikami dla każdego z używanych gazów toksycznych. Skalibruj czujniki zgodnie z instrukcjami producenta. Test funkcjonalności (sprawdzanie działania czujnika i alarmu za pomocą gazów kalibracyjnych) często, zgodnie z instrukcjami producenta. Umieść monitor gazu tuż za wyciągiem.
3. Przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentów z gazami korozyjnymi należy powiadomić pobliski personel o zagrożeniu i systemie alarmowym. Powiadom również odpowiednie lokalne służby ratownicze. Na wejściach do laboratoriów należy umieścić tabliczki informujące o tym, jakie niebezpieczne gazy są w użyciu.
   1. Poinstruuj cały pobliski personel, aby ewakuował się w przypadku wykrycia toksycznego gazu. Powiadom kierowników laboratoriów i personel ratowniczy.
      UWAGA: W przypadku przerwy w dostawie prądu wieża regulująca gaz zatrzyma przepływ gazu, gdy utraci zasilanie. Jeśli jednak system ogrzewania, wentylacji i klimatyzacji (HVAC) w pomieszczeniu lub okap ulegnie awarii bez przerwy w dostawie prądu, spowoduje to wyciek toksycznego gazu.
4. Modeluj możliwe skumulowane stężenie toksycznych gazów w pomieszczeniu w przypadku awarii dygestoria, korzystając z arkusza kalkulacyjnego modelowania matematycznego Amerykańskiego Stowarzyszenia Higieny Przemysłowej (AIHA) IH MOD⁸ dla każdego gazu.
   1. Szybkość nawiewania/wywiewu powietrza w pomieszczeniu, Q, w m^{3 min-1} należy uzyskać od personelu konserwacyjnego HVAC budynku lub technika HVAC. Obliczyć objętość V laboratorium (dł. x szer. x wys.) w m³. Obliczyć wskaźnik emisji zanieczyszczeń, G, dla każdego rodzaju gazu toksycznego w mg ^min-1, stosując równanie 1 zaadaptowane z prawa gazu doskonałego:
      (1)
      gdzie P jest ułamkiem ciśnienia wywieranego przez gaz toksyczny przy 1 atm (ppm gazu/10⁶ ppm), _{Q gaz} jest natężeniem przepływu gazu w L ^min-1, R jest uniwersalną stałą gazową (0,082057 L·atm·^mol-1·^K-1), T jest temperaturą w K, a MW jest masą cząsteczkową gazu w g ^mol-1.
   2. Użyj wartości V, Q i G dla każdego gazu (obliczonych w kroku 1.4.1) w algorytmie "Well-Mixed Room Model With option to cease generation and model room purge" w arkuszu kalkulacyjnym IH MOD, aby obliczyć skumulowane stężenia gazów w pomieszczeniu dla każdego gazu w okresie symulacji 1440 min (24 h). Porównaj te wartości z limitami ekspozycji (Tabela 2)⁹.

2. Przygotowanie inokulum mikroalg

1. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy przygotować inokulum Scenedesmus obliquus lub inne gatunki mikroglonów wybrane do fotobioreaktora, przenosząc je z magazynu, niezależnie od tego, czy są kriokonserwowane, czy hodowane na pożywkach agarowych.
   1. Dodaj 30−50 ml sterylnego podłoża do wzrostu mikroglonów (potrójnie azotowe podłoże podstawowe Bolda [3N-BBM], tabela 3) do sterylnej (150−250 ml) kolby wstrząsającej zamkniętej korkiem piankowym.
      UWAGA: O ile kolba nie zostanie przetrząśnięta, tylko jedna piąta objętości kolby do wytrząsania powinna być zajęta przez płynne media.
   2. Używaj komory bezpieczeństwa biologicznego, aby zachować sterylność podczas przenoszenia komórek do kolby skośnej lub wstrząsowej. W przypadku kultur na agarze należy użyć sterylnej pętli, aby przenieść mikroalgi z płytki agarowej lub skosu do kolby do wytrząsania. W przypadku kultur kriokonserwowanych należy stopniowo rozmrażać kriokonserwowaną próbkę i wypłukać krioprotektant zgodnie z wybranym protokołem¹⁰, a następnie dodać komórki do kolby wstrząsającej.
   3. Komórki hodowlane w 3N-BBM w temperaturze 20−25 °C w temperaturze 16 h: 8 h światło: ciemno i wstrząsające w temperaturze 115−130 obr./min.
   4. Śledź wzrost mikroglonów w czasie za pomocą pomiarów gęstości optycznej (OD) (jak w sekcjach 5 i 6). Pozwól mikroalgom osiągnąć fazę wykładniczego wzrostu (2-4 dni) przed przeniesieniem komórek do fotobioreaktora.
      UWAGA: W zależności od celu eksperymentu, komórki mogą być przepłukane z pożywki hodowlanej (to badanie) i/lub zagęszczone za pomocą wielu etapów wirowania przed inokulacją bioreaktora.

3. Konfiguracja i działanie fotobioreaktora

1. Użyj fotobioreaktora (Rysunek 1) do kontrolowania temperatury, pH, szybkości mieszania, szybkości przepływu gazu i natężenia przepływu roztworu wejściowego.
   UWAGA: Fotobioreaktor może być używany do kontrolowania przepływu do czterech różnych roztworów wejściowych, zwykle kwasowych, zasadowych, przeciwpieniących i substratowych.
   1. Przygotować po 100 ml 1 N NaOH i 1 N HCl i dodać każdy z nich do butelki z roztworem wejściowym o pojemności 250 ml. Dla tych rozwiązań należy użyć wtórnego zabezpieczenia.
   2. Odmierzone roztwory wejściowe należy przechowywać w autoklawowalnych butelkach z nakrętką, wyposażonych w rurki zanurzeniowe i rurkę odpowietrzającą ze sterylnym wbudowanym filtrem powietrza. Podłącz rurki zanurzeniowe do czterech portów wejściowych fotobioreaktora za pomocą rurki do sterylizacji w autoklawie, a podczas pracy fotobioreaktora zanurz rurki zanurzeniowe w roztworach wejściowych. Przepuść rurkę autoklawowalną o średnicy wewnętrznej (ID) 1,6 mm między roztworami wejściowymi a ich portami przez oddzielne pompy perystaltyczne, które mogą być sterowane albo przez ręcznie wybierane natężenia przepływu, albo przez sprzężenie zwrotne z sond pH i poziomu piany (w przypadku roztworów kwasów, zasad i środków przeciwpieniących).
2. Skalibruj pH-metr fotobioreaktora przed autoklawowaniem.
   1. Podłącz sondę pH do wieży kontrolnej fotobioreaktora, dopasowując sondę do przewodu połączeniowego i przekręcając w celu zablokowania. Użyj o pH 4 i pH 7, aby skalibrować pH-metr. Poczekaj, aż wartości się ustabilizują, zanim zaakceptujesz wartość pH-metru.
   2. Odłącz sondę pH od przewodu pH-metru, który łączy sondę z wieżą kontrolną.
   3. Sterylizuj powierzchnię 70% etanolem lub sterylizuj sondę w autoklawie za pomocą reaktora. Aby sterylizować w autoklawie, szczelnie przykryj sondę pH folią aluminiową.
      UWAGA: Jeśli sonda jest sterylizowana w autoklawie, istnieje ryzyko korozji wnętrza sondy w wyniku uszkodzenia przez parę. Ta metoda zamykania nie gwarantuje całkowicie zapobiegania uszkodzeniom.
   4. Dodać 10 mM buforu kwasu 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowego (HEPES) do pożywki hodowlanej, aby lepiej kontrolować pH.
3. Włóż i przykręć zimny palec i skraplacz spalin na płycie głównej fotobioreaktora.
4. Włóż port zaszczepiania i mocno przykręć. Dodaj odcinek rurki do sterylizacji w autoklawie do sekcji portu inokulacji powyżej płyty głowicy fotobioreaktora. Przed autoklawowaniem bioreaktora należy zacisnąć rurkę zamkniętą za pomocą autoklawowalnej opaski zaciskowej.
5. Podłącz rurki zakryte sterylnymi filtrami do wszystkich nieużywanych portów fotobioreaktora.
6. Podłącz roztwory wejściowe kwasów i zasad do portów wejściowych fotobioreaktora za pomocą rurki do sterylizacji w autoklawie. Dodać 1,5 l pożywki hodowlanej.
7. Autoklawować reaktor i związane z nim roztwory wejściowe przez 30−45 min w temperaturze 121 °C w zależności od objętości roboczej.
   UWAGA: Jeśli autoklawowanie ma negatywny wpływ na pożywkę hodowlaną, dodaj pożywkę po autoklawowaniu w sterylnych warunkach w okapie z przepływem laminarnym. Protokół można wstrzymać tutaj.
   UWAGA: Reaktor będzie gorący po wyjęciu z autoklawu.
8. Przymocuj silnik wirnika do wału wirnika i dokręć złączkę.
9. Panele świetlne LED należy rozmieścić symetrycznie na zewnątrz bioreaktora zgodnie z wymaganiami dotyczącymi oświetlenia.
   1. Przed autoklawowaniem zmierz i zapisz natężenie światła za pomocą fotometru. Umieść czujnik natężenia oświetlenia w naczyniu fotobioreaktora i skieruj czujnik w stronę źródła światła.
10. Podłączyć do dwóch butli gazowych, aby dostarczyć symulowane emisje z elektrowni węglowej (tabela 1) do mikroalg w fotobioreaktorze.
    UWAGA: Stężenia gazów użyte w tym badaniu były zbliżone do stężeń elektrowni Uniwersytetu Iowa.
    1. Zamontuj połączenia między butlą gazową, wieżą regulacyjną gazu i pierścieniem zapalającym fotobioreaktora. Podłącz odpowiednie regulatory o ciśnieniu wylotowym 20 psi do butli gazowych. Przymocuj rurkę odporną na ciśnienie 6 mm ID do króćca węża wylotowego regulatora i zabezpiecz wężem clamp. Podłącz drugi koniec rurki odpornej na ciśnienie do wlotu gazu z wieży regulacyjnej za pomocą króćca węża do szybkozłączki trzpienia 6 mm zabezpieczonej wężem clamp. Podłącz rurkę o średnicy wewnętrznej 3.2 mm do wylotu gazu w wieży regulacyjnej za pomocą innej szybkozłączki 6 mm, a drugi koniec rurki wylotowej podłącz do portu pierścienia iskrzącego na płycie czołowej fotobioreaktora.
       UWAGA: W przypadku drugiego gazu wejściowego powtórz krok 3.9.1, ale użyj króćca węża w kształcie litery T, aby skonsolidować dwa przewody gazu wejściowego do jednej sekcji rurki podłączonej do portu pierścienia zapłonowego.
    2. Ustaw ciśnienie wylotowe na 20 psi na każdym regulatorze gazu i użyj interfejsu bioreaktora, aby ustawić eksperymentalne natężenia przepływu gazu.
       UWAGA: Oblicz i podaj objętość powietrza w standardowych warunkach na objętość cieczy na minutę (vvm); Podziel objętościowe natężenie przepływu gazu przez objętość kultury. Raportowanie w jednostkach na minimum.
11. W przypadku spryskiwania więcej niż jedną butlą gazową należy potwierdzić dostarczone stężenie CO₂ do fotobioreaktora za pomocą czujnika CO₂ .
    1. Podłącz czujnik CO₂ kompatybilny z oprogramowaniem (np. GasLab) do portu USB komputera. Pobierz najnowsze oprogramowanie odpowiadające modelowi czujnika CO_{2 .} Otwórz oprogramowanie i wprowadź model czujnika, przedział czasu pomiaru i czas rejestrowania danych pomiarowych.
    2. Umieść czujnik CO₂ i połączoną rurkę przepływu gazu (przed połączeniem rurki z bioreaktorem) w 100-250 ml, zakorkowanym, odpowietrzonym naczyniu (na zewnątrz bioreaktora).
       UWAGA: Podczas eksperymentu stężenie CO₂ w przestrzeni nad powierzchnią może być mierzone z jednej z rurek odpowietrzających na płycie głowicy fotobioreaktora.
    3. Rozpocznij pomiary stężenia CO₂ w interfejsie użytkownika i poczekaj, aż pomiary się zrównoważą.
    4. Użyj interfejsu użytkownika fotobioreaktora, aby dostosować natężenie przepływu gazu z każdego zbiornika, aż do osiągnięcia pożądanego całkowitego natężenia przepływu (0,1 l ^min-1) i stężenia CO₂ (12%).
12. W interfejsie użytkownika fotobioreaktora użyj funkcji STIRR, aby ustawić szybkość obrotową wirnika. Upewnij się, że szybkość mieszania jest wystarczająco szybka, aby pożywka hodowlana mogła przyswoić rozpryskiwane pęcherzyki gazu.
    UWAGA: Niektóre gatunki mikroglonów mają słabe struktury komórkowe i zostaną uszkodzone lub pęknięte przez dużą siłę ścinającą.

4. Adaptacja fotobioreaktora i zestawu eksperymentalnego do użycia toksycznych gazów

UWAGA: Gazy korozyjne w prawdziwych lub symulowanych spalinach są i toksyczne. Wdychanie tych gazów stanowi poważne zagrożenie.
UWAGA: Metoda ta nie opisuje odpowiednich materiałów do bezpiecznej hodowli drobnoustrojów, które wytwarzają lub zużywają wysoce łatwopalne gazy (tj. metan, wodór itp.).

1. Zastąp mosiężne, plastikowe i standardowe elementy rur materiałami odpornymi na korozję.
   1. Użyj stali nierdzewnej, aby niezawodnie przeciwdziałać korozji spowodowanej silnymi kwasami powstałymi w reakcji między NO_x lub SO_x a wodą. Wymień plastikowe szybkozłączki na wlotach i wylotach gazu na wieży regulacyjnej gazu na szybkozłączki ze stali nierdzewnej. Do butli gazowych należy używać regulatorów ze stali nierdzewnej, w tym króćca węża wylotowego, a nie mosiądzu.
   2. Użyj rurki z politetrafluoroetylenu (PTFE) lub naturalnego octanu etylu i winylu (EVA), aby zabezpieczyć się przed korozją spowodowaną gazami NO_x i SO_x (odpowiednio) na połączeniach między butlą gazową a wieżą regulującą gaz i wieżą regulującą gaz a fotobioreaktorem.
2. Po autoklawowaniu zmontuj fotobioreaktor i butle z gazem w dygestoriach. Umieść fotobioreaktor na stole wewnątrz wtórnej obudowy i umieść butle z gazem w wolnostojących kołnierzach butli lub stojaku na butle.
3. Po zainicjowaniu przepływu gazu należy użyć bąbelkowego detektora wycieków cieczy, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków gazu we wszystkich połączeniach między butlami gazowymi a bioreaktorem. Użyj butelki do mycia naczyń wypełnionej wodą z płynem do mycia naczyń w stosunku 1:100 (v:v), aby pokryć połączenie małym strumieniem roztworu mydła.
   UWAGA: Nieszczelności będą sygnalizowane bulgotaniem na połączeniach.
4. Rozpoczynając eksperymenty z mikroalgami, rozpocznij spryskiwanie, a następnie dostosuj pH przed inokulacją (jak w standardowych eksperymentach z fotobioreaktorem).
   UWAGA: Buforowanie pożywki hodowlanej podczas eksperymentów z gazami korozyjnymi jest wysoce zalecane, ponieważ gazy wejściowe są silnie kwaśne.
5. Zaszczepić fotobioreaktor poprzez zasysanie przygotowanego inokulum mikroglonów do sterylnej strzykawki, dopasowanie strzykawki do rurki przymocowanej do portu inokulacji, otwarcie zacisku rurki do inokulacji i wciśnięcie strzykawki.
6. Sprawdzaj monitor gazu, ciśnienie w butli z gazem i fotobioreaktor dwa razy dziennie (i przed pobraniem próbki) pod kątem podwyższonego poziomu toksycznego gazu lub oznak wycieków.
7. Ograniczyć otwór skrzydła dygestorium do szerokości umożliwiającej dostęp do bioreaktora i regulatorów butli gazowych. Aby uniknąć ryzyka narażenia przez drogi oddechowe, należy upewnić się, że otwór nie wystawia personelu powyżej obszaru tułowia.
8. Przekręć regulatory butli gazowych do pozycji zamkniętej, aby zatrzymać przepływ gazu do reaktora. Zamknij skrzydło dygestorium i odczekaj 5 minut, aż okap usunie gazy korozyjne przed pobraniem próbki kultury fotobioreaktora.
9. Pobrać próbkę z dygestoria przez otwarcie otworu płyty czołowej i użycie sterylnej pipety serologicznej lub pobranie kultury do strzykawki przez otwór do zaszczepiania/pobierania próbek. Zabezpiecz porty fotobioreaktora przed otwarciem butli z gazem i wznowieniem eksperymentu.

5. Pomiar produktywności biomasy mikroglonów

1. Użyj krzywej kalibracyjnej, aby powiązać pomiary OD₇₅₀ kultur mikroglonów ze stężeniami wysuszonej biomasy mikroglonów.
   1. Przygotować kilka (minimum: 4, minimalna objętość robocza: 500 ml) kolb ze sterylnym podłożem z mikroalg i zaszczepić interesującymi nas gatunkami (np. S. obliquus w tym badaniu).
   2. Zmierzyć poziom OD₇₅₀ w kulturze, aż wzrost stanie się wykładniczy, i niezwłocznie pobrać próbki z kolb, filtrując znane objętości (minimum 100 ml) zawartości za pomocą membrany filtracyjnej 0,45 μm o znanej masie. Używaj zakrytych aluminiowych łodzi wagowych lub szklanych naczyń do podtrzymywania biomasy i filtrów podczas suszenia.
   3. Masować biomasę i filtry po wysuszeniu przez około 18−24 h w piecu w temperaturze 80−100 °C. Aby sprawdzić całkowite wyschnięcie, zmierz ponownie po dodatkowych 2-3 godzinach, aby określić, czy masa się ustabilizowała.
   4. Odejmij masę filtra od połączonej biomasy i masy filtra, aby obliczyć masę biomasy.
   5. Wykreślić krzywą kalibracyjną zmierzoną OD₇₅₀ w stosunku do stężenia biomasy (masa biomasy podzielona przez objętość przefiltrowanej kultury) i dopasować dane do regresji liniowej.

6. Modelowanie produktywności biomasy i obliczanie stawek

1. Obliczyć eksperymentalne stężenia biomasy na podstawie pomiarów OD₇₅₀ przy użyciu krzywej kalibracyjnej regresji liniowej (określonej w sekcji 5).
2. Dopasuj dane dotyczące wzrostu mikroglonów wsadowych od fazy opóźnionej do wykładniczej do fazy stacjonarnej z regresją logistyczną (równanie 2) w oprogramowaniu do tworzenia wykresów i statystyk (tabela materiałów):
   (2)
   gdzie L jest maksymalną wartością koncentracji biomasy na krzywej, k jest względną stromością fazy wykładniczej (^czas-1), x_o jest czasem punktu środkowego krzywej sigmoidalnej, a x jest czasem.
   1. Ręcznie wprowadź powyższe równanie logistyczne. Wybierz opcję Dopasuj krzywą z regresją nieliniową na karcie Analiza w oprogramowaniu. Po lewej stronie pola Parametry: Regresja nieliniowa wybierz pozycję Utwórz nowe równanie w polu listy rozwijanej Nowe. Użyj domyślnego równania jawnego jako typu równania, nazwij nową funkcję i zdefiniuj nową funkcję jako Y = L/(1+ exp(-k*(x-b))), gdzie b reprezentuje x_o.
3. Oblicza się całkowitą produktywność biomasy w partii mikroglonów, dzieląc różnicę między końcowym i początkowym stężeniem biomasy przez różnicę między czasem końcowym a początkowym.
4. Obliczyć maksymalną produktywność biomasy partii mikroglonów na podstawie pochodnej równania 2 (równanie 3) w punkcie środkowym esicy, gdy x = x_o.
   (3)

Results

Krzywa kalibracyjna dla zielonych mikroalg, S. obliquus, zebranych w fazie wykładniczej, została ustalona z OD₇₅₀ i stężeniami suszonej biomasy (Rysunek 2). Regresja liniowa miała wartość R² równą 0,9996.

Hodowla S. obliquus została rozpoczęta w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 ml z kultury przechowywanej na chłodzonej płycie agarowej. Mikroalgę zaszczepiono w 3N-BBM 10 mM buforem HEPES i spryskano 2,2% CO₂ w fot...

Discussion

Eksperymenty z wsadowym fotobioreaktorem aksenicznym z regulowanym pH, temperaturą, natężeniem przepływu i stężeniem gazu zapewniają znaczące wyniki, eliminując zanieczyszczenie niedocelowymi szczepami glonów i zmienność warunków hodowli. Dokładną kinetykę wzrostu czystych kultur można uzyskać nawet w obecności gazów korozyjnych (CO₂, SO₂, NO₂), które służą jako składniki odżywcze, przekształcając gazy odlotowe w cenny produkt, taki jak pasza dla zwierząt.

Prze...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biostat Bioreaktor	A Sartorius Stedim		2-litrowy bioreaktor do fermentacji mikrobiologicznej; przeznaczony do sterylizacji w autoklawie; kontrola pH, temperatury, natężenia przepływu gazu
Test sprawności GAZ NO2	Grainger	GAS34L-112-5	Gaz kalibracyjny do detektora gazu MultiRAE
Test sprawności O2, CO, gaz LEL	Gaz Grainger	GAS44ES-301A	Gaz kalibracyjny do Detektor gazu MultiRAE
Test sprawności SO2 gaz	Grainger	GAS34L-175-5	Gaz kalibracyjny do detektora gazu MultiRAE
Rurka odporna na korozję do gazu NO2	Swagelok	SS-XT4TA4TA4-6	Wąż rdzeniowy PTFE z gładkim otworem serii X— Oplot z włókna i wzmocnienie oplotu 304 SS
Odporne na korozję rurki do gazu SO2< / sub>	Zasilanie QC	120325	Wzmocnione plecione rurki z naturalnej pianki EVA - 1/4" ID
cozIR 100% CO2 metr	Gas Sensing Solutions Ltd.	CM-0121 w CO2meter.com	mierniku CO2 do stężeń do 100%
cozIR 20% miernika CO2	Gas Sensing Solutions Ltd.	CM-0123 przy CO2meter.com	mierniku CO2 dla stężeń do 20%
Durapore Filtr membranowy, 0,45 μ m	Millipore Sigma	HVLP04700	Hydrofilowy, biały zwykły, średnica 47 mm, 0,45 μ m wielkość porów, filtry membranowe PVFD
Reduktory do butli gazowych	Praxair	PRS 40221331-660	Jednostopniowy regulator ze stali nierdzewnej skonfigurowany do montażu wylotu 0-15 psi Zawór membranowy z gwintem 1/4" MNPT, Stal nierdzewna odporna na korozję spowodowaną NOx i SOx
Butle gazowe	Praxair	Ulta-zero powietrza, CO2 o wysokiej czystości lub niestandardowy skład gazu	W zależności od celów badania
System monitorowania i wykrywania nieszczelności	gazów RAE Systems firmy Honeywell	MAB3000235E020	Model pompowy, który wykrywa O2, SO2, NO2, CO i LEL
Oprogramowanie GasLab	GasLab	v2.0.8.14	Oprogramowanie do pomiarów miernika CO2 i rejestracji danych Króciec
	Grainger	Pozycja # 3DTN3	Służy do adaptacji regulatorów do rur, Stal nierdzewna odporna na korozję od NOx i SOx
Miernik K30 1% CO2	Senseair	CM-0024 w CO2meter.com	Miernik CO2 dla stężeń mniejszych niż 1%
Panele do uprawy LED	Roleadro	HY-MD-D169-S	Czerwone i niebieskie panele świetlne LED
Sonda tlenu rozpuszczonego Memosens	Endress+ Hauser	COS22D-19M6/0	Autoklawowalna (ze środkami ostrożności) sonda tlenu rozpuszczonego do bioreaktora
Sonda pH Memosens	Endress+ Hauser	CPS71D-7TB41	Możliwość sterylizacji w autoklawie (z zachowaniem środków ostrożności) Sonda pH do bioreaktora
Piekarnik, seria Isotemp 500	Fisher Scientific	13246516GAQ	Mały piec do suszenia
Oprogramowanie Prism GraphPad	Oprogramowanie GraphPad	w wersji 7.03 lub 8.0.1	Oprogramowanie do tworzenia wykresów do organizacji danych, analizy danych i wykresów o jakości publikacji
Łącznik trzpienia do węża	Swagelok	SS-4-HC-A-6MTA	Złącze węża ze stali nierdzewnej, adapter rurki 6 mm, 1/4 cala Średnica węża
Rurki do przenoszenia rozcieńczonego kwasu/zasady	Allied Electronics and Automation	6678441	Silikonowe rurki procesowe TP; 1.6mm Rozmiar otworu; 3000mm Długość; Przewody dopuszczone do kontaktu z żywnością
, transfer gazu	Allied Electronics and Automation	6678444	Silikonowe rurki procesowe TP; 3.2mm Rozmiar otworu; 3000mm długości; Klasa spożywcza