Pomimo długotrwałego zainteresowania pochodzeniem różnorodności zwierząt, mamy ograniczoną wiedzę na temat zmian genetycznych, które leżą u podstaw ewolucji morfologii, fizjologii i zachowania. Tetra meksykańska, Astyanax mexicanus, stała się potężnym modelem, który pogłębia nasze zrozumienie ewolucji cech. Ten gatunek ryb występuje jako dwa morfotypy, morf zamieszkujący rzekę o oczach (ryba powierzchniowa), który występuje obficie w rzekach w Meksyku i południowym Teksasie, oraz bezoki morf żyjący w jaskiniach (ryby jaskiniowe), które rozwijają się w wiecznie ciemnych wapiennych jaskiniach w regionie Sierra del Abra w północno-wschodnim Meksyku1. Znanych jest 29 populacji jaskiniowych, które powstały w wyniku co najmniej dwóch niezależnych inwazji ryb powierzchniowych 2,3. Morfy jaskiniowe i rzeczne pozostały interferyjne i są łatwe do rozmnażania w laboratorium, co pozwala naukowcom na genetyczne mapowanie cech, które ewoluują w odpowiedzi na unikalne naciski selekcyjne w jaskini. Na przykład brak światła doprowadził do regresji oczu 4,5,6,7,8,9, pigmentu 10,11,12,13,14 i snu 15,16,17,18,19; Ograniczenie składników odżywczych wybrało przejadanie się20, przyrost masy ciała21 i magazynowanie tłuszczu22; A nawigowanie w ciemności sprzyja zwiększonej zdolności wyczuwania otoczenia 23,24,25,26,27,28. Coraz więcej badaczy wykorzystuje tę rybę do badania genetycznych podstaw ewolucji. Ponieważ niektóre cechy, które są adaptacyjne u ryb jaskiniowych, są szkodliwe dla ludzi, ryby jaskiniowe stały się również atrakcyjne dla badań biomedycznych 21,29,30,31. Mając na celu promowanie odtwarzalności i zapewnienie platformy dla nowych badaczy, ta kolekcja metod JoVE zawiera techniki hodowli, pomiaru cech i badania aktywności genów.
Jako punkt wyjścia należy zastosować procedurę zapłodnienia in vitro zademonstrowaną przez Peuß i wsp. 32 służy wielu celom, ponieważ zapewnia metodę uzyskiwania 1) hybryd jaskiniowo-powierzchniowych, które mogą być trudne do wyhodowania, 2) zarodków w stadium jednokomórkowym do mikroiniekcji oraz 3) próbek dopasowanych do etapu do analizy fenotypów embrionalnych. A. mexicanus zazwyczaj składa ikrę w nocy. Peuß i wsp. Opisz system zmiany cyklu światło-ciemność i uzyskanie ryb, które są przygotowane do pobierania gamet w normalnych godzinach pracy. Ich wizualna demonstracja zbierania gamet jest szczególnie pomocna, ponieważ ten krok wymaga starannej techniki. Ich artykuł ma zasadnicze znaczenie dla wielu dalszych zastosowań, w tym dla porównania wzorców ekspresji genów podczas embriogenezy.
Luc i wsp. 33 zapewniają solidny protokół hybrydyzacji in situ zoptymalizowany pod kątem wizualizacji ekspresji genów w zarodkach A. mexicanus . Upraszczają tę wielodniową procedurę za pomocą listy kontrolnej (dostarczonej jako plik dodatkowy) i udostępniają wskazówki dotyczące rozwiązywania problemów. Uzupełnieniem tej metody są Riddle i wsp. 34 pokazują, jak badać ekspresję genów i lokalizację białek u wyklutych ryb przy użyciu immunohistochemii Wholemount. Aby dokonać znaczących porównań morfotypów po wykluciu i rozpoczęciu karmienia, konieczne jest kontrolowanie warunków wzrostu. Pokazują, jak rozmnażać dorosłe osobniki poprzez naturalne tarło i hodować larwy w ustalonych zagęszczeniach na diecie wrotka, która ma znaczne zalety pod względem zawartości składników odżywczych i kosztów w porównaniu z innymi źródłami pożywienia. Ich protokół barwienia immunologicznego z powodzeniem rozpoznaje antygeny w mózgu, jelitach i trzustce dopiero po 12 dniach od wyklucia, co pozwala na zbadanie późnych etapów rozwoju i funkcji narządów. Co ważne, dostarczają one listę przeciwciał, które zostały z powodzeniem zastosowane u A. mexicanus. Połączone metody Luca i wsp. oraz Riddle i wsp. są przydatne do analizy skutków manipulacji genetycznych.
W tym zbiorze metod, Stahl i wsp. 35 opisuje wiele sposobów manipulowania funkcją genów u A. mexicanus , w tym: mikroiniekcję morfolino, mutagenezę za pośrednictwem CRISPR-Cas9 i transgenezę za pośrednictwem Tol2. Oprócz zademonstrowania picoiniekcji i badań przesiewowych wstrzykniętych zarodków, dostarczają one pomocnych wskazówek dotyczących projektowania morfolinosów, przewodników RNA i transgenów. Dzielą się wynikami, które potwierdzają każdą z tych technik. Na przykład, celowanie w hipokretynę/oreksynę (HCRT) za pomocą morfoliny blokującej splot zmniejsza aktywność lokomotoryczną i zwiększa sen u ryb jaskiniowych; edycja oca2 (przyczynowego locus albinizmu ryb jaskiniowych) u ryb powierzchniowych przy użyciu CRISPR/Cas9 daje ryby powierzchniowe albinosów; a wprowadzenie genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia napędzanego przez panneuronalny promotor danio pręgowanego za pomocą transgenezy Tol2 osiąga prawie wszechobecną ekspresję neuronalną w tetrze meksykańskiej. Zwracają uwagę, że wiele narzędzi genetycznych opracowanych u danio pręgowanego może być bezpośrednio przeniesionych na ryby jaskiniowe ze względu na ich podobne genomy. Ich artykuł jest niezbędnym źródłem informacji dla naukowców przeprowadzających badania funkcjonalne nad A. mexicanus i uzupełnia dodatkowe artykuły koncentrujące się na pomiarze fenotypów, w tym zachowania.
Ryby jaskiniowe znacznie ograniczyły sen i zmieniły rytm okołodobowy 36,37,38. Jest to ekscytująca okazja do zbadania wpływu genetyki i środowiska na zmienność snu u kręgowców. Jaggard i wsp. 39 pokazują, jak zbudować system z niedrogich materiałów, który można wykorzystać do rejestrowania snu na różnych etapach życia i w różnych kontekstach. Ponadto opisują, jak zautomatyzować śledzenie ryb w tej konfiguracji i uzyskać pomiary ilościowe dla snu i lokomocji. Opracowana przez nich technika ma zastosowanie w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych leków i genetyki, a także w tradycyjnych badaniach mapowania genetycznego.
Oprócz zmniejszonego snu, ryby jaskiniowe wyewoluowały różnice w czynnościach lokomotorycznych związanych z żerowaniem, w tym zmieniony kąt żerowania i przyciąganie wibracji 16,30,40. Kluczowe dla zrozumienia, w jaki sposób te działania ewoluowały, jest powiązanie ich ze zmianami rozwojowymi. Worsham i wsp. 41 przedstawia metody rejestrowania zachowań i korelowania ich ze zmianami w neuromastach; zewnętrzne struktury mechanosensoryczne, które reagują na przepływ wody. Najpierw pokazują, jak tworzyć komory do rejestrowania przyciągania drgań i snu, a także szczegółowo opisują, jak określić ilościowo zachowania za pomocą bezpłatnego oprogramowania i konfigurowalnych skryptów. Następnie pokazują, jak wizualizować neuromasty u żywych dorosłych ryb za pomocą fluorescencyjnego barwnika mitochondrialnego i ponownie, przy użyciu wolnego oprogramowania, jak określić ilościowo liczbę neuromastów w sposób półautomatyczny. Przyciąganie drgań i liczba neuromasztów są ze sobą skorelowane23; Ich metoda zapewnia protokół krok po kroku do zbadania tej relacji. Metody Jaggarda i Worshama mogą być wykorzystane do odkrycia dodatkowych zachowań, a także mogą być stosowane do innych gatunków ryb. Metody te dają ilościowe i spójne wyniki, które są niezbędne do odkrycia genetycznych podstaw ewolucji behawioralnej.
Nowoczesne techniki pomiaru i manipulowania funkcją genów przesunęły badania ewolucyjne z porównawczych na mechanistyczne. Łącznie, artykuły zawarte w tym zbiorze metod służą jako przewodnik do prowadzenia badań nad funkcją genów u A. mexicanus. Podczas gdy naukowcy odkryli fascynujące różnice w morfologii, fizjologii i zachowaniu między morfami powierzchniowymi i jaskiniowymi, istnieje wiele cech, które nie zostały jeszcze szczegółowo zbadane, a prawdopodobnie więcej do odkrycia. W miarę jak będziemy wykonywać kolejne prace, ta mała rybka będzie nadal miała duży wpływ na nasze zrozumienie ewolucji.