Wizualizacja rozwijającego się mózgu u żyjących danio pręgowanych za pomocą Brainbow i poklatkowego obrazowania konfokalnego

Summary

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem, które może być użyte do zbadania mechanizmów komórkowych leżących u podstaw rozwoju układu nerwowego. W tym miejscu opisujemy technikę wykorzystania poklatkowej mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dużej liczby wielokolorowych komórek znakowanych Brainbow w czasie rzeczywistym w rozwijającym się układzie nerwowym danio pręgowanego.

Abstract

Rozwój układu nerwowego kręgowców wymaga precyzyjnej koordynacji złożonych zachowań i interakcji komórkowych. Zastosowanie technik obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości może zapewnić wyraźny wgląd w te procesy zachodzące w żywym organizmie. Na przykład dzielące się komórki i ich potomstwo można śledzić w czasie rzeczywistym, gdy tworzy się układ nerwowy. W ostatnich latach postęp techniczny w technikach wielobarwnych rozszerzył rodzaje pytań, które można badać. Wielokolorowe podejście Brainbow może być używane nie tylko do rozróżniania podobnych komórek, ale także do kodowania kolorami wielu różnych klonów powiązanych komórek, z których każdy pochodzi z jednej komórki progenitorowej. Pozwala to na multipleksową analizę rodowodu wielu różnych klonów i ich zachowań jednocześnie podczas rozwoju. Tutaj opisujemy technikę wykorzystania poklatkowej mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dużej liczby wielokolorowych komórek znakowanych Brainbow w czasie rzeczywistym w rozwijającym się układzie nerwowym danio pręgowanego. Jest to szczególnie przydatne do śledzenia interakcji komórkowych między podobnymi komórkami, które są trudne do zróżnicowanego oznaczania przy użyciu tradycyjnych kolorów sterowanych promotorem. Nasze podejście może być używane do śledzenia relacji pochodzenia między wieloma różnymi klonami jednocześnie. Duże zbiory danych wygenerowane przy użyciu tej techniki dostarczają bogatych informacji, które można porównywać ilościowo z manipulacjami genetycznymi lub farmakologicznymi. Ostatecznie uzyskane wyniki mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na systematyczne pytania dotyczące tego, jak rozwija się układ nerwowy.

Introduction

We wczesnych fazach rozwoju, pule wyspecjalizowanych komórek progenitorowych dzielą się wielokrotnie w strefy proliferacyjne, tworząc różnorodne układy komórek potomnych. Komórki urodzone w tym okresie rozwojowym będą się następnie różnicować i przemieszczać, tworząc powstające narządy. W układzie nerwowym czynniki progenitorowe, takie jak glej promieniowy, powodują powstawanie niedojrzałych neuronów w strefach komorowych. Gdy neurony migrują z komór i dojrzewają, rozszerzająca się tkanka ostatecznie tworzy bardzo złożone struktury mózgu^1,2,3,4

Protocol

Procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) w Lewis & Clark College.

1. Mikroiniekcja zarodków danio pręgowanego

1. Ustaw dorosłego danio pręgowanego typu dzikiego w zbiornikach godowych z separacją płciową po południu przed wykonaniem mikroiniekcji^39,40.
2. Przygotuj roztwór DNA rano po wykonaniu mikrowstrzyknięć. Rozcieńczyć hsp: Zebrabow¹¹ plazmidowe DNA do stężenia ~10 ng / μL w 0,1 mM KCl, wraz z 2,5% czerwieni fenolowej i enzymem rekombinazy Cre....

Results

Ta sekcja ilustruje przykłady wyników, które można uzyskać za pomocą opisanego tutaj podejścia do wielokolorowego obrazowania poklatkowego in vivo. Pokazujemy, że Brainbow koduje kolorami klony komórek w proliferacyjnej strefie komorowej rozwijającego się tyłomózgowia danio pręgowanego¹⁴ (Rysunek 1).

Zazwyczaj, gdy komórki oznaczone symbolem Brainbow były ułożone wzdłuż określonego promieniowego włókna, miały ten sam kolor (

Discussion

Protokół ten opisuje metodę wizualizacji klonów komórek progenitorowych i neuronów w rozwijającym się tyłomózgowiu danio pręgowanego i śledzenia ich in vivo za pomocą Brainbow i poklatkowej mikroskopii konfokalnej¹¹. Główną zaletą tego protokołu w porównaniu z badaniami in vitro lub ex vivo jest możliwość bezpośredniej obserwacji strefy proliferacyjnej mózgu kręgowców w jego naturalnym środowisku w czasie. Technika ta opiera się na wcześniejszych badaniach, w których znakowano pojedynczy klon za p.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipeta transferowa 1,5 ml (cienka końcówka)	Globe Scientific, Inc.	134020
1-fenylo-2-tiomocznik (PTU)	Alfa Aesar	L06690	Rozcieńczony do 0,2 mM w E3 w celu zapobiegania pigmentacji zarodków
50 ml stożkowe rurki	Corning	352070	Do szokujących termicznie zarodków
Nylonowa żyłka wędkarska 6 funtów	SecureLine	NMT250	Do produkcji manipulatorów zarodków
7,5 ml pipeta transferowa	Globe Scientific, Inc.	135010
CaCl2	Sigma	C3881	Do
wacików bawełnianych	Puritan	867-WC BEZ KLEJU	Do wytwarzania manipulatorów zarodków
Cre rekombinaza New	England Biolabs	M0298M
Cyfrowa sucha kąpiel	Genemate	490016-616	Służy do przechowywania LMA w temperaturze 42 &; C
			preparacji epifluorescencji
Szklane rurki kapilarne	World Precision Instruments	TW100F-4
Inkubator	Forma Scientific	3158	Aby utrzymać zarodki w temperaturze 28 & stopni; C
Formy do płytek wtryskowych	Adaptacyjne narzędzia naukowe	TU-1
Kąpiel wodna izotempowa	Fisher Scientific	2320	Do szokujących termicznie zarodków
KCl	AMRESCO	0395	Do E3 i do roztworu DNA do wstrzykiwań
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny	Zeiss	LSM710
LE agaroza	Genemate	E3120	Tworzyć Płytki wtryskowe agarozy
Agaroza niskotopliwa (LMA)	AMRESCO	J234
Zbiorniki łączące	Aquaneering, Inc.
Błękit metylenowy	Sigma	M9140	Dla E3
MgSO4< / sub>	Sigma	9397	Dla
E3 Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301
Ściągacz do mikropipet	Sutter Instrument Co.	P-97
MS-222 Trikaina-S	Western Chemical, Inc.		Wywar wykonany w dawce 4 mg/ml w wodzie z odwróconej osmozy (RO), a następnie dodany kroplami do E3 do końcowego stężenia 0,2 mM w celu znieczulenia zarodków
NaCl	J.T. Baker	4058-01	Do
szalek Petriego E3 (90 mm, 60 mm)	Genesee Scientific	32-107G	Do przechowywania zarodków i tworzenia komory obrazowania (60 mm)
Czerwień fenolowa	Sigma	P0290
Markery pierścieniowe z miękkim ściegiem	Koniczyna Needlecraft, Inc.	354	Do tworzenia komory obrazowania z szalką Petriego
Super klej (Ultra gel control)	Loctite	1363589	Do wykonywania manipulatorów zarodków
Igły strzykawkowe	Beckton Dickinson	BD329412	Do dekorionacji zarodków