Method Article

Identyfikacja regulatorów czynników transkrypcyjnych za pomocą średnioprzepustowego badania przesiewowego bibliotek tablicowych i reportera opartego na podwójnej lucyferazie

DOI:

10.3791/60582

⸱

March 27th, 2020

 , 
1Department of Molecular & Cellular Physiology, Albany Medical College

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zidentyfikować nowe regulatory czynników transkrypcyjnych, opracowaliśmy podejście do badania przesiewowego bibliotek RNAi lentiwirusowych lub retrowirusowych za pomocą testu reporterowego opartego na podwójnej lucyferazie. Takie podejście oferuje szybki i stosunkowo niedrogi sposób na przebadanie przesiewowe setek kandydatów w jednym eksperymencie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czynniki transkrypcyjne mogą zmieniać ekspresję wielu genów docelowych, które wpływają na różne dalsze procesy, co czyni je dobrymi celami dla terapii przeciwnowotworowych. Jednak bezpośrednie ukierunkowanie na czynniki transkrypcyjne jest często trudne i może powodować niepożądane skutki uboczne, jeśli czynnik transkrypcyjny jest niezbędny w jednej lub więcej dorosłych tkanek. Identyfikacja wcześniejszych regulatorów, które nieprawidłowo aktywują czynniki transkrypcyjne w komórkach nowotworowych, stanowi bardziej realną alternatywę, zwłaszcza jeśli białka te są łatwe do wyleczenia. W tym miejscu opisujemy protokół, który można wykorzystać do połączenia macierzowanych bibliotek lentiwirusowych na średnią skalę i testu reporterowego opartego na podwójnej lucyferazy w celu zidentyfikowania nowych regulatorów czynników transkrypcyjnych w komórkach nowotworowych. Nasze podejście oferuje szybki, łatwy i niedrogi sposób na przetestowanie setek genów w jednym eksperymencie. Aby zademonstrować zastosowanie tego podejścia, przeprowadziliśmy badanie przesiewowe macierzowanej biblioteki RNAi lentiwirusa zawierającej kilka regulatorów białka związanego z Tak (YAP) i koaktywatora transkrypcji z motywem wiążącym PDZ (TAZ), dwóch koaktywatorów transkrypcji, które są dalszymi efektorami szlaku Hippo. Jednak podejście to można zmodyfikować w celu wykrycia regulatorów praktycznie dowolnego czynnika transkrypcyjnego lub kofaktora, a także można je wykorzystać do badań przesiewowych bibliotek CRISPR/CAS9, cDNA lub ORF.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego testu jest wykorzystanie bibliotek wirusowych do identyfikacji regulatorów czynników transkrypcyjnych w stosunkowo szybki i tani sposób. Nieprawidłowa aktywność transkrypcyjna jest związana z rakiem i przerzutami1,2,3,4,5,6, więc ukierunkowanie na czynniki transkrypcyjne w komórkach nowotworowych jest obiecującym podejściem terapeutycznym. Jednak czynniki transkrypcyjne są często trudne do farmakologicznego ukierunkowania7, a wiele z nich jest wymaganych do prawidłowego funkcjonowania komórek w tkankach dorosłych8,9,10. Celowanie w szlaki związane z rakiem, które nieprawidłowo aktywują czynniki transkrypcyjne w celu napędzania choroby, jest bardziej wykonalnym podejściem, które może mieć mniej poważne skutki uboczne. Komercyjna dostępność matrycowych lentiwirusowych i retrowirusowych RNAi, CRISPR/CAS9, cDNA lub bibliotek ORF pozwala naukowcom przetestować znaczenie wielu genów w jednym eksperymencie. Wymagany jest jednak wiarygodny odczyt zmienionej aktywności transkrypcyjnej.

Tutaj opisujemy użycie testu reporterowego opartego na podwójnej lucyferazy transkrypcyjnej i uporządkowanych bibliotek lentiwirusowych do identyfikacji białek, które regulują czynniki transkrypcyjne w komórkach nowotworowych. W tym teście shRNA, które celują w geny związane z rakiem, są dostarczane do komórek raka ssaków poprzez transdukcję lentiwirusową, a komórki są selekcjonowane do stabilnej integracji za pomocą puromycyny. Komórki są następnie transfekowane konstruktem reporterowym, który wyraża lucyferazy świetlika napędzanej przez promotor specyficzny dla badanego czynnika transkrypcyjnego oraz konstruktem kontrolnym, który wyraża lucyferazy Renilla z konstytutywnie aktywnego promotora, który nie reaguje na badany czynnik transkrypcyjny. Demonstrujemy to podejście za pomocą ekranu potwierdzającego słuszność koncepcji dla regulatorów YAP i TAZ, krytycznych efektorów dalszych szlaków Hippo pathway8,10,11. Nieprawidłowa aktywność YAP i TAZ sprzyja kilku etapom kaskady przerzutów11 i jest obserwowana w wielu nowotworach11,12,13. Jednak sposób, w jaki YAP i TAZ stają się nieprawidłowo aktywowane w niektórych komórkach nowotworowych, nie jest jeszcze w pełni zrozumiały. YAP i TAZ nie wiążą DNA, ale zamiast tego są rekrutowane do promotorów przez inne czynniki transkrypcyjne. Czynniki transkrypcyjne należące do rodziny domen TEA (TEAD) są głównymi partnerami wiążącymi YAP i TAZ oraz mają kluczowe znaczenie dla większości funkcji zależnych od YAP i TAZ. Nasz konstrukt reporterowy wyraża lucyferazy świetlika z promotora reagującego na YAP/TAZ-TEAD, a poprzednie badania wykazały, że wiernie wykrywa zmiany w aktywności transkrypcyjnej YAP-TEAD i TAZ-TEAD2,14,15.

Nasze podejście jest szybkie, o średniej przepustowości i nie wymaga urządzeń do selekcji, zautomatyzowanych robotów ani głębokiego sekwencjonowania bibliotek w puli. Koszty są stosunkowo niskie, a do wyboru jest wiele komercyjnie dostępnych bibliotek. Wymagany sprzęt i odczynniki są również stosunkowo standardowe w większości laboratoriów. Może być stosowany do badań przesiewowych pod kątem regulatorów praktycznie każdego czynnika transkrypcyjnego, jeśli istnieje lub jest generowany reporter oparty na lucyferazy. Używamy tego podejścia do badań przesiewowych shRNA w komórkach nowotworowych, ale każda linia komórkowa, która może być transfekowana z rozsądną wydajnością, może być używana z dowolnym typem biblioteki macierzowej.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Schematyczne podsumowanie tego protokołu jest pokazane w Rysunek 1.

1. Przygotowanie biblioteki wektorów lentiwirusowych

UWAGA: Na zademonstrowanym ekranie użyto biblioteki shRNA zakupionej jako zapasy glicerolu na 96-dołkowych płytkach, ale biblioteki mogą być również tworzone ręcznie na podstawie listy kandydatów. Odpowiednie formanty powinny być brane pod uwagę i uwzględniane w każdej bibliotece. Obejmuje to kontrolne shRNA nieukierunkowane (shNTC), kontrolne shRNA ukierunkowane na badany czynnik transkrypcyjny oraz, jeśli to możliwe, shRNA ukierunkowane na lucyferazę świetlika.

  1. Dodaj 1,3 ml bulionu Luria (LB) (1% bakto-tryptonu, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 1% NaCl, pH 7,5) zawierającego 100 μg/ml ampicyliny do każdego dołka 96-dołkowej płytki głębinowej. Zaszczepić każdą studzienkę 2 μl glicerolu i rosnąć w temperaturze 37 °C przez noc, stale mieszając przy 225 obr./min.
  2. Przenieść każdą kulturę bakteryjną do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i osadzać bakterie przez odwirowanie w temperaturze 21 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
  3. Oczyść każdy wektor za pomocą bakteryjnego zestawu do mini-przygotowania, postępując zgodnie z protokołem producenta.
  4. Określ stężenie każdego wektora za pomocą spektrofotometru.
  5. Przechowywać plazmidy w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

2. Pakowanie biblioteki lentiwirusowej z tablicą

UWAGA: Wszystkie prace związane z lentiwirusem, w tym pakowanie, infekcja i późniejsza hodowla zainfekowanych komórek, powinny ściśle przestrzegać zasad i przepisów dotyczących bezpieczeństwa biologicznego.

  1. Namnażanie komórek 293FT za pomocą kompletnych pożywek wzrostowych (zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM) firmy Dulbecco zawierająca 4 mM L-glutaminę, 4500 mg / L glukozy i pirogronian sodu, uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 jednostek / ml penicyliny, 100 μg / ml antybiotyku streptomycyny i 2 mM L-glutaminy).
  2. Dla każdego wektora w bibliotece z kroku 1.4 zasiej jeden 24-dołkowy z komórkami 1 x 105 293FT.
    UWAGA: Zaleca się, aby przed przejściem do kroku 3 zapakować kilka dodatkowych studzienek kontrolnego wektora wirusowego i użyć ich do zbadania miana wirusa (patrz poniżej).
  3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny
    UWAGA: Ogólny protokół pakowania lentiwirusa, który został opisany wcześniej14 został zmniejszony do 24 dołków dla tego protokołu. Wykorzystuje psPAX2 do pakowania lentiwirusa i VSVG jako białko płaszcza. Jeśli pożądany jest wirus ektropiczny, zamiast VSVG można użyć wektora dostarczającego Eco. Zdecydowanie zaleca się, aby ten protokół był zoptymalizowany w celu osiągnięcia miana wirusa, które daje od 30% do 70% skuteczności infekcji komórek docelowych (patrz Dyskusja). Tabela uzupełniająca 1 zawiera listę wszystkich użytych wektorów.
  4. Skonfiguruj mieszaninę transfekcyjną dla każdego wektora wirusowego z kroku 1.4, jak opisano poniżej. Każda transfekcja powinna zawierać 250 ng wektora wirusowego, 125 ng psPAX2, 125 ng VSVG, 1,25 μl odczynnika do transfekcji 1 i 23,75 μl buforu transfekcyjnego (patrz tabela materiałów).
    1. Rozcieńczyć każdy wektor lentiwirusowy do 50 ng / μl wodą wolną od nukleaz, a następnie przenieść 5 μl (250 ng) do dołka z 96-dołkową płytką PCR.
    2. Przygotować super mieszankę do transfekcji, mieszając 1,25 μl * X odczynnika do transfekcji 1 i 23,75 μl * X wstępnie podgrzanego buforu do transfekcji, gdzie "X" oznacza całkowitą liczbę transfekcji plus kilka dodatkowych w celu uwzględnienia utraty objętości podczas pipetowania.
    3. Inkubować super mieszankę transfekcji w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    4. Dodaj 125 ng * X psPAX2 i 125 ng * X VSVG do probówki transfekcji super mix z kroku 2.4.3 i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać. Szybko przejdź do kroku 2.4.5.
    5. Natychmiast podwielokrotnić mieszaninę z kroku 2.4.4 do każdej probówki paska PCR, a następnie za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 25 μl mieszaniny do każdej studzienki zawierającej wektor wirusowy z kroku 2.4.1.
    6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
    7. Przenieść wszystkie 30 μl z każdego 96-dołkowego z kroku 2.4.6 do dołka z 24-dołkowym zawierającym 293 komórki FT z kroku 2.3.
  5. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny, a następnie zastąpić pożywkę w każdym dołku 24-dołkowej płytki 500 μl świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez kolejne 24 godziny.
  6. Za pomocą pipety wielokanałowej zebrać supernatant wirusa z każdej studzienki i podać 220 μl (wystarcza na 1 infekcję w kroku 3 plus trochę dodatkowej objętości) do dwóch 96 dołków każdy. Są to ułożone w układ wirusowe płytki supernatantowe.
  7. Przechowywać ułożone w układ płytki supernatantu wirusowego w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Zaleca się również przetestowanie części dodatkowego wirusa kontrolnego, który został umieszczony (patrz wyżej) na komórkach, które mają być zakażone, przed przejściem do Kroku 3. Ma to na celu zapewnienie, że miano jest wystarczające do osiągnięcia co najmniej 30% skuteczności infekcji.

3. Infekcja komórek na ekranie

UWAGA: Ludzkie komórki czerniaka (A375) zostały użyte do zademonstrowania tego podejścia, ale ta metoda może być zastosowana do wszystkich przylegających komórek, które infekują lentiwirusem. Jednak warunki hodowli komórkowej i posiewu powinny być zoptymalizowane dla każdej linii komórkowej (patrz Dyskusja).

  1. Rozwiń komórki, które mają zostać zainfekowane, w kompletnej pożywce wzrostowej.
  2. Wysiewaj 24-dołkowe płytki z 1 x 105 komórek w 0,5 ml kompletnej pożywki wzrostowej na dołek. Wysiew jedną studzienkę dla każdego wektora wirusowego, który ma być badany (w tym kontrole) i dołącz dodatkową studzienkę, która nie zostanie zainfekowana, która posłuży jako kontrola przy wyborze leku w kroku 3.7.
  3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny.
  4. Zainfekować każdą studzienkę z kroku 3.2 innym supernatantem wirusowym z zamrożonego supernatantu lentiwirusowego w układzie w następujący sposób.
    1. Przygotuj kompletną pożywkę wzrostową, która zawiera 20 μg/ml polibrenu.
    2. Rozmrozić supernatanty biblioteki lentiwirusowej z krokiem 2.7 do temperatury pokojowej.
    3. Odessać pożywkę wzrostową z 24-dołkowych płytek z kroku 3.2 i natychmiast dodać 200 μl pożywki wzrostowej zawierającej polibren do każdej studzienki.
    4. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 200 μl supernatantu wirusa z każdego 96-dołkowego z kroku 3.4.2 do 24 dołków z kroku 3.4.3.
  5. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 - 48 h.
    UWAGA: Niektóre linie komórkowe mogą potrzebować więcej niż 24 godziny, aby wyrazić shRNA i stać się odpornymi na puromycynę. Zastosowany tutaj wektor wirusowy dostarcza Turbo-GFP-IRES-puroR z shRNA opartym na miR30 w 3'UTR puroR (Rysunek 1). Skuteczność infekcji i ekspresję genu oporności na puromycynę oraz shRNA monitorowano za pomocą białka zielonej fluorescencji.
  6. Przygotuj kompletną pożywkę wzrostową, która zawiera 2,5 μg/ml puromycyny.
    UWAGA: Stężenie selekcyjne puromycyny różni się w zależności od linii komórkowych. Zaleca się wykonanie krzywej zabijania antybiotyków dla każdej linii komórkowej, która ma być oznaczona przed badaniem przesiewowym.
  7. Odessać pożywkę z każdej studzienki i zastąpić 500 μl kompletnej pożywki wzrostowej zawierającej puromycynę.
    UWAGA: Pamiętaj, aby dodać puromycynę do kontrolnej studni niezainfekowanej, którą można wykorzystać w kolejnych krokach, aby upewnić się, że wybór puromycyny jest kompletny.
  8. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 48 h.
    UWAGA: Najlepiej jest wybierać przez 48 godzin, więc gęstość posiewu i miano wirusa powinny być zoptymalizowane tak, aby komórki nie były nadmiernie zlewające się przed 48 godzinami.
  9. Upewnij się, że zainfekowane komórki są zielone pod mikroskopem fluorescencyjnym i że komórki w grupie kontrolnej niezakażonej, dobrze potraktowanej puromycyną, są martwe przed przejściem do Kroku 4.

4. Komórki wysiewające do transfekcji reportera podwójnej lucyferazy

UWAGA: Należy przeprowadzić próbną transfekcję, aby określić optymalną gęstość wysiewu dla każdej nowej linii komórkowej.

  1. Trypsynizuj każdą studzienkę z kroku 3.9 i przenieś około 1 x 105 komórek do studzienek w odpowiednim miejscu na nowej 24-dołkowej płytce w następujący sposób.
    UWAGA: Ten protokół jest przeznaczony do badań przesiewowych bibliotek z setkami shRNA, więc nie jest możliwe policzenie każdej studni zainfekowanych komórek. W związku z tym poniższe kroki zostały wykorzystane do oszacowania liczby komórek w każdym dołku, aby zapewnić mniej więcej równą gęstość posiewu.
    1. Pogrupuj studzienki z kroku 3.9 w 3-4 grupy, tak aby wszystkie studzienki w grupie miały podobną gęstość komórek.
    2. Trypsynizować 1 przedstawiciela z każdej grupy za pomocą 200 μl trypsyny-EDTA (1x PBS uzupełniony 0,5 mM EDTA i 0,1% trypsyny) przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Następnie zneutralizuj trypsynę-EDTA, dodając 400 μl puromycyny zawierającej kompletną pożywkę wzrostową.
    3. Policz każdą studzienkę reprezentatywną, aby określić całkowitą liczbę komórek i rozcieńczyć zawiesinę komórek z każdej studzienki reprezentatywnej do 2 x 105 komórek/ml przy użyciu kompletnej pożywki wzrostowej.
    4. Zasiać 0,5 ml (1 x 105 komórek) z każdej studzienki z etapu 4.1.3 do odpowiedniej pozycji na nowej 24-dołkowej płytce i inkubować tę nową 24-dołkową płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny.
    5. Dla każdej grupy z kroku 4.1.1 należy użyć całkowitej liczby komórek określonej w kroku 4.1.3, aby obliczyć objętość trypsyny-EDTA, którą należy dodać do każdej studzienki, tak aby wynikowa zawiesina komórek wynosiła 1 x 106 komórek/ml.
    6. Dodać odpowiednią objętość trypsyny-EDTA do każdego dołka i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: W przypadku większego ekranu zaleca się, aby płytki 24-dołkowe były trypsynizowane i ponownie powlekane w grupach, a nie wszystkie naraz, aby zapewnić żywotność komórek.
    7. Podczas powyższej inkubacji użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 400 μl kompletnej pożywki wzrostowej zawierającej puromycynę do odpowiednich studzienek na nowej 24-dołkowej płytce.
    8. Przenieść 100 μl zawiesiny komórek (około 1 x 105 komórek) z każdej studzienki do odpowiedniego miejsca na nowych 24-dołkowych płytkach przygotowanych w kroku 4.1.7.
    9. Powtórz kroki od 4.1.6 do 4.1.8 dla wszystkich płyt zgrupowanych studzienek z kroku 4.1.1, po jednej płytce na raz.
  2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny.

5. Transfekcja reportera podwójnej lucyferazy

  1. Transfekcja każdej studzienki z kroku 4.2 za pomocą reportera podwójnej lucyferazy tworzy się w następujący sposób.
    UWAGA: Przed rozpoczęciem tego testu należy określić całkowitą ilość DNA i optymalny stosunek wektora reporterowego lucyferazy świetlika do wektora kontrolnego lucyferazy Renilla. W tym przypadku użyto 400 ng mieszaniny DNA, która zawiera 20 części reportera lucyferazy świetlika i 1 część kontrolnej lucyferazy Renilla.
    1. Mieszaninę rozcieńczającą do transfekcji (probówka A) i mieszaninę rozcieńczającą reporterową (probówka B) należy sporządzić mieszając wskazane objętości każdego odczynnika (tabela 1) przez całkowitą liczbę transfekcji (plus kilka dodatkowych).
      UWAGA: Ten protokół jest zoptymalizowany pod kątem odczynnika do transfekcji 2 (patrz Tabela materiałów). Jeśli używany jest inny odczynnik do transfekcji, transfekcja powinna być zoptymalizowana przed tym krokiem.
    2. Mieszaninę rozcieńczającą do transfekcji (probówka A) zmieszać z mieszaniną rozcieńczającą reporterową (probówka B) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut w celu uzyskania mieszaniny do transfekcji.
    3. Podczas powyższej inkubacji przepłukać każdą 24-studzienkę z etapu 4.2 0,25 ml soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS) i dodać 447 μl kompletnej pożywki wzrostowej do każdej studzienki.
    4. Po 15 minutowej inkubacji za pomocą pipety wielokanałowej rozprowadzić 53 μl mieszanki transfekcyjnej do każdego dołka z 24-dołkowych płytek.
  2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny.

6. Kwantyfikacja aktywności podwójnej lucyferazy

  1. Zmierz aktywność lucyferazy za pomocą czytnika płytek i zestawu do testowania reporterowego z podwójnym lucyferazy, jak opisano poniżej.
    UWAGA: Ten protokół jest zoptymalizowany pod kątem wskazanego zestawu do oznaczania reporterowego (patrz Tabela materiałów) i jest zgodny z protokołem zalecanym przez producenta.
    1. Przygotuj wystarczającą ilość 1x pasywnego buforu do lizy dla wszystkich studzienek plus kilka dodatkowych (potrzeba 75 μl na studzienkę), rozcieńczając 5x pasywny bufor do lizy (dostarczony w zestawie) od 1 do 5 wodą dejonizowaną. Rozmrozić również odczynnik A i bufor odczynnika B (dostarczone w zestawie, 100 μl każdego z nich jest potrzebne do każdej studzienki).
    2. Odessać pożywkę z każdej studzienki płytki 24-dołkowej z kroku 5.2.
    3. Dodaj 75 μl 1x pasywnego buforu do lizy do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut, od czasu do czasu wstrząsając.
    4. Przygotować odczynnik B, rozcieńczając 50x substrat odczynnika B (dostarczony w zestawie) w stosunku 1:50 z rozmrożonym buforem odczynnika B.
    5. Dodać 30 μl 1x pasywnego buforu do lizy do 4 dołków w celu wygaszenia (patrz Tabela uzupełniająca 2).
    6. Przenieść 30 μl lizatu z etapu 6.1.3 do zduplikowanych studzienek 96-dołkowej białej płytki do oznaczania z płaskim dnem.
    7. Użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 50 μl odczynnika A do każdej studzienki i odczytać sygnał lucyferazy świetlika za pomocą czytnika płytek.
    8. Za pomocą pipety wielokanałowej dodać 50 μl odczynnika B z kroku 6.1.4 do każdej studzienki i odczytać sygnał lucyferazy Renilla za pomocą czytnika płytek.
  2. Przetwarzaj nieprzetworzone dane w następujący sposób (szczegółowy opis znajduje się w tabeli uzupełniającej 2).
    1. Wyklucz próbki z bardzo niskim sygnałem lucyferazy Renilla, ponieważ niskie wartości wskazują, że konstrukt wirusa był toksyczny lub że oznaczono zbyt mało transfekowanych komórek.
      UWAGA: Jak wyjaśniono w Dyskusji, znacznie "niski" sygnał lucyferazy Renilla może skutkować nietypowymi wynikami. W tym przypadku wykluczono studzienki, w których sygnał lucyferazy Renilla był większy niż 1 odchylenie standardowe poniżej średniej (patrz Tabela Uzupełniająca 2). Zostało to oparte na wcześniejszych badaniach przeprowadzonych przy użyciu tego systemu reporterowego w tych komórkach14, ale może się różnić w innych liniach komórkowych.
    2. Znormalizuj wartość surowej lucyferazy świetlika w każdym dołku do surowej wartości lucyferazy Renilla w tym samym dołku, aby uzyskać stosunek świetlika/Renilli.
    3. Uśrednij stosunek świetlików/Renilla wszystkich powtórzonych studzienek kontrolnych, a następnie podziel stosunek świetlików/Renilla w każdym innym studzience przez tę liczbę, aby uzyskać zmianę krotności.
    4. Przypisz próbkę kontrolną i ustaw jej wartość stosunku świetlika/Renilli na 1.
    5. Uśrednić stosunek świetlika/Renilla zduplikowanych studni i wykreślić go z odchyleniem standardowym.
      UWAGA: Odchylenie standardowe nie jest wykorzystywane do analizy statystycznej, ale jako środek do identyfikacji odwiertów, w których kontrpróby znacznie się różnią.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasz konstrukt reportera YAP/TAZ-TEAD (pGL3-5xMCAT (SV)-492,14,15) zawiera minimalny promotor SV-49 z 5 powtórzeniami kanonicznego elementu wiążącego TEAD (MCAT)15 sterujący genem lucyferazy świetlika (Rysunek 1). Jest on kotransfekowany do komórek wraz z wektorem kontrolnym PRL-TK (Promega), który eksprymuje lucyferazy Renilla z kons...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu demonstrujemy podejście do średnioprzepustowych badań przesiewowych macierzowych bibliotek wirusowych w połączeniu z testem reporterowym opartym na podwójnej lucyferazy, który można wykorzystać do identyfikacji i testowania nowych regulatorów czynników transkrypcyjnych. Bardzo ważne jest, aby scharakteryzować i zoptymalizować system reporterowy dla każdej linii komórkowej przed przeprowadzeniem jakiegokolwiek badania. Należy przeprowadzić doświadczenia w celu potwierdzenia, że osoba zgłaszająca reaguje na z...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Emily Norton i Mikaelanowi Cucciarre-Stuligrossowi za pomoc w przygotowaniu wektorów shRNA. Praca ta została częściowo wsparta grantem Susan G. Komen Career Catalyst Grant, który został przyznany J.M.L. (#CCR17477184).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,0 ml 96-dołkowa głęboka płytka polipropylenowaUSA Scientific1896-2000Do mikro-preparatu bakteryjnego
Trypsyna - 2,50%Gibco15090-046Składnik trypsyny-EDTA
96-dołkowa biała płytka testowa z płaskim dnemCorning3922Do testu podwójnej lucyferazy
Ampicylina - 100 mg / mlSigma-Aldrich45-10835242001-EADo mini-preparatu bakteryjnego
Bactoo-trypton - proszekSigma-Aldrich95039Składnik bulionu LB
System testów reporterowych z podwójną lucyferazy, który obejmuje odczynnik LAR II (odczynnik A), Stop & Glo substrate (substrat odczynnika B) oraz Stop & Bufor Glo (bufor odczynnika B) - ZestawPromegaE1960Do testu podwójnej lucyferazy
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco bez wapnia, magnezu i czerwieni fenolowej - 9,6 g/LHimediaTS1006Dla PBS
EDTA - 0,5 MVWR97061-406Składnik etanolu trypsyna-EDTA
- 100%Pharmco-AAPER111000200Do mini-preparatu bakteryjnego
Płod Surowica bydlęca - 100%VWR97068-085Składnik kompletnych pożywek wzrostowych
Bromek heksadimetryny (Polybrene) - 8 mg/mlSigma-Aldrich45-H9268Na infekcję wirusową
HyClone DMEM/Wysoka glukoza - 4 mM L-glutamina; 4500 mg/L glukozy; pirogronian soduGE Healthcare nauki przyrodniczeSH30243.01Składnik kompletnej pożywki wzrostowej
I3-P/i3 Multi-Mode Microplate/EAUrządzenia molekularneDo testu podwójnej lucyferazy
BDHBDH9286Składnik bulionu LB
NanoDrop One Mikroobjętość Spektrofotometr UV-VisThermo scientificDo pomiaru stężenia DNA wektora
Opti-MEM (bufor transfekcyjny) - 100%Gibco31985-062Do transfekcji
Penicylina Streptomycyna - 10 000 jednostek/ml (penicylina); 10 000 i mikro; g/ml (Streptomycyna)Gibco15140-122Składnik kompletnej pożywki
hodowlanej PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit - ZestawThermo Fisher ScientificK210010Do minipreparatu bakteryjnego
Puromycyna - 2,5 mg/mlSigma-Aldrich45-P7255Do selekcji antybiotyków po infekcji
TC20 Automatyczny licznik komórekBio-RadDo liczenia komórek
Odczynnik do transfekcji DNA X-tremeGENE 9 (Odczynnik do transfekcji 1) - 100%Roche6365787001Do pakowania wirusów
Ekstrakt drożdżowy - proszekVWRJ850Składnik bulionu LB
P3000 (odczynnik do transfekcji 3) - 100%Life technologiesL3000008Do transfekcji
L-Glutamina - 200 mM Gibco 25030-081 Składnik kompletnej pożywki wzrostowej Lipofectamine 3000 (odczynnik do transfekcji 2) - 100%Life technologies L3000008 Do transfekcji Biologia molekularna Woda - 100%VWR 02-0201-0500 Do rozcieńczania wektora shRNA do pakowania wirusów NaCl - proszek

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, K. S., Lim, J. W. C., Richards, L. J., Bunt, J. The convergent roles of the nuclear factor I transcription factors in development and cancer. Cancer Letters. 410, 124-138 (2017).
  2. Lamar, J. M., et al. The Hippo pathway target, YAP, promotes metastasis through its TEAD-interaction domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), E2441-E2450 (2012).
  3. Liu, C. Y., Yu, T., Huang, Y., Cui, L., Hong, W. ETS (E26 transformation-specific) up-regulation of the transcriptional co-activator TAZ promotes cell migration and metastasis in prostate cancer. Journal of Biological Chemistry. 292 (22), 9420-9430 (2017).
  4. Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1: oxygen homeostasis and disease pathophysiology. Trends in Molecular Medicine. 7 (8), 345-350 (2001).
  5. Willmer, T., Cooper, A., Peres, J., Omar, R., Prince, S. The T-Box transcription factor 3 in development and cancer. Bioscience Trends. 11 (3), 254-266 (2017).
  6. Zhu, C., Li, L., Zhao, B. The regulation and function of YAP transcription co-activator. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 47 (1), 16-28 (2015).
  7. Dang, C. V., Reddy, E. P., Shokat, K. M., Soucek, L. Drugging the 'undruggable' cancer targets. Nature Reviews: Cancer. 17 (8), 502-508 (2017).
  8. Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
  9. Hansen, C. G., Moroishi, T., Guan, K. L. YAP and TAZ: a nexus for Hippo signaling and beyond. Trends in Cell Biology. 25 (9), 499-513 (2015).
  10. Yu, F. X., Zhao, B., Guan, K. L. Hippo Pathway in Organ Size Control, Tissue Homeostasis, and Cancer. Cell. 163 (4), 811-828 (2015).
  11. Warren, J. S. A., Xiao, Y., Lamar, J. M. YAP/TAZ Activation as a Target for Treating Metastatic Cancer. Cancers. 10 (4), (2018).
  12. Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  13. Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. YAP/TAZ at the Roots of Cancer. Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).
  14. Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
  15. Mahoney, W. M., Hong, J. H., Yaffe, M. B., Farrance, I. K. The transcriptional co-activator TAZ interacts differentially with transcriptional enhancer factor-1 (TEF-1) family members. Biochemical Journal. 388 (Pt 1), 217-225 (2005).
  16. Codelia, V. A., Sun, G., Irvine, K. D. Regulation of YAP by mechanical strain through Jnk and Hippo signaling. Current Biology. 24 (17), 2012-2017 (2014).
  17. Cosset, E., et al. Glut3 Addiction Is a Druggable Vulnerability for a Molecularly Defined Subpopulation of Glioblastoma. Cancer Cell. 32 (6), 856-868 (2017).
  18. de Cristofaro, T., et al. TAZ/WWTR1 is overexpressed in papillary thyroid carcinoma. European Journal of Cancer. 47 (6), 926-933 (2011).
  19. Densham, R. M., et al. MST kinases monitor actin cytoskeletal integrity and signal via c-Jun N-terminal kinase stress-activated kinase to regulate p21Waf1/Cip1 stability. Molecular and Cellular Biology. 29 (24), 6380-6390 (2009).
  20. Eda, H., Aoki, K., Marumo, K., Fujii, K., Ohkawa, K. FGF-2 signaling induces downregulation of TAZ protein in osteoblastic MC3T3-E1 cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 366 (2), 471-475 (2008).
  21. Elbediwy, A., et al. Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis. Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).
  22. Enomoto, M., Igaki, T. Src controls tumorigenesis via JNK-dependent regulation of the Hippo pathway in Drosophila. EMBO Reports. 14 (1), 65-72 (2013).
  23. Enomoto, M., Kizawa, D., Ohsawa, S., Igaki, T. JNK signaling is converted from anti- to pro-tumor pathway by Ras-mediated switch of Warts activity. Developmental Biology. 403 (2), 162-171 (2015).
  24. Fan, R., Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Regulation of Hippo pathway by mitogenic growth factors via phosphoinositide 3-kinase and phosphoinositide-dependent kinase-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (7), 2569-2574 (2013).
  25. Feng, R., et al. MAPK and Hippo signaling pathways crosstalk via the RAF-1/MST-2 interaction in malignant melanoma. Oncology Reports. 38 (2), 1199-1205 (2017).
  26. Fisher, M. L., et al. Transglutaminase Interaction with alpha6/beta4-Integrin Stimulates YAP1-Dependent DeltaNp63alpha Stabilization and Leads to Enhanced Cancer Stem Cell Survival and Tumor Formation. Cancer Research. 76 (24), 7265-7276 (2016).
  27. Haskins, J. W., Nguyen, D. X., Stern, D. F. Neuregulin 1-activated ERBB4 interacts with YAP to induce Hippo pathway target genes and promote cell migration. Science Signaling. 7 (355), (2014).
  28. Hoeing, K., et al. Presenilin-1 processing of ErbB4 in fetal type II cells is necessary for control of fetal lung maturation. Biochimica et Biophysica Acta. 1813 (3), 480-491 (2011).
  29. Hwang, J. H., et al. Extracellular Matrix Stiffness Regulates Osteogenic Differentiation through MAPK Activation. PloS One. 10 (8), e0135519(2015).
  30. Kaneko, K., Ito, M., Naoe, Y., Lacy-Hulbert, A., Ikeda, K. Integrin alphav in the mechanical response of osteoblast lineage cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 447 (2), 352-357 (2014).
  31. Kim, N. G., Gumbiner, B. M. Adhesion to fibronectin regulates Hippo signaling via the FAK-Src-PI3K pathway. Journal of Cell Biology. 210 (3), 503-515 (2015).
  32. Kuser-Abali, G., Alptekin, A., Cinar, B. Overexpression of MYC and EZH2 cooperates to epigenetically silence MST1 expression. Epigenetics. 9 (4), 634-643 (2014).
  33. Liu, N., et al. HDM2 Promotes NEDDylation of Hepatitis B Virus HBx To Enhance Its Stability and Function. Journal of Virology. 91 (16), (2017).
  34. Liu, X., et al. The EZH2- H3K27me3-DNMT1 complex orchestrates epigenetic silencing of the wwc1 gene, a Hippo/YAP pathway upstream effector, in breast cancer epithelial cells. Cellular Signalling. 51, 243-256 (2018).
  35. Omerovic, J., et al. Ligand-regulated association of ErbB-4 to the transcriptional co-activator YAP65 controls transcription at the nuclear level. Experimental Cell Research. 294 (2), 469-479 (2004).
  36. Pegoraro, S., et al. A novel HMGA1-CCNE2-YAP axis regulates breast cancer aggressiveness. Oncotarget. 6 (22), 19087-19101 (2015).
  37. Xia, H., et al. EGFR-PI3K-PDK1 pathway regulates YAP signaling in hepatocellular carcinoma: the mechanism and its implications in targeted therapy. Cell Death & Disease. 9 (3), 269(2018).
  38. Yan, F., et al. ErbB4 protects against neuronal apoptosis via activation of YAP/PIK3CB signaling pathway in a rat model of subarachnoid hemorrhage. Experimental Neurology. 297, 92-100 (2017).
  39. Aragona, M., et al. A mechanical checkpoint controls multicellular growth through YAP/TAZ regulation by actin-processing factors. Cell. 154 (5), 1047-1059 (2013).
  40. Bonilla, X., et al. Genomic analysis identifies new drivers and progression pathways in skin basal cell carcinoma. Nature Genetics. 48 (4), 398-406 (2016).
  41. Enger, T. B., et al. The Hippo signaling pathway is required for salivary gland development and its dysregulation is associated with Sjogren's syndrome. Laboratory Investigation. 93 (11), 1203-1218 (2013).
  42. Fausti, F., et al. ATM kinase enables the functional axis of YAP, PML and p53 to ameliorate loss of Werner protein-mediated oncogenic senescence. Cell Death and Differentiation. 20 (11), 1498-1509 (2013).
  43. He, J., et al. Positive regulation of TAZ expression by EBV-LMP1 contributes to cell proliferation and epithelial-mesenchymal transition in nasopharyngeal carcinoma. Oncotarget. 8 (32), 52333-52344 (2017).
  44. Huang, W., et al. The N-terminal phosphodegron targets TAZ/WWTR1 protein for SCFbeta-TrCP-dependent degradation in response to phosphatidylinositol 3-kinase inhibition. Journal of Biological Chemistry. 287 (31), 26245-26253 (2012).
  45. Imada, S., et al. Role of Src Family Kinases in Regulation of Intestinal Epithelial Homeostasis. Molecular and Cellular Biology. 36 (22), 2811-2823 (2016).
  46. Kim, N. G., Koh, E., Chen, X., Gumbiner, B. M. E-cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling-pathway components. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (29), 11930-11935 (2011).
  47. Lai, J. K. H., et al. The Hippo pathway effector Wwtr1 regulates cardiac wall maturation in zebrafish. Development. 145 (10), (2018).
  48. Li, H., Gumbiner, B. M. Deregulation of the Hippo pathway in mouse mammary stem cells promotes mammary tumorigenesis. Mammalian Genome. 27 (11-12), 556-564 (2016).
  49. Pefani, D. E., O'Neill, E. Hippo pathway and protection of genome stability in response to DNA damage. The FEBS Journal. 283 (8), 1392-1403 (2016).
  50. Serrano, I., McDonald, P. C., Lock, F., Muller, W. J., Dedhar, S. Inactivation of the Hippo tumour suppressor pathway by integrin-linked kinase. Nature Communications. 4, 2976(2013).
  51. Vlug, E. J., et al. Nuclear localization of the transcriptional coactivator YAP is associated with invasive lobular breast cancer. Cellular Oncology (Dordrecht). 36 (5), 375-384 (2013).
  52. Xie, Q., et al. YAP/TEAD-mediated transcription controls cellular senescence. Cancer Research. 73 (12), 3615-3624 (2013).
  53. Yee, K. S., et al. A RASSF1A polymorphism restricts p53/p73 activation and associates with poor survival and accelerated age of onset of soft tissue sarcoma. Cancer Research. 72 (9), 2206-2217 (2012).
  54. Zhou, Z., et al. Oncogenic Kinase-Induced PKM2 Tyrosine 105 Phosphorylation Converts Nononcogenic PKM2 to a Tumor Promoter and Induces Cancer Stem-like Cells. Cancer Research. 78 (9), 2248-2261 (2018).
  55. Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transcription Factor RegulatorsMedium Throughput ScreeningArrayed Lentiviral LibrariesDual Luciferase ReporterYAP TAZ RegulationHippo Pathway ScreeningRNAi Library ScreeningViral Vector ProductionLuciferase Activity AssayPuromycin Selection

Related Articles