Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Uprawa mikroalg i kwantyfikacja biomasy w fotobioreaktorze laboratoryjnym z korozyjnymi gazami spalinowymi

10K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60566

⸱

19 grudnia 2019

 ,  , 
1Department of Civil and Environmental Engineering, University of Iowa

W tym artykule

Podsumowanie

Uprawa akseniczna na skalę laboratoryjną ułatwia charakterystykę mikroglonów i optymalizację produktywności przed kolejnym zwiększeniem skali procesu. Fotobioreaktory zapewniają niezbędną kontrolę dla wiarygodnych i powtarzalnych eksperymentów z mikroalgami i mogą być przystosowane do bezpiecznej hodowli mikroalg z gazami korozyjnymi (CO2, SO2, NO2) z emisji ze spalania komunalnego lub przemysłowego.

Streszczenie

Fotobioreaktory to oświetlone systemy hodowli do eksperymentów na mikroorganizmach fototroficznych. Systemy te zapewniają sterylne środowisko do hodowli mikroglonów z kontrolą temperatury, pH i składu gazu oraz natężenia przepływu. W skali laboratoryjnej fotobioreaktory są korzystne dla naukowców badających właściwości mikroglonów, produktywność i optymalizację wzrostu. Na skalę przemysłową fotobioreaktory mogą utrzymywać czystość produktu i poprawiać wydajność produkcji. Film opisuje przygotowanie i użytkowanie fotobioreaktora w skali laboratoryjnej do hodowli mikroglonów, w tym bezpieczne stosowanie gazów korozyjnych, a także szczegółowe informacje na temat odpowiednich pomiarów biomasy i obliczeń wydajności biomasy. W szczególności film ilustruje przechowywanie kultur mikroglonów i przygotowanie do inokulacji, montaż i sterylizację fotobioreaktora, pomiary stężenia biomasy oraz model logistyczny produktywności biomasy mikroglonów wraz z obliczeniami szybkości, w tym maksymalną i ogólną produktywnością biomasy. Ponadto, ze względu na rosnące zainteresowanie eksperymentami mającymi na celu hodowlę mikroalg przy użyciu symulowanych lub rzeczywistych emisji gazów odlotowych, film obejmie adaptacje sprzętu fotobioreaktora niezbędne do pracy z gazami korozyjnymi oraz omówi bezpieczne pobieranie próbek w takich scenariuszach.

Wprowadzenie

Fotobioreaktory są przydatne do kontrolowanych eksperymentów i hodowli czystszych produktów z mikroalg, niż można uzyskać w otwartych stawach. Hodowla mikroglonów w fotobioreaktorach na skalę laboratoryjną wspiera rozwój podstawowej wiedzy, którą można wykorzystać do zwiększenia skali procesu. Niewielkie zmiany warunków środowiskowych mogą znacząco wpłynąć na eksperymenty mikrobiologiczne i zakłócić wyniki1. Sterylny proces z kontrolą temperatury, pH i rozpryskiwania gazu jest korzystny dla badania właściwości i wydajności mikroglonów w różnych warunkach. Ponadto kontrola nad stężeniami gazu wejściowego, temperaturą, siłą ścinającą podczas mieszania i pH podłoża może wspierać różnorodne gatunki, które w innym przypadku byłyby trudne w uprawie. Fotobioreaktory mogą być uruchamiane jako proces wsadowy z ciągłym podawaniem gazu i rozpylaniem lub jako system przepływu chemostatu z ciągłym podawaniem gazu i rozpryskiwaniem oraz dopływem składników odżywczych do ścieków i ścieków. W tym miejscu demonstrujemy proces wsadowy z ciągłym podawaniem gazu i rozpylaniem.

Użycie fotobioreaktorów rozwiązuje kilka wyzwań związanych z hodowlą i produkcją mikroglonów. Dziedzina generalnie zmaga się z obawami o zanieczyszczenie innymi mikroorganizmami, efektywne wykorzystanie substratów (co jest szczególnie ważne w przypadku ograniczania emisji CO2 lub oczyszczania ścieków)2, kontrola pH, zmienność oświetlenia i produktywność biomasy3. Fotobioreaktory umożliwiają naukowcom badanie szerokiej gamy fototrofów w ściśle kontrolowanych systemach wsadowych, w których nawet wolno rosnące gatunki są chronione przed drapieżnikami lub konkurencyjnymi mikroorganizmami4. Te systemy wsadowe są również lepsze w ułatwianiu większych wskaźników wykorzystania CO2 i produktywności biomasy, ponieważ są to systemy zamknięte, które z większym prawdopodobieństwem będą w równowadze z dostarczanymi gazami. Technologia fotobioreaktorów oferuje również kontrolę pH, której brak utrudniał wysoką produktywność biomasy w poprzednich badaniach5. W skali laboratoryjnej poziom kontroli oferowany przez fotobioreaktory jest korzystny dla badaczy. W większych skalach przemysłowych fotobioreaktory mogą być wykorzystywane do utrzymania czystości komercyjnych bioproduktów i poprawy wydajności produkcji w zastosowaniach nutraceutycznych, kosmetycznych, spożywczych lub paszowych6.

Mikroalgi są bardzo interesujące dla biosekwestracji CO2, ponieważ mogą szybko związać CO2 jako węgiel z biomasy. Jednak większość antropogenicznych źródeł CO2 jest zanieczyszczona innymi i toksycznymi gazami lub zanieczyszczeniami (NOx, SOx, CO, Hg), w zależności od źródła paliwa w procesie spalania. Rosnące zainteresowanie zrównoważoną sekwestracją CO2 skłoniło do opracowania technologii fotobioreaktorów do oczyszczania emisji bogatych w CO2, takich jak te z elektrowni węglowych (tabela 1). Niestety, istnieje nieodłączne ryzyko narażenia ludzi i środowiska na i toksyczne zanieczyszczenia podczas badań i procesów zwiększania skali. W związku z tym opisanie bezpiecznego montażu i eksploatacji bioreaktorów wykorzystujących gazy korozyjne jest konieczne i pouczające.

Ta metoda jest przeznaczona do użycia 2-litrowego fotobioreaktora do hodowli mikroalg w ściśle kontrolowanych warunkach eksperymentalnych. Protokół opisuje przechowywanie mikroglonów, przygotowanie inokulum oraz konfigurację i sterylizację fotobioreaktora. Poza podstawową obsługą, praca ta opisuje pomiary biomasy mikroglonów i obliczenia produktywności biomasy oraz dostosowanie urządzeń do hodowli mikroglonów za pomocą gazów korozyjnych. Opisany poniżej protokół jest odpowiedni dla badaczy, którzy chcą sprawować większą kontrolę eksperymentalną, zoptymalizować warunki wzrostu mikroglonów lub hodować osiowo szereg mikroorganizmów fototroficznych. Metoda ta nie opisuje odpowiednich materiałów do hodowli mikroorganizmów, które wytwarzają lub zużywają gazy palne (np.CH4,H2 itp.)7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Bezpieczne użytkowanie i pobieranie próbek z fotobioreaktora napowietrzanego gazami korozyjnymi

UWAGA: Niniejsza metoda nie opisuje odpowiednich procedur bezpiecznego pobierania próbek z kultur mikroalg, które produkują lub zużywają gazy wysoce łatwopalne.

  1. Zarządzanie toksycznymi gazami jako zagrożeniem dla zdrowia ludzi.
    UWAGA: Zgodnie z Planem Higieny Chemicznej University of Iowa, autorzy współpracowali z Koordynatorem ds. Bezpieczeństwa przeciwpożarowego Uniwersytetu oraz z Uniwersyteckim Wydziałem Zdrowia i Środowiska & Specjalista ds. BHP i higieny pracy przemysłowej opracuje protokół bezpieczeństwa dotyczący pracy z gazami toksycznymi.
  2. Należy zainstalować system monitorowania gazów toksycznych z czujnikami dla każdego z używanych gazów toksycznych. Czujniki należy skalibrować zgodnie z instrukcjami producenta. Należy często przeprowadzać testy szczelności i funkcjonalności (bump test), sprawdzając działanie czujników i alarmów za pomocą gazów kalibracyjnych, zgodnie z instrukcjami producenta. Monitor gazowy należy umieścić tuż przy dygestorium.
  3. Przed rozpoczęciem jakichkolwiek eksperymentów z użyciem gazów żrących należy poinformować personel znajdujący się w pobliżu o występującym ryzyku oraz o systemie alarmowym. Należy również powiadomić odpowiednie lokalne służby ratunkowe. Przy wejściach do laboratorium należy umieścić oznakowania określające, jakie gazy niebezpieczne są używane.
    1. W przypadku wykrycia toksycznego gazu należy polecić wszystkim osobom znajdującym się w pobliżu ewakuację. Należy powiadomić kierowników laboratorium oraz personel służb ratunkowych.
      UWAGA: W przypadku przerwy w dostawie energii elektrycznej wieża regulacyjna gazu zatrzyma przepływ gazu po utracie zasilania. Jednakże, jeśli system ogrzewania, wentylacji i klimatyzacji (HVAC) w pomieszczeniu lub dygestorium ulegną awarii bez jednoczesnej przerwy w dostawie prądu, doprowadzi to do wycieku toksycznego gazu.
  4. Przeprowadź modelowanie możliwej skumulowanej koncentracji gazów toksycznych w pomieszczeniu w przypadku awarii dygestorium, wykorzystując arkusz kalkulacyjny do modelowania matematycznego IH MOD opracowany przez American Industrial Hygiene Association (AIHA).8 dla każdego gazu.
    1. Wyznacz wartość nawiewu/wywiewu powietrza w pomieszczeniu, Q, w m3 min-1 od personelu konserwującego systemy HVAC w budynku lub technika HVAC. Oblicz objętość, V, laboratorium (D x Sz x W) w m3Oblicz tempo emisji zanieczyszczeń, G, każdego rodzaju toksycznego gazu w mg/min-1, stosując równanie 1 dostosowane do prawa gazów doskonałych:
      figure-protocol-1 (1)
      gdzie P jest to ułamek ciśnienia wywieranego przez toksyczny gaz przy 1 atm (ppm gazu/10^6)6 ppm), Qgaz czy przepływ gazu podawany jest w L min-1-1, R jest uniwersalna stała gazowa (0,082057 L·atm·mol-1·K-1), T jest temperaturą w K, a masa cząsteczkowa Czy masa cząsteczkowa gazu jest podana w g/mol?-1.
    2. Użyj wartości dla V, Qi G dla każdego gazu (obliczonego w kroku 1.4.1) w algorytmie „Well-Mixed Room Model With option to cease generation and model room purge” w arkuszu IH MOD, aby obliczyć skumulowane stężenia gazów w pomieszczeniu dla każdego gazu w okresie symulacji wynoszącym 1440 min (24 h). Porównać te wartości z limitami ekspozycji (Tabela 2)9.

2. Przygotowanie inokulum mikroalg

  1. Przed rozpoczęciem eksperymentu przygotować inokulum Scenedesmus obliquus lub innego gatunku mikroalg wybranego do fotobioreaktora, przenosząc je z miejsca przechowywania, niezależnie od tego, czy było kriozachowane, czy hodowane na podłożu agarowym.
    1. Do sterylnej kolby analitycznej (150−250 mL) zamkniętej korkiem z pianki dodać 30−50 mL sterylnego pożywki do wzrostu mikroalg (podłoże Bold's basal medium z potrójną dawką azotu [3N-BBM], Tabela 3).
      UWAGA: Jeśli kolba nie jest napowietrzana, ciecz powinna zajmować jedynie jedną piątą objętości kolby.
    2. W celu zachowania sterylności podczas przenoszenia komórek do kolby pochyłej lub analitycznej należy korzystać z komory z laminarnym przepływem powietrza. W przypadku kultur na agarze, do przeniesienia mikroalg z płytki lub kolby pochyłej do kolby analitycznej należy użyć sterylnej pętli. W przypadku kultur kriozachowanych, próbkę należy stopniowo rozmrozić i wypłukać krioprotektant zgodnie z wybranym protokołem10, a następnie dodać komórki do kolby analitycznej.
    3. Hodować komórki w 3N-BBM w temperaturze 20−25 °C przy cyklu światło:ciemność 16 h:8 h i wstrząsaniu z prędkością 115−130 rpm.
    4. Monitorować wzrost mikroalg w czasie, mierząc gęstość optyczną (OD) (zgodnie z sekcjami 5 i 6). Przed przeniesieniem komórek do fotobioreaktora doprowadzić mikroalgi do fazy wzrostu wykładniczego (2−4 dni).
      UWAGA: W zależności od celu eksperymentu, przed inokulacją bioreaktora komórki można wypłukać z pożywki (w niniejszym badaniu) i/lub skoncentrować za pomocą wielokrotnych etapów wirowania.

3. Konfiguracja i obsługa fotobioreaktora

  1. Użyć fotobioreaktora (Rysunek 1) do kontrolowania temperatury, pH, prędkości mieszania, natężenia przepływu gazów oraz natężenia przepływu roztworów wejściowych.
    UWAGA: Fotobioreaktor może być wykorzystywany do sterowania przepływem do czterech różnych roztworów wejściowych, zazwyczaj kwasu, zasady, odpieniacza i substratu.
    1. Przygotować po 100 mL 1 N NaOH i 1 N HCl i przelać każdy z nich do butelki na roztwór wejściowy o pojemności 250 mL. Zastosować wtórne zabezpieczenie dla tych roztworów.
    2. Przechowywać odmierzone roztwory wejściowe w autoklawowalnych butelkach z nakrętkami, wyposażonych w rurki zanurzeniowe oraz rurkę odpowietrzającą ze sterylnym filtrem powietrza w linii. Podłączyć rurki zanurzeniowe do czterech portów wejściowych fotobioreaktora za pomocą autoklawowalnych przewodów i podczas pracy fotobioreaktora zanurzyć rurki w roztworach wejściowych. Przeprowadzić autoklawowalne przewody o średnicy wewnętrznej (ID) 1,6 mm pomiędzy roztworami wejściowymi a ich portami przez oddzielne pompy perystaltyczne, które mogą być sterowane albo poprzez ręcznie wybrany przepływ, albo poprzez sprzężenie zwrotne z sond pH i poziomu piany (w przypadku roztworów kwasu, zasady i odpieniacza).
  2. Zkalibrować miernik pH fotobioreaktora przed autoklawowaniem.
    1. Podłączyć sondę pH do wieży sterującej fotobioreaktora, dopasowując sondę do linii połączeniowej i przekręcając do zablokowania. Do kalibracji miernika pH użyć buforów o pH 4 i pH 7. Odczekać do ustabilizowania się wartości przed zatwierdzeniem odczytu miernika pH.
    2. Odłączyć sondę pH od przewodu miernika pH łączącego sondę z wieżą sterującą.
    3. Zastosować sterylizację powierzchniową 70% etanolem lub autoklawować sondę wraz z reaktorem. W przypadku autoklawowania, szczelnie owinąć sondę pH folią aluminiową.
      UWAGA: W przypadku autoklawowania sondy istnieje ryzyko korozji wnętrza sondy wskutek uszkodzeń spowodowanych parą. Metoda ta nie gwarantuje całkowitego zapobiegania uszkodzeniom.
    4. Do pożywki dodać 10 mM buforu kwasu 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowego (HEPES), aby lepiej kontrolować pH.
  3. Włożyć i dokręcić palec chłodzący oraz kondensator wylotowy na płycie głównej fotobioreaktora.
  4. Włożyć port inokulacyjny i mocno dokręcić. Do sekcji portu inokulacyjnego powyżej płyty głównej fotobioreaktora dołączyć odcinek autoklawowalnego przewodu. Przed autoklawowaniem bioreaktora zamknąć przewód za pomocą autoklawowalnego zacisku do węży.
  5. Do niewykorzystanych portów fotobioreaktora przymocować przewody zakończone sterylnymi filtrami.
  6. Podłączyć roztwory wejściowe kwasu i zasady do portów wejściowych fotobioreaktora za pomocą autoklawowalnych przewodów. Dodać 1,5 L pożywki hodowlanej.
  7. Autoklawować reaktor i powiązane roztwory wejściowe przez 30−45 min w temperaturze 121 °C, zależnie od objętości roboczej.
    UWAGA: Jeśli autoklawowanie wpływa niekorzystnie na pożywkę, dodać ją po autoklawowaniu w warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Protokół można w tym miejscu przerwać.
    OSTRZEŻENIE: Reaktor będzie gorący po wyjęciu z autoklawu.
  8. Przymocować silnik mieszadła do wału mieszadła i dokręcić złącze.
  9. Rozmieścić panele świetlne LED symetrycznie na zewnątrz bioreaktora zgodnie z wymaganiami dotyczącymi oświetlenia.
    1. Przed autoklawowaniem zmierzyć i zapisać natężenie światła za pomocą fotometru. Umieścić czujnik oświetlenia wewnątrz naczynia fotobioreaktora, kierując czujnik w stronę źródła światła.
  10. Podłączyć do dwóch butli gazowych w celu dostarczenia do mikroalg w fotobioreaktorze symulowanych emisji z elektrowni węglowej (Tabela 1).
    UWAGA: Stężenia gazów zastosowane w tym badaniu były zbliżone do tych z elektrowni University of Iowa.
    1. Złożyć połączenia między butlą gazową, wieżą regulacji gazu a pierścieniem napowietrzającym fotobioreaktora. Do butli gazowych przymocować odpowiednie regulatory zdolne do zapewnienia ciśnienia wylotowego 20 psi. Do króćca wylotowego regulatora przymocować odporny na ciśnienie przewód o średnicy wewnętrznej ID 6 mm i zabezpieczyć zaciskiem do węży. Drugi koniec przewodu odpornego na ciśnienie podłączyć do wlotu gazu w wieży regulacji gazu za pomocą szybkozłącza z króćcem 6 mm zabezpieczonego zaciskiem do węży. Do wylotu gazu w wieży regulacji gazu podłączyć przewód o średnicy wewnętrznej ID 3,2 mm za pomocą innego szybkozłącza 6 mm, a drugi koniec przewodu wylotowego podłączyć do portu pierścienia napowietrzającego na płycie głównej fotobioreaktora.
      UWAGA: W przypadku drugiego gazu wejściowego powtórzyć krok 3.9.1, stosując króciec w kształcie litery T, aby połączyć dwie linie gazu wejściowego w jedną sekcję rurki podłączonej do portu pierścienia napowietrzającego.
    2. Ustawić ciśnienie wylotowe na 20 psi na każdym regulatorze gazu i użyć interfejsu bioreaktora do ustawienia eksperymentalnych natężeń przepływu gazów.
      UWAGA: Obliczyć i podać objętość powietrza w warunkach standardowych na objętość cieczy na minutę (vvm); podzielić wolumetryczne natężenie przepływu gazu przez objętość hodowli. Podać w jednostkach na minutę­­­.
  11. Przy napowietrzaniu z więcej niż jednej butli gazowej potwierdzić dostarczone stężenie CO2 do fotobioreaktora za pomocą czujnika CO2.
    1. Podłączyć kompatybilny z oprogramowaniem (np. GasLab) czujnik CO2 do portu USB komputera. Pobrać najnowszą wersję oprogramowania odpowiadającą modelowi czujnika CO2. Otworzyć oprogramowanie i wprowadzić model czujnika, odstęp czasu pomiaru oraz czas trwania rejestrowania danych pomiarowych.
    2. Umieścić czujnik CO2 i połączoną rurkę przepływu gazu (przed podłączeniem rurki do bioreaktora) w naczyniu o pojemności 100−250 mL z nakrętką i otworem wentylacyjnym (na zewnątrz bioreaktora).
      UWAGA: Podczas eksperymentu stężenia CO2 w przestrzeni nad cieczą można mierzyć z jednej z rurek odpowietrzających na płycie głównej fotobioreaktora.
    3. Rozpocząć pomiary stężenia CO2 w interfejsie użytkownika i odczekać do wyrównania pomiarów.
    4. Użyć interfejsu użytkownika fotobioreaktora, aby dostosować natężenia przepływu gazu z każdego zbiornika, aż do osiągnięcia pożądanego całkowitego natężenia przepływu (0,1 L min-1) i stężenia CO2 (12%).
  12. W interfejsie użytkownika fotobioreaktora użyć funkcji STIRR, aby ustawić prędkość obrotową mieszadła. Upewnić się, że szybkość mieszania jest wystarczająca, aby pożywka hodowlana mogła asymilować pęcherzyki gazu z napowietrzania.
    UWAGA: Niektóre gatunki mikroalg mają słabą strukturę komórkową i mogą zostać uszkodzone lub rozerwane przez wysoką siłę ścinania.

4. Adaptacja fotobioreaktora i układu eksperymentalnego do pracy z toksycznymi gazami

UWAGA: Gazy korozyjne w rzeczywistych lub symulowanych gazach spalinowych są żrące i toksyczne. Gazy te stwarzają poważne ryzyko w przypadku wdychania.
UWAGA: Niniejsza metoda nie opisuje odpowiednich materiałów do bezpiecznej hodowli drobnoustrojów produkujących lub zużywających gazy wysoce łatwopalne (np. metan, wodór itp.).

  1. Zastąp mosiężne, plastikowe i standardowe elementy przewodów materiałami odpornymi na korozję.
    1. Stosuj stal nierdzewną, aby skutecznie zapobiegać korozji wywoływanej przez silne kwasy powstające w reakcji NOx lub SOx z wodą. Zastąp plastikowe szybkozłączki przy wlotach i wylotach gazu w wieży regulującej gaz szybkozłączkami ze stali nierdzewnej. W przypadku butli gazowych stosuj regulatory ze stali nierdzewnej, w tym króciec wylotowy, zamiast mosiężnych.
    2. Aby zapobiegać korozji wywoływanej przez gazy NOx oraz SOx (odpowiednio), stosuj przewody z politetrafluoroetylenu (PTFE) lub naturalnego etylenu octanu winylu (EVA) w połączeniach między butlą gazową a wieżą regulującą gaz oraz między wieżą regulującą gaz a fotobioreaktorem.
  2. Po autoklawowaniu zmontuj fotobioreaktor i butle gazowe wewnątrz komory dygestorium. Umieść fotobioreaktor na stole wewnątrz wtórnego zabezpieczenia przed wyciekiem, a butle gazowe ustaw w wolnostojących obręczach lub na stojaku do butli.
  3. Po uruchomieniu przepływu gazu użyj bąbelkowego detektora nieszczelności cieczowych, aby sprawdzić szczelność wszystkich połączeń między butlami gazowymi a bioreaktorem. Użyj butelki z myjką wypełnionej rozcieńczeniem płynu do naczyń z wodą w stosunku 1:100 (v:v), aby pokryć połączenie niewielkim strumieniem roztworu mydła.
    UWAGA: Nieszczelności będą sygnalizowane przez powstawanie pęcherzyków powietrza w miejscach połączeń.
  4. Rozpoczynając eksperymenty z mikroalgami, najpierw uruchom napowietrzanie, a następnie dostosuj pH przed inokulacją (podobnie jak w standardowych eksperymentach z fotobioreaktorem).
    UWAGA: Podczas eksperymentów z gazami korozyjnymi wysoce zalecane jest buforowanie pożywki hodowlanej, ponieważ gazy doprowadzane są silnie kwasowe.
  5. Zaszczep fotobioreaktor, odsysając przygotowany inokulum mikroalg do sterylnej strzykawki, mocując strzykawkę do przewodu przymocowanego do portu inokulacyjnego, otwierając zacisk przewodu inokulacyjnego i wciskając tłok strzykawki.
  6. Dwa razy dziennie (oraz przed pobraniem próbek) sprawdzaj monitor gazu, ciśnienie w butlach gazowych oraz fotobioreaktor pod kątem podwyższonego poziomu toksycznych gazów lub oznak wycieku.
  7. Ogranicz otwarcie przesłony dygestorium do szerokości umożliwiającej dostęp do bioreaktora i regulatorów butli gazowych. Aby uniknąć ryzyka ekspozycji drogą wziewną, upewnij się, że otwór nie odsłania personelu powyżej klatki piersiowej.
  8. Przekręć regulatory butli gazowych do pozycji zamkniętej, aby zatrzymać przepływ gazu do reaktora. Zamknij przesłonę dygestorium i odczekaj 5 min, aż dygestorium usunie gazy korozyjne, przed pobraniem próbek z kultury w fotobioreaktorze.
  9. Pobierz próbkę wewnątrz dygestorium, otwierając port płyty nagłownej i używając sterylnej pipety serologicznej lub odsysając kulturę do strzykawki przez port inokulacyjny/pobierny. Zabezpiecz porty fotobioreaktora przed otwarciem butli gazowych i wznowieniem eksperymentu.

5. Pomiar produktywności biomasy mikroalg

  1. Należy wykorzystać krzywą kalibracyjną, aby powiązać pomiary OD750 kultury mikroalg z stężeniami wysuszonej biomasy mikroalg.
    1. Przygotować kilka kolb (minimum: 4, minimalna objętość robocza: 500 mL) ze sterylną pożywką dla mikroalg i zaszczepić je badanym gatunkiem (np. S. obliquus w niniejszym badaniu).
    2. Pomiar OD750 kultury prowadzić do momentu osiągnięcia fazy wzrostu wykładniczego, a następnie niezwłocznie pobrać próbki z kolb poprzez przefiltrowanie znanych objętości (minimum 100 mL) zawartości przez membranę filtracyjną 0,45 μm o znanej masie. Do podtrzymywania biomasy i filtrów podczas suszenia należy używać przykrytych aluminiowych łódeczek wagowych lub naczyń szklanych.
    3. Zważyć biomasę wraz z filtrami po suszeniu przez około 18−24 h w suszarce w temperaturze 80−100 °C. Aby zweryfikować całkowite wysuszenie, należy wykonać pomiar ponownie po dodatkowych 2−3 h, aby sprawdzić, czy masa się ustabilizowała.
    4. Odjąć masę filtra od łącznej masy biomasy i filtra, aby obliczyć masę samej biomasy.
    5. Wykreślić krzywą kalibracyjną, nanosząc zmierzone wartości OD750 w funkcji stężenia biomasy (masa biomasy podzielona przez objętość przefiltrowanej kultury) i dopasować dane za pomocą regresji liniowej.

6. Modelowanie produktywności biomasy i obliczenia szybkości

  1. Oblicz stężenia biomasy w eksperymencie z pomiarów OD750, korzystając z regresji liniowej krzywej kalibracyjnej (wyznaczonej w sekcji 5).
  2. Dopasuj dane wzrostu mikroalg w kulturze okresowej od fazy adaptacyjnej, przez wykładniczą, aż do stacjonarnej za pomocą regresji logistycznej (Równanie 2) w oprogramowaniu do tworzenia wykresów i analizy statystycznej (Tabela materiałów):
    figure-protocol-2 (2)
    gdzie L to maksymalna wartość stężenia biomasy na krzywej, k to względna stromość fazy wykładniczej (czas-1), xo to czas w punkcie środkowym krzywej sigmoidalnej, a x to czas.
    1. Wprowadź ręcznie powyższe równanie logistyczne. Wybierz opcję Fit a curve with nonlinear regression w zakładce Analysis w programie. Po lewej stronie okna Parameters: Nonlinear Regression wybierz Create new equation z rozwijanego menu New. Jako typ równania wybierz domyślne równanie jawne (explicit equation), nazwij nową funkcję i zdefiniuj ją jako Y = L/(1+ exp(-k*(x-b))), gdzie b reprezentuje xo.
  3. Oblicz całkowitą produktywność biomasy w kulturze okresowej mikroalg, dzieląc różnicę między końcowym a początkowym stężeniem biomasy przez różnicę między czasem końcowym a początkowym.
  4. Oblicz maksymalną produktywność biomasy w kulturze okresowej mikroalg z pochodnej Równania 2 (Równanie 3) w punkcie środkowym sigmoidy, gdy x = xo.
    figure-protocol-3 (3)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Krzywa kalibracyjna dla zielonych mikroalg S. obliquus, zbieranych w fazie wykładniczej, została opracowana z wykorzystaniem OD750 oraz stężeń suchej biomasy (Rysunek 2). Regresja liniowa wykazała wartość R2 równą 0,9996.

Kulturę S. obliquus rozpoczęto w kolbie Erlenmeyera o pojemności 250 mL z kultury przechowywanej na schłodzonej płytce z agarem. Mikroalgę zaszczepiono w pożywce 3N-BBM z buforem HEPES 10 mM i napowietrzano...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Eksperymenty z wsadowym fotobioreaktorem aksenicznym z regulowanym pH, temperaturą, natężeniem przepływu i stężeniem gazu zapewniają znaczące wyniki, eliminując zanieczyszczenie niedocelowymi szczepami glonów i zmienność warunków hodowli. Dokładną kinetykę wzrostu czystych kultur można uzyskać nawet w obecności gazów korozyjnych (CO2, SO2, NO2), które służą jako składniki odżywcze, przekształcając gazy odlotowe w cenny produkt, taki jak pasza dla zwierząt.

Prze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ten materiał jest oparty na pracy wspieranej przez National Science Foundation Graduate Research Fellowship w ramach grantu nr 1546595. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy National Science Foundation. Prace były również wspierane przez grant badawczy University of Iowa Graduate and Professional Student Government oraz University of Iowa Foundation, Allen S. Henry endowment. Badania prowadzono w Laboratorium Fitotechnologii im. W. M. Kecka. Autorzy pragną podziękować pracownikom elektrowni Uniwersytetu Iowa, a w szczególności Markowi Maxwellowi, za ekspertyzę i wsparcie finansowe dla symulowanych spalin. Autorzy chcieliby również podziękować Emily Moore za jej pomoc w pobieraniu próbek i analizie oraz Emily Greene za jej pomoc i udział w filmie z protokołem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Biostat BioreaktorA Sartorius Stedim2-litrowy bioreaktor do fermentacji mikrobiologicznej; przeznaczony do sterylizacji w autoklawie; kontrola pH, temperatury, natężenia przepływu gazu
Test sprawności GAZ NO2GraingerGAS34L-112-5Gaz kalibracyjny do detektora gazu MultiRAE
Test sprawności O2, CO, gaz LELGaz GraingerGAS44ES-301AGaz kalibracyjny do Detektor gazu MultiRAE
Test sprawności SO2 gazGraingerGAS34L-175-5Gaz kalibracyjny do detektora gazu MultiRAE
Rurka odporna na korozję do gazu NO2SwagelokSS-XT4TA4TA4-6Wąż rdzeniowy PTFE z gładkim otworem serii X— Oplot z włókna i wzmocnienie oplotu 304 SS
Odporne na korozję rurki do gazu SO2< / sub>Zasilanie QC120325Wzmocnione plecione rurki z naturalnej pianki EVA - 1/4" ID
cozIR 100% CO2 metrGas Sensing Solutions Ltd.CM-0121 w CO2meter.commierniku CO2 do stężeń do 100%
cozIR 20% miernika CO2Gas Sensing Solutions Ltd.CM-0123 przy CO2meter.commierniku CO2 dla stężeń do 20%
Durapore Filtr membranowy, 0,45 μ mMillipore SigmaHVLP04700Hydrofilowy, biały zwykły, średnica 47 mm, 0,45 μ m wielkość porów, filtry membranowe PVFD
Reduktory do butli gazowychPraxairPRS 40221331-660Jednostopniowy regulator ze stali nierdzewnej skonfigurowany do montażu wylotu 0-15 psi Zawór membranowy z gwintem 1/4" MNPT, Stal nierdzewna odporna na korozję spowodowaną NOx i SOx
Butle gazowePraxairUlta-zero powietrza, CO2 o wysokiej czystości lub niestandardowy skład gazuW zależności od celów badania
System monitorowania i wykrywania nieszczelnościgazów RAE Systems firmy HoneywellMAB3000235E020Model pompowy, który wykrywa O2, SO2, NO2, CO i LEL
Oprogramowanie GasLabGasLabv2.0.8.14Oprogramowanie do pomiarów miernika CO2 i rejestracji danych Króciec
GraingerPozycja # 3DTN3Służy do adaptacji regulatorów do rur, Stal nierdzewna odporna na korozję od NOx i SOx
Miernik K30 1% CO2SenseairCM-0024 w CO2meter.comMiernik CO2 dla stężeń mniejszych niż 1%
Panele do uprawy LEDRoleadroHY-MD-D169-SCzerwone i niebieskie panele świetlne LED
Sonda tlenu rozpuszczonego MemosensEndress+ HauserCOS22D-19M6/0Autoklawowalna (ze środkami ostrożności) sonda tlenu rozpuszczonego do bioreaktora
Sonda pH MemosensEndress+ HauserCPS71D-7TB41Możliwość sterylizacji w autoklawie (z zachowaniem środków ostrożności) Sonda pH do bioreaktora
Piekarnik, seria Isotemp 500Fisher Scientific13246516GAQMały piec do suszenia
Oprogramowanie Prism GraphPadOprogramowanie GraphPadw wersji 7.03 lub 8.0.1Oprogramowanie do tworzenia wykresów do organizacji danych, analizy danych i wykresów o jakości publikacji
Łącznik trzpienia do wężaSwagelokSS-4-HC-A-6MTAZłącze węża ze stali nierdzewnej, adapter rurki 6 mm, 1/4 cala Średnica węża
Rurki do przenoszenia rozcieńczonego kwasu/zasadyAllied Electronics and Automation6678441Silikonowe rurki procesowe TP; 1.6mm Rozmiar otworu; 3000mm Długość; Przewody dopuszczone do kontaktu z żywnością
, transfer gazuAllied Electronics and Automation6678444Silikonowe rurki procesowe TP; 3.2mm Rozmiar otworu; 3000mm długości; Klasa spożywcza
węża

Bibliografia

  1. Obom, K. M., Magno, A., Cummings, P. J. Operation of a Benchtop Bioreactor. Journal of Visualized Experiments. (79), e50582(2013).
  2. Cheah, W. Y., Pau Loke, S., Chang, J. -S., Ling, T., Juan, J. C. Biosequestration of atmospheric CO2 and flue gas-containing CO2 by microalgae. Bioresource Technology. 184, 190-201 (2014).
  3. Xu, L., Weathers, P. J., Xiong, X. -R., Liu, C. -Z. Microalgal bioreactors: Challenges and opportunities. Engineering in Life Sciences. 9 (3), 178-189 (2009).
  4. Tsang, Y. F. Photobioreactors: Advancements, Applications and Research. , Nova Science Publishers, Inc. Hauppauge, NY. (2017).
  5. Molitor, H. R., Moore, E. J., Schnoor, J. L. Maximum CO2 Utilization by Nutritious Microalgae. ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 7 (10), 9474-9479 (2019).
  6. Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microbial Cell Factories. 17 (1), 36(2018).
  7. Benemann, J. R. Hydrogen production by microalgae. Journal of Applied Phycology. 12 (3), 291-300 (2000).
  8. AIHA. IH MOD. , Available from: https://aiha.org/public-resources/consumer-resources/topics-of-interest/ih-apps-tools (2019).
  9. Centers for Disease Control and Prevention, Immediately Dangerous To Life or Health (IDLH) Values. The National Institute for Occupational Safety and Health. , Available from: https://www.cdc.gov/niosh/idlh/intridl4.html (2019).
  10. Nakanishi, K., Deuchi, K., Kuwano, K. Cryopreservation of four valuable strains of microalgae, including viability and characteristics during 15 of cryostorage. Journal of Applied Phycology. 24 (6), 1381-1385 (2012).
  11. Bischoff, H. W., Bold, H. C. Some soil algae from Enchanted Rock and related algal species. , University of Texas. Austin, Texas. (1963).
  12. Mata, T. M., Martins, A. A., Caetano, N. S. Microalgae for biodiesel production and other applications: A review. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 14 (1), 217-232 (2010).
  13. Wood, A. M., Everroad, R. C., Wingard, L. M. Measuring growth rates in microalgal cultures. Algal Culturing Techniques. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. Burlington, MA. 270-272 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Montaż fotobioreaktorapostępowanie z gazami korozyjnymiwykrywanie wycieków gazupomiary OD750model wzrostu logistycznegobezpieczeństwo w dygestoriumsystem monitorowania gazówrurki odporne na ciśnienie
Uprawa mikroalg i kwantyfikacja biomasy w fotobioreaktorze laboratoryjnym z korozyjnymi gazami spalinowymi
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.