Zależna od NF-κB aktywacja lucyferazy i kwantyfikacja ekspresji genów w komórkach hodowli tkankowej zakażonych salmonellą

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do szybkiego i łatwego pomiaru czynnika jądrowego kappa-light-chain-enhancer aktywacji aktywowanych komórek B (NF-κB) w liniach komórkowych wyrażających NF-κB::lucyferazy reporterowe, poprzez pomiary luminescencji w lizacie komórkowym. Dodatkowo ekspresję genów określa się za pomocą RT-qPCR wyizolowanego z komórek zakażonych Salmonellą Typhimurium.

Streszczenie

Dimeryczny czynnik transkrypcyjny NF-κB reguluje wiele szlaków odpowiedzi komórkowych, w tym szlaki zapalne, indukując ekspresję różnych cytokin i chemokin. NF-κB ulega konstytutywnej ekspresji i jest sekwestrowany w cytozolu przez białkowy czynnik jądrowy białka hamującego wzmacniacza genu polipeptydu kappa light w inhibitorze limfocytów B, alfa (IκBα). Aktywacja NF-κB wymaga degradacji IκBα, która następnie uwidacznia sygnał lokalizacji jądrowej na NF-κB i sprzyja jego transportowi do jądra. Po dostaniu się do jądra NF-κB wiąże się z regionem promotora docelowych genów NF-κB, takich jak interleukina 6 (IL-6) i IL-23, aby promować ich ekspresję.

Aktywacja NF-κB następuje niezależnie od transkrypcji czy translacji. W związku z tym stan aktywacji NF-κB musi być mierzony albo poprzez ilościowe określenie NF-κB specyficznie w jądrze, albo poprzez ilościowe określenie ekspresji docelowych genów NF-κB. W tym protokole komórki stabilnie transfekowane konstruktem reporterowym NF-κB::lucyferazy są testowane pod kątem aktywacji NF-κB przy użyciu technik hodowli tkankowej in vitro. Komórki te są zakażone Salmonellą Typhimurium w celu aktywacji NF-κB, który przemieszcza się do jądra i wiąże się z miejscami κB w regionie promotorowym lucyferazy, indukując jego ekspresję. Komórki są poddawane lizie i analizowane za pomocą systemu testów lucyferazy. Ilość lucyferazy wytwarzanej przez komórki koreluje z intensywnością sygnału luminescencji, który jest wykrywany przez czytnik płytkowy. Sygnał luminescencyjny generowany przez tę procedurę zapewnia szybką i bardzo czułą metodę oceny aktywacji NF-κB w różnych warunkach. Protokół ten wykorzystuje również ilościową reakcję PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) do wykrywania względnych poziomów mRNA, które wskazują na ekspresję genów.

Wprowadzenie

Rodzina białek czynnika jądrowego κB (NF-κB) jest ważnym aktywatorem transkrypcji, który reguluje ekspresję genów w różnych szlakach biologicznych. Aktywacja NF-κB indukuje transkrypcję docelowych genów, z których wiele jest ważnych dla odpowiedzi immunologicznej i zapalnej, proliferacji komórek, reakcji na stres i progresji raka^1,2. NF-κB odgrywa integralną rolę we wczesnym etapie stanu zapalnego w celu usunięcia patogenu. Biorąc pod uwagę wiele procesów biologicznych, w których pośredniczy aktywacja NF-κB, zakłócenia w jego sygnalizacji mogą mieć poważne konsekwencje dla zdrowia i choroby. Mutacje powodujące utratę funkcji w sygnalizacji NF-κB są związane z kilkoma fenotypami niedoboru odporności, podczas gdy mutacje związane ze wzmocnieniem funkcji są związane z kilkoma typami nowotworów, w tym chłoniakami z komórek B i rakiem piersi³. Ponadto wykazano, że wiele patogenów bezpośrednio moduluje stan aktywacji NF-κB poprzez ekspresję czynników wirulencji^4,5^,6,7.

Aktywacja NF-κB jest znana jako konsekwencja wielu zmiennych bodźców, w tym produktów bakteryjnych, takich jak lipopolisacharydy (LPS), flagelina i peptydoglikany znane jako wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP). Te PAMP są wykrywane przez receptory rozpoznawania wzorców (PRR), takie jak receptory Toll-podobne (TLR) i receptory podobne do Nod (NLR), co prowadzi do aktywacji NF-κB, a następnie ekspresji szeregu genów zapalnych zależnych od NF-κB⁸. Oprócz aktywacji PRR przez PAMP, inne produkty bakteryjne, takie jak bakteryjne białka efektorowe, mogą indukować aktywację NF-κB. Co ciekawe, bakterie wykazują również ekspresję białek efektorowych, które aktywnie osłabiają szlak NF-κB i zwiększają ich patogenność, co podkreśla znaczenie NF-κB jako niezbędnego mediatora odporności⁹.

Istnieje pięć różnych podjednostek, które tworzą dimery NF-κB; p50, p52, RelA (p65), RelB i cRel. Dwa główne heterodimery NF-κB to dimery p50:RelA i p52:RelB. Aktywowane dimery NF-κB wiążą się z miejscami DNA, znanymi jako miejsca κB, w regionach promotora i wzmacniacza różnych genów docelowych. W normalnych warunkach homeostatycznych NF-κB oddziałuje z rodziną białek inhibitorowych znanych jako białka IκB, pozostając nieaktywnymi. Po stymulacji IκB jest fosforylowany przez kinazę IκB (IKK), co pozwala na ukierunkowanie go na ubikwitynację, a następnie degradację. Degradacja IκB aktywuje NF-κB poprzez ujawnienie sygnału lokalizacji jądrowej. NF-κB następnie przemieszcza się do jądra, gdzie wiąże miejsca κB w regionie promotorowym genów docelowych i promuje transkrypcję¹⁰. Tak więc aktywacja NF-κB zwiększa ekspresję mRNA docelowych genów NF-κB, a zmianę tę można zmierzyć za pomocą testów kwantyfikacji RNA, takich jak RT-qPCR¹¹.

Istnieje kilka metod, które są powszechnie używane do pomiaru aktywacji NF-κB, w tym testy przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA), translokacji jądrowej i testy reporterowe genów. EMSA służy do wykrywania kompleksów białkowych z kwasami nukleinowymi. Stymulowane komórki są frakcjonowane w celu wyizolowania białek jądrowych, w tym translokowanego NF-κB, który jest następnie inkubowany z znakowanymi radioaktywnie nukleotydami zawierającymi domenę wiążącą NF-κB. Próbki są umieszczane w żelu i obrazowane za pomocą autoradiografii ³²kwasów nukleinowych znakowanych P. Jeśli NF-κB jest obecny we frakcji białkowej, zwiąże nukleotydy, które będą wolniej migrować przez żel i będą obecne jako dyskretne prążki. Frakcje jądrowe komórek pozbawionych aktywowanego NF-κB (np. Niestymulowane komórki kontrolne) nie wytwarzają prążków, ponieważ nukleotydy migrują szybciej do końca żelu. Główną wadą tej metody jest to, że jest ona w dużej mierze ilościowa w sensie binarnym (tj. włączona lub wyłączona) i nie oddaje odpowiednio znaczących różnic w zdolności wiązania NF-κB. Ponadto metoda ta nie uwzględnia struktur chromatyny, które są funkcjonalnie ważne dla docelowych genów NF-κB^12,13.

Podobnie jak w poprzedniej metodzie, istnieje test "bez przesunięcia", w którym płytki wielodołkowe są pokryte nukleotydami zawierającymi sekwencję wiążącą NF-κB. Po potraktowaniu komórek frakcjami jądrowymi białka, NF-κB zwiąże się z nukleotydami związanymi ze studnią. Następnie dodawane są przeciwciała anty-NF-κB, które będą oddziaływać ze związanym NF-κB i wytwarzać sygnał kolorymetryczny proporcjonalny do ilości NF-κB, wskazujący stopień aktywacji NF-κB. Metoda ta jest korzystniejsza w stosunku do EMSA, ponieważ nie wymaga znakowanych radioizotopowo kwasów nukleinowych i jest ilościowa. Jednak zastrzeżenie tej metody polega na tym, że ponownie nie różnicuje ona stanów chromatyny docelowych genów NF-κB¹⁴.

Inną metodą, za pomocą której można wykryć aktywację NF-κB, jest immunoprecypitacja chromatyny (ChIP), dzięki której DNA i oddziałujące białka są sieciowane formaldehydem i immunoprecypitowane specyficznymi przeciwciałami anty-NF-κB. Specyficzne fragmenty nukleotydów są następnie oczyszczane i identyfikowane poprzez amplifikację PCR lub bezpośrednie sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości. Wyniki uzyskane tą metodą dostarczają półilościowych wyników aktywności wiązania NF-κB z genami docelowymi. Jednak wyniki są w dużym stopniu zależne od warunków utrwalania i procesów oczyszczania na każdym etapie¹⁵.

W testach translokacji jądrowej komórki są stymulowane do wywołania aktywacji NF-κB, a następnie utrwalane. Przeciwciała anty-p65 są dodawane do utrwalonych komórek. Alternatywnie, sama podjednostka p65 może być oznaczona peptydem fluorescencyjnym, takim jak zielony zielony fluorescencyjny (GFP). W obu przypadkach immunofluorescencja pozwoli na obrazowanie lokalizacji p65 w celu określenia dystrybucji komórkowej. Mierząc proporcję białka zlokalizowanego cytozolowo i jądrowo, badacze mogą określić względny stan aktywacji NF-κB. Wadą tej metody jest to, że immunofluorescencja jest stosunkowo czasochłonna, wymaga drogich przeciwciał i wymaga stosunkowo większej wiedzy technicznej¹⁶.

Geny reporterowe są powszechnie używanymi narzędziami do badania wzorców regulacji i ekspresji interesującego genu. Zazwyczaj geny reporterowe są konstruowane z sekwencji promotorowej genu będącego przedmiotem zainteresowania połączonej z genem kodującym łatwo wykrywalne białko. Białka o aktywności enzymatycznej, fluorescencji lub właściwościach luminescencyjnych są powszechnie wybierane ze względu na ich zdolność do oznaczania i oznaczania ilościowego. W ten sposób odczyt (np. luminescencja, fluorescencja) służy jako sygnał do wykrywania ekspresji genu. Te konstrukty reporterowe można następnie wprowadzić do różnych typów komórek, takich jak komórki nabłonkowe lub makrofagi.

Opisane w protokole jest użycie sklonowanej linii komórkowej HeLa (HeLa 57A), która jest stabilnie transfekowana reporterem lucyferazy zawierającym trzy kopie konsensusu κB regionu promotora łańcucha κ immunoglobuliny¹⁷. Ekspresja lucyferazy jest zależna od aktywacji NF-κB, która następuje po stymulacji komórek. Stymulowane komórki są łatwo poddawane lizie za pomocą buforu do lizy komórek znajdującego się w zestawie do oznaczania lucyferazy. Część lizatu komórkowego jest następnie mieszana z buforem testowym lucyferazy, który zawiera lucyferynę. Lucyferyna jest substratem lucyferazy i jest niezbędna do wytwarzania światła w obecności lucyferazy. Po połączeniu buforu testowego z lizatem, roztwór będzie emitował światło w procesie znanym jako luminescencja. Ilość wytwarzanego światła, podawana w lumenach, jest proporcjonalna do ilości lucyferazy obecnej w lizacie i służy jako miara aktywacji NF-κB. Odczyty strumienia świetlnego są interpretowane w porównaniu z niestymulowanym wzorcem w celu uwzględnienia podstawowej aktywności NF-κB, a sam sygnał jest stabilny przez kilka minut, co pozwala na wiarygodny pomiar. Ponadto linia komórkowa HeLa 57A jest stabilnie transfekowana reporterem β-galaktozydazy niezależnym od NF-κB. Reporter β-galaktozydazy ulega konstytutywnej ekspresji, a aktywność β-galaktozydazy można zmierzyć w celu kontrolowania żywotności komórek lub zmienności liczby komórek¹⁷. Wartości lucyferazy można następnie dostosować do wartości β-galaktozydazy i podać jako wzrost krotności w stosunku do niestymulowanych komórek kontrolnych.

Ponieważ NF-κB jest czynnikiem transkrypcyjnym odpowiedzialnym za zwiększoną ekspresję genów docelowych zależnych od NF-κB, kolejnym eksperymentem mającym na celu kontrolę zwiększonej ekspresji genu zależnej od NF-κB jest ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR). RT-qPCR jest bardzo czułą metodą, za pomocą której zmiany w ekspresji genów można określić ilościowo w kilku rzędach wielkości. Stymulowane i kontrolne komórki są zbierane na RNA poprzez ekstrakcję fenolowo-chloroformową. Po rozdzieleniu faz RNA jest ekstrahowany jako główny składnik warstwy wodnej. RNA jest następnie wytrącane i przemywane w celu wytworzenia czystej osadki. Osad ten jest następnie odtwarzany i dalej oczyszczany z zanieczyszczonego DNA poprzez obróbkę DNazą. Czyste RNA jest następnie poddawane odwrotnej transkrypcji w celu utworzenia komplementarnego DNA (cDNA). To cDNA można następnie przeanalizować za pomocą ilościowych technik PCR, w których obfitość określonej sekwencji mRNA jest określana ilościowo w celu określenia ekspresji genów. Technika ta nie wyjaśnia kontroli translacyjnej, modyfikacji potranslacyjnej, obfitości białek ani aktywności białek. Jednak wiele genów, szczególnie tych zaangażowanych w procesy prozapalne, jest regulowanych przez NF-κB, a ich obfitość mRNA wskazuje na ich ekspresję.

Proponowana tutaj metoda wykorzystuje szybki i prosty sposób, dzięki któremu aktywacja NF-κB może być wykryta za pomocą testów luminescencyjnych lizatu komórkowego. RT-qPCR ekspresji docelowego genu NF-κB może być stosowany do ilościowego określania ekspresji poszczególnych genów, a także walidacji funkcjonalnej aktywności aktywacji NF-κB. Głównymi zaletami takiego systemu są jego prostota i szybkość, co pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe w zakresie warunków, które modulują aktywację NF-κB. Protokół ten jest odpowiedni dla innych linii komórkowych wykazujących ekspresję reportera NF-κB::lucyferazy i został zademonstrowany w stabilnie transfekowanych komórkach RAW264.7¹⁸. Czas potrzebny do obsługi próbek, począwszy od lizy komórek do wygenerowania sygnału luminescencyjnego, jest minimalny i zajmuje około godziny. Pomiar NF-κB wymaga jedynie podstawowego sprzętu laboratoryjnego, takiego jak nieprzezroczyste płytki, czytnik płytek zdolny do pomiaru luminescencji oraz proste oprogramowanie do analizy danych, takie jak arkusz kalkulacyjny.

Protokół

1. Przekazywanie i wysiewanie komórek

1. Utrzymuj komórki HeLa 57A w kolbie o średnicy 75^cm2 zawierającej 10 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 5% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂ .
2. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych i przemyć 1 ml 0,05% roztworu trypsyny-EDTA. Odessać trypsynę i zastąpić ją dodatkowym 1 ml. Umieścić kolbę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 4-5 minut, aby umożliwić odłączenie komórek od kolby.
3. Dodać 9 ml pożywki do hodowli komórkowych i delikatnie umyć dno kolby kilka razy, aby usunąć komórki i utworzyć jednorodną zawiesinę.
4. Rozcieńczyć komórki HeLa 57A w stosunku 1:6 lub 1:8 w świeżej pożywce i rozsiać nasiona do nowych kolb. Przenikaj komórki, gdy są zlewające się w 90% lub co trzy dni i utrzymuj komórki na poziomie co najmniej 25% konfluencji.
5. Dzień przed stymulacją komórek trypsynizuj komórki HeLa 57A i zawieś w 10 ml pożywki wzrostowej. Policz komórki w zawiesinie za pomocą hemocytometru i użyj pożywki wzrostowej do rozcieńczenia komórek do końcowego stężenia 2,5 x 10⁵ komórek/ml w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
6. Przenieś 250 μl zawiesiny komórek (~6,25 x 10⁴ komórki) do każdego dołka 48-dołkowej płytki. Okresowo zakrywaj i obracaj stożkową rurkę, aby zapewnić jednorodną zawiesinę komórek. Delikatnie postukaj w płytkę z boku, aby upewnić się, że komórki równomiernie rozprowadzają się w studzienkach.
7. Przenieść płytkę do temperatury 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂ i pozwolić komórkom przyczepić się i rosnąć przez noc.

2. Przygotowanie bakterii

1. Dwa dni przed infekcją rozłóż zamrożone zapasy Salmonelli na płytkach agarowych LB, aby wytworzyć pojedyncze kolonie. Przenieść płytki do inkubatora ustawionego na 37 °C i pozostawić na nocny wzrost.
2. Na dzień przed zakażeniem dodaj 3 ml bulionu lizogenicznego (LB) do sterylnych probówek do hodowli bakterii, dodając odpowiednie antybiotyki do pożywki.
3. Używając sterylnej pętli inokulacyjnej, wybierz pojedynczą kolonię z prążkowanych kultur bakteryjnych i przyłóż pętlę do pożywki LB. Po zaszczepieniu zakryj probówki i wyrzuć pętlę.
4. Umieścić probówki w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na 37 °C, 180 obr./min i pozostawić na noc do wzrostu.
5. W dniu zakażenia należy pobrać z inkubatora nocne kultury bakterii.
6. Przygotuj probówki do subhodowli, dodając 3 ml świeżego LB, zawierającego antybiotyki, jeśli to konieczne.
7. Przenieść 30 μl nocnej kultury bakteryjnej (rozcieńczenie 1 na 100) do świeżo przygotowanej pożywki. Umieścić probówki w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na 37 °C na 3 godziny.
8. Po 3 godzinnej inkubacji przenieś 1 ml sterylnego bulionu LB do plastikowej kuwety, która posłuży jako ślepa próba. Przenieść 900 μl LB do innych kuwet, które mają być użyte do analizy próbki.
9. Przenieś 100 μl subkultury bakteryjnej do kuwety zawierającej 900 μl LB i kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Powtórzyć tę czynność dla każdej zawiesiny bakteryjnej.
10. Włącz spektrofotometr, aby zmierzyć gęstość optyczną (OD) kultur bakteryjnych o długości fali 600 nm (OD₆₀₀).
11. Umieść ślepą próbę w spektrofotometrze. Zwróć uwagę na orientację, ponieważ u góry powinien znajdować się znak wskazujący na to.
12. Zamknij pokrywę i naciśnij przycisk Blank na spektrofotometrze, aby uzyskać absorbancję tła.
13. Zastąp pustą kuwetę próbną kuwetą w tej samej orientacji i naciśnij Odczyt.
14. Zapisz wartości OD₆₀₀ tych próbek. Pomnóż tę wartość przez 10, aby uwzględnić współczynnik rozcieńczenia.
15. Rozcieńczyć subkulturę bakteryjną świeżym LB, aby osiągnąć wartość absorbancji około 1,0, co w przybliżeniu odpowiada 1 x 10⁹ jtk/ml. Rozcieńczyć tę zawiesinę w stosunku 1:10 w kuwecie i zmierzyć absorbancję - co powinno dać wartość ~0,1.
16. W nowej probówce dodać odpowiednią objętość rozcieńczonej subkultury do świeżego LB, aby uzyskać zawiesinę 1 x 10⁸ jtk/ml do użycia jako inokulum.
17. Przygotować seryjne rozcieńczenia inokulum, przenosząc 50 μl zawiesiny bakteryjnej do probówki zawierającej 450 μl sterylnego PBS (10-krotne rozcieńczenie), aż do uzyskania końcowego rozcieńczenia około^10-2 jtk/ml.
18. Przenieść 100 μl dwóch najniższych rozcieńczeń (10² i 10³ odpowiadające odpowiednio 10 i 100 jednostkom tworzącym kolonie) na płytkę agarową LB i rozprowadzić zawiesinę za pomocą rozsiewacza komórek w celu uzyskania pojedynczych kolonii. Przenieść te płytki do inkubatora o temperaturze 37 °C i inkubować przez noc.
19. Następnego dnia policz kolonie i oblicz stężenie bakterii w początkowym inokulum, aby określić rzeczywiste stężenie inokulum.

3. Zakażenie komórek

UWAGA: W tym momencie komórki powinny być w około 90% zbieżności. W przypadku komórek HeLa 57A w 48-dołkowej płytce jest to około 1 x 10⁵ komórek na dołek. Komórki zostaną zakażone wielokrotnością infekcji (MOI) wynoszącą 10 lub 10⁶ jtk/studzienkę.

1. Oznacz pokrywkę płytki zgodnie z warunkami infekcji, które będą stosowane dla każdej studzienki, przy czym każdy warunek należy wykonać w trzech egzemplarzach.
2. Dodać 10 μl inokulum do odpowiednich studzienek. Dodać 10 μl sterylnego LB do niezakażonych studzienek kontrolnych.
3. Aby zsynchronizować czas infekcji, umieść płytkę w wirówce stołowej i wiruj z prędkością 500 x g przez 5 minut, upewniając się, że płytka jest zrównoważona.
4. Przenieść zakażone komórki do inkubatora o stężeniu 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
5. Umieścić podwielokrotność pożywki do hodowli komórkowych w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C w celu użycia w następnym kroku.
6. Godzinę po zakażeniu wyjmij pożywkę do hodowli komórkowych z łaźni wodnej i przetrzyj zewnętrzną powierzchnię 70% etanolem. Przenieś płytkę do hodowli tkankowej do szafki bezpieczeństwa biologicznego.
7. Stosując technikę sterylną, odessać pożywkę ze studzienek i zastąpić 250 μl świeżej, ciepłej pożywki do hodowli komórkowych.
8. Włożyć płytki do inkubatora o stężeniu 5%_{CO2 w} temperaturze 37 °C przez dodatkowe 4 godziny.
9. Wyjąć płytki z inkubatora CO₂ i odessać pożywkę ze studzienek. W celu analizy lucyferazy przejdź do kroku 4.1. W przypadku izolacji RNA przejdź do kroku 5.1.

4. Analiza lucyferazy

1. Dodaj 100 μl 1x buforu do lizy komórek do studzienek. Może być konieczne uprzednie rozcieńczenie buforu do stężenia roboczego, w zależności od odczynnika.
2. Przenieść płytkę do zamrażarki o temperaturze -80 °C i inkubować przez co najmniej 30 minut, aby zapewnić skuteczną lizę komórek.
3. Umieść płytkę zawierającą zamrożony lizat komórkowy na stole do rozmrożenia i przygotuj odczynniki substratu lucyferazy zgodnie z zaleceniami producenta.
4. Pozwól, aby odczynniki substratu lucyferazy zrównoważyły się do temperatury pokojowej.
5. Włącz czytnik płytek i otwórz odpowiedni program czytnika. Ustaw urządzenie tak, aby mierzyło luminescencję.
6. Przenieść 10 μl każdej próbki do studzienki na nieprzezroczystej 96-dołkowej płytce.
7. Dodać 50 μl odczynnika do oznaczania lucyferazy za pomocą pipety wielokanałowej do każdego dołka nieprzezroczystej płytki.
8. Delikatnie postukaj w płytkę z boku, aby dobrze wymieszać i upewnij się, że dolna powierzchnia jest pokryta płynem. Umieść tabliczkę w czytniku płytek i rozpocznij czytanie.
9. Skopiuj wartości luminescencji do arkusza kalkulacyjnego i wykreśl wyniki.

5. Izolacja RNA

1. Dodaj 500 μl tiocyjanianu guanidu do każdej studzienki i kilkakrotnie pipetuj w górę iw dół, aby zapewnić całkowitą lizę.
2. Przenieś zawartość do oznaczonej probówki mikrowirówkowej. Utrzymuj próbki na lodzie tak długo, jak to możliwe, aby utrzymać jakość RNA.
3. Ustawić wirówkę stołową na 4 °C i utrzymywać wirówkę w tej temperaturze do końca protokołu.
4. Do każdej probówki z próbką dodać 100 μl chloroformu, szczelnie zakryć i wstrząsać przez 15 s. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
5. Wirować przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. W tym czasie przygotuj się do kolejnego etapu oczyszczania RNA, znakując nowe probówki.
6. Przenieść górną fazę wodną do nowej probówki zawierającej 250 μl izopropanolu, uważając, aby nie naruszyć środkowej lub dolnej warstwy.
7. Niewykorzystany produkt należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C, która może być również wykorzystana do analizy białka. Pozostała warstwa wodna może również służyć jako kopia zapasowa, jeśli RNA będzie potrzebne później.
8. Mieszaninę warstwy wodnej i izopropanolu należy przetworzyć wirowo i pozostawić próbki w temperaturze pokojowej na 10 minut.
9. Odwirować próbki o masie 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
10. Wyjmij probówki z wirówki. Osad RNA tworzy białą osadkę z boku i na dole probówki. Otwórz probówki i ostrożnie usuń supernatant, wylewając go do pojemnika na odpady.
11. Przemyj osad RNA, dodając 500 μl 75% etanolu i wir.
12. Wirować przy 8 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
13. Usunąć supernatant przez wylanie i ponownie umyć granulat 75% etanolem.
14. Wirować przy 8 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
15. Używając pipety o małej objętości (np. 10-200 μl objętości), należy zassać jak najwięcej supernatantu, uważając, aby nie wepchnąć żadnej cieczy z powrotem do probówki ani nie usunąć osadu za pomocą końcówki pipety. Jeśli osad zostanie przemieszczony, odwirować na krótko i ponownie spróbować usunąć supernatant.
    1. Wysuszyć granulki RNA na powietrzu. Jeśli granulki są widoczne dla jakiejkolwiek próbki, okresowo (co 5 minut) sprawdzaj je, czy zmieniają kolor z białego na przezroczysty, wskazując, że są suche. Gdy granulki zaczną stawać się klarowne, dodaj 20 μl ultraczystej, wolnej od RNaz wody, aby rozpuścić RNA.
    2. Jeśli granulki nie były początkowo widoczne dla żadnych próbek, po prostu dodaj ultraczystą wodę 5 minut po usunięciu supernatantu.
16. W celu zwiększenia rozpuszczalności przepuścić roztwór kilka razy przez końcówkę pipety i inkubować przez 10 minut w temperaturze 55-60 °C.

6. Leczenie RNA przez DNazę

1. Aby zachować integralność RNA, przechowuj próbki RNA na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej. W tym czasie 10-krotny bufor DNazy można wyjąć z zamrażarki i pozostawić do rozmrożenia na lodzie.
2. Przygotuj spektrofotometr do analizy próbki, czyszcząc wszystkie powierzchnie do analizy próbki niestrzępiącą się szmatką.
3. Wykonaj pomiar tła przed analizą. W tym celu należy załadować czujnik 1,5 μl tej samej ultraczystej wody, która służy do rozpuszczania granulek RNA. Naciśnij przycisk Czytaj puste miejsce, aby wygenerować odczyt w tle.
4. Użyj niestrzępiącej się szmatki, aby wytrzeć próbkę powierzchni ładowania. Powtórz ten krok po każdym odczycie próbki.
5. Załaduj 1,5 μl zawieszonego RNA do uchwytu próbki i wybierz opcję Odczyt próbki. Powtarzać tę czynność, aż wszystkie próbki zostaną odczytane.
6. Przygotować główną mieszaninę DNazy, łącząc 2,4 μl 10-krotnego buforu DNazy i 1 μl DNazy na próbkę w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Przygotuj miks wzorcowy na dwie dodatkowe objętości.
7. Wymieszaj mieszankę główną, kilkakrotnie przesuwając rurkę. Krótko odwirować probówkę, aby zebrać zawartość na dnie probówki. Dodać 3,4 μl mastermixu do 20 μl próbki RNA. Wymieszaj zawartość, przesuwając i krótko odwiruj, tak jak poprzednio.
8. Przenieść próbki do bloku grzewczego ustawionego na 37 °C na 20 minut. Wyjąć odczynnik inaktywujący DNazę z zamrażarki i rozmrozić w temperaturze pokojowej.
9. Po 20 minutach od umieszczenia próbek na bloku grzewczym należy przenieść próbki do stojaka na probówki umieszczonego na stole roboczym.
10. Delikatnie wymieszać zawartość odczynnika do inaktywacji DNazy. Przenieś 2,6 μl odczynnika do inaktywacji DNazy do probówek zawierających RNA, a następnie przesuń probówki, aby uzyskać jednorodną mieszaninę.
11. Odwirować próbki o masie 12 000 x g przez 1 minutę.
12. Ostrożnie odpipetować supernatant do nowej, oznaczonej probówki.

7. Odwrotna transkrypcja mRNA do cDNA

1. Przygotować mieszankę wzorcową w zależności od ilości próbek plus dwie dodatkowe w celu uwzględnienia strat spowodowanych pipetowaniem (tabela 1). Użyj 1 μg RNA i dodaj_H2Odo objętości 50 μl ogółem.

Odczynnik	Objętość (μL)	Końcowa koncentracja
MgCl2 (25mM)	3.5	1.75 mM
Bufor do odwrotnej transkrypcji (10x)	5	1x
Mieszanina dNTP (10 μM, każda)	2.5	500 nm
heksamerów losowy (100 μM)	1.25	2,5 μM
Multiscribe odwrotna transkryptaza (50 U/μL)	1	1 U/μL
Inhibitor RNazy (20 U/μL)	1.25	1.25 U/μL
RNA (1 μg)		20 ng/uL
H2O	do 50

Tabela 1: Składniki i przepis na główny miks odwrotnej transkrypcji.

2. Szczelnie zakryj próbki i oznacz probówki PCR z boku, ponieważ etykiety na pokrywie można później usunąć z podgrzewanej pokrywy termocyklera. Wymieszaj przez wirowanie.
3. Krótko odwirować probówki do PCR, aby pobrać próbki na dno probówki.
4. Umieść probówki PCR w termocyklerze i uruchom próbki w następujących ustawieniach:
   25 °C przez 10 min, 48 °C przez 30 min, 95 °C przez 5 min, a następnie utrzymać w temperaturze 10 °C.
5. Probówki zawierające nowo zsyntetyzowane cDNA przenieść do zamrażarki o temperaturze -20 °C lub natychmiast użyć w analizie qPCR.

8. Przygotowanie i ładowanie płytki do analizy RT-qPCR

1. Przed rozpoczęciem należy zaplanować konfigurację 384-dołkowej płytki qPCR do analizy próbki.
2. Rozmrozić startery i cDNA na lodzie.
3. Przygotować mieszankę wzorcową (patrz Tabela 2) plus około 10% więcej, aby uwzględnić straty spowodowane pipetowaniem.

Odczynnik	Objętość (μL)
Podkład 10 μM F	1
Podkład 10 μM R	1
Ultraczysty H2O	4
2x SYBR zielony	10

Tabela 2: Składniki i przepis na główną mieszankę qPCR.

4. Zmieszać mieszaninę wzorcową i dozować 8 μl do dołków płytki 384-dołkowej za pomocą pipety powtarzalnej. Próbki będą analizowane w dwóch egzemplarzach dla każdej kombinacji startera i próbki cDNA.
5. Za pomocą pipety P10 (lub mniejszej) przenieś 2 μl cDNA do zduplikowanych studzienek dla każdego zestawu starterów, który ma być analizowany. Wymień końcówki po każdym dołku, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
6. Uszczelnij płytkę, ostrożnie nakładając folię samoprzylepną na powierzchnię, upewniając się, że wszystkie studzienki są zakryte. Dociśnij folię za pomocą łopatki uszczelniającej lub wałka, aby mocno uszczelnić.
7. Umieść płytkę w wirówce, z pustą płytką jako przeciwwagą. Odwirować płytkę o sile 500 x g przez 5 minut.

9. Uruchamianie termocyklera do analizy qPCR

1. Włącz komputer i przyrząd do PCR w czasie rzeczywistym.
2. Otwórz oprogramowanie RT-qPCR i wybierz opcję New Experiment (Nowy eksperyment).
3. Na karcie Konfiguracja wybierz pozycję Właściwości eksperymentu, w której można ustawić parametry przebiegu.
4. Zdefiniuj nazwę eksperymentu, która ustawi nazwę pliku i ustawienia używane do przechowywania wyników.
5. W polu Wybór instrumentu wybierz aktualnie podłączony instrument, który będzie uruchamiał analizę. Wybierz metodę badania porównawczego CT (ΔΔCt).
6. Wybierz SYBR Green Reagents jako fluorescencyjny barwnik DNA, który ma być użyty, i Standard jako prędkość narastania.
7. Upewnij się, że pole obok opcji Uwzględnij krzywą topnienia jest zaznaczone.
8. Na karcie Definiuj przypisz cele (tj. geny do amplifikacji) i próbki (tj. warunki eksperymentalne).
9. Wybierz zakładkę Przypisz. Oznacz studzienki odpowiednimi celami i próbkami, ponieważ odpowiadają one schematowi załadunku płytki 384-dołkowej.
10. Wybierz pozycję Uruchom metodę. Do analizy należy wykorzystać parametry wymienione w (Tabela 3).

	Przytrzymaj scenę		Etap PCR		Etap krzywej topnienia
	Krok 1	Krok 2	Krok 1	Krok 2	Krok 1	Krok 2	Krok 3
Najwyższa temp	50 °C	95 °C	95 °C	60 °C	95 °C	60 °C	95 °C
Godzina	2:00	10:00	0:15	1:00	0:15	1:00	0:15
Gromadzenie danych				tak			tak
Liczba cykli	1x		40x		1x

Tabela 3: Parametry cyklu dla termocyklera.

11. Umieść 384-dołkową płytkę w termocyklerze i rozpocznij analizę.

10. Analiza wyników qPCR metodą Delta-delta Ct (^2-ΔΔCt)

1. Analizuj wyniki uzyskane w reakcji qPCR pod kątem błędów, które mogą zakłócać dalszą analizę. Wiele błędów zostanie automatycznie oznaczonych przez system.
2. W przypadku prawidłowo skonstruowanych podkładów krzywe topnienia powinny mieć tylko jeden pik. Z dalszej analizy należy wykluczyć wszelkie studzienki zawierające krzywą topnienia z więcej niż jednym pikiem.
3. Eksportuj wartości Ct do programu arkusza kalkulacyjnego, aby przeanalizować dane przy użyciu metody ΔΔCt. Podano sugerowany format (tabela 4). Ostatnia kolumna to zmiana wyrażenia krotnego próbki w stosunku do próbek kontrolnych.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. jedni TGL pkt. prospekcja pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. jecia jedni pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

	Gen sprzątania (GAPDH)			Gen zainteresowania (IL6)
	Ct1	Ct2	Ave Ct	Ct1	Ct2	Ave Ct	ΔCt	Ave ΔCt ctrls	ΔΔCt	2^-(ΔΔCt)	Geomean
Sterowanie 1	godz. 15.33	godz. 15.37	godz. 15.35	Godzina 26,81	Godzina 26,91	Do dnia 26,86	Godzina 11.51	Godzina 10,51	godz. 1.00	0,50	1.00
Sterowanie 2	Godzina 16,83	godz. 16.77	godz. 16.80	Godzina 26,89	Dnia 26,92	Godzina 26,91	Dnia 10.11	Godzina 10,51	-0,41	1,33
Sterowanie 3	godz. 17.56	godz. 17.53	godz. 17.54	Godzina 27.38	Godzina 27,56	Godzina 27,47	9,93	Godzina 10,51	-0,59	Godzina 1,50
Zobacz materiał SL1344 1	godz. 15.50	godz. 15.41	godz. 15.45	O godz. 22.15	Godzina 22,13	O godz. 22.14	Klasa 6,69	Godzina 10,51	-3,83	Godzina 14.21	13.23
Zobacz materiał SL1344 2	Godzina 16.02	Godzina 15,98	godz. 16.00	Godzina 23.01	Godzina 22,96	Godzina 22,98	6,98	Godzina 10,51	-3,53	Godzina 11.57
SL1344 3	godz. 17.27	godz. 17.30	godz. 17.28	Godzina 23,99	Dnia 23,98	Dnia 23,98	O godz. 6.70	Godzina 10,51	-3,82	Godzina 14.09
sipA sopB sopE2 1	godz. 15.38	godz. 15.41	godz. 15.39	O godz. 23.31	Godzina 23.09	Godzina 23.20	O godz. 7.80	Godzina 10,51	-2,71	Godzina 6,56	7.29
sipA sopB sopE2 2	Godzina 16.01	Godzina 16.05	Godzina 16.03	Godzina 23,89	Godzina 23,92	Dnia 23,91	7,88	Godzina 10,51	-2,64	Lokal mieszkalny 6,23
sipA sopB sopE2 3	godz. 16.78	godz. 16.78	godz. 16.78	Godzina 24.02	Godzina 24.06	Godzina 24.04	Godzina 7,27	Godzina 10,51	-3,25	Godzina 9,49
sipA sopB sopE2 sopE 1	godz. 15.52	godz. 15.60	15,56	Godzina 27.04	Godzina 27.03	Godzina 27.03	Godzina 11.47	Godzina 10,51	0,96	0,51	0.79
sipA sopB sopE2 sopE 2	15,56	godz. 15.59	godz. 15.57	O godz. 26.37	Godzina 26.42	O godz. 26.39	Godzina 10,82	Godzina 10,51	0,31	0,81
sipA sopB sopE2 sopE 3	15,91	15,92	15,91	O godz. 26.24	Godzina 26.12	Godzina 26,18	Godzina 10,27	Godzina 10,51	-0,25	Pytanie 1,19

Tabela 4: Format analizy danych qPCR.

Wyniki

Test opisany tutaj skupia się na aktywacji czynnika transkrypcyjnego NF-κB za pomocą zależnego od NF-κB reportera lucyferazy, który jest stabilnie transfekowany do linii komórek HeLa. Aktywowany NF-κB przemieszcza się do jądra, gdzie wiąże miejsca wiązania κB genów docelowych, w tym cytokin prozapalnych IL6 i IL23. Ogólny przegląd aktywacji NF-κB przedstawiono na Rysunek 1. Bakteria Gram-ujemna Salmonella enterica serowar Typhimuriu...

Dyskusja

Głównym wkładem opisanego protokołu jest to, że zapewnia on szybką i łatwą metodę wykrywania aktywacji NF-κB w komórkach, co pozwala na wysokoprzepustową analizę wielu stanów stymulujących lub leków wpływających na aktywację NF-κB. W tym miejscu opisujemy protokół aktywacji NF-κB w komórkach HeLa zakażonych Salmonellą. Komórki te mogą być również wykorzystywane do infekcji innymi patogenami, a także do badania wpływu infekcji bakteryjnej na aktywację NF-κB. Ponadto zależna od NF-κB aktywacja lucyferazy w komórka...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Folia samoprzylepna	VWR International	60941-070
Chloroform	Fisher Bioreagents	C298-500
DMEM	Thermo Fisher	11665092
zestaw do leczenia DNAzy	Qiagen	79254
dNTPs	Promega	U1511
Etanol	Fisher Bioreagents	BP2818100	klasy molekularnej
FBS	Sigma-Aldrich	F0926
		HeLa 57A	Ref # 15
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności	Applied Biosystems	4368814
Izopropanol	Odczynniki Fishera	BP26181
Kanamycyna	Bioreaktory Fisher	BP906-5
LB agar	Fisher Bioodczynniki	BP1425-500
Rosół lizogeniczny	Bioodczynniki Fisher	BP1426-500
MgCl2	Fisher Chemical
NanoDrop ND-1000	Thermo Scientific		spektrofotometr
System oznaczania lucyferazy Promega	Promega	E1501	Bufor do lizy komórek i substrat
lucyferynyLosowy Hexamers	Thermo Scientific	SO142
		do przodu GAPDH w czasie rzeczywistym	5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3'Starter
odwrotny			5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3'Starter
do przodu			5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3'W
czasie rzeczywistym Odwrócony starter IL-23	5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'Starter
	Naukowy	bufor EO0381
RT	Promega	A3561
SL1344			Nr ref. # 17
SL1344 Δ sipA sopB::MudJ sopE2::p SB1039			Ref # 18
SL1344 Δ sopE Δ sipA sopB::MudJ sopE2::p SB1039			Ref # 18
SYBR zielony	Applied Biosystems	4309155	2x mastermix
Tri-reagent	Centrum Badań Molekularnych	TR 118	tiocyjanian guanidyny
Trypsyna -EDTA	Thermo Fisher	25300054	0,05% Trypsyna-EDTA
Ultraczysta woda	Bioreagenty	Fisher
Płytka BP248450 dołkowa do PCR	VWR International	89218-294	Płytka 384-dołkowa