Method Article

Identyfikacja regulatorów czynników transkrypcyjnych za pomocą średnioprzepustowego badania przesiewowego bibliotek tablicowych i reportera opartego na podwójnej lucyferazie

DOI:

10.3791/60582

⸱

March 27th, 2020

 , 
1Department of Molecular & Cellular Physiology, Albany Medical College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zidentyfikować nowe regulatory czynników transkrypcyjnych, opracowaliśmy podejście do badania przesiewowego bibliotek RNAi lentiwirusowych lub retrowirusowych za pomocą testu reporterowego opartego na podwójnej lucyferazie. Takie podejście oferuje szybki i stosunkowo niedrogi sposób na przebadanie przesiewowe setek kandydatów w jednym eksperymencie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czynniki transkrypcyjne mogą zmieniać ekspresję wielu genów docelowych, które wpływają na różne dalsze procesy, co czyni je dobrymi celami dla terapii przeciwnowotworowych. Jednak bezpośrednie ukierunkowanie na czynniki transkrypcyjne jest często trudne i może powodować niepożądane skutki uboczne, jeśli czynnik transkrypcyjny jest niezbędny w jednej lub więcej dorosłych tkanek. Identyfikacja wcześniejszych regulatorów, które nieprawidłowo aktywują czynniki transkrypcyjne w komórkach nowotworowych, stanowi bardziej realną alternatywę, zwłaszcza jeśli białka te są łatwe do wyleczenia. W tym miejscu opisujemy protokół, który można wykorzystać do połączenia macierzowanych bibliotek lentiwirusowych na średnią skalę i testu reporterowego opartego na podwójnej lucyferazy w celu zidentyfikowania nowych regulatorów czynników transkrypcyjnych w komórkach nowotworowych. Nasze podejście oferuje szybki, łatwy i niedrogi sposób na przetestowanie setek genów w jednym eksperymencie. Aby zademonstrować zastosowanie tego podejścia, przeprowadziliśmy badanie przesiewowe macierzowanej biblioteki RNAi lentiwirusa zawierającej kilka regulatorów białka związanego z Tak (YAP) i koaktywatora transkrypcji z motywem wiążącym PDZ (TAZ), dwóch koaktywatorów transkrypcji, które są dalszymi efektorami szlaku Hippo. Jednak podejście to można zmodyfikować w celu wykrycia regulatorów praktycznie dowolnego czynnika transkrypcyjnego lub kofaktora, a także można je wykorzystać do badań przesiewowych bibliotek CRISPR/CAS9, cDNA lub ORF.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego testu jest wykorzystanie bibliotek wirusowych do identyfikacji regulatorów czynników transkrypcyjnych w stosunkowo szybki i tani sposób. Nieprawidłowa aktywność transkrypcyjna jest związana z rakiem i przerzutami1,2,3,4,5,6, więc ukierunkowanie na czynniki transkrypcyjne w komórkach nowotworowych jest obiecującym podejściem terapeutycznym. Jednak czynniki transkrypcyjne są często trudne do farmakologicznego ukierunkowania7, a wiele z nich....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Schematyczne podsumowanie tego protokołu jest pokazane w Rysunek 1.

1. Przygotowanie biblioteki wektorów lentiwirusowych

UWAGA: Na zademonstrowanym ekranie użyto biblioteki shRNA zakupionej jako zapasy glicerolu na 96-dołkowych płytkach, ale biblioteki mogą być również tworzone ręcznie na podstawie listy kandydatów. Odpowiednie formanty powinny być brane pod uwagę i uwzględniane w każdej bibliotece. Obejmuje to kontrolne shRNA nieukierunkowane (shNTC), kontrolne shRNA ukierunkowane na badany czynnik transkrypcyjny oraz, jeśli to możliwe, shRNA ukierunkowane na lucyferazę świetli....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasz konstrukt reportera YAP/TAZ-TEAD (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) zawiera minimalny promotor SV-49 z 5 powtórzeniami kanonicznego elementu wiążącego TEAD (MCAT)15 sterujący genem lucyferazy świetlika (Rysunek 1). Jest on kotransfekowany do komórek wraz z wektorem kontrolnym PRL-TK (Promega), który eksprymuje lucyferazy Renilla z kons.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu demonstrujemy podejście do średnioprzepustowych badań przesiewowych macierzowych bibliotek wirusowych w połączeniu z testem reporterowym opartym na podwójnej lucyferazy, który można wykorzystać do identyfikacji i testowania nowych regulatorów czynników transkrypcyjnych. Bardzo ważne jest, aby scharakteryzować i zoptymalizować system reporterowy dla każdej linii komórkowej przed przeprowadzeniem jakiegokolwiek badania. Należy przeprowadzić doświadczenia w celu potwierdzenia, że osoba zgłaszająca reaguje na z.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Emily Norton i Mikaelanowi Cucciarre-Stuligrossowi za pomoc w przygotowaniu wektorów shRNA. Praca ta została częściowo wsparta grantem Susan G. Komen Career Catalyst Grant, który został przyznany J.M.L. (#CCR17477184).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,0 ml 96-dołkowa głęboka płytka polipropylenowaUSA Scientific1896-2000Do mikro-preparatu bakteryjnego
Trypsyna - 2,50%Gibco15090-046Składnik trypsyny-EDTA
96-dołkowa biała płytka testowa z płaskim dnemCorning3922Do testu podwójnej lucyferazy
Ampicylina - 100 mg / mlSigma-Aldrich45-10835242001-EADo mini-preparatu bakteryjnego
Bactoo-trypton - proszekSigma-Aldrich95039Składnik bulionu LB
System testów reporterowych z podwójną lucyferazy, który obejmuje odczynnik LAR II (odczynnik A), Stop & Glo substrate (substrat odczynnika B) oraz Stop & Bufor Glo (bufor odczynnika B) - ZestawPromegaE1960Do testu podwójnej lucyferazy
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco bez wapnia, magnezu i czerwieni fenolowej - 9,6 g/LHimediaTS1006Dla PBS
EDTA - 0,5 MVWR97061-406Składnik etanolu trypsyna-EDTA
- 100%Pharmco-AAPER111000200Do mini-preparatu bakteryjnego
Płod Surowica bydlęca - 100%VWR97068-085Składnik kompletnych pożywek wzrostowych
Bromek heksadimetryny (Polybrene) - 8 mg/mlSigma-Aldrich45-H9268Na infekcję wirusową
HyClone DMEM/Wysoka glukoza - 4 mM L-glutamina; 4500 mg/L glukozy; pirogronian soduGE Healthcare nauki przyrodniczeSH30243.01Składnik kompletnej pożywki wzrostowej
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EAUrządzenia molekularneDo testu podwójnej lucyferazy
BDHBDH9286Składnik bulionu LB
NanoDrop One Mikroobjętość Spektrofotometr UV-VisThermo scientificDo pomiaru stężenia DNA wektora
Opti-MEM (bufor transfekcyjny) - 100%Gibco31985-062Do transfekcji
Penicylina Streptomycyna - 10 000 jednostek/ml (penicylina); 10 000 i mikro; g/ml (Streptomycyna)Gibco15140-122Składnik kompletnej pożywki
hodowlanej PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - ZestawThermo Fisher ScientificK210010Do minipreparatu bakteryjnego
Puromycyna - 2,5 mg/mlSigma-Aldrich45-P7255Do selekcji antybiotyków po infekcji
TC20 Automatyczny licznik komórekBio-RadDo liczenia komórek
Odczynnik do transfekcji DNA X-tremeGENE 9 (Odczynnik do transfekcji 1) - 100%Roche6365787001Do pakowania wirusów
Ekstrakt drożdżowy - proszekVWRJ850Składnik bulionu LB
P3000 (odczynnik do transfekcji 3) - 100%Life technologiesL3000008Do transfekcji
L-Glutamina - 200 mM Gibco 25030-081 Składnik kompletnej pożywki wzrostowej Lipofectamine 3000 (odczynnik do transfekcji 2) - 100%Life technologies L3000008 Do transfekcji Biologia molekularna Woda - 100%VWR 02-0201-0500 Do rozcieńczania wektora shRNA do pakowania wirusów NaCl - proszek

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
  2. Lamar, J. M., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transcription Factor RegulatorsMedium Throughput ScreeningArrayed Lentiviral LibrariesDual Luciferase ReporterYAP TAZ RegulationHippo Pathway ScreeningRNAi Library ScreeningViral Vector ProductionLuciferase Activity AssayPuromycin Selection

Related Articles