Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Optymalizacja procesów z wykorzystaniem zautomatyzowanych mikrobioreaktorów o wysokiej przepustowości w hodowli komórek jajnika chomika chińskiego

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60577

⸱

18 maja 2020

 ,  ,  , 
1Institute for Technical Chemistry, Gottfried-Wilhelm-Leibniz Universität Hannover

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę przeprowadzania projektu eksperymentu w zautomatyzowanym mikro-bioreaktorze, a następnie zbierania komórek i kwantyfikacji białka za pomocą kolumny Białko A.

Streszczenie

Optymalizacja procesów biologicznych w celu zwiększenia wydajności pożądanych produktów ma znaczenie w przemyśle biofarmaceutycznym. Można to osiągnąć poprzez dobór szczepów i opracowanie parametrów bioprocesu. Do tego celu użyto kolb wstrząsowych. Brakuje im jednak możliwości kontrolowania parametrów procesu, takich jak pH i tlen rozpuszczony (DO). To ograniczenie można przezwyciężyć za pomocą zautomatyzowanego mikrobioreaktora. Bioreaktory te naśladują uprawę na większą skalę. Jedną z głównych zalet tego systemu jest integracja Design of Experiment (DOE) z oprogramowaniem. Integracja ta umożliwia stworzenie projektu, w którym wiele parametrów procesu może być zmienianych jednocześnie. W oprogramowaniu można analizować krytyczne parametry procesu i optymalne warunki bioprocesu. Przedstawione tutaj prace koncentrują się na zapoznaniu użytkownika z krokami związanymi z projektowaniem procesów w oprogramowaniu i włączeniem DOE do cyklu uprawy.

Wprowadzenie

Globalny rynek biofarmaceutyczny był wart ponad 250 miliardów dolarów amerykańskich w 2018 roku i stale się rozwija1. Firmy farmaceutyczne odchodzą od produkcji leków małocząsteczkowych na rzecz terapii wytwarzanych biotechnologicznie, takich jak białka rekombinowane. Tylko one są odpowiedzialne za przychód w wysokości ponad 150 miliardów dolarów1. Komórki ssaków są obecnie szeroko wykorzystywane do produkcji tych farmaceutycznych białek rekombinowanych. W obecnym okresie, spośród 68 zatwierdzonych produktów wytwarzanych przez komórki ssaków, 57 jest wytwarzanych przez komórki jajnika chomika chińskiego (CHO)2. Komórki CHO są specyficznie wykorzystywane do produkcji rekombinowanych białek, które wymagają modyfikacji potranslacyjnych. Komórki te są preferowane, ponieważ rosną w zawiesinie, a tym samym umożliwiają powtarzalne wyniki w chemicznie zdefiniowanym podłożu wolnym od surowicy3,4. Inną zaletą stosowania komórek CHO jest to, że struktura glikanów produktu przypomina strukturę ludzkiego przeciwciała monoklonalnego (mAb) i skutkuje wyższą wydajnością białka rekombinowanego i specyficzną produktywnością dzięki amplifikacji genów5.

Wydajność hodowli komórek rekombinowanych CHO (rCHO) wzrosła stukrotnie w ciągu ostatnich dwóch dekad. Poprawa ta wynika z optymalizacji parametrów procesu, strategii żywienia i opracowania chemicznie zdefiniowanego podłoża wolnego od surowicy6. Wraz ze wzrostem wymagań stawianych produktom farmaceutycznym wzrasta nacisk na efektywność kosztową i czasową rozwoju procesu produkcyjnego7. Zmniejszenie presji przy jednoczesnym zapewnieniu jakości produktu spowodowało, że przemysł farmaceutyczny ponownie skupił się na jakości w fazie projektowania (QbD). QbD służy do zrozumienia procesu wytwarzania produktu, a także procesu. Istotnym narzędziem wykorzystywanym w ObD jest Design of Experiment (DOE). Pomaga lepiej zrozumieć proces, ujawniając związek między różnymi zmiennymi wejściowymi a wynikowymi danymi wyjściowymi. Zastosowanie podejścia DOE w celu optymalizacji bioprocesu jest korzystne na wczesnych etapach projektu w asymilacji warunków procesu oraz zwiększeniu ilości i jakości miana. Takie podejście jest korzystne w porównaniu ze staromodną strategią: jeden czynnik na raz (OFAT). Statystyczne podejścia do DOE wykorzystujące Classical, Shainin lub Taguchi są znacznie lepsze niż OFAT8.

Proces optymalizacji mediów można przeprowadzić w kolbach wstrząsowych. Kolby są stosunkowo niedrogie. Nie jest jednak możliwe kontrolowanie parametrów takich jak temperatura, pH i tlen rozpuszczony (DO). Aby przezwyciężyć te wady, można zastosować wielofunkcyjne bioreaktory laboratoryjne o objętości roboczej od 0,5 l do 5 l. Reaktory zapewniają rozbudowane monitorowanie on-line i kontrolę procesu. Jednak korzystanie z bioreaktora wielofunkcyjnego jest czasochłonne i pracochłonne. Aby przezwyciężyć te wady, zastosowano nowatorski bioreaktor jednorazowego użytku, który łączy w sobie kompleksowy proces monitorowania bioreaktora laboratoryjnego z łatwą obsługą kolby do wytrząsania. Wysokowydajny system przesiewowy i technologia jednorazowego użytku przyczyniły się do zwiększenia efektywności wydajności i rozwoju procesów9.

W tym artykule znajdują się wytyczne dotyczące ładowania receptury w oprogramowaniu automatycznego mikrobioreaktora (AMBR). W trakcie tego eksperymentu badany jest wpływ różnych prędkości mieszadła i pH na stężenie żywotnych komórek (VCC) i miano. Wynik eksperymentu i analiza są przeprowadzane za pomocą oprogramowania eksperymentalnego MODDE 12. Analiza produktu odbywa się w systemie wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) z kolumną białka A. Opiera się na zasadzie, że region Fc mAb wiąże się z białkiem A z wysokim powinowactwem10,11. Dzięki tej metodzie możliwa jest identyfikacja i ilościowe określenie mAb. Oznaczanie ilościowe przeprowadza się na zmierzonych obszarach pików elucji przy długości fali 280 nm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Procedura precultury

UWAGA: W tym protokole wykorzystuje się rekombinowane komórki CHO DG44 o stężeniu żywych komórek 1 x 107 cells/mL.

  1. Rozmrozić fiolkę zawierającą 1,2 mL komórek w temperaturze pokojowej i niezwłocznie przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mL zawierającej 10 mL zimnej pożywki startowej.
  2. Wirować probówkę stożkową przez 5 minut przy 190 x g w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć nadosad.
  3. Podgrzać 150 mL pożywki startowej w kolbie wytrząsowej o pojemności 50 mL do temperatury 36,8 °C.
  4. Delikatnie resuspender osad komórkowy w 10 mL uprzednio ogrzanej pożywki startowej i przenieść komórki do kolby wytrząsowej.
  5. Użyć 1 mL próbki z kolby do pomiaru początkowej VCC i żywotności za pomocą licznika komórek.
    UWAGA: Żywotność po rozmrożeniu powinna wynosić powyżej 70% dla zapewnienia sukcesu hodowli.
  6. Inkubować kolbę wytrząsową w inkubatorze orbitalnym (średnica wytrząsacza 19 mm) w temperaturze 36,8 °C i przy 7,5% CO2 z prędkością wytrząsania 120 rpm.
    UWAGA: Warunki te różnią się w zależności od szczepu komórek i pożywki.
  7. Trzy dni po pasażowaniu komórek wyjąć kolbę wytrząsową z inkubatora i umieścić ją w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Pobrać 1 mL próbki w celu pomiaru końcowej koncentracji komórek. Obliczyć objętość, którą należy przenieść do świeżej, ogrzanej pożywki startowej, tak aby początkowa koncentracja komórek w nowym pasażu wynosiła 2 x 105 komórek/mL.
  8. Pasażować komórki łącznie 5 razy przed przeniesieniem do bioreaktora w celu przeprowadzenia głównej hodowli.

2. Główna hodowla

  1. Zmierz końcowe stężenie komórek w precukturze. Oblicz objętość, którą należy przenieść do bioreaktora, tak aby początkowe stężenie komórek w reaktorze wynosiło 3 x 105 komórek/ml
  2. Napełnić reaktor pożywką produkcyjną na dzień przed inokulacją, aby ustabilizować warunki w reaktorze i ustawić parametry procesu, takie jak temperatura, pH i DO.
    UWAGA: Warunki hodowli to 36.8 °C oraz 60% stężenia tlenu rozpuszczonego (DO). Przetestowano prędkości mieszania wynoszące 1050 obr./min oraz 130 obr./min przy wartościach pH wynoszących 6,9, 7,1 i 7,3. Całkowity czas hodowli wynosi 12 dni aż do momentu zbioru komórek. Proces okresowy (batch) trwa 72 godziny, po których pożywka dożywiania jest dodawana co 24 h. Protokół, który należy zastosować podczas hodowli, został szczegółowo opisany w następnym fragmencie.

3. Tworzenie receptury w oprogramowaniu automatycznego mikro-bioreaktora

UWAGA: Istnieją dwa sposoby tworzenia receptury w oprogramowaniu do hodowli komórkowych AMBR: można ją stworzyć za pomocą kreatora lub dodając każdy krok ręcznie. Na potrzeby niniejszego protokołu przedstawiono kroki z wykorzystaniem kreatora.

  1. Tworzenie nowego eksperymentu
    1. Otwórz oprogramowanie do hodowli komórkowej AMBR i w karcie Introduction kliknij Create New Experiment.
  2. Ładowanie receptury
    1. W karcie New Experiment wprowadź nazwę eksperymentu oraz datę jego przeprowadzenia.
      1. Aktywuj pole wyboru dla stacji hodowli oraz naczyń, które będą wykorzystywane podczas inkubacji. Opcja Auto Add DOE Tags zostanie również aktywowana, aby ułatwić przejście do programowania eksperymentu DOE. Kliknij Next, aby przejść do następnej karty.
    2. Ustaw informacje dotyczące dodawania pożywek do naczyń wraz z odpieniaczem, inokulum, pożywką do dokarmiania i glukozą.
      1. Aktywuj pole wyboru Add Media Plate. Zdefiniuj typ płytki, nazwę i lokalizację płytki zawierającej pożywkę.
        UWAGA: W zależności od rodzaju płytki i tego, czy posiada ona pokrywę, zaznacz opcję Is Lidded, aby zapewnić prawidłowe działanie modułu dozującego ciecze
      2. Kliknij Add Media To Vessels. Wprowadź objętość pożywki, która ma zostać dodana do naczyń. Zdefiniuj mapowanie transferu pożywki z płytki do naczyń. Kliknij Next, aby przejść do następnej karty.
    3. Ustaw warunki hodowli w bioreaktorze.
      1. Po wprowadzeniu informacji o pożywkach do oprogramowania, przypisz warunki hodowli. Kliknij Condition Media i uzupełnij temperaturę, docelowe DO, górną granicę pH oraz prędkość mieszania RPM (mieszanie w górę lub w dół).
    4. Ustaw dodawanie inokulów do naczyń.
      1. Aktywuj Add Cell Plate. Zdefiniuj typ płytki, nazwę i lokalizację płytki zawierającej medium.
      2. Kliknij Add Cells To Vessels. Wprowadź czas inokulacji i objętość pożywki, która ma zostać dodana do naczyń.
      3. Zdefiniuj ścieżkę poruszania się modułu dozującego ciecze podczas transferu komórek z płytki do naczyń. Kliknij Next, aby przejść do następnej karty.
        UWAGA: Upewnij się, że opcja Reuse Pipette Tips jest dezaktywowana, aby uniknąć zanieczyszczeń krzyżowych i nieprawidłowego początkowego stężenia żywych komórek.
    5. Ustaw dodawanie pożywki do dokarmiania, glukozy i odpieniacza.
      UWAGA: Procedura dodawania pożywki do dokarmiania, glukozy i odpieniacza jest do siebie podobna. Na potrzeby niniejszego protokołu procedura została opisana dla „pożywki do dokarmiania” (Feed). Można ją powtórzyć dla glukozy i odpieniacza.
      1. Aktywuj Add Feed Plate i zdefiniuj typ płytki, nazwę oraz lokalizację. Kliknij Add Feed To Vessels i wprowadź objętość pożywki do dodania do naczyń. Zdefiniuj mapowanie transferu pożywki z płytki do naczyń.
      2. W zależności od procesu hodowli, dodaj liczbę cykli dokarmiania. W przypadku tej hodowli reaktor jest dokarmiany co 24 godziny, zaczynając od 72 godziny.
      3. Ręcznie dodaj opóźnienie czasowe między dokarmianiami, wprowadzając dane w polu Delay from cells added. Pierwszy dzień dokarmiania następuje po 72 godzinach od inokulacji, kolejny po 96 godzinach i tak dalej.
        UWAGA: Dodawanie odpieniacza jest zaprogramowane codziennie, aby zapobiec pienieniu się podczas hodowli.
    6. Ustaw pobieranie próbek podczas hodowli.
      1. Aktywuj Add Sample Plate i zdefiniuj typ płytki, nazwę oraz lokalizację.
      2. Zaznacz Take Sample from Vessels i wprowadź objętość próbki, która ma zostać pobrana z naczyń. Zdefiniuj mapowanie transferu próbki z naczyń na płytkę. Upewnij się, że objętość nie spadnie poniżej 10 mL w całym przebiegu hodowli.
      3. Dodaj liczbę próbek do pobrania podczas hodowli. Podobnie jak w przypadku dokarmiania, wprowadź czas pobrania próbki z naczynia dla każdego punktu poboru.
    7. Zapisz proces. Jest on teraz gotowy do wykonania.
      UWAGA: Aby zapewnić prawidłowy przebieg protokołu, przejdź do karty Process Steps w oprogramowaniu do hodowli komórkowej AMBR i wybierz Process Step view, aby zwizualizować przebieg receptury.
  3. Projektowanie eksperymentu (DOE) w zautomatyzowanym mikrobioreaktorze
    1. Aby uruchomić oprogramowanie DOE bioreaktora, upewnij się, że receptura w głównym oprogramowaniu została zapisana i jest gotowa do użycia.
    2. Otwórz oprogramowanie AMBR 15 DOE, kliknij Investigation i wybierz New.
      1. Wprowadź nazwę nowego badania DOE w oknie dialogowym Create Investigation.
      2. Aby przypisać eksperyment do badania DOE, otwórz recepturę stworzoną do badania różnych parametrów. Kliknij Browse i wybierz odpowiedni eksperyment.
    3. Zdefiniuj czynnik DOE.
      1. Tagi naczyń są już wymienione w kolumnie. Aby zdefiniować pożądany czynnik DOE, wybierz parametr i kliknij kolumnę oznaczoną jako DOE factor. Wybierz New i dodaj jednostki, skrót oraz dolną i górną granicę czynników (np. temperatura, DO, pH).
    4. Zdefiniuj czynnik odpowiedzi.
      1. Po zdefiniowaniu czynników DOE, określ odpowiedź, na podstawie której ustrukturyzowana zostanie analiza eksperymentalna.
      2. W karcie Responses zdefiniuj wartości, które mają zostać uwzględnione w analizie danych.
      3. Kliknij Edit DOE Responses i zdefiniuj nazwę odpowiedzi, skrót, jednostki oraz granice minimalne i maksymalne (np. miano, stężenie żywych komórek).
      4. Po zdefiniowaniu odpowiedzi wybierz zmienną AMBR dla każdej odpowiedzi i zdefiniuj tę zmienną. Odpowiedź może zostać automatycznie powiązana ze zmienną mikrobioreaktora; wybierz wymaganą zmienną z listy rozwijanej.
      5. Zmień równanie dla każdej odpowiedzi w zależności od wymagań. Możliwy jest wybór danych minimalnych, maksymalnych, pierwszych, ostatnich lub średnich.
    5. Utwórz projekt.
      1. Użyj kreatora Start Design Wizard, aby wybrać typ projektu eksperymentalnego oraz dodać lub usunąć liczbę powtórzeń i punktów środkowych.
      2. Wybierz cel, który determinuje wybór projektów i modeli:
        Screening: Wykorzystuje modele liniowe i interakcji w celu znalezienia istotnych czynników
        Optimization (RSM): Wykorzystuje modele kwadratowe i sześcienne do szczegółowego modelowania i optymalizacji
        Split objective: Modele dla czynników formulacji i procesu mogą być wybierane oddzielnie
      3. Po ustaleniu celu wybierz model i projekt wraz z liczbą punktów środkowych i powtórzeń.
      4. Kliknij Finish i przejdź do następnej karty.
    6. Zdefiniuj eksperyment.
      UWAGA: Czynniki DOE są wymienione w prawej kolumnie oprogramowania. Po wybraniu pożądanych czynników, naczynia realizujące dany eksperyment z określonym parametrem zostaną podświetlone. Naczynia w stacji hodowli można przesuwać, klikając prawym przyciskiem myszy na naczynie i przenosząc je w pożądane miejsce.
      1. Utwórz pakiety robocze (work packets), które mogą zostać zaimportowane do oprogramowania do hodowli komórkowej AMBR. W zależności od liczby eksperymentów tworzone i przechowywane są różne pakiety robocze do późniejszej implementacji
  4. Wykonanie eksperymentu w pakietach roboczych utworzonych na laptopie sterującym AMBR
    1. W karcie Experiment kliknij Create DOE Experiment i wyszukaj pakiet roboczy utworzony w oprogramowaniu DOE.
    2. Zainicjuj proces, klikając Start.
  5. Analiza wyników eksperymentalnych
    1. Po wykonaniu eksperymentu wyeksportuj dane za pomocą opcji Export DOE Results. Otworzy się okno Export DOE Results, a w tabeli zostaną wyświetlone wiersze wskazujące naczynie hodowlane i stację.
    2. Wybierz żądane wiersze i kliknij Exported Selected Rows lub Export Experimental data, aby zapisać wszystkie wyniki w pliku do dalszej analizy.
    3. Zaimportuj dane do modułu AMBR DOE, przechodząc do karty Results i wybierając Import Results.
    4. Wyszukaj odpowiedni plik danych i kliknij Analysis Results.
    5. Przeprowadź dalszą analizę wyników w programie MODDE.

4. Przeprowadzenie hodowli w zautomatyzowanym mikrobioreaktorze

UWAGA: Poniższe kroki są wykonywane przez użytkownika z pomocą protokołu napisanego w wyżej wymienionym oprogramowaniu. Kroki te są realizowane przez użytkownika, chyba że zaznaczono inaczej.

  1. Załadunek naczyń
    1. Otwórz sterylizowane promieniami gamma naczynia hodowlane w komorze z laminarnym przepływem powietrza i ustaw je w stacji hodowlanej zgodnie z przedstawionym schematem w Rycina 2.
    2. Oczyścić płytkę zaciskową 70% etanolem oraz wodą dwukrotnie destylowaną. Następnie poddać płytkę autoklawowaniu i umieścić ją na górze naczynia.
    3. Zamontuj płytę zaciskową z płytą mieszającą, upewniając się, że każdy trzpień jest mocno osadzony.
    4. Mocno dokręć zarówno płytkę mieszadełka, jak i płytkę zaciskową do zespołu mieszającego.
  2. Uruchamianie oprogramowania mikrobioreaktora
    1. Należy użyć programu opisanego w sekcji 3 do przeprowadzenia hodowli.
    2. Wizualizacja zaplanowanych lub zrealizowanych kroków procesu w Proces tab. W razie potrzeby zmień etapy hodowli podczas przebiegu procesu, najpierw wstrzymując pracę urządzenia do obsługi cieczy, a następnie edytując recepturę procesu.
    3. Przed uruchomieniem mieszadła do naczyń należy dodać odpieniacz, aby zapobiec nadmiernemu pienieniu się podczas hodowli. Odpieniacz będzie dodawany regularnie, a obecność piany będzie monitorowana wizualnie.
  3. Dodawanie pożywki do naczynia
    1. Napełnij ręcznie dostarczoną płytkę 24-dołkową z mikrobioreaktorami sterylną pożywką i umieść ją w wyznaczonej sekcji systemu. Upewnij się, że płytka została umieszczona w sekcji wskazanej w programie (rozdział 3). Napełnianie naczynia odbędzie się zgodnie z opisem w rozdziale 3.2.2.
      UWAGA: Nagrzewanie i mieszanie rozpoczynają się niezwłocznie po dodaniu pożywki oraz odpieniacza. Odczyt z czujnika jest aktywowany 1 godzinę po napełnieniu naczynia (krok Start Monitor). Napowietrzanie każdego naczynia rozpoczyna się po aktywacji odczytu. Pożywka jest pozostawiana do wyrównania parametrów przez minimum 6 godzin przed ponowną kalibracją pH i inokulacją. Parametry procesu mogą być zmieniane w oprogramowaniu, zgodnie z opisem w sekcji 3.2.3.
  4. Inokulacja
    1. Zmierz stężenie żywych komórek po 5th pasaż. Obliczyć liczbę komórek do przeniesienia do naczyń, aby zapewnić, że początkowe stężenie komórek we wszystkich naczyniach wynosi 3 x 105 komórek/ml
    2. Przenieś komórki do 24-dołkowej płytki głębokiej w taki sposób, aby objętość zawiesiny była co najmniej 1,6 raza większa od objętości wymaganej. Dla wymaganej objętości szczepionki wynoszącej 2 ml, przenieś 3,2 ml zawiesiny komórkowej do każdego dołka w płytce.
    3. Umieść płytkę 24-dołkową w wyznaczonym miejscu na platformie. Naczynia zostaną zaszczepione zgodnie z opisem w sekcji 3.2.4.
  5. Codzienne pobieranie próbek i analizy
    1. Usuń a 460 μL pobierać próbki z naczyń codziennie przy użyciu automatycznego systemu do obsługi cieczy. Rozcieńczyć 200 µL próbki za pomocą 800 µL przefiltrowanego buforu 1x PBS (rozcieńczenie 5x), a następnie umieścić w liczniku komórek.
    2. Wirować pozostałą próbkę przez 5 min przy 190 x g. g do temperatury pokojowej, a następnie należy przechowywać nadsącz do dalszych analiz (glukozy, mleczanu, glutaminy i glutaminianu).
    3. Zamrażanie 100 µL nadpływu w temperaturze -20 °C do końca hodowli w celu ilościowego oznaczenia białka.
  6. Zakończenie hodowli
    1. Po zakończeniu kontroli parametrów procesu (tj. temperatury, mieszania, pH i DO), należy przerwać monitorowanie procesu.
    2. Odkręć płytkę mieszalnika i płytkę zaciskową.
    3. Wyjąć naczynia hodowlane i oczyścić stanowiska hodowli. Umieścić płyty suszące na stanowiskach hodowli i przykręcić je.
    4. W tym czasie dokładnie oczyść płytki zaciskowe 70% etanolem i wodą dwukrotnie destylowaną.
    5. Kliknij Zatrzymaj w oprogramowaniu bioreaktora po zakończeniu cyklu suszenia.
  7. Zbiór hodowli komórkowych
    1. Zbierz komórki w 12. dniu hodowli, ręcznie przelewając zawartość naczyń do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml. Odwiruj zawiesinę komórkową przy 190 x g przez 30 min.
    2. Odcień pellet komórkowy i przechowuj nadsącz w temperaturze -20 °C.

5. Pomiar stężenia przeciwciał mAb

  1. Do ilościowego oznaczenia białka podczas procesu hodowli należy użyć kolumny z białkiem A o pojemności 1,7 mL.
  2. Przed rozmrożeniem próbek należy przygotować bufor równoważący i bufor elucyjny.
    1. Jako bufor równoważący należy zastosować roztwór 0,5 M Na2HPO4 zawierający 0,5 M NaCl o pH 7,9, a jako bufor elucyjny roztwór 10 mM glicyny zawierający 0,5 M NaCl o pH 2.
  3. Oba bufory należy przefiltrować przez membranę 0,2 µm i odgazować przed przystąpieniem do analizy.
  4. Przepłukać system wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) świeżo przygotowanym buforem równoważącym.
  5. Zamontować kolumnę z białkiem A w systemie HPLC.
  6. Przeprowadzić chromatografię przy szybkości przepływu 1 mL/min. Temperaturę termostatu kolumny ustawić na 30 °C, a temperaturę autosamplera na 10 °C.
  7. Zamrożone próbki rozmrozić w temperaturze pokojowej, a następnie 25 µL każdej próbki przefiltrować przez membranę PVDF 0,2 µm. Próbki o wyższym stężeniu pożądanego białka rozcieńczyć w stosunku 1:20 buforem równoważącym i przefiltrować przez membranę przed umieszczeniem w autosamplerze.
  8. Umieścić próbki w autosamplerze. Wgrać metodę i sekwencję do oprogramowania, a następnie uruchomić sekwencję.
    UWAGA: Metoda składa się z trzech faz (patrz Rysunek 1): wstrzyknięcie próbki do kolumny przez pierwsze dwie minuty, następnie podawanie buforu elucyjnego przez 8 min oraz regeneracja kolumny buforem równoważącym przez 10 min.

Wykres procesu chromatografii; przedstawia elucję przeciwciał monoklonalnych (mAb); fazy: wtrysk, elucja, regeneracja kolumny.
Rycina 1: Chromatogram białka A, przedstawiający poszczególne fazy podczas jednego cyklu. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przegląd hodowli przeprowadzonej w niniejszym badaniu przedstawiono na Rysunku 2.

Analiza pH próbek w mikropłytce przy prędkościach mieszania 1050 i 130 obr./min; schemat doświadczenia.
Rycina 2: Schematyczny przedstawienie warunków eksperymentalnych służących do przetestowania profili pH i pręd...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Optymalizacja procesu w celu zwiększenia uzysku ma kluczowe znaczenie w przemyśle biofarmaceutycznym. Kolby do wytrząsania mogą być potencjalnie używane do badania przesiewowego szczepu; jednak monitorowanie parametrów procesu, takich jak pH i DO, jest niedostępne w kolbach. Mikrobioreaktory mają tę zaletę, że umożliwiają ciągłe monitorowanie i kontrolę procesu. Te pętle sterowania w mikrobioreaktorze zapewniają również warunki podobne do tych na większą skalę, a tym samym dostarczają wyniki porównywalne z bioreaktorami ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), Federalnemu Ministerstwu Edukacji i Badań Naukowych, Niemcy, oraz zespołowi BioProcessing firmy Sartorius Stedim Biotech GmbH, Niemcy, za wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Jednorazowe końcówki do pipet 1 mL, sterylizowaneSartorius Stedim Biotech GmbHA-0040
200 mM L-glutaminaCorning, Merck25-005-CV
24 Płytki głębinoweSartorius Stedim Biotech GmbHA-0038
Jednorazowe końcówki do pipet 5 mL, sterylizowaneSartorius Stedim Biotech GmbHA-0039
ambr 15 zautomatyzowane system mikrobioreaktorówSartorius Stedim Biotech GmbH001-2804
ambr 15 Hodowla komórkowa 24 Jednorazowe bioreaktory - SpargedSartorius Stedim Biotech GmbH001-1B86
Emulsja przeciwpieniąca CSigma-Aldrich, MerckA8011
Sterylny filtr butelkowyCorning, MerckCLS4314740,1 μ m wielkość porów
CEDEX Detergent (3% Mucosol)Roche Innovatis AG05-650-658-001
Licznik komórekRoche Innovatis AG05-650-216-001CEDEX HiRes
Linia komórkowa CHO DG44Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH
CHOKO Feed Media A (FMA)Sigma-Aldrich, MerckCR80025
CHOKO Feed Media B (FMB)Sigma-Aldrich, MerckCR80026
CHOKO Pożywka produkcyjnaSigma-Aldrich, MerckCR80027
CHOKO Kultura zapasowa MeiumSigma-Aldrich, MerckCR80028
Chromaster system wysokociśnieniowej chromatografii cieczowejVWR Międzynarodowa
stożkowa probówka wirówkowaCorning, MerckSIAL0790
EtanolMerck
Fiolki z glicynąCarl Roth56-40-6
VWRInternationalSUPLSU860181
PBSSigma-Aldrich, MerckP4417
Kolumna białkowa AThermo Fisher Scientific1502226POROS™ A 1.7  ml
Chlorek soduSigma-Aldrich, Merck7647-14-5
Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodnySigma-Aldrich, Merck7558-79-4
Błękit trypanowyVWR InternationalVWRVK940
YSIYSI Inc2900DYSI 2900 Wybierz
1070179026

Bibliografia

  1. Langer, E. S. 15th Annual report and survey of Biopharmaceutical Manufacturing Capacity and Production: A study of Biotherapeutical Developers and Contract Manufacturing Organizations. Bioplan Associates. , Available from: http://bioplanassociates.com/wp-content/uploads/2018/07/15thAnnualBiomfgReport_TABLEOFCONTENTS-LR.pdf (2019).
  2. Walsh, G. Biopharmaceutical benchmarks 2018. Nature Biotechnology. 36, 1136(2018).
  3. Kim, J. Y., Kim, Y., Lee, G. M. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 917-930 (2012).
  4. Lai, T., Yang, Y., Ng, S. K. Advances in Mammalian cell line development technologies for recombinant protein production. Pharmaceuticals (Basel). 6 (5), 579-603 (2013).
  5. Carlage, T., et al. Analysis of dynamic changes in the proteome of a Bcl-XL overexpressing Chinese hamster ovary cell culture during exponential and stationary phases. Biotechnology Progress. 28 (3), 814-823 (2012).
  6. Hacker, D. L., de Jesus, M., Wurm, F. M. 25 years of recombinant proteins from reactor-grown cells - where do we go from here. Biotechnology Advances. 27 (6), 1023-1027 (2009).
  7. Shukla, A. A., Gottschalk, U. Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing. Trends in Biotechnology. 31 (3), 147-154 (2013).
  8. Ao, S., Gelman, L. Advances in electrical engineering and computational science. Lecture notes in electrical engineering. 39, Springer. New York. (2009).
  9. Bareither, R., et al. Automated disposable small scale reactor for high throughput bioprocess development: a proof of concept study. Biotechnology and Bioengineering. 110 (12), 3126-3138 (2013).
  10. Kang, Y., Ludwig, D. L., Balderes, P. What can cell culture flocculation offer for antibody purification processes. Pharmaceutical Bioprocessing. 2 (6), 483-485 (2014).
  11. Choe, W., Durgannavar, T. A., Chung, S. J. Fc-Binding Ligands of Immunoglobulin G: An Overview of High Affinity Proteins and Peptides. Materials (Basel). 9 (12), (2016).
  12. Schäpper, D., et al. Application of microbioreactors in fermentation process development: a review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 395 (3), 679-695 (2009).
  13. Zhang, Z., et al. Microbioreactors for Bioprocess Development. Journal of the Association for Laboratory Automation. 12 (3), 143-151 (2007).
  14. Claßen, J., et al. Spectroscopic sensors for in-line bioprocess monitoring in research and pharmaceutical industrial application. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (3), 651-666 (2017).
  15. Janoschek, S., et al. A protocol to transfer a fed-batch platform process into semi-perfusion mode: The benefit of automated small-scale bioreactors compared to shake flasks as scale-down model. Biotechnology Progress. 35 (2), 2757(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zautomatyzowany mikrobioreaktorprojektowanie eksperymentuparametry bioprocesoweoprogramowanie DOEhodowla kom rkowapr dko mieszania RPMtlen rozpuszczonykontrola pH
Optymalizacja procesów z wykorzystaniem zautomatyzowanych mikrobioreaktorów o wysokiej przepustowości w hodowli komórek jajnika chomika chińskiego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.