Tutaj prezentujemy protokoły dotyczące 1) laboratoryjnego rozmnażania zagrożonego wyginięciem motyla niebieskiego motyla z Miami (Cyclargus thomasi bethunebakeri) oraz 2) oceny podstawowych informacji o historii życia, takich jak czas niedojrzałego rozwoju i liczba stadiów larwalnych. Obie metody mogą być dostosowane do stosowania z innymi programami ochrony ex situ.
Artykuł metodologiczny
Programy rozmnażania zagrożonych motyli w niewoli w celu poszerzenia wiedzy na temat historii życia i skutecznych technik ochrony ex situ
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Poprawa wiedzy na temat najlepszych praktyk ex situ dla zagrożonych motyli jest ważna dla generowania udanych wyników programu ochrony i odbudowy. Badania nad takimi populacjami w niewoli mogą również dostarczyć cennych danych, które pozwolą wypełnić kluczowe luki informacyjne na temat zachowania, historii życia i ekologii docelowych taksonów. Opisujemy protokół rozmnażania w niewoli zagrożonego wyginięciem Cyclargus thomasi bethunebakeri, który może być wykorzystany jako model dla innych zagrożonych programów ex situ dla motyli, zwłaszcza tych z rodziny Lycaenidae. Ponadto udostępniamy prosty i nieskomplikowany protokół rejestrowania różnych wskaźników historii życia, który może być przydatny do informowania o metodologiach ex situ, a także dostosowany do badań laboratoryjnych innych lepidoptera.
Wprowadzenie
Rosnąca lista badań wskazuje na powszechne i poważne globalne spadki populacji motyli1,2,3,4,5. Dotyczy to zdecydowanej większości zagrożonych gatunków. Programy ochrony mające na celu złagodzenie takich spadków często wykorzystują mieszankę strategii, w tym monitorowanie populacji, zarządzanie siedliskami i odbudowę, badania naukowe, rozmnażanie w niewoli i translokację organizmów6. W samych Stanach Zjednoczonych i na ich terytoriach łącznie 30 taksonów motyli jest wymienionych w ustawie o gatunkach zagrożonych wyginięciem (ESA) jako zagrożone lub zagrożone, a 21 z nich ma zatwierdzone projekty lub ostateczne plany odbudowy. W przypadku takich taksonów ponad połowa zidentyfikowanych strategii odbudowy zaleca rozmnażanie w niewoli lub stwierdza, że należy ocenić rozmnażanie w niewoli7. Wykorzystanie działań na rzecz ochrony motyli ex situ znacznie wzrosło w ostatnich latach8,9 i ma potencjał, aby stać się kluczowym narzędziem wspomagającym wysiłki na rzecz odbudowy10. Liczne instytucje, organizacje i agencje są obecnie zaangażowane w działania ex situ dla co najmniej 11 taksonów motyli wymienionych na liście ESA (tj. Cyclargus thomasi bethunebakeri, Euphydryas editha quino, Euphydryas editha taylori, Heraclides aristodemus, Hesperia dacotae, Lycaeides melissa samuelis, Oarisma poweshiek, Pyrgus ruralis lagunae i Speryeria zerene hippolyta) oraz kilku innych zagrożonych taksonów (np. Callophrys irus, Euphydryas phaeton, Speyeria idalia, oraz Eumaeus atala)11. Pomimo wielu solidnych i udanych wysiłków, nadal brakuje regularnej komunikacji między programami i między praktykami zajmującymi się ochroną przyrody, obejmującej wymianę pomysłów, danych, skutecznych metodologii i wyników. Takie dzielenie się wiedzą jest niezbędne, ponieważ pomaga zminimalizować powielanie wysiłków, poprawia ogólne najlepsze praktyki i zwiększa wpływ na ochronę przyrody. Niewiele opublikowanych protokołów hodowli, hodowli lub hodowli w niewoli jest łatwo dostępnych dla zagrożonych taksonów motyli, a te, które są, często nie mają wystarczających szczegółów narracyjnych i/lub ilustracji. Często zawierają one głównie streszczenia szczegółów z ograniczonymi instrukcjami krok po kroku i towarzyszącymi obrazami, co utrudnia replikację lub zastosowanie do innych taksonów utrudnia ocenę12,13,14,15. Wiele z dostępnych protokołów jest w jakiś sposób ograniczonych: istnieją one tylko w szarej literaturze lub na różnych poziomach szczegółowości, w zależności od wieku publikacji, lub jako części składowe w materiałach z sympozjów, raportach agencji/fundatorów lub wewnętrznych podręcznikach16,17,18,19,20,21,22,23,24.
Dla większości programów ochrony przyrody, rozmnażanie w niewoli jest przede wszystkim prowadzone w celu wsparcia translokacji ochronnej, która obejmuje reintrodukcję, wzmocnienie (tj. rozszerzenie) i introdukcję25,26. Takie działania mają być realizowane strategicznie jako element ogólnej strategii odbudowy, aby pomóc w zapobieganiu wyginięciu gatunków, podgatunków lub populacji umieszczonych w wykazie. Należy jednak zauważyć, że jest to jedna z kilku innych potencjalnych ról, jakie mogą pełnić takie programy ex situ. Mogą one również obejmować utrzymanie populacji ubezpieczonej (tj. refugia), tymczasowe ratowanie organizmów, wspieranie badań i/lub szkoleń związanych z rekonwalescencją oraz promowanie edukacji i działań uświadamiających związanych z ochroną przyrody27,28. Niezależnie od tego, czy programy ex situ mają jeden zdefiniowany cel, czy też połączenie kilku, praktycy zajmujący się ochroną przyrody powinni maksymalizować możliwości gromadzenia danych, aby w miarę możliwości wypełnić kluczowe luki informacyjne. Jest to szczególnie ważne, ponieważ zdecydowana większość zagrożonych taksonów była na ogół słabo zbadana przed znacznym spadkiem populacji dzikich zwierząt. Uzyskana w ten sposób poszerzona wiedza na temat różnych aspektów behawioralnych, ekologicznych lub historii życia taksonu centralnego może pomóc w rozwoju skutecznej ochrony i zarządzania gatunkami29.
Tutaj szczegółowo opisujemy protokół rozmnażania w niewoli, który został opracowany dla zagrożonego federalnie niebieskiego motyla z Miami (Cyclargus thomasi bethunebakeri) (Rysunek uzupełniający 1) jako część większego programu ochrony i odbudowy. W tym przypadku program rozmnażania w niewoli pełni trzy konkretne, określone role: 1) populacja ubezpieczeniowa na wypadek utraty istniejącej dzikiej populacji, 2) populacja badawcza zaprojektowana w celu wypełnienia zidentyfikowanych luk w wiedzy ekologicznej i historii życia, które mogą pomóc w odbudowie i/lub zarządzaniu, oraz 3) produkcja organizmów zdolnych do życia, translokacja ochronna na tereny w historycznym zasięgu taksonu. Powstały protokół został dobrze sprawdzony i sprawdzony, jest używany i ulepszany od ponad dekady. W związku z tym uważamy, że opisane techniki i metodologie stanowią realny model, który może być zastosowany lub łatwo zaadaptowany do innych programów ex situ zagrożonych motyli, szczególnie tych obejmujących Lycaenidae lub pokrewne taksony. Chociaż nie sugerujemy, że opisany protokół jest lepszy od innych, uważamy, że istnieją możliwości szerszego zastosowania niektórych metod w celu zwiększenia produktywności, opieki lub wydajności. Jest to szczególnie prawdziwe, ponieważ większość naszej hodowli odbywa się w warunkach laboratoryjnych z ograniczoną przestrzenią, podobnie jak w programach ochrony z udziałem Euphydryas editha taylori i Speryeria zerene hippolyta17,23. Wiele innych protokołów często wykorzystuje materiał doniczkowy do składania jaj lub hodowli larw, co czasami może prowadzić do zwiększonej złożoności związanej z kontrolą drapieżników, kontrolą środowiska (tj. wilgotnością, temperaturą), monitorowaniem zwierząt gospodarskich, gromadzeniem danych, problemami ze szkodnikami roślin i przestrzenią, aby wymienić tylko kilka21,22. Wreszcie, w przedstawionym protokole przedstawiono metody hodowli w niewoli. Wiele innych zagrożonych programów ochrony motyli obejmuje hodowlę w niewoli lub hodowlę w niewoli, a reprezentatywne protokoły odzwierciedlają te różnice. Chociaż często jest to niewielkie, uważamy, że pomaga to poszerzyć istniejącą pulę dostępnych informacji, które mogą być przeglądane przez inne programy. Ma to zasadnicze znaczenie, ponieważ większość programów ex situ stanowi pionierskie wysiłki mające na celu ułatwienie odtworzenia rzadkich i często słabo zbadanych taksonów. Dostępne protokoły mogą służyć jako doskonały punkt wyjścia, który pomoże dostarczyć cennych informacji, ograniczyć powielanie wysiłków i promować innowacje. Ze względu na "rozległą międzygatunkową różnorodność zachowań motyli, cech historii życia i wymagań ekologicznych w połączeniu z często wyraźnymi różnicami w obiektach programowych, budżetach, wiedzy specjalistycznej praktyków" i innymi nieodłącznymi różnicami, poleganie na jednej metodologii, nawet w przypadku blisko spokrewnionych taksonów, jest często ograniczające i nieuzasadnione30. Elastyczność w zakresie udoskonalania lub opracowywania nowych protokołów dostosowanych do potrzeb konkretnych taksonów lub programów ma zasadnicze znaczenie dla osiągnięcia sukcesu i dlatego należy na nią kłaść nacisk. Dodatkowo opisujemy techniki laboratoryjne służące do zbierania wskaźników dotyczących rozwoju organizmów w warunkach niewoli, w tym liczby stadiów larwalnych, czasu trwania poszczególnych etapów rozwojowych, całkowitego czasu rozwoju oraz długości larw i poczwarek. Techniki te mają szerokie zastosowanie w badaniach historii życia Lepidoptera, które mogą być wykorzystane do udoskonalenia protokołów ex situ lub dostarczenia danych terenowych.
Protokół
1. Zapewnienie udanych zalotów i krycia dorosłych
- Po udanej ekfiltracji wypuść zdolne do życia dorosłe motyle do bezpiecznej, przesianej klatki lotniczej znajdującej się w szklarni o kontrolowanej temperaturze (rysunek uzupełniający 2).
UWAGA: Dorosłe osobniki mogą być oznaczane na brzusznej powierzchni skrzydeł trwałymi markerami atramentowymi, jeśli identyfikacja konkretnych osobników jest pożądana w celu rozdzielenia linii genetycznych, pochodzenia bydła lub w celu zebrania określonych danych związanych z długowiecznością organizmu, zachowaniem itp.- Chociaż dokładne wymiary klatki mogą się różnić, upewnij się, że jest wystarczająco dużo miejsca, aby pomieścić odpowiedni materiał roślinny nektarowy niezbędny do utrzymania zagęszczenia dorosłych motyli w pomieszczeniach i zapewnić człowiekowi miejsce do swobodnego stania i obracania się.
- Poza regulacją temperatury upewnij się, że szklarnia jest bezpieczna, aby mogła zapewnić drugą warstwę izolacji wraz z ochroną przed niekorzystnymi warunkami pogodowymi (np. ulewnym deszczem, wiatrem).
- Podnieś doniczkowy materiał roślinny z nektaru tak, aby nie było więcej niż 30 cm wolnej przestrzeni od wewnętrznej górnej części klatki do najwyżej kwitnących kwiatów (rysunek uzupełniający 2). Zapewnia to optymalny dostęp do dostępnych zasobów nektaru, oferuje dużą ilość dorosłych grzęd i minimalizuje nadmierną aktywność lotniczą.
- Umieść jedną roślinę żywicielską w doniczce w klatce lotu. Gwarantuje to, że nawet w przypadku pominięcia sparowanej pary można zebrać wszelkie złożone jaja.
- Zapewnij stały przepływ powietrza. Zwiększa to aktywność zalotów i sukces godowy. W szklarni najlepiej sprawdzają się dmuchawy i wentylatory cyrkulacyjne montowane na stałe, aby poprawić wentylację i ruch powietrza. Można również zastosować mniejsze przenośne urządzenia wentylacyjne, takie jak wentylatory skrzynkowe lub biurkowe.
- Utrzymuj wewnętrzną temperaturę w szklarni między 27 °C a 32 °C, aby zapewnić optymalną aktywność dorosłego osobnika i sukces godowy. Temperatura wewnątrz klatki jest monitorowana za pomocą termometru monitorującego z pamięcią identyfikowalną.
- Regularnie spryskuj ekranowaną klatkę lotniczą (mniej więcej raz na 2 godziny) wodą za pomocą pompy ręcznej, plastikowego opryskiwacza zbiornika lub węża ogrodowego.
- Delikatnie zebrać poszczególne pary kojarzące się z przesianą klatką lotową za pomocą przezroczystej plastikowej fiolki z zatrzaskiem o pojemności 50 dram (tabela materiałów), umieszczając od jednej do dwóch par w fiolce i przetransportować do pomieszczenia hodowlanego lub laboratorium (rysunek uzupełniający 3).
2. Maksymalizacja produkcji jaj
- Zmontować komorę do składania jaj.
- Weź zwykły biały papierowy kubek o pojemności 12 uncji i za pomocą noża uniwersalnego z ostrzem zatrzaskowym wykonaj dwa poziome nacięcia po każdej stronie kubka naprzeciwko siebie. Każde cięcie powinno znajdować się około 1 cm poniżej krawędzi.
- Przetnij pojedynczy bawełniany wacik na pół i włóż końcówkę pręta każdego z nich w dwa poziome nacięcia po każdej stronie papierowego kubka, tak aby część bawełnianego wacika wystawała około 2 cm w kierunku wnętrza kubka.
- Za pomocą noża uniwersalnego z ostrzem zatrzaskowym wykonaj dwa nacięcia "X" na dnie papierowego kubka. Każde ukośne cięcie powinno mieć około 1 cm długości.
- Weź plastikowy kubek o pojemności 9 uncji i napełnij dno około 2 cm wodą z kranu.
- Umieść świeży kawałek o długości około 15 cm, przedstawiający końcowy wzrost larwalnej rośliny żywicielskiej w papierowym kubku, wkładając łodygę przez jedno z nacięć "X" w dnie. Przepchnij łodygę przez nacięcie tak, aby około 4-5 cm wystawało z dna.
- Umieść papierowy kubek z materiałem żywicielskim w plastikowym kubku, upewniając się, że łodyga rośliny znajduje się w wodzie.
- Napełnij strzykawkę sub-Q o pojemności 1 ml (0,45 mm x 16 mm) aromatyzowanym napojem sportowym i nasącz oba bawełniane waciki w papierowym kubku. Działają one jak sztuczne kwiaty.
UWAGA: Napój sportowy o smaku melona i ponczu owocowego stanowi najlepszą alternatywę dla nektaru. - Gdy każda para godowa oddzieli się, umieść 2-3 ciężarne samice w zmontowanej konfiguracji kubka (tj. komorze składania jaj ).
- Przykryj miseczkę wyciętym kwadratowym fragmentem czarnego tiulu (około 15 cm x 15 cm) i zabezpiecz ją gumką wokół pokrywki (Rysunek uzupełniający 4). tiul zapewnia najlepszą widoczność w miseczce i łatwą identyfikację wszelkich jaj, które mogą czasami zostać złożone na tiulu.
- Stymuluj aktywność dorosłych motyli i składanie jaj.
- Umieść każdą komorę do składania jaj na stole laboratoryjnym lub stole około 19 cm poniżej 8.5 cala (21.59 cm) clamp lamp z aluminiowym reflektorem mieszczącym żarówkę o mocy 40 W (rysunek uzupełniający 5).
UWAGA: Żarówka zapewnia promieniowanie cieplne niezbędne do stymulowania aktywności osoby dorosłej i składania jaj. - Umieść termometr monitorujący z pamięcią w pobliżu świateł i uruchom czujnik temperatury tak, aby spoczywał na komorze składania jaj umieszczonej bezpośrednio pod lampą zaciskową.
UWAGA: Docelowy zakres temperatur wynosi od 27.5 °C do 29 °C. - W razie potrzeby dodaj dodatkowe lampy zaciskowe, w zależności od całkowitej liczby rozmieszczonych komór do składania jaj.
- Podłącz lampy zaciskowe do programowalnego wewnętrznego mechanicznego timera wtykowego 15 Amp 24 h z dwoma wyjściami (programowalnymi w 30-minutowych odstępach czasu).
- Ustaw timer, aby włączyć lampę zaciskową na 30 minut interwały (tj. powtarzalny cykl 30 minut włączenia, 30 minut wyłączenia).
UWAGA: Ten cykl świetlny pomaga zmaksymalizować produkcję jaj, zapewniając powtarzalne okresy oświetlenia w celu stymulowania aktywności dorosłych motyli i składania jaj, po których następują krótkie ciemne okresy odpoczynku. - Odświeżaj bawełniane waciki w każdej filiżance aromatyzowanym napojem sportowym za pomocą strzykawki sub-Q i regularnie spryskuj wodą za pomocą plastikowej butelki z rozpylaczem mniej więcej co 2-3 godziny lub w razie potrzeby.
UWAGA: Zapewnia to odpowiednią ilość sztucznego nektaru i wilgoci, aby motyle mogły swobodnie żerować zgodnie z życzeniem. W ten sposób zwiększa zarówno długowieczność dorosłych osobników, jak i produktywność składania jaj w warunkach laboratoryjnych, w których żywy, kwitnący materiał roślinny nie może być łatwo wykorzystany. - Regularnie monitoruj kubki i w razie potrzeby zastępuj roślinę żywicielską świeżymi sadzonkami.
- Kiedy jaja zaczną się wykluwać lub gęstość jaj stanie się wysoka, przenieś samicę (samice) do nowego kubka ze świeżym żywicielem i rozpocznij protokół larwalny z noworodkami.
- Umieść każdą komorę do składania jaj na stole laboratoryjnym lub stole około 19 cm poniżej 8.5 cala (21.59 cm) clamp lamp z aluminiowym reflektorem mieszczącym żarówkę o mocy 40 W (rysunek uzupełniający 5).
3. Pielęgnacja i utrzymanie larw
- Powtórz kroki 2.3-2.6, aby złożyć kubki na larwy.
- Kiedy jaja zaczną się wykluwać, przenieś materiał roślinny żywiciela z jajami i larwami noworodków do nowo złożonego kubka, umieszczając łodygę przez drugi "X" na dnie, upewniając się, że łodyga rośliny znajduje się w wodzie, a liście dotykają sąsiedniego świeżego cięcia żywiciela.
- Gdy larwy są młode (noworodek-2 w stadium), codziennie sprawdzaj kubki larwalne pod kątem świeżości materiału roślinnego żywiciela i obecności pleśni lub nadmiernego frass.
UWAGA: Nie zaleca się codziennego usuwania materiału żywicielskiego, gdy larwy są młode, ponieważ może to spowodować uszkodzenie organizmu w wyniku obchodzenia się z nim i/lub niepotrzebnego marnowania świeżego materiału żywicielskiego. - Jeśli materiał żywiciela jest zwiędły lub w innym złym stanie, umieść kolejny kawałek świeżego materiału żywicielskiego w kubku tak, aby dotykał istniejących liści i pozwól larwom samodzielnie przenieść się do nowego żywiciela.
- Gdy larwy osiągną 3. stadium rozwojowe, wymień papierowy kubek i codziennie dodawaj świeży materiał żywicielski.
- Użyj małego pędzla do malowania akwarelami z włosia wielbłąda, aby delikatnie przesunąć larwy ze starego materiału żywiciela lub powierzchni kubka na świeży materiał żywiciela w nowym kubku.
- Umieść stary materiał hosta w pustym prostokątnym plastikowym pojemniku do przechowywania żywności.
- Powtarzaj kroki 3,5-3,7 codziennie, aż wszystkie kubki z larwami zostaną przetworzone.
- Po zakończeniu dodaj niewielką ilość świeżego materiału żywicielskiego na odpady roślinne w pojemniku do przechowywania żywności i luźno przykryj pokrywką na wierzchu.
UWAGA: Służy to jako zabezpieczenie na wypadek, gdyby jakiekolwiek larwy zostały przeoczone podczas codziennego przetwarzania, ponieważ będą one pełzać po nowym materiale żywicielskim na wierzchu odpadów roślinnych i mogą zostać usunięte następnego dnia. - Utrzymuj bańki w temperaturze laboratoryjnej między 25 °C a 28 °C w celu uzyskania optymalnej aktywności larwalnej i rozwoju (rysunek uzupełniający 6).
UWAGA: Aby osiągnąć optymalne temperatury chowu w warunkach wewnętrznych, często konieczne jest umieszczenie kubków pod lampami zaciskowymi z aluminiowymi reflektorami mieszczącymi żarówki o mocy 40 W. Temperatury mogą być następnie aktywnie monitorowane za pomocą termometru monitorującego z pamięcią identyfikowaną, a wysokość światła dostosowana do optymalnych warunków chowu.
4. Budowa komory przepoczwarzania
- Pokrój pojedynczą rolkę papieru falistego na kwadraty o równych wymiarach 3,8 cm x 3,8 cm.
- Umieść jeden kwadrat w przezroczystym plastikowym kubku na porcje o pojemności 2 uncji.
- Umieść kubek na przezroczystej plastikowej tacce na kubki (Rysunek uzupełniający 7).
5. Przygotowanie larw do przepoczwarzenia
- Identyfikacja dojrzałych larw gotowych do przepoczwarzenia podczas codziennego przetwarzania kolonii.
UWAGA: Takie larwy zmienią kolor na jednolity, matowy zielonkawo-brązowy, stracą szewrony i często odejdą od żywiciela. - Delikatnie usuń każdą dojrzałą larwę za pomocą małego pędzla do malowania akwarelą z włosia wielbłąda lub kleszczy i umieść po jednej w każdej komorze przepoczwarzalniczej.
- Mocno zatrzaśnij przezroczystą plastikową pokrywę na komorze przepoczwarzalniczej.
- Powtarzać kroki 5.1-5.3 do momentu, gdy wszystkie larwy gotowe do przepoczwarzenia zostaną przeniesione do komór przepoczwarzających, dodając w razie potrzeby nowe plastikowe tacki (rysunek uzupełniający 8).
6. Utrzymywanie poczwarek
- Dla każdej tacki z komorami przepoczwarzalniczymi należy zapisać datę pierwszego przepoczwarzenia oraz wszelkie inne potrzebne istotne informacje (np. linię genetyczną, próbę doświadczalną itp.).
- Uporządkuj tace według daty i umieść w bezpiecznym miejscu w laboratorium (rysunek uzupełniający 8).
- Codziennie monitoruj tace do oglądania dorosłych.
UWAGA: Warunki laboratoryjne, takie jak temperatura, będą miały duży wpływ na czas rozwoju. - Przed eklosją osobnika dorosłego (zwykle w ciągu 10 dni od pierwszego przepoczwarzenia) zdejmij pokrywki z poszczególnych komór przepoczwarzalniczych i umieść tacę w składanej siatkowej klatce hodowlanej o wymiarach 34,29 cm x 34,29 cm x 60,96 cm (rysunek uzupełniający 9).
UWAGA: Poczwarki bezpiecznie przymocowane w rowkach kwadratów z tektury falistej ułatwiają udaną eklozję dorosłego osobnika (rysunek uzupełniający 10). - Powtórz cały protokół od kroku 1.1 dla kolejnego generowania na więź.
7. Ocena czasu rozwoju niedojrzałych etapów i liczby stadionów
- Umieść pojedynczą larwę pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj małego pędzla do malowania akwarelami z włosia wielbłąda, aby ostrożnie przesunąć i odizolować larwy, aby uniknąć uszkodzenia organizmu.
- Zanurz pojedynczy włos pędzla w nietoksycznej świecącej farbie (Tabela materiałów) i ostrożnie nałóż jedną małą kroplę farby na grzbiet (grzbiet) larwy. Użyj koloru farby, który wyróżnia się na tle koloru i koloru wzoru larwy (rysunek uzupełniający 11). Pamiętaj, aby unikać nakładania farby na głowę larwy.
- Gdy farba wyschnie (około 30 s), umieść każdą pojedynczą larwę we własnym przezroczystym plastikowym kubku o pojemności 2 uncji, zawierającym około 1-3 małych liści świeżego końcowego materiału żywicielskiego i napisz unikalny identyfikator na kubku i pokrywce (rysunek uzupełniający 12).
- Dokładnie sprawdzaj każdą larwę codziennie. Usuń liście i ustaw na białej powierzchni. Sprawdzić kubek, przezroczystą pokrywkę i zbadać liście pod mikroskopem preparacyjnym pod kątem obecności wysięków larwalnych (odlanych skórek) i/lub kapsułek głowy.
- W przypadku znalezienia wysięku larwalnego, należy wyjąć go z kubka i umieścić w probówce do mikrowirówki oznaczonej odpowiednim numerem kubka i datą (patrz kroki 8.1-8.6 poniżej).
- Przemaluj larwy po każdym linieniu i zapisz daty linienia.
- Codziennie mierz całkowitą długość ciała (od głowy do ostatniego segmentu brzucha) każdej larwy za pomocą suwmiarki cyfrowej. Wykonaj trzy pomiary i zapisz średnią z tych trzech wraz z datą i godziną. W przypadku larw we wczesnym stadium rozwoju podczas pomiaru należy użyć szkła powiększającego lub lunety sekcyjnej, aby zapewnić dokładne pomiary.
- Włóż larwę z powrotem do odpowiedniego plastikowego kubka na porcje.
- W razie potrzeby dodaj świeży materiał hosta i usuń wszystkie wióry i stare resztki hosta. Jeśli w kubku zostanie znaleziona pleśń, wyrzuć i użyj nowego kubka. Wpisz prawidłowy unikalny numer identyfikacyjny na nowym kubku.
- Powtarzaj kroki 7.5-7.9, aż wszystkie larwy osiągną swój ostatni stadium rozwojowy i rozpoczną fazę przedmiedniczą. Kiedy larwy przestają żerować, zmieniają jednolity matowy zielonkawo-brązowy kolor, tracą szewrony i często oddalają się od żywiciela, minimalizując ich przeszkadzanie.
- Umieść mały kawałek tektury falistej w kubku (patrz krok 4.1).
- Gdy każda larwa w pełni się przepoczwarzy, zmierz jej całkowitą długość, jak w kroku 7.8 powyżej, i zapisz datę przepoczwarzenia. Będzie to ostatnie linienie każdego osobnika.
- Codziennie sprawdzaj poczwarki i zapisuj datę wylęgu oraz płeć każdego dorosłego motyla.
- Zmierz długość cięciwy skrzydła każdego motyla za pomocą suwmiarki cyfrowej. Motyle można delikatnie trzymać kleszczami do pomiaru. Jeśli motyl jest zbyt aktywny, aby można go było łatwo zmierzyć, tymczasowo umieść go w lodówce na 30 s lub krócej i spróbuj ponownie.
8. Zbieranie wysięków larwalnych
- W przypadku zaobserwowania wysięku larwalnego napełnij probówkę mikrowirówkową 0,2 μl gliceryny. Oznacz górną część wieczka i bok numerem larwy, datą linienia i kapsułką na głowę (H.C.).
UWAGA: Larwy niektórych larw lepidoptera regularnie zjadają wysięki, ale torebka głowa powinna pozostać. - Umieść wysięk larwalny i powiązaną z nim kapsułkę na głowę w przezroczystej plastikowej pokrywce kubka na porcje i wlej do niej kilka kropli etanolu.
- Zbadaj wysięk larwalny pod mikroskopem preparacyjnym, umieszczając go w przezroczystej plastikowej pokrywce kubka na porcje i nakładając na nią kilka kropli etanolu. Jeśli torebka z głową larwy jest już oddzielona od wysięku, umieść kroplę gliceryny na końcówce spiczastych kleszczy entomologicznych i delikatnie przyłóż torebkę głowy do gliceryny. Umieść kapsułkę na głowę w odpowiedniej probówce do mikrowirówki.
- Jeśli torebka na głowę jest nadal przyczepiona do wysięku larwy, użyj spiczastych kleszczy i szpilki do owadów, aby oddzielić torebkę głowy od wysięku larwy.
- Po oddzieleniu użyj techniki gliceryny, aby podnieść kapsułkę na głowę. Jeśli jest za dużo etanolu, możesz użyć małego ręcznika papierowego, aby go usunąć, ale uważaj, aby przypadkowo nie wyjąć kapsułki na głowę.
- Umieścić kapsułkę na głowę w oznaczonej fiolce wypełnionej gliceryną i szczelnie zamknąć pokrywkę.
Wyniki
W ramach dwóch oddzielnych inicjatyw konserwacyjnych nakierowanych na odzyskanie Cyclargus thomasi bethunebakeri, realizowanych od lutego 203 do grudnia 2010 oraz od listopada 2016 do chwili obecnej, niniejszy protokół pozwolił na pomyślne wyprodukowanie ponad 51 052 zdolnych do życia organizmów. Na podstawie rocznego zestawienia całkowitej produktywności populacji w niewoli od czerwca 2018 do czerwca 2019, wyprodukowano łącznie 10 16 zdolnych do życia organizmów, co stanowi 782,0 ± 118,93 organizmów miesięcznie w ciągu 13 pokoleń. Analogicznie, średnia całkowita produkcja jaj na jedną samicę w warunkach laboratoryjnych wyniosła 14,0 ± 26,12 (n = 12)31. Wynikająca z tego znaczna produktywność organizmów plasuje ten program wśród największych tego typu wysiłków ex situ w USA, obok programów dotyczących Euphydryas editha taylori, Speyeria zerene hippolyta oraz Lycaeides melissa samuelis24. Częściowo produktywność ta wynika z faktu, że motyle te są hodowane w sposób ciągły, co pozwala na uzyskanie jednego pokolenia w niewoli mniej więcej co 4-6 tygodni. Większość innych programów hodowli konserwatorskiej obejmuje taksony univoltine lub bivoltine. Niemniej jednak, nawet w przypadku programów obejmujących taksony o niezwykle wysokiej płodności, takie jak Speyeria spp., całkowita liczba organizmów zdolnych do życia, produkowanych rocznie na potrzeby translokacji konserwatorskiej, rzadko przekracza kilka tysięcy32. W związku z tym nasza populacja w niewoli umożliwiła prowadzenie ukiercowanych badań i szeroko zakrojone gromadzenie danych w celu wypełnienia licznych luk informacyjnych, istotnych dla udoskonalenia najlepszych praktyk hodowlanych i pielęgnacyjnych w laboratorium (Rycina 1), a także pomogła w podejmowaniu decyzji dotyczących odzyskiwania i zarządzania populacją.
Średni całkowity czas rozwoju od larwy neonatalnej do postaci dorosłej wynosił 28,63 dni (Tabela 1). Większość larw przeszła cztery linie zmiany skóry (Rycina 2, Rycina 3), choć dwie przeszły pięć, a jedna sześć linii zmiany skóry. Ogólna średnia długość wszystkich stadiów larwalnych wynosiła 5,97 mm, a larwy osiągały największe rozmiary w czwartym stadium oraz w stadium przedpoczwarkowym (Tabela 1). Uwzględniając jedynie zmienne z więcej niż 30 obserwacjami, najkrótszy czas rozwoju przypadał na pierwsze stadium larwalne oraz stadium przedpoczwarkowe, a najdłuższy na stadium poczwarki (Tabela 1, Rycina 2). Samice zazwyczaj rozwijały się szybciej we wszystkich stadiach niedojrzałych w porównaniu do samców, choć efekt ten nie był istotny statystycznie (p = 0,625). Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu programu RStudio wersja 1.1.463 (R Core Team 2016)3. Średnia długość cięciwy skrzydła osobników dorosłych wynosiła 12,64 mm (Tabela 2), stwierdzono istotną różnicę między płciami (p = 0,047). W celu oceny różnic w długości cięciwy skrzydła między płciami przeprowadzono dwustronny test t. Model regresji liniowej oraz regresja krokowa dla średniej długości każdego stadium rozwojowego wykazały, że długość poczwarki była najlepszym predyktorem długości cięciwy skrzydła osobników dorosłych (Tabela 3, Tabela 4). Modele regresji dla czasu rozwoju wykazały, że liczba dni spędzonych w drugim i czwartym stadium larwalnym oraz całkowita liczba dni były najlepszymi predyktorami długości cięciwy skrzydła dorosłych, jednak tylko liczba dni w czwartym stadium była istotna (Tabela 5, Tabela 6). Ze względu na ciągły charakter zmiennych, przeprowadzono dwa modele regresji liniowej dla czasu rozwoju każdego stadium, a także dla długości każdego stadium, przyjmując długość cięciwy skrzydła osobników dorosłych jako zmienną zależną. Dla obu modeli regresji przeprowadzono regresje krokowe w celu wyłonienia najlepszych predyktorów długości cięciwy skrzydła osobników dorosłych.
Rysunek uzupełniający 1: Przyszpiliłe okazy dorosłych osobników Cyclargus thomasi bethunebackeri. (A) Samiec dorosły, widok grzbietowy (lewo), brzuszny (prawo). (B) Samica dorosła, widok grzbietowy (lewo), brzuszny (prawo). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina uzupełniająca 2: Siatkowana klatka lotna umieszczona w szklarni z kontrolą temperatury. (A) Wnętrze przedstawia doniczkowe dorosłe rośliny nektarodajne oraz pojedynczą doniczkową roślinę żywicielską dla larw. (BMetalowe regały pozwalają na wyniesienie roślin nektarodajnych w doniczkach w taki sposób, aby od górnej wewnętrznej krawędzi klatki do najwyższych kwitnących kwiatów pozostało nie więcej niż 30 cm przestrzeni. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rycina uzupełniająca 3: Procedura zbierania sparowanych osobników dorosłych w trakcie kopulacji. (A) Para kopulacyjna osobników dorosłych Cyclargus thomasi bethunebakeri wewnątrz klatki lotniczej z siatką (samica po prawej, samiec po lewej). (B) Pary kopulujące zebrane z klatki lotowej do probówek z zakrętkami typu snap cap i przeniesione do laboratorium. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rysunek uzupełniający 4: Procedura montażu komory składania jaj. (A) System dwukubkowy z materiałem gospodarza końcowego i patyczkami bawełnianymi. (B) Strzykawka podskórna o pojemności 1 ml (0,45 mm x 16 mm) oraz nasączone smakowym napojem sportowym patyczki bawełniane w papierowym kubku. (C) Pojemniki z zapłodnionymi samicami zabezpieczone czarną tiulową siatką. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rycina uzupełniająca 5: Konfiguracja laboratoryjna w celu maksymalizacji produkcji jaj. (A) Komory do składania jaj umieszczone na stole laboratoryjnym pod lampką warsztatową z żarówką wolframową o mocy 40 W. (B) Obok lamp zostanie umieszczony atestowany termometr z funkcją zapisu danych, którego czujnik temperatury spoczywać będzie na górnej ściance komory składania jaj, znajdującej się bezpośrednio pod lampą zaciskową. (C) Strzykawka podskórna o pojemności 1 ml oraz mały zlew z aromatyzowanym napojem izotonicznym umieszczone obok komór do składania jaj, aby ułatwić regularne odświeżanie tamponów bawełnianych w ciągu dnia. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rycina uzupełniająca 6: Konfiguracja laboratoryjna do pielęgnacji i utrzymania larw. (A) System dwukubkowy, w którym każdy kubek zawiera świeży materiał gospodarza z pędów wierzchołkowych oraz larwy. (B) Temperaturę w naczyniach utrzymuje się w przedziale od 25 °C-28 °C dla optymalnej aktywności i rozwoju larw, stosując nadstawne lampy zaciskowe z żarówkami żarnikowymi o mocy 40 W. (CDo monitorowania temperatury wykorzystuje się termometr z funkcją zapisu pamięci i możliwością prześledzenia pomiarów, z czujnikiem temperatury umieszczonym bezpośrednio w naczyniu. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek uzupełniający 7: Przygotowane komory przepoczwarczenia. (A) Pojedyncze plastikowe kubeczki do porcji umieszczone w przezroczystych plastikowych tackach. (B) Do każdego plastikowego kubeczka do porcji wkłada się kwadrat z kartonu falistego. (C) Do każdego przygotowanego plastikowego kubeczka zostanie umieszczona jedna dojrzała larwa w celu przepoczwarzenia. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina uzupełniająca 8: Przygotowanie larw do przepoczwarzenia i utrzymanie poczwarek. (A) Dojrzała larwa gotowa do przepocwarzenia na papierze falistym. Ma jednolity, matowy, zielonkawobrązowy kolor i nie wykazuje już obecności pręg (chevronów). (BKomory przepoczwarzenia gotowe do przyjęcia dojrzałych larw, znajdujące się obok kubków z żerującymi larwami. Wszystkie komory przepoczwarzenia z przykrywkami zawierają larwy przygotowujące się do przepoczwarzenia.C) Komory przepoczwarczania z poczwarkami. (D) Banki komór poczekowych z poczwarkami uporządkowane według daty i utrzymywane w warunkach laboratoryjnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.
Rycina uzupełniająca 9: Laboratoryjna klatka wylęgowa. (A) Składana siatkowa klatka hodowlana typu pop-up zawierająca zajęte komory przepoczwarzenia. (BZdejmuje się pokrywy ze wszystkich komór pupalnych, aby ułatwić pomyślne wykluwanie się osobników dorosłych.CWszystkie otrzymane żywe dorosłe motyle zostaną wypuszczone do zabezpieczonej siatką klatki lotniczej, aby zapewnić udaną kopulację. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.
Rycina uzupełniająca 10: Dorosły samiec motyla po udanym wykluciu się z poczwarki na kwadracie z tektury falistej. (A) Imago wykluwające się z poczwarki. (B) Imago całkowicie wydobyte z poczwarki. (C) Dorosły osobnik w pozycji z rozpostartymi skrzydłami. (D) Dorosły osobnik rozpościerający skrzydła. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina uzupełniająca 1: Larwa w piątym stadium rozwojowym oznakowana nietoksyczną farbą luminescencyjną. (A) Mała kropla kontrastowej czerwonej, nietoksycznej farby luminescencyjnej jest nanoszona pędzlem na grzbiet w celu skutecznego oznakowania larwy. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina uzupełniająca 12: Układ hodowlany dla badania historii życia. (A) Przezroczyste plastikowe kubeczki porcjowe o pojemności 2 uncji z unikalnymi etykietami. (B) W każdym kubku odizolowano jedną larwę. (CWszystkie larwy są śledzone indywidualnie przez wszystkie stadia rozwojowe, od stadium noworodkowego do dorosłego motyla. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 1: Liczba zarejestrowanych par w kopulacji w zależności od temperatury (°C) wewnątrz wejściowej, zabezpieczonej siatką klatki lotnej, znajdującej się w szklarni z kontrolą temperatury. Temperaturę odnotowano w ciągu pierwszych 2 min od udanego procesu parowania (n = 41). Uzyskane dane posłużyły do doprecyzowania kontrolowanych warunków środowiskowych w celu zmaksymalizowania sukcesu kojarzenia, a w konsekwencji ogólnej wydajności hodowli w niewoli. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Średni czas rozwoju (liczba dni) każdego stadium niedojrzałego. (ASłupki przedstawiają średnią dla każdej grupy, a słupki błędu reprezentują górne i dolne wartości odchylenia standardowego dla każdej grupy.B) Ciemnoniebieskie słupki reprezentują samice, a jasnoniebieskie samce. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Kapsułki głowowe pobrane od osobnika nr 25 zgodnie z protokołem historii życia. Kapsuły głowowe zostały sfotografowane przez Johnathana Bremera przy użyciu systemu automontażu. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.
| Stadium rozwojowe | Średnia długość ciała (mm) | Błąd std. (długość) | Średni czas rozwoju (liczba dni) | Błąd std. (czas rozwoju) |
| I stadium larwalne | 1,69478261 (n=23) | 0.02152643 | 2,90625 (n=32) | 0.08229783 |
| Stadium larwalne II | 2,7248958 (n=32) | 0.04302826 | 3,375 (n=32) | 0.16649857 |
| Stadium larwalne III | 5,45751042 (n=32) | 0.12120829 | 3,5 (n=32) | 0.20080483 |
| IV stadium larwalne | 10,236968 (n=32) | 0.23653991 | 3,875 (n=32) | 0.18917265 |
| Piąte stadium larwalne | 8,7625 (n=2) | 2.6125 | 1,5 (n=2) | 0.5 |
| VI stadium larwalne | 10,2667 (n=1) | Brak danych | 3 (n=1) | N/D |
| Przepoczwar (stadium przedpoczwarcze) | 1,085833 (n=24) | 0.23948251 | 2,9375 (n=32) | 0.21504641 |
| Poczwarka | 9,0316129 (n=31) | 0.12106792 | 1,6578947 (n=38) | 0.3272288 |
Tabela 1: Średnia długość i czas rozwoju każdego stadium życiowego. Błąd standardowy podany dla każdej zmiennej, a wielkość próby w nawiasach.
| Stadium rozwoju | Średnia długość cięciwy skrzydła (mm) | Błąd standardowy |
| Dorosły | 12,63895 (n=38) | 0.1365516 |
| Kobieca | 12,960 (n=13) | 0.1465588 |
| Samiec | 12,472 (n=25) | 0.1863205 |
Tabela 2: Średnia długość cięciwy przedniego skrzydła u dorosłych motyli. Zawiera wartości średnie dla samic, samców oraz wszystkich osobników dorosłych (obie płcie łącznie).
| Model LM 1 | Błąd standardowy estymacji | wartość t | wartość p |
| Intercept | 1.9179 | 3.128 | 0.046 ** |
| Śr. długość drugiego stadium larwalnego | 0.682 | -1.1 | 0.278 |
| Śr. długość trzeciego stadium larwalnego | 0.2928 | 0.476 | 0.6381 |
| Śr. długość czwartego stadium larwalnego | 0.1373 | -0.57 | 0.5739 |
| Śr. długość poczwarki | 0.246 | 3.957 | 0.05 *** |
| *** p < 0.001; ** p < 0.01; * p < 0.05. | |||
Tabela 3: Tabela współczynników dla modelu regresji liniowej (model LM 1) w celu oceny związku między średnią długością każdego stadium życiowego (do analizy włączono n > 30) a długością rozpiętości skrzydeł osobników dorosłych. Zmienna zależna: długość rozpiętości skrzydeł osobników dorosłych (mm).
| Współczynniki | Błąd standardowy estymacji | wartość t | Pr (>|t|) |
| Przecięcie | 1.7091 | 3.031 | 0.0053 ** |
| Śr. długość poczwarki | 0.1878 | 4.414 | 0.0002 *** |
Tabela 4: Regresja krokowa (Stepwise 1). Zmienna zależna: długość cięciwy skrzydła dorosłego osobnika (mm).
| Model LM 2 | Błąd standardowy estymacji | wartość t | wartość p |
| Przecięcie | 1.1888 | 12.643 | 4,21e-12 *** |
| Liczba dni pierwszego stadium larwalnego | 0.3486 | 0.937 | 0.3583 |
| Liczba dni drugiego stadium larwalnego | 0.2603 | -0.686 | 0.4993 |
| Liczba dni w trzecim stadium larwalnym | 0.2281 | 1.028 | 0.3141 |
| Liczba dni czwartego stadium larwalnego | 0.2048 | 2.378 | 0.0257 * |
| Liczba dni w stadium przedpoczwalkowym | 0.222 | 1.133 | 0.2686 |
| Liczba dni poczwarki | 0.2495 | 0.616 | 0.5435 |
| Całkowita liczba dni | 0.1913 | -1.454 | 0.1589 |
| *** p < 0,01; ** p < 0,01; * p < 0.05. | |||
Tabela 5: Tabela współczynników dla modelu regresji liniowej (model LM 2) w celu oceny zależności między czasem rozwoju a długością cięciwy skrzydła osobników dorosłych. Zmienna zależna: długość cięciwy skrzydła osobników dorosłych (mm).
| Współczynniki | Błąd standardowy estymacji | wartość t | wartość p |
| Punkt przecięcia | 0.89304 | 16.314 | 7,86e-16 *** |
| Liczba dni drugiego stadium larwalnego | 0.17974 | -1.809 | 0.0811 • |
| Liczba dni czwartego stadium larwalnego | 0.16917 | 2.075 | 0.0473 * |
| Całkowita liczba dni | 0.04184 | -1.787 | 0.0848 • |
| *** p < 0,01; ** p < 0,01; * p < 0.05; • p < 0.1 | |||
Tabela 6: Regresja krokowa (Stepwise 2) dla czasu rozwoju. Zmienna zależna: długość cięciwy skrzydła osobnika dorosłego (mm).
Dyskusja
W tym miejscu ilustrujemy skuteczność tego sprawdzonego protokołu hodowli konserwującej ex situ w masowej produkcji zagrożonych motyli oraz to, jak można go zaadaptować do badań naukowych, aby pomóc w rozwiązaniu kluczowych luk w danych behawioralnych, historii życia lub ekologicznych. Na przykład lepsze zrozumienie średniego całkowitego czasu rozwoju (od jaja do dorosłego osobnika), średniego czasu trwania na każdym etapie życia oraz optymalnej temperatury do krycia pomogło udoskonalić protokół i zwiększyć ogólny sukces programu. Zdecydowana większość istniejących protokołów szczegółowo opisuje jedynie metody hodowli organizmów i nie omawia gromadzenia danych, badań naukowych ani wykorzystania takich wyników w celu pomocy w informowaniu i potencjalnym dostosowaniu metod ex situ.
Protokół ten wymaga codziennej hodowli organizmów. Zdrowie i produktywność organizmów są maksymalizowane dzięki czystym warunkom hodowli, brakowi przeludnienia organizmów i dostępności wysokiej jakości materiału roślinnego żywiciela larwnego. W większości używamy jednorazowych materiałów i pojemników hodowlanych (np. papierowych i plastikowych kubków) i zazwyczaj wymieniamy je regularnie, często codziennie, i nigdy nie używamy ponownie materiału. Jest to zarówno opłacalne, jak i minimalizuje potrzebę bardziej pracochłonnej dezynfekcji materiałów. Jednak powszechnie używane narzędzia, takie jak kleszcze entomologiczne, pędzle do malowania akwarelami i małe wysuwane klatki do ćwiczeń, a także wszystkie powierzchnie hodowlane, takie jak blaty i blaty stołów laboratoryjnych, są regularnie odkażane przy użyciu 5% roztworu wybielacza. Dokładny harmonogram dezynfekcji jest w dużym stopniu zależny od częstotliwości użytkowania, fenologii organizmu i innych zmiennych i powinien być dostosowany do konkretnych potrzeb każdego programu ex situ. Dodatkowo dowiadujemy się, że biały papier rzeźniczy jest przydatny do pokrycia wszystkich powierzchni hodowlanych. Zapewnia niedrogie, łatwe do rozmieszczenia czyste podłoże, a biały kolor tła ułatwia obserwację wszelkich zabłąkanych organizmów. Podczas codziennej hodowli cały personel laboratoryjny powinien zawsze nosić jednorazowe rękawice do badań laboratoryjnych, aby zminimalizować zanieczyszczenie i chronić personel przed potencjalnym podrażnieniem skóry wynikającym z obchodzenia się z roślinami lub organizmami. Jest to szczególnie ważne, jeśli personel laboratoryjny ma zwierzęta domowe, które wymagają miejscowego leczenia pcheł. Nawet niewielka ilość pozostałości substancji czynnej może być niebezpieczna dla zwierząt gospodarskich żyjących w niewoli.
Dodatkowo należy zadbać o zminimalizowanie przeludnienia organizmu. Przeludnienie larw może szybko doprowadzić do pogorszenia stanu zdrowia organizmu, a nawet kanibalizmu u niektórych taksonów, zwłaszcza Lycaenidae. Konieczne może być regularne oddzielanie larw w celu zmniejszenia ich liczebności w pojemnikach hodowlanych i/lub nawet izolowanie pojedynczych larw, jak opisano w części protokołu dotyczącej historii życia. Idealna liczba osób przypadających na kontener może się znacznie różnić w zależności od konkretnego taksonu i różnych ograniczeń programu ex situ, takich jak dostępny budżet, zaplecze laboratoryjne i całkowita liczba personelu hodowlanego. Podobnie zalecamy pozostawienie odpowiedniej przestrzeni między kubkami, w których znajdują się larwy, aby zminimalizować możliwość przemieszczania się organizmu między pojemnikami. Wreszcie, w przypadku większych populacji żyjących w niewoli, zdecydowanie zaleca się oddzielenie stada między jednym lub kilkoma obiektami laboratoryjnymi. Ta strategia ochronna może pomóc zminimalizować katastrofalne straty całej populacji z powodu choroby lub innych nieprzewidzianych skutków.
Jakość i dostępność roślin żywicielskich larw napędza produkcję zwierzęcą i silnie wpływa zarówno na tempo rozwoju larw, jak i ogólny stan zdrowia populacji. Niemniej jednak niewiele opublikowanych raportów lub badań podkreśla ten zakulisowy wymóg lub omawia najlepsze praktyki szkółkarskie. Skuteczne planowanie programu ex situ musi uwzględniać odpowiednią ilość roślin, produkcję i konserwację. Ponieważ wiele larw wymaga lub preferuje również pewne części roślin (np. końcowy nowy wzrost, pąki kwiatowe i kwiatostany, owoce itp.), wymagana jest skuteczna inscenizacja, aby zapewnić odpowiednią fenologię rośliny.
Dodatkowe względy obejmują odpowiednie zarządzanie demograficzne i genetyczne oraz minimalizację wszelkich potencjalnych negatywnych skutków niewoli. Zalecamy opracowanie planu zarządzania genetycznego. Może to obejmować strategie regularnego wprowadzania nowego materiału genetycznego, maksymalizacji różnorodności i zapobiegania bliskiemu chowowi wsobnemu, okresowej oceny kluczowych zmiennych przystosowania organizmów oraz monitorowania genetyki na pewnym poziomie, aby umożliwić porównanie z istniejącymi populacjami i sprawdzić stan zdrowia stad żyjących w niewoli. Uzasadnione jest również okresowe porównywanie cech osobników żyjących w niewoli z osobnikami z populacji założycielskich34,35.
Protokoły te reprezentują sprawdzone najlepsze praktyki. Powinny one przynieść korzyści wielu badaczom i praktykom zajmującym się ochroną przyrody, którzy mogą bezpośrednio zastosować lub dostosować nasze metody do własnych badań i programów ochrony i odbudowy zagrożonych motyli lub owadów ex situ. Specyficznie zarysowany protokół hodowli w niewoli jest prawdopodobnie najbardziej odpowiedni dla programów skoncentrowanych na innych Lycaenidae, pokrewnych taksonach lub taksonach o mniejszych rozmiarach. Niemniej jednak wiele elementów, takich jak te związane z zapewnieniem udanych zalotów i kopulacji, utrzymywaniem dorosłych osobników za pomocą sztucznego nektaru, maksymalizacją składania jaj i ogólną opieką nad larwami, można prawdopodobnie szerzej zastosować lub dostosować do szerszego zakresu taksonów. Jak wspomniano wcześniej, chociaż należy położyć nacisk na elastyczność protokołu, dostęp do innych uznanych metodologii może pomóc w dostarczeniu cennych informacji i realnym punktem wyjścia dla adaptacji i innowacji. Przedstawione metody oceny różnych cech historii życia, takich jak czas rozwoju larw i liczba stadiów larwalnych, mają prawdopodobnie szerokie zastosowanie w innych programach hodowli zachowawczej i zagrożonych taksonach. Zachęcamy innych do pomocy w wypełnianiu kluczowych luk w danych ekologicznych, gdy tylko jest to możliwe, oraz do publikowania zweryfikowanych protokołów i wyników programów.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty z U.S. Fish and Wildlife Service's Conservation Recovery Initiative (F17AP00467) oraz Disney Conservation Fund. Dodatkowego wsparcia udzieliło Muzeum Historii Naturalnej na Florydzie oraz Wydział Entomologii i Nematologii Uniwersytetu Florydy.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 12 uncji zwykłych białych kubków papierowych (karat) | Lollicup | C-KC16 | |
| 15-Amp 2-wylotowy mechaniczny mieszkaniowy wtyk odliczający minutnik Zegar oświetleniowy | Lowes | UTTNI2423 | |
| strzykawki sub-Q o pojemności 1 ml (0,45 mm x 16 mm) | Fisher Scientific | 14-829-10F | |
| 2 uncje przezroczystych plastikowych pokrywek na kubki Party | City | #791091 | |
| 2 uncje przezroczystych plastikowych kubków na porcje | Party City | #791088 | |
| 34,29 cm x 34,29 cm x 60,96 cm składana siatka popup chowu | Bioquip | 1466BV | |
| 8,5 "1-watowa żarówka zaciskana lampa robocza | Lowes | PTC301L | |
| Adoric Elektroniczna suwmiarka cyfrowa | Amazon.com | B07QX2SK2F | |
| Big Kid's Choice Arts & Zestaw szczotek rzemieślniczych-12/opakowanie, różne rozmiary | Walmart | #10965135 | |
| Przezroczysta plastikowa taca na kubki | Frontier Scientific Services | AG_9040 | |
| Fisher Scientific Termometr monitorujący pamięć | Fisher Scientific | 15-077-8D Kleszcze Fisher Scientific 15-077-8D | |
| , Proste punkty, Szwajcarski #4, Nierdzewny | BioQuip | 4531 | |
| Gliceryna Humco 6 uncji | Walmart | #303951037966 | |
| Zestaw farb świetlnych, niebieski, czerwony, żółty, 4 Dram | Bioquip | 1166A | |
| Gatorade Fierce Thirst Quencher o smaku melonowym lub napój sportowy Gatorade Thirst Quencher o smaku ponczu owocowego | Walmart | #568456137 | |
| Neoteck Digital 2 w 1 higrometr-termometr | Amazon.com | NTK026 | |
| Olympus 0,6 ml mikroprobówki, przezroczyste, polipropylenowe, Niesterylny | zbiornikowy Amazon.com | 24-272C | |
| Lowes | #5318 | ||
| Q-tips Waciki bawełniane | Walmart | #551398298 | |
| Prostokątny plastikowy pojemnik na tupperware z pokrywką (Rubbermaid) | Walmart | #554320171 | |
| Showgard 903 Szczypce do stempli, końcówka łopatkowa 4 5/8 cala | Amazon.com | #787793151378 | |
| Jednostronna rolka papieru falistego | Amazon.com | BXSF12 | |
| Nóż uniwersalny z ostrzem zatrzaskowym | OLFA | #5023 | |
| Plastikowe kubki Solo 9 uncji | Solo | SQ950 | |
| Thorton Plastics 50 dram przezroczysta plastikowa fiolka z zatrzaskiem (6.25 uncji) | Thorton Plastics | #50 | |
| Tiulowa szpula 9 cali x 150 stóp - Czarne | tkaniny Jo Ann | #16029696 | |
| Zep 32 uncje Plastikowa butelka z rozpylaczem | Lowes | HDPRO36 |
Bibliografia
- Thomas, J. A. Butterfly communities under threat. Science. 352 (6296), 216-218 (2016).
- Swengel, S. R., Schlicht, D., Olsen, F., Swengel, A. B. Declines of prairie butterflies in the Midwestern USA. Journal of Insect Conservation. 15 (1-2), 327-339 (2011).
- Habel, J. C., et al. Butterfly community shifts over two centuries. Conservation Biology. 30 (4), 754-762 (2016).
- Gilburn, A. S., et al. Are neonicotinoid insecticides driving declines of widespread butterflies? Peer J. 3, e1402(2015).
- Sánchez-Bayo, F., Wyckhuys, K. A. G. Worldwide decline of the entomofauna: A review of its drivers. Biological Conservation. 232, 8-27 (2019).
- Daniels, J. C., Magdich, M., Tolson, P. Butterfly recovery planning: Determining how to contribute. Butterfly Conservation in North America: Efforts to Help Save Our Charismatic Microfauna. Daniels, J. C. , Springer Science+Business Media B.V. New York. 1-21 (2015).
- U.S. Fish and Wildlife Service. Environmental Conservation Online System. Listed Animals. , https://ecos.fws.gov/ecp (2019).
- Schultz, C. B., Russell, C., Wynn, L. Restoration, reintroduction and captive propagation efforts for at-risk butterflies: a review. Israel Journal of Ecology and Evolution. 54, 41-61 (2008).
- Grow, S., Allard, R., Luke, D. The role of AZA-accredited zoos and aquariums in butterfly conservation. Butterfly Conservation in North America: Efforts to Help Save Our Charismatic Microfauna. Daniels, J. C. , Springer Science+Business Media B.V. New York. 23-34 (2015).
- Crone, E. E., Pickering, D., Schultz, C. B. Can captive rearing promote recovery of endangered butterflies? An assessment in the face of uncertainty. Biological Conservation. 139, 103-112 (2007).
- Sanchez, S. J., Daniels, J. C. The butterfly conservation initiative: Developing a new conservation vision through compound eyes. News of the Lepidopterists' Society. 49 (3), 75-77 (2007).
- Wardlaw, J. C., Elmes, G. W., Thomas, J. A. Techniques for studying Maculinea butterflies: I. Rearing Maculinea caterpillars with Myrmica ants in the laboratory. Journal of Insect Conservation. 2 (1), 79-84 (1998).
- Mattooni, R., Longcore, T., Krenova, Z., Lipman, A. Mass rearing the endangered Palos Verdes blue butterfly (Glaucopsyche lygdamus palosverdesensis:Lycaenidae). Journal of Research on the Lepidoptera. 37, 55-67 (1998).
- Pearce-Kelly, P., et al. The captive rearing of threatened Orthoptera: a comparison of the conservation potential and practical considerations of two species' breeding programmes at the Zoological Society of London. Journal of Insect Conservation. 2 (3-4), 201-210 (1998).
- Wells, C. N., Edwards, L., Hawkins, R., Smith, L., Tonkyn, D. A rearing method for Agrynnis (Speyeria) diana (Lepidoptera: Nymphalidae) that avoids diapause. Psyche. , 1-6 (2011).
- Grosboll, D. N. Captive Rearing the Endangered Mardon Skipper (Polites mardon) and Taylor's Checkerspot (Euphydryas editha taylori) Butterflies: Initial Results (Lepidoptera, Nymphalidae). Proceedings of the species at risk, pathways to recovery conference. , Species at Risk Pathways to Recovery Conference Organizing Committee. Victoria. 1-6 (2004).
- Barclay, E., Arnold, M., Andersen, M., Shepherdson, D. Husbandry manual: Taylor's checkerspot (Euphydryas editha taylori). , 1st edition, Oregon Zoo. Portland, Oregon. (2009).
- Johnson, J., et al. Captive Rearing of the Laguna Mountains Skipper (Pyrgus ruralis laguanae): Final Report. , (2010).
- Linders, M. Captive rearing and translocation of Taylor's checkerspot in South Puget Sound: 2011-2012. 2012 Annual Progress Report to the ACUB Technical Review Committee. , (2012).
- Linders, M., Lewis, K. Captive rearing and translocation of Taylor's checkerspot butterfly (Euphydryas editha taylori.): South Puget Sound, Washington, 2012–2013. 2013 Annual Report to the US Fish and Wildlife Service (Cooperative Agreement F12ACI00835), Joint Base Lewis-McChord Fish and Wildlife Program and JBLM-ACUB Technical Review Committee. , (2013).
- Department of Conservation and Research, Toledo Zoo. Propagation Handbook for the Karner Blue Butterfly Lycaeides melissa samuelis. , Fourth edition, (2006).
- Johnson, J. J., et al. Captive Rearing of Lange's Metalmark Butterfly, 2011-2015. United States Fish and Wildlife Service, CVPIA Habitat Restoration Program (F11AP00168). , (2016).
- Andersen, M. J., et al. Oregon Silverspot Butterfly Husbandry Manual. , Oregon Zoo. Portland, Oregon. (2010).
- Washington Department of Fish and Wildlife. Threatened and Endangered Wildlife in Washington: 2012 Annual Report. Listing and Recovery Section, Wildlife Program, Washington Department of Fish and Wildlife. , Olympia. (2013).
- McGowan, P. J. K., Traylor-Holzer, K., Leus, K. IUCN guidelines for determining how ex situ management should be used in species conservation. Conservation Letters. 10 (3), 361-366 (2017).
- Pearce-Kelly, P., et al. The conservation value of insect breeding programmes: Rationale, evaluation tools and example programme case studies. Insect Conservation Biology: Proceedings of the Royal Entomological Society's 23nd Symposium. Stuart, A. J. A., New, T. R., Lewis, O. T., et al. , 57-75 (2007).
- U.S. Fish and Wildlife Service. Policy Regarding Controlled Propagation of Species Listed Under the Endangered Species Act. United States Federal Register. 65 (183), 56916-56922 (2000).
- IUCN/SSC. Guidelines on the use of ex situ management for species conservation. Version 2.0. IUCN Species Survival Commission. , Gland, Switzerland. (2014).
- Sutherland, W. J., Pullin, A. S., Dolman, P. M., Knight, T. M. The need for evidence-based conservation. Trends in Ecology & Evolution. 19 (6), 305-308 (2004).
- Daniels, J. C., Nordmeyer, C., Runquist, E. Improving standards for at-risk butterfly translocations. Diversity. 10, 67(2018).
- Saarinen, E. V. Population genetics of the endangered Miami blue butterfly Cyclargus thomasi bethunebakeri.: implications for conservation. , University of Florida. Gainesville. (2009).
- Becker, T. Propagation and repatriation of the regal fritillary butterfly. , http://titag.org/2016/2016papers/beckerregal.pdf (2019).
- R Core Team. R A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2016).
- Schultz, C. B., Dzurisin, J. D., Russell, C. Captive rearing of Puget blue butterflies (Icaricia icarioides blackmorei) and implications for conservation. Journal of Insect Conservation. 13 (3), 309-313 (2009).
- Frankham, R., Loebel, D. A. Modeling problems in conservation genetics using captive Drosophila populations: Rapid genetic adaptation to captivity. Zoo Biology. 11 (5), 333-342 (1992).
Przedruki i uprawnienia
