Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Immunohistochemia całego wierzchowca w zarodkach i larwach danio pręgowanego

21.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60575

⸱

29 stycznia 2020

 , 
1Department of Biological Sciences, Murray State University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania białek za pośrednictwem przeciwciał fluorescencyjnych w całych preparatach zarodków i larw danio pręgowanego.

Streszczenie

Immunohistochemia jest powszechnie stosowaną techniką do badania ekspresji i lokalizacji białek zarówno w normalnych stanach rozwojowych, jak i chorobowych. Chociaż wiele protokołów immunohistochemicznych zostało zoptymalizowanych pod kątem tkanek ssaków i skrawków tkanek, protokoły te często wymagają modyfikacji i optymalizacji dla organizmów modelowych innych niż ssaki. Danio pręgowany jest coraz częściej wykorzystywany jako system modelowy w badaniach podstawowych, biomedycznych i translacyjnych w celu zbadania molekularnych, genetycznych i biologicznych mechanizmów procesów rozwojowych komórek. Danio pręgowany oferuje wiele zalet jako system modelowy, ale wymaga również zmodyfikowanych technik w celu optymalnego wykrywania białek. W tym miejscu przedstawiamy nasz protokół immunohistochemii fluorescencji całej góry w zarodkach i larwach danio pręgowanego. Protokół ten dodatkowo opisuje kilka różnych strategii montażu, które można zastosować, oraz przegląd zalet i wad każdej strategii. Opisujemy również modyfikacje tego protokołu, aby umożliwić wykrywanie substratów chromogennych w całej tkance wierzchowca i wykrywanie fluorescencji w wyciętej tkance larwalnej. Protokół ten ma szerokie zastosowanie w badaniu wielu etapów rozwojowych i struktur embrionalnych.

Wprowadzenie

Danio rerio (danio rerio) stał się potężnym modelem do badania procesów biologicznych z kilku powodów, w tym krótkiego czasu generacji, szybkiego rozwoju i podatności na techniki genetyczne. W rezultacie danio pręgowany jest powszechnie stosowany w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych małych cząsteczek do badań toksykologicznych i odkrywania leków. Danio pręgowany jest również atrakcyjnym modelem do badania procesów rozwojowych, biorąc pod uwagę, że pojedyncza samica może rutynowo wyprodukować 50-300 jaj na raz, a optycznie czyste zarodki rozwijają się zewnętrznie, co pozwala na efektywną wizualizację procesów rozwojowych. Jednak wczesne badania opierały się głównie na zaawansowanych badaniach genetycznych z użyciem N-etylo-N-nitrozomocznika (ENU) lub innych mutagenów ze względu na wyzwania związane z ustaleniem technik odwrotnej genetyki. Mniej więcej dwie dekady temu morpholinos zostały po raz pierwszy użyte u danio pręgowanego do niszczenia wybranych genów1. Morfoliny to małe oligonukleotydy antysensowne, które hamują translację docelowego mRNA po mikrowstrzyknięciu do zarodka we wczesnym stadium rozwoju. Główną słabością morfolinosów jest to, że są one rozcieńczane podczas podziału komórek i na ogół tracą skuteczność po 72 godzinach od zapłodnienia (hpf). Podczas gdy morfoliny pozostają potężnym narzędziem do zakłócania genów danio pręgowanego, nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALEN), nukleazy palców cynkowych (ZFN) i zgrupowane, regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR) są ostatnio wykorzystywane do bezpośredniego celowania w genom danio pręgowanego2,3. Te odwrócone strategie genetyczne, w połączeniu z genetyką postępową i wysokowydajnymi badaniami przesiewowymi, sprawiły, że danio pręgowany stał się potężnym modelem do badania ekspresji i funkcji genów.

Zdolność do badania funkcji genów zazwyczaj wymaga oceny czasoprzestrzennego rozkładu ekspresji genów lub produktów genowych. Dwie najczęściej stosowane techniki wizualizacji takich wzorców ekspresji we wczesnym okresie rozwoju to hybrydyzacja in situ (ISH) i immunohistochemia całego wierzchowca (IHC). Hybrydyzacja in situ została po raz pierwszy opracowana w 1969 roku i opiera się na użyciu znakowanych antysensownych sond RNA do wykrywania ekspresji mRNA w organizmie4. Natomiast znakowane przeciwciała są używane w immunohistochemii do wizualizacji ekspresji białek. Pomysł znakowania białek do wykrywania sięga lat 30-tych XX wieku5, a pierwszy eksperyment IHC został opublikowany w 1941 roku, kiedy przeciwciała znakowane FITC zostały użyte do wykrywania bakterii chorobotwórczych w zakażonych tkankach6. ISH i IHC ewoluowały i znacznie się poprawiły w ciągu kolejnych dziesięcioleci i są obecnie rutynowo stosowane w molekularnym i diagnostycznym laboratorium badawczym7,8,9,10,11. Chociaż obie techniki mają zalety i wady, IHC oferuje kilka zalet w porównaniu z ISH. W praktyce IHC jest znacznie mniej czasochłonny niż ISH i jest generalnie tańszy w zależności od kosztu przeciwciała pierwotnego. Ponadto ekspresja mRNA nie zawsze jest wiarygodnym wskaźnikiem ekspresji białka, ponieważ wykazano u myszy i ludzi, że tylko około jednej trzeciej zmienności obfitości białka można wyjaśnić obfitością mRNA12. Z tego powodu IHC jest ważnym uzupełnieniem do potwierdzania danych ISH, gdy tylko jest to możliwe. Wreszcie, IHC może dostarczyć dane subkomórkowe i kolokalizacyjne, których nie można określić za pomocą ISH13,14,15. W tym miejscu opisujemy krok po kroku metodę niezawodnego wykrywania białek za pomocą immunohistochemii w całych zarodkach i larwach danio pręgowanego. Celem tej techniki jest określenie przestrzennej i czasowej ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania w całym zarodku. Technologia ta wykorzystuje przeciwciała pierwszorzędowe specyficzne dla antygenu i fluorescencyjnie znakowane przeciwciała drugorzędowe. Protokół można łatwo dostosować do stosowania na szkiełkowych skrawkach tkanek oraz do stosowania z podłożami chromogennymi zamiast fluorescencji. Korzystając z tego protokołu, wykazujemy, że rozwijające się mięśnie szkieletowe danio pręgowanego wyrażają jonotropowe receptory glutaminianu oprócz receptorów acetylocholiny. Podjednostki receptora glutaminianu typu NMDA są wykrywalne na mięśniu podłużnym przy 23 hpf.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury pracy z dorosłymi osobnikami i embrionami hodowli danio pręgowanego opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Stanowym Murray.

1. Pobieranie i utrwalanie zarodków

  1. Przygotuj zbiorniki tarłowe, umieszczając dorosłe pary lub grupy mieszanej płci danio pręgowanego w zbiornikach z siatką lub szczelinową wkładką wypełnioną na noc wodą systemową.
  2. Przy włączonych światłach zmień wodę w zbiorniku tarłowym na świeżą wodę systemową, aby usunąć kał. Użyj 14-godzinnego/10-godzinnego cyklu jasnej ciemności ze światłami włączającymi się o 9 rano.
  3. Po złożeniu jaj przywróć dorosłe osobniki do zbiorników domowych.
  4. Zbieraj jaja, pobierając je za pomocą pipety transferowej lub wlewając do sitka o oczkach.
  5. Przenieś jaja na szalki Petriego wypełnione do połowy pożywką dla zarodków (taką jak pożywka dla zarodków 30% Danieau lub E2 z 0,5 mg/l błękitu metylenowego), ograniczając liczbę zarodków na szalce do 50.
  6. Usuń wszystkie jaja, które są martwe lub nie dzielą się.
    UWAGA: Martwe zarodki można łatwo zidentyfikować, ponieważ stają się nieprzezroczyste i często wydają się "mętne". Jeśli błękit metylenowy zostanie dodany do pożywki zarodkowej, martwe zarodki nabierają ciemnoniebieskiego wyglądu.
  7. Inkubować szalki z jaj w temperaturze 28,5 °C, aż osiągną pożądany etap. W tym eksperymencie podnieś zarodki do 23 hpf.
  8. Opcjonalnie) Przenieś zarodki w temperaturze 24 hpf do 200 μM 1-fenylo-2-tiomocznika (PTU) w pożywce zarodkowej, aby zapobiec melanogenezie16,17. Alternatywnie, wybielać zarodki po utrwaleniu (patrz opcjonalnie punkt 5).
  9. Codziennie zmieniaj pożywkę zarodkową lub pożywkę PTU.
  10. Dechorionuj niewyklute zarodki za pomocą ultracienkich kleszczy pod mikroskopem stereoskopowym. Alternatywnie, chemicznie dekorionować zarodki, inkubując w 1 mg/ml pronazy w pożywce dla zarodków przez kilka minut w temperaturze pokojowej. Usuń zarodki z Pronase i przemyj je trzykrotnie pożywką dla zarodków.
  11. Zarodki z odkorekcją przyklejają się do plastiku. Przechowuj je na szklanych lub plastikowych szalkach Petriego pokrytych 1-2% agarozą rozpuszczoną w pożywce dla zarodków. Przenieś zdekorionowane zarodki za pomocą polerowanych ogniowo pipet Pasteura, aby zminimalizować uszkodzenia.
  12. Przenieś zarodki do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml za pomocą plastikowej lub polerowanej ogniowo pipety.
  13. Usunąć podłoże z zarodków za pomocą mikropipety. Pozostaw tylko tyle płynu, aby przykryć zarodki po każdej zmianie płynu.
  14. Przygotować 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w dygestoriach chemicznych.
    UWAGA: PFA jest materiałem niebezpiecznym. Nosić rękawice i usuwać zanieczyszczone płyny i ciała stałe w wyznaczonych miejscach.
  15. Utrwal zarodki w 4% PFA przez 1-2 godziny, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej. Alternatywnie, utrwalić zarodki 4 godziny do nocy w temperaturze 4 °C.
  16. Prać trzykrotnie w 1x PBS + 1% Triton-X (PBTriton) przez 5 min.
  17. Zarodki należy zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia.
  18. W celu długotrwałego przechowywania należy odwodnić zarodki w 100% metanolu (MeOH) przez 2 godziny lub przez noc w temperaturze -20 °C. Zarodki należy przechowywać w temperaturze -20 °C w MeOH przez kilka miesięcy.
    UWAGA: MeOH jest materiałem niebezpiecznym. Nosić rękawice i usuwać zanieczyszczone płyny i ciała stałe w wyznaczonych miejscach.

2. Przygotowanie zarodków

  1. Uwodnić zarodki poprzez seryjne inkubacje w temperaturze pokojowej.
    1. Inkubować w 75% MeOH/25% 1x PBS przez 5 minut, kołysząc.
    2. Inkubować w 50% MeOH/50% 1x PBS przez 5 minut, kołysząc.
    3. Inkubować w 25% MeOH/75% 1x PBS przez 5 minut, kołysząc.
    4. Inkubować w 100% PBTriton przez 5 minut, kołysząc.
  2. (Opcjonalnie) Przygotować świeży roztwór roboczy proteinazy K (10 μg/ml w PBTriton) na lodzie, dodając 10 μl świeżo rozmrożonej proteinazy K (10 mg/ml).
    1. Przepuszczalność zarodków poprzez trawienie do 30 minut w Proteinazie K.
      UWAGA: Sugerowany czas to <24 hpf: brak trawienia; 24 hpf: 15 min trawienie; i 7 dni: 30 minut trawienia.
    2. Przepłukać przepuszczalne zarodki w PBTriton i ponownie utrwalić w 4% PFA przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Umyj zarodki trzy razy w PBTriton przez 5 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem.

3. Inkubacja przeciwciał pierwotnych

  1. Należy wybrać komercyjny roztwór blokujący lub surowicę pasującą do drugorzędowego gatunku przeciwciała gospodarza (np. 10% surowicy koziej w PBTriton) z lub bez 2 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej (BSA) lub bez niej.
  2. Zablokować zarodki w roztworze blokującym na 1-3 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C podczas kołysania.
  3. Inkubować w pierwotnym przeciwciałie rozcieńczonym w roztworze blokującym lub 1% surowicy w PBTriton przez noc w temperaturze 4 °C podczas kołysania. W tym eksperymencie głównymi przeciwciałami użytymi były anty-NMDAR1, receptor anty-pan-AMPA i anty-fosfo-histon H3, każde rozcieńczone do końcowego stężenia 1:500 w 1% surowicy koziej w PBTriton.
  4. Umyj pięć razy w PBTriton przez 10 minut w temperaturze pokojowej podczas bujania.

4. Inkubacja przeciwciał wtórnych

  1. Wybierz przeciwciało drugorzędowe na podstawie gatunku gospodarza przeciwciała pierwszorzędowego i żądanej długości fali.
  2. Inkubować w przeciwciałie drugorzędowym rozcieńczonym w roztworze blokującym lub 1% surowicy przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (lub przez noc w temperaturze 4 °C) podczas kołysania.
    UWAGA: Fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe są wrażliwe na światło. Użyliśmy 1:500 koziego anty-mysiego Alexa488 rozcieńczonego w 1% koziej surowicy w PBTriton.
  3. Przykryj rurki folią aluminiową lub przykryj pudełkiem blokującym światło w tym celu i wszystkich kolejnych krokach.
  4. Umyj trzy razy w PBTriton przez 10 minut w temperaturze pokojowej podczas kołysania.
  5. Przenieść zarodki do 50% roztworu glicerolu w PBS na podłożu z 2% agarozy w pożywce dla zarodków i przejść do dokumentacji lub przejść do dalszych etapów przetwarzania poniżej.

Opcjonalne kroki

5. Wybielanie

  1. Przygotuj roztwór wybielacza w probówce o pojemności 1,5 ml, dodając 810,7 μl ddH2O, 89,3 μl 2 M KOH i 100 μl 30% H2O2 .
  2. Odwróć rurkę trzy razy, aby wymieszać.
  3. Odpipetować pipetą 1 ml roztworu wybielacza w kierunku do zarodków.
  4. Otwórz nakrętkę probówki z zarodkiem, aby umożliwić ucieczkę gazu. Delikatnie postukaj rurką o ławkę, aby usunąć bąbelki.
  5. Monitoruj proces bielenia (w razie potrzeby użyj mikroskopu) i zatrzymaj reakcję, gdy pigment zostanie wystarczająco usunięty (około 5 minut dla 24 hpf lub 10 minut dla 72 hpf).
  6. Ostrożnie usunąć roztwór wybielający za pomocą mikropipety i trzykrotnie spłukać zarodki w 1 ml PBTriton.
    UWAGA: Na tym etapie zarodki są lepkie.
  7. Przejdź do dokumentacji lub dalszych kroków przetwarzania poniżej.

6. Sekcja zarodków i usuwanie żółtka

  1. Aby usunąć żółtko, przenieś niewielką ilość (~200 μl lub wystarczającą, aby całkowicie pokryć zarodek, ale wystarczająco restrykcyjną, aby ograniczyć miejsce, w którym może się unosić) 1x PBS do szkiełka wgłębieniowego lub zwykłego szkiełka podstawowego.
  2. Użyj plastikowej pipety transferowej, aby przenieść 1 lub więcej zarodków do kropli PBS.
  3. Użyj ultracienkich kleszczyków i szpilek do owadów, aby rozbić żółtko i bardzo delikatnie zeskrobać granulki żółtka z brzusznej powierzchni zarodka (patrz także Cheng i in., 2014)18.
  4. Usuń granulki żółtka i uzupełnij PBS w razie potrzeby.
  5. Powtarzaj tę czynność, aż zarodek będzie wystarczająco wolny od żółtka.

7. Płaski montaż na prowadnicach

  1. Przenieś otoczkowe zarodki do naładowanego szkła za pomocą plastikowej pipety lub mikropipety o pojemności 1 ml z przyciętą końcówką (w celu zmniejszenia naprężeń ścinających). Zorientuj zgodnie z potrzebami za pomocą końcówki do mikropipet o pojemności 200 μl lub szpilki do owadów.
  2. Usuń nadmiar PBS chusteczką Kim lub ręcznikiem papierowym.
  3. Dodaj 2-3 krople podłoża montażowego do szkiełka i szkiełka nakrywkowego.
  4. Suszyć na powietrzu przez około 5 do 10 minut.
  5. Uszczelnij szkło nakrywkowe na szkiełku przezroczystym lakierem do paznokci.
    UWAGA: Krawędzie szkła nakrywkowego muszą być całkowicie pokryte cienką, ciągłą warstwą lakieru do paznokci.
  6. Pozostawić do wyschnięcia na około 10 minut przed obrazowaniem.

8. Montaż w Agarozie

  1. Przygotować 1% agarozy w pożywce zarodkowej, dodając 0,5 g agarozy do 50 ml pożywki dla zarodków w kolbie lub zlewce nadającej się do kuchenki mikrofalowej o objętości co najmniej 3 razy większej niż pożądana.
  2. Podgrzej w kuchence mikrofalowej, wirując co 30 sekund, aż agaroza całkowicie się rozpuści.
  3. Przygotować 1 ml porcji w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml. Porcje należy przechowywać w temperaturze pokojowej.
  4. Zaślepki rurki z zatrzaskami przed podgrzaniem.
  5. Umieść rurki agarozowe w pływającym uchwycie na probówkę w zlewce wypełnionej do połowy wodą.
  6. Podgrzewaj zlewkę z pływającymi rurkami w kuchence mikrofalowej przez 2-3 minuty lub do momentu, aż agaroza całkowicie się rozpuści.
  7. Przenieś zarodek do zmostkowanego szkiełka za pomocą plastikowej pipety lub mikropipety o pojemności 200 μl z przyciętą końcówką (w celu zmniejszenia naprężeń ścinających).
  8. Umieść zarodek na prostokątnym szkiełku nakrywkowym za pomocą szpilek przeciw owadom i dodaj około 20 μl stopionej agarozy bezpośrednio do zarodka.
  9. Szybko zorientuj obszar zainteresowania najbliżej szkiełka nakrywkowego za pomocą 00 pinezki na owady.
    UWAGA: To jest mocowanie do góry nogami.
  10. Umieść rurkę agarozową z powrotem na pływaku rurki gorącej wody między każdym użyciem i w razie potrzeby w kuchence mikrofalowej.
  11. Obraz za pomocą mikroskopu, gdy agaroza twardnieje. Trzymaj zamontowany zarodek do góry nogami do użycia w odwróconym mikroskopie. Odwróć szkiełko nakrywkowe (tak, aby agaroza znalazła się pod szkiełkiem nakrywkowym) do użycia w mikroskopach pionowych.

9. Montaż na prowadnicach mostkowych

  1. Aby wykonać zmostkowane szkiełka, przyklej kwadratowe szkiełka nakrywkowe do szkiełka za pomocą małej kropki superglue.
    UWAGA: Pomiędzy szkiełkami nakrywkowymi powinna znajdować się rynna o szerokości co najmniej 5 mm. Dwa szkiełka nakrywkowe o wysokości #1 są zazwyczaj odpowiednie dla zarodków o mocy 24-48 hpf, podczas gdy trzy szkiełka nakrywkowe o wysokiej wysokości mogą być konieczne dla 72 hpf.
  2. Przenieść 1-2 zarodki pozbawione żółtka do zmostkowanego szkiełka za pomocą plastikowej pipety lub mikropipety o pojemności 200 μl z przyciętą końcówką (w celu zmniejszenia naprężeń ścinających).
  3. Usuń nadmiar płynu chusteczką Kim lub ręcznikiem papierowym.
  4. Dodaj kroplę ≥80% glicerolu bezpośrednio do zarodka.
  5. Przykryj prostokątną szklanką nakrywkową. Kropla glicerolu powinna dotykać szkła nakrywkowego.
  6. Dodaj więcej glicerolu do przestrzeni między szkłem nakrywkowym i przesuń w razie potrzeby, aby całkowicie pokryć zarodek marginesem glicerolu po bokach zarodka.
  7. Delikatnie przesuń prostokątną szklankę nakrywkową, aby przetoczyć zarodek na miejsce do obrazowania.

10. Barwienie DAB

UWAGA: Ta sekcja zaczyna się po kroku 4.2 powyżej i zastępuje resztę kroku 4.

  1. Inkubować zarodki w roztworze blokującym z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C podczas kołysania.
  2. Prać trzy razy w PBTriton przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Przenieść zarodki na płytkę hodowlaną lub szkiełko depresyjne za pomocą pipety transferowej.
  4. Zmieszać 50 μl 1% DAB (3,3'-diaminobenzydyny) rozpuszczonej w ddH2O i 50 μl 0,3% nadtlenku wodoru i doprowadzić do 1 ml z PBS.
    UWAGA: DAB jest materiałem niebezpiecznym. Nosić rękawice i utylizować zanieczyszczone DAB ciecze i ciała stałe w wyznaczonych miejscach.
  5. Przykryj zarodki barwione HRP przygotowanym powyżej roztworem DAB i monitoruj rozwój koloru (zwykle 1-5 minut) pod mikroskopem.
  6. Po osiągnięciu pożądanego poziomu rozwoju koloru należy krótko przepłukać zarodki w PBS.
  7. Przenieś zarodki z powrotem do probówki o pojemności 1,5 ml przed utrwaleniem.
  8. Ponownie utrwal zarodki przez 15-20 minut w 4% PFA w temperaturze pokojowej.
  9. Umyj zarodki trzy razy w PBTriton przez 5 minut.
  10. Przejdź do dokumentacji.

11. Zmodyfikowany protokół barwienia wyciętej tkanki zamontowanej na szkiełkach

  1. Owiń tkankę, która ma być zabarwiona pisakiem.
  2. Przenieś szkiełka do wilgotnej komory.
  3. Dodaj 1 ml PBS bezpośrednio do szkiełka.
  4. Inkubować przez 7 minut w temperaturze pokojowej, aby usunąć podłoże do zatapiania.
  5. Odlej PBS, odwracając szkiełko.
  6. Nawadniaj przez 1 minutę w maksymalnie 1 ml buforu TNT (100 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1% Tween20).
  7. Zablokować do 1 ml roztworu blokującego (handlowego lub 10% surowicy + 2% BSA) na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  8. Inkubować przez noc w pierwszorzędowym przeciwciałie rozcieńczonym w 1% surowicy lub roztworze blokującym w temperaturze 4 °C.
  9. Umyć pięć razy w objętości do 1 ml buforu TNT w temperaturze pokojowej.
  10. Inkubować w przeciwciałie drugorzędowym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Przykryć komorę folią lub użyć ciemnej pokrywki.
  11. Umyć pięć razy w trotylu w temperaturze pokojowej. Odlej ostatnie pranie.
  12. Zamontuj za pomocą 2-3 kropli podłoża montażowego i szkiełka nakrywkowego. Odstawić na 5-10 min.
  13. Uszczelnij szkło nakrywkowe na szkiełku za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci. Pozostawić do całkowitego wyschnięcia przed obrazowaniem.

12. Dokumentacja

  1. Zapisz całą procedurę i wszelkie odchylenia w notatniku laboratoryjnym.
  2. Zanotować stężenie, nazwę, numer katalogowy, producenta i numer partii przeciwciała pierwszorzędowego.
  3. Umieść odpowiednio zamontowaną próbkę na stoliku mikroskopu. Zlokalizuj interesujący Cię region.
  4. Wybierz stosunkowo jasny przykład. Ustaw ekspozycję i wzmocnienie kamery tak, aby sygnał był wystarczająco jasny bez nasycenia.
  5. Porównaj intensywność barwienia tego samego obszaru zainteresowania przy użyciu tych samych ustawień ekspozycji, porównując eksperymentalne zarodki znakowane przeciwciałami i zarodki z przeciwciałami kontrolnymi (np. IgG).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Immunohistochemia całego preparatu wykorzystuje przeciwciała do wykrywania przestrzennego wzorca ekspresji białka w nienaruszonym organizmie zwierzęcia. Podstawowy schemat pracy w immunohistochemii (przedstawiony na Rysunku 1) obejmuje hodowlę rybek danio-przełomowych, wychów i przygotowanie embrionów, blokowanie nieswoistych antygenów, zastosowanie swoistego przeciwciała pierwszorzędowego w celu ukierunkowania na badane białko, wykrycie przeciwciała pierwszo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Immunohistochemia jest wszechstronnym narzędziem, które można wykorzystać do scharakteryzowania czasoprzestrzennej ekspresji praktycznie każdego białka będącego przedmiotem zainteresowania w organizmie. Immunohistochemia jest stosowana w odniesieniu do szerokiej gamy tkanek i organizmów modelowych. Protokół ten został zoptymalizowany do stosowania u danio pręgowanego. Immunohistochemia u różnych gatunków może wymagać różnych technik utrwalania i obchodzenia się z nimi, roztworów blokujących w zależności od gatunku i obec...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych informacji do ujawnienia.

Podziękowania

Finansowanie z grantu NIH 8P20GM103436 14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgaroseFisher ScientificBP160-100
Folia aluminiowa, wytrzymałaKirklandKażda marka może być podstawiona
Przeciwciało anty-NMDAMillipore SigmaMAB363
Anty-fosfo-histon H3 (Ser10), klon RR002Milipore Sigma05-598
Receptor anty-pan-AMPA (GluR1-4)Millipore Sigma
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Fisher ScientificBP1600-100
Azotan wapnia [Ca(NO3)2]Sigma AldrichC4955
Probówki wirówkowe, 1,5 mlAxygenMCT150C
Bezbarwny lakier do paznokciSally HansonMożna zastąpić
dowolny lakier do paznokci lub utwardzaczSzkiełko depresyjne (wklęsłe)Elektronowa miskroskopia Sciences71878-01
DiaminobenzydynaThermo Scientific1855920
Pożywka zarodkowa, Danieau, 30%17,4 mM NaCl, 0,21 mM KCl, 0,12 mM MgS04, 0,18 mM Ca(NO3)2, 1,5 mM HEPES w ultraczystej wodzie.
Pożywka zarodkowa, E27,5 mM NaCl, 0,25 mM KCl, 0,5 mM MgSO4, 75 μ M KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L błękit metylenowy
Pływający uchwyt rurkiThermo Scientific59744015
Mikroskop fluorescencyjny LeicaBiosystemsDMi8
Stereomikroskop fluorescencyjnyLeica BiosystemsM165-FC
Szkiełka nakrywkowe szklane 18 mm x 18 mmCorning284518
Szkiełka nakrywkowe szklane 22 mm x 60 mmThermo Scientific22-050-222
SzkiełkaFisher Scientific12-544-4
GlicerolFisher ScientificBP229-1
Kozioł anty-mysi IgG Alexa 488InvitrogenA11001
Roztwór HEPESSigma AldrichH0887
Komora wilgotna z pokrywąSimportM920-2
Nadtlenek wodoru, 30%Fisher ScientificH325-500
Immunedge Pap penVector labsH-4000
Szpilki do owadów, rozmiar 00Stoelting5213323
Siarczan magnezu (MgSO4 · 7H2O)Sigma Aldrich63138
Sitko siatkoweOneidaMożna zastąpić dowolną markę
MetanolSigma Aldrich34860
Błękit metylenowySigma AldrichM9140
Blokada nasadki mikrorurkiResearch Products International145062
Kuchenka mikrofalowaToastmaster
Mysz IgGSigma AldrichI8765
Normalna surowica koziaMillipore SigmaS02L1ML
Mikser nutującyFisher Scientific88-861-044
ParaformaldehydFisher Scientific04042-500
Pipety PasteuraFisher Scientific13-678-20C
PBTriton1% TritonX-100 w 1x PBS
Podłoże montażowe PermountFisher ChemicalSP15-500
szalka Petriego (szkło)Pyrex3160100
szalka Petriego (plastikowa)Fisher ScientificFB0875713
1-fenylo 2-tiomocznikAcros Organics207250250
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 10x, pH 7,4Gibco70011-044
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 1x1x wykonana z 10x bulionu rozcieńczonego w dH2O
Chlorek potasu (KCl)Sigma AldrichP9333
Wodorotlenek potasu (KOH)FisherP250-500
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)Sigma AldrichP5655
PronazaSigma Aldrich10165921001
Proteinaza KInvitrogenAM2544
Chlorek sodu (NaCl)Sigma AldrichS7653
Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)Sigma AldrichS7907
Zbiornik tarłowy z pokrywą i wkłademAquaneeringZHCT100
SuperBlock PBSThermo Scientific37515
Superfrost + zjeżdżalnieFisher Scientific12-550-15
Superglue żel3M Scotch
TNT100 mM Tris, pH 8,0; 150 mM NaCl; 0,1% Tween20; wykonane z dH2O
Pipeta transferowaFisher13-711-7M
Kwas trichlorooctowy (Cl3CCOOH)Sigma AldrichT6399
Tris BaseFisher ScientificS374-500
TritonX-100Sigma AldrichT9284
Tween20Fisher ScientificBP337-500
Ultracienkie kleszczeFisher Scientific16-100-121
Woda, ultraczysta/podwójnie destylowanaFisher ScientificW2-20
MABN832 podstawowe

Bibliografia

  1. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).
  2. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  3. Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
  4. van der Ploeg, M. Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century. European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).
  5. Marrack, J. Nature of Antibodies. Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).
  6. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  7. Lopez, M. E. Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections. Bio-protocol. 4 (18), (2014).
  8. Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study. Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).
  9. Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections. Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).
  10. Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. , Academic Press. 105-111 (2014).
  11. Corthell, J. T. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. Corthell, J. T. , Academic Press. 91-103 (2014).
  12. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
  13. Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines. Islets. 6 (4), e982376(2014).
  14. Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease. Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).
  15. Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain. Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).
  16. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2000).
  17. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
  18. Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
  19. Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo. Journal of Cell Science. 118 (22), 5181(2005).
  20. Liu, D. W., Westerfield, M. Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture. The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859(1992).
  21. Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).
  22. Brunelli, G., et al. Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).
  23. Hans, F., Dimitrov, S. Histone H3 phosphorylation and cell division. Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).
  24. Yee, N. S., Pack, M. Zebrafish as a model for pancreatic cancer research. Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).
  25. Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. The emerging use of zebrafish to model metabolic disease. Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).
  26. Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review. Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).
  27. Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).
  28. Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
  29. Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo. Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).
  30. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS one. 6 (8), e22991(2011).
  31. Inoue, D., Wittbrodt, J. One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos. PLoS One. 6 (5), e19713(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekspresja białekmikroskopia konfokalnabarwienie przeciwciałamifiksacja tkanekroztwór blokującyprzeciwciało wtórnestrategie montowania preparatówdetekcja fluorescencyjna
Immunohistochemia całego wierzchowca w zarodkach i larwach danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.