Efektywne różnicowanie neuronalne przy użyciu hodowli jednokomórkowej ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Summary

Przedstawiony tutaj jest protokół generowania jednokomórkowej hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i ich późniejszego różnicowania w neuronalne komórki progenitorowe. Protokół jest prosty, solidny, skalowalny i odpowiedni do badań przesiewowych leków i zastosowań w medycynie regeneracyjnej.

Abstract

Różnicowanie in vitro ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) zmieniło zdolność do badania rozwoju człowieka zarówno na poziomie biologicznym, jak i molekularnym oraz dostarczyło komórek do wykorzystania w zastosowaniach regeneracyjnych. Standardowe metody hodowli hESC wykorzystujące hodowlę typu kolonii w celu utrzymania niezróżnicowanych komórek zarodkowych oraz tworzenia ciał zarodkowych (EB) i rozet w celu różnicowania się w różne listki zarodkowe są nieefektywne i czasochłonne. Przedstawiono metodę hodowli jednokomórkowej z wykorzystaniem hESC zamiast hodowli typu kolonijnego. Metoda ta pozwala na utrzymanie cech charakterystycznych niezróżnicowanych komórek macierzystych, w tym ekspresji markerów hESC na poziomach porównywalnych z ludzkimi komórkami macierzystymi. Ponadto w protokole przedstawiono skuteczną metodę generowania neuronalnych komórek progenitorowych (NPC) z pojedynczych komórek hESC, które wytwarzają NPC w ciągu 1 tygodnia. Komórki te wykazują wysoką ekspresję kilku genów markerowych NPC i mogą różnicować się w różne typy komórek nerwowych, w tym neurony dopaminergiczne i astrocyty. Ten system hodowli pojedynczych komórek dla hESC będzie przydatny w badaniu molekularnych mechanizmów tych procesów, badaniach niektórych chorób i badaniach przesiewowych odkrywania leków.

Introduction

Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) mają potencjał do różnicowania się w trzy główne listki zarodkowe, które następnie różnicują się w różne multipotencjalne linie komórek progenitorowych. Te linie następnie dają początek wszystkim typom komórek w ludzkim ciele. Systemy hodowli hESC in vitro zmieniły możliwości badania rozwoju embrionalnego człowieka i posłużyły jako cenne narzędzie do uzyskania nowych informacji na temat tego, w jaki sposób procesy te są regulowane na poziomie biologicznym i molekularnym. Podobnie, badania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) powstałych w wyniku przeprogramowania komórek somatycznych wyizolowanych od ludzkich pacjentów dostarczają nowych informacji na temat różnych chorób. Ponadto komórki progenitorowe i zróżnicowane pochodzące z hESC mogą być przydatne w badaniach obejmujących terapię komórkami macierzystymi i badania przesiewowe leków^1,2,3,4.

hESC mogą być indukowane do różnicowania się w neuronalne komórki progenitorowe (NPC), które są komórkami wielopotencjałowymi o dużej zdolności do samoodnawiania. Następnie komórki te mogą być różnicowane w neurony, astrocyty i oligodendrocyty^5,6. NPC oferują również system komórkowy do badań in vitro biologii neurorozwojowej i różnych chorób neurologicznych. Jednak obecne metody hodowli typu kolonii z udziałem hESC i różnicowania ich w NPC są nieefektywne i często obejmują kokulturę, a także tworzenie ciała zarodka (EB) i rozety^5,7,8,9. Protokoły te wykazują niższe wskaźniki przeżycia i spontanicznego różnicowania oraz są bardziej czasochłonne.

Prezentowany tutaj jest ulepszony i solidny system hodowli, który jest łatwo skalowalny i wykorzystuje hodowlę pojedynczych komórek hESC o wysokiej gęstości¹⁰. Włączenie inhibitora kinazy Roh (ROCK) przyczyniło się do znacznego zwiększenia wydajności przeżycia podczas hodowli pojedynczych typów komórek hESC^{10,11,12,13,14}. W tym systemie hodowli hESC mogą być łatwo utrzymywane i rozwijane. Ponadto protokół przedstawia wydajną metodę generowania NPC z jednokomórkowych hodowli typu hESC, co pozwala na produkcję NPC o wysokiej czystości. Hamowanie szlaków sygnałowych BMP/TGFβ/aktywiny za pomocą inhibitorów ALK skutecznie indukuje różnicowanie jednokomórkowych hESC typu na NPC^15,16, które następnie można skłonić do różnicowania się w funkcjonalne linie nerwowe, takie jak neurony dopaminergiczne i astrocyty.

Podsumowując, protokół hodowli pojedynczych komórek z wykorzystaniem hESC oferuje atrakcyjny model do badania różnicowania tych komórek w różne linie, w tym NPC. Protokół ten jest łatwo skalowalny i dlatego nadaje się do generowania komórek do badań obejmujących terapię regeneracyjną i badania przesiewowe leków.

Protocol

1. Przygotowanie płyt pokrytych matrycą z membraną podstawną z kwalifikacją hESC

1. Roztwór matrycy błony podstawnej zakwalifikowanej do hESC (patrz tabela materiałów) należy powoli rozmrażać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 2–3 godziny lub przez noc, aby uniknąć tworzenia się żelu.
2. Aby przygotować płyty pokryte matrycą membrany podstawnej, należy rozcieńczyć matrycę w zimnym DMEM/F12 do 2% stężenia końcowego. Dobrze wymieszać i pokryć każde zagłębienie płytki 6-dołkowej 1 ml rozcieńczonego roztworu matrycowego.
3. Inkubować płytki pokryte membraną podstawną w temperaturze pokojowej (RT) przez co najmniej 3 godziny lub w temperaturze 4 °C przez noc.
   UWAGA: Płytki z matrycą membrany podstawnej można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień przed usunięciem roztworu matrycy i użyciem płytek.

2. Adaptacja hESC typu kolonii do hodowli pojedynczych komórek hESC

1. Aby przejść przez wolne od karmienia kultury hESC typu kolonii H9 (WA09) wyhodowane na macierzy błony podstawnej, należy zassać pożywkę z dołków (Rysunek 1A)⁹.
2. Przemyć 1x 1 ml DPBS. Dodać 1 ml roztworu do dyspazy (1 j./ml) do dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
3. Usuń papę, delikatnie umyj komórki 2 ml DMEM/F12, usuń pożywkę i dodaj 2 ml DMEM/F12 do każdej płytki.
4. Delikatnie odłącz kolonie, delikatnie pipetując w górę i w dół, a następnie przenieś do probówki o pojemności 15 ml.
5. Odwirować granulki przez 2 minuty przy 370 x g i odessać pożywkę.
6. Aby rozdzielić osady komórkowe na pojedyncze komórki, dodać 2 ml roztworu do oddzielania komórek (stężenie 1x, patrz Tabela Materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
7. Odwirowywać komórki przez 2 minuty przy 370 x g i usunąć roztwór oddzielający.
8. Dodaj świeżą pożywkę mTeSR1 z ludzkim ESC i rozdziel komórki na pojedyncze komórki, delikatnie pipetując w górę iw dół.
9. Aby dostosować hESC typu kolonijnego do hodowli jednokomórkowej, umieść około 1,5–2,0 x 10⁶ hESC w każdym dołku 6-dołkowej płytki pokrytej matrycą błony podstawnej w 2 ml mTeSR1 zawierającej 10 μM inhibitora ROCK przez 24 godziny (Rysunek 1A).
10. Po 24 godzinach należy zastąpić pożywkę hESC świeżym mTeSR1 bez inhibitora ROCK i pozwolić hESC rosnąć jako typ jednokomórkowy przez 3 dni. Zmieniaj medium codziennie.
11. W 4 dniu, gdy kultury osiągną prawie 100% konfluencję, zdysocjuj komórki w roztworze oddzielającym, a następnie ponownie plateruj, jak opisano w kroku 2.6.
    UWAGA: Inhibitor ROCK poprawia przeżywalność komórek podczas początkowych 24 godzin hodowli pojedynczych komórek typu hESC.

3. Formowanie się ciała zarodka i różnicowanie w trzy listki zarodkowe (Rysunek 2)

1. Aby utworzyć EB, należy najpierw ponownie zawiesić komórki w 3 ml pożywki mTeSR1 z 10 μM inhibitorem ROCK w ciągu pierwszych 24 godzin, a następnie inkubować przez noc w 60-milimetrowych naczyniach o niskim nakładzie w inkubatorze o temperaturze 37 °C, aby umożliwić agregację.
2. Po 24 godzinach małe EB przenosi się do probówki o pojemności 15 ml. Pozwól EB osiąść na dnie probówki i delikatnie usuń pożywkę za pomocą pipety. Przenieś EB do pożywki EB (knockout-DMEM uzupełniony 20% zamiennikiem surowicy nokautującej, 1x suplementem glutaminy [patrz Tabela Materiałów], 1% NEAA [aminokwasy endogenne; patrz Tabela Materiałów] i 0,2% β-merkaptoetanolu) i pozwól im się rozwijać w naczyniach o niskim nawiązaniu przez 7 dni. Pożywkę można wymieniać co drugi dzień, jak opisano powyżej (Rysunek 2A).
3. W 7 dniu zbierz EB z szalek i przenieś je do probówki o pojemności 15 ml. Delikatnie usunąć pożywkę pipetą i przenieść EBs na 6-dołkową płytkę pokrytą membraną podstawną.
4. Pozwól EB przyczepić się do płytki i inkubować przez 12 dni w pożywce EB, podczas których rozróżnicują się na trzy listki zarodkowe (Rysunek 2B). Zmieniaj podłoże co drugi dzień.
   UWAGA: Podczas agregacji komórek niska miska z mocowaniem pomaga uniknąć przyłączenia EB.

4. Różnicowanie jednokomórkowych typu hESC na NPC (Rysunek 3)

1. Aby wywołać różnicowanie NPC, należy zdysocjować jednokomórkowe hESC za pomocą 1 ml roztworu oddzielającego (1x) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
2. Odwirowywać komórki przez 2 minuty przy 370 x g i usunąć supernatant roztworu oddzielającego. Dodać 1 ml DMEM/F12 i zawiesić komórki metodą delikatnego pipetowania.
3. Komórki płytkowe na 6-dołkowej płytce pokrytej matrycą błony podstawnej o gęstości 2 x 10 5 komórek/studzienkę w 2 ml mTeSR1 zawierającego 10 μM inhibitora ROCK.
4. Po 24 godzinach zastąp pożywkę hodowlaną pożywką do indukcji neuronalnej (DMEM z 1% B27 minus witamina A) uzupełnioną 1 μM dorsomorfiną i 5 μM SB431542.
5. Zmieniaj podłoże co drugi dzień przez pierwsze 4 dni indukcji neuronalnej, a następnie codziennie, aż do osiągnięcia konfluencji w 7 dniu (Rysunek 3B).
   UWAGA: (1) Dorsomorfina hamuje szlak BMP poprzez celowanie w receptory ALK2,3,6, a także hamuje AMPK; SB431542 jest inhibitorem szlaku TGFβ/aktywina poprzez celowanie w ALK5,7. (2) Ten sam protokół został przetestowany z inną linią ESC (WA01), która dała podobne wyniki jak WA09¹⁶. (3) Generalnie używaliśmy Matrigelu do matrycy błony podstawnej; jednak komórki mogą być hodowane na Geltrex, a następnie różnicowane w NPC z bardzo podobnymi wynikami, na co wskazuje ekspresja kilku markerów NPC (Rysunek 4D, E). Z lekiem Geltrex należy obchodzić się w taki sam sposób jak z lekiem Matrigel (patrz punkt 1).

5. Ekspansja NPC i kriokonserwacja

1. Po 7 dniach indukcji neuronalnej rozdzielić komórki za pomocą 1 ml roztworu oddzielającego (1x) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
2. Odwirowywać komórki przez 2 minuty przy 370 x g i usunąć supernatant roztworu oddzielającego. Dodać 1 ml pożywki ekspandującej NPC (patrz Tabela Materiałów) i ponownie zawiesić komórki przez delikatne pipetowanie.
3. Płytka 1 x 10⁵ komórek w 2 ml pożywki ekspansywnej NPC na 6-dołkowych płytkach pokrytych matrycą błony podstawnej.
4. W razie potrzeby przechodź z NPC wiele razy, gdy kultury osiągną prawie 90% zbieżności. Podczas pierwszych 3-4 pasaży dodaj 10 μM inhibitora ROCK w ciągu pierwszych 24 godzin, aby zapobiec śmierci komórki. Po tych pasażach komórki mogą być pasażowane i hodowane bez inhibitora ROCK. Zmieniaj medium co drugi dzień podczas rozbudowy.
5. Kriokonserwuj NPC, gdy kultury osiągną zbieg.
   1. W celu kriokonserwacji należy rozdzielić komórki w 1 ml roztworu oddzielającego (1x) przez 5 minut w temperaturze 37 °C, a następnie odwirować zawiesinę przez 2 minuty przy 370 x g w celu usunięcia roztworu oddzielającego.
   2. Dodać roztwór do zamrażania komórek (patrz tabela materiałów) do zdysocjowanych NPC w stężeniu 1 x 10⁶ komórek/ml i rozprowadzić 1 ml porcji do kriowialiów.
   3. Umieść kriowiale w pojemniku do zamrażania i przechowuj je przez noc w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
6. Przechowuj kriowiale w ciekłym azocie.

6. Przygotowanie płytek pokrytych poli-L-ornityną (PLO) i lamininą

1. Aby przygotować płytki powlekane PLO/lamininą, należy rozcieńczyć roztwór podstawowy PLO w PBS lub wodzie do końcowego stężenia 10 μg/ml. Dobrze wymieszać i pokryć każde zagłębienie płytki 6-dołkowej 1 ml rozcieńczonego roztworu PLO.
2. Inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C.
3. Umyj każdą studzienkę PBS.
4. Rozcieńczyć roztwór podstawowy lamininy w zimnym PBS lub wodzie o stężeniu 10 μg/ml. Dobrze wymieszaj roztwór lamininy. Usunąć PBS i natychmiast pokryć każdą studzienkę 1 ml roztworu lamininy. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 1 tygodnia. Przemyć PBS i natychmiast dodać pożywkę hodowlaną.
   UWAGA: Nie pozwól, aby płytki pokryte PLO/lamininą wyschły.

7. Różnicowanie NPC pochodzących z hESC na neurony dopaminergiczne (Rysunek 6A)

1. Płytka NPC w naczyniach pokrytych PLO/lamininą w podłożu ekspandacyjnym NPC o gęstości około 50%.
2. Po 24 godzinach zmień pożywkę na pożywkę DA1 (pożywka neuropodstawowa zawierająca 2 mM suplementu glutaminy, 1x NEAA, 1x B27, 200 ng/ml SHH i 100 ng/ml FGF8) i zmieniaj pożywkę co drugi dzień.
3. Kultury przejścia, gdy osiągną zbieg. Dysocjować komórki za pomocą 1 ml roztworu oddzielającego (1x) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
4. Odwirowywać komórki przez 2 minuty przy 370 x g i usunąć supernatant roztworu oddzielającego. Dodać 1 ml pożywki DA1 i zawiesić komórki metodą delikatnego pipetowania.
5. Płytka 1 x 10⁵ komórek w 2 ml pożywki DA1 na 6-dołkowych płytkach pokrytych PLO/lamininą.
6. Po 10 dniach zmień pożywkę na DA2 (pożywka neuropodstawowa zawierająca 2 mM suplementu glutaminy, 1x NEAA, 1x B27, 200 μM kwasu askorbinowego, 20 ng/ml BDNF i 20 ng/ml GNDF) i zmieniaj pożywkę co drugi dzień przez dodatkowe 20 dni (Rysunek 6A).
   UWAGA: Codziennie dodawaj świeży kwas askorbinowy do podłoża DA2. W ciągu pierwszych 14 dni zróżnicowane komórki powinny zostać przepuszczone, gdy osiągną 90% zbieżności, ale nie już po tym.

8. Różnicowanie NPC pochodzących z ESC na astrocyty

1. Płytki nerwowych komórek progenitorowych na płytkach pokrytych PLO/lamininą w podłożu ekspandującym NPC o gęstości około 50%.
2. Po 24 godzinach zmień pożywkę na pożywkę astrocytów (pożywka DMEM/F12 w tym 1:100 N2, 1:100 B27, 200 ng/ml IGF, 10 ng/ml aktywiny A, 10 ng/ml hereguliny β-1 i 8 ng/ml bFGF) i zmieniaj pożywkę co drugi dzień.
3. Kultury przejścia, gdy osiągną zbieg. Dysocjować komórki za pomocą 1 ml roztworu oddzielającego (1x) i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
4. Odwirowywać komórki przez 2 minuty przy 370 x g i usunąć supernatant roztworu oddzielającego. Dodać 1 ml pożywki dla astrocytów i ponownie zawiesić komórki przez delikatne pipetowanie.
5. Płytka 1 x 10⁵ komórek w 2 ml pożywki astrocytowej na 6 dołkach pokrytych PLO/lamininą.
6. Pozwól, aby różnicowanie trwało w sumie przez 5–6 tygodni (Rysunek 6B).

9. Barwienie immunofluorescencyjne

1. Hodować komórki w szalkach μ o średnicy 35 mm, jak opisano powyżej dla każdego typu komórek. Odessać pożywkę i dodać 1 ml 4% roztworu PFA na szalkę i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
2. Myć 2x przez 5 min PBS.
   UWAGA: Po utrwaleniu komórek płytki testowe można uszczelnić parafilmem i przechowywać w temperaturze 4 °C. Zabarwić przeciwciałem w ciągu 1 tygodnia po utrwaleniu.
3. Dodać 300 μl roztworu blokującego (surowica kozia lub ośle w PBS) na miskę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30–60 minut.
4. Myj naczynie 2x PBS przez 5 min.
5. Dodać 300 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (tabela 1) (rozcieńczonego w roztworze blokującym) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny lub przez noc w temperaturze 4 °C.
6. Myć 2x PBS przez 10 min.
7. Dodać 300 μl fluorescencyjnie sprzężonego przeciwciała drugorzędowego (tabela 1) w roztworze blokującym i inkubować w ciemności przez 1 godzinę w temperaturze suchej.
8. Myj komórki 2x przez 10 min PBS.
9. Dodać roztwór barwiący Hoechst (1 μM końcowe stężenie w PBS) do barwienia jąder. Inkubować komórki w ciemności przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
10. Myj komórki 1x PBS przez 5 min, a następnie dodaj 500 μL PBS. Trzymaj naczynia w ciemności, a następnie obserwuj fluorescencję za pomocą mikroskopu konfokalnego (Rysunek 2B, Rysunek 5C, Rysunek 6A, oraz Rysunek 7B).

Results

Prezentowany tutaj jest ulepszony protokół utrzymania i rozwoju hodowli pojedynczych komórek hESC oraz ich efektywnego różnicowania w neuronalne komórki progenitorowe, które następnie różnicują się w różne dalsze linie nerwowe, w tym neurony dopaminergiczne i astrocyty.

Reprezentatywne obrazy kontrastu fazowego pokazują morfologię komórek na różnych etapach adaptacji komórek typu kolonijnego do hodowli jednokomórkowej (Rysunek 1A). Poprzez warunki hodowli p...

Discussion

Skalowalne i skuteczne metody różnicowania hESC w różne linie genetyczne oraz generowanie wystarczającej liczby zróżnicowanych komórek są ważnymi kryteriami badań przesiewowych leków i terapii komórkami macierzystymi. Opublikowano różne metody przekazywania pojedynczych komórek, w których komórki są hodowane w obecności inhibitora ROCK lub innych małych cząsteczek w celu poprawy przeżywalności, ale produktami końcowymi tych metod hodowli są hESC typu kolonijnego 17,18,19,20,21.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Szalki M 35 mm	ibidi	81156	Naczynie do hodowli komórkowych
6-dołkowe płytki	Corning	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104-500	Roztwór do odłączania komórek
Activin A	R& D system	338-AC-050
Kwas askorbinowy	Sigma Aldrich	A4403
B27 suplement	Thermo Fisher	17504044
B27 suplement (-Vit A)	Thermo Fisher	12587010
BDNF	Stosowane materiały biologiczne	Z100065
bFGF	Wirówka Peprotech	100-18C
	DAMON/ICE	428-6759
	Thermo Fisher	4110
Corning Matryca z kluzowaniem hESC (Magrigel)	Corning	354277	Matryca membrany podstawnej (używana w większości protokołu tutaj)
Cryostor CS 10	Stemcell Technologies	7930	Roztwór do zamrażania komórek
Dispase	Stemcell Technologies	7923
DMEM	Thermo Fisher	10569-010
	Thermo Fisher	10565-018
Dorsomorphin	Tocris	3093
EGF	Peprotech	AF-100-16A
Płodowa surowica bydlęca	Fisher Scientific	SH3007003HI
FGF8	Stosowane materiały biologiczne	Z101705
GDNF	Applied Biological Materials	Z101057
Geltrex matrix	Thermo Fisher	A1569601	Macierz błony podstawnej
GlutaMax	Thermo Fisher	35050061	Suplement glutaminy, 100X
H9 (WA09) ludzka linia embrionalnych komórek macierzystych	WiCell	WA09
Heregulina b-1	Peprotech	100-3
IGF	Peprotech	100-11
Knockout	DMEM Thermo Fisher	10829018
Zamiennik serum do nokautu	Thermo Fisher	10828028
Laminin	Sigma Aldrich	L2020
mTeSR1	Stemcell Technologies	85850	pożywka hodowlana hESC
suplement N2	Thermo Fisher	17502001
NEAA	Thermo Fisher	11140050
Neurobasal	Thermo Fisher	21103049
Poli-L-ornityna	Sigma Aldrich	P3655
Inhibitor ROCK	Tocris	1254
SB431542	Tocris	1614
SHH	Stosowane materiały biologiczne	Z200617
Pożywka dla progenitorów nerwowych Stemdiff	Stemcell Technologies	5833	Pożywka ekspandująca NPC