Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wizualizacja rozwijającego się mózgu u żyjących danio pręgowanych za pomocą Brainbow i poklatkowego obrazowania konfokalnego

8.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60593

⸱

23 marca 2020

 ,  , 
1Biology Department, Lewis & Clark College

W tym artykule

Podsumowanie

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem, które może być użyte do zbadania mechanizmów komórkowych leżących u podstaw rozwoju układu nerwowego. W tym miejscu opisujemy technikę wykorzystania poklatkowej mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dużej liczby wielokolorowych komórek znakowanych Brainbow w czasie rzeczywistym w rozwijającym się układzie nerwowym danio pręgowanego.

Streszczenie

Rozwój układu nerwowego kręgowców wymaga precyzyjnej koordynacji złożonych zachowań i interakcji komórkowych. Zastosowanie technik obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości może zapewnić wyraźny wgląd w te procesy zachodzące w żywym organizmie. Na przykład dzielące się komórki i ich potomstwo można śledzić w czasie rzeczywistym, gdy tworzy się układ nerwowy. W ostatnich latach postęp techniczny w technikach wielobarwnych rozszerzył rodzaje pytań, które można badać. Wielokolorowe podejście Brainbow może być używane nie tylko do rozróżniania podobnych komórek, ale także do kodowania kolorami wielu różnych klonów powiązanych komórek, z których każdy pochodzi z jednej komórki progenitorowej. Pozwala to na multipleksową analizę rodowodu wielu różnych klonów i ich zachowań jednocześnie podczas rozwoju. Tutaj opisujemy technikę wykorzystania poklatkowej mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dużej liczby wielokolorowych komórek znakowanych Brainbow w czasie rzeczywistym w rozwijającym się układzie nerwowym danio pręgowanego. Jest to szczególnie przydatne do śledzenia interakcji komórkowych między podobnymi komórkami, które są trudne do zróżnicowanego oznaczania przy użyciu tradycyjnych kolorów sterowanych promotorem. Nasze podejście może być używane do śledzenia relacji pochodzenia między wieloma różnymi klonami jednocześnie. Duże zbiory danych wygenerowane przy użyciu tej techniki dostarczają bogatych informacji, które można porównywać ilościowo z manipulacjami genetycznymi lub farmakologicznymi. Ostatecznie uzyskane wyniki mogą pomóc w udzieleniu odpowiedzi na systematyczne pytania dotyczące tego, jak rozwija się układ nerwowy.

Wprowadzenie

We wczesnych fazach rozwoju, pule wyspecjalizowanych komórek progenitorowych dzielą się wielokrotnie w strefy proliferacyjne, tworząc różnorodne układy komórek potomnych. Komórki urodzone w tym okresie rozwojowym będą się następnie różnicować i przemieszczać, tworząc powstające narządy. W układzie nerwowym czynniki progenitorowe, takie jak glej promieniowy, powodują powstawanie niedojrzałych neuronów w strefach komorowych. Gdy neurony migrują z komór i dojrzewają, rozszerzająca się tkanka ostatecznie tworzy bardzo złożone struktury mózgu1,2,3,4,5,6. Koordynacja między podziałem przodków a różnicowaniem i migracją neuronów określi ostateczną wielkość, kształt, a tym samym funkcję mózgu, bezpośrednio wpływając na zachowanie7,8,9,10. Podczas gdy ścisła kontrola nad tymi procesami jest oczywiście kluczowa dla prawidłowego rozwoju mózgu, globalne mechanizmy regulujące tę dynamikę nie są dobrze poznane. Tutaj opisujemy narzędzie do badania rozwoju układu nerwowego w rozdzielczości komórkowej, pozwalające naukowcom na wizualizację komórek progenitorowych i neuronów in vivo w rozwijającym się mózgu danio pręgowanego za pomocą Brainbow i śledzenie ich zachowania w czasie za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej11. Podejście to można również dostosować do wizualizacji innych części rozwijającego się zarodka.

Aby obserwować i rozróżniać komórki w rozwijającym się mózgu danio pręgowanego, dostosowaliśmy technikę znakowania komórek Brainbow11. Brainbow wykorzystuje losowo określoną, kombinatoryczną ekspresję trzech odrębnych białek fluorescencyjnych (FP) do znakowania populacji komórek. Podczas gdy domyślnym wyrażeniem ekspresji Brainbow jest czerwony FP dTomato, rekombinacja przez enzym rekombinazę Cre powoduje ekspresję mCerulean (cyjan fluorescencyjne białko, CFP) lub żółtego białka fluorescencyjnego (YFP)12,13. Łączna ilość każdego FP wyrażonego w komórce nadaje jej unikalny odcień, umożliwiając wyraźne wizualne odróżnienie od sąsiednich komórek. Dodatkowo, gdy komórka progenitorowa dzieli się, każda komórka potomna odziedziczy kolor z komórki macierzystej, tworząc klony oznaczone kolorami i umożliwiając badaczom śledzenie linii komórkowej11,14. Chociaż pierwotnie był używany do analizy obwodów neuronalnych u myszy12, Brainbow został od tego czasu wyrażony w wielu różnych organizmach modelowych, w tym w danio pręgowanym15.

Nasza technika opiera się na poprzednich metodach wielokolorowego etykietowania i obrazowania, aby bezpośrednio obrazować wiele kolorowych klonów w czasie u żyjących danio pręgowanych. Ze względu na ich przezroczystość optyczną jako embrionów, danio pręgowany dobrze nadaje się do eksperymentów obrazowych16, a poprzednie badania wykorzystywały Brainbow u danio pręgowanego do badania różnych tkanek, w tym układu nerwowego11,15,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Możliwość bezpośredniego obrazowania w żywym organizmie, wraz z ich szybkim rozwojem ex utero, sprawiają, że danio pręgowany jest cennym modelem rozwoju kręgowców. W przeciwieństwie do mózgu ssaków, cała strefa proliferacyjna tyłomózgowia danio pręgowanego jest łatwo dostępna do obrazowania bez zakłócania jej endogennego środowiska6. Pozwala to na przeprowadzanie eksperymentów w żywym organizmie, a nie w warunkach in vitro lub utrwalonych preparatów tkankowych. W przeciwieństwie do eksperymentów z obrazowaniem stałym, badania in vivo pozwalają na projektowanie podłużne, generując godziny danych, które można analizować pod kątem wzorców, zwiększając w ten sposób prawdopodobieństwo zaobserwowania stosunkowo rzadkich zdarzeń. W zależności od szybkości i długości interesujących nas zdarzeń, badacze mogą zdecydować się na przeprowadzenie krótkich (1-2 h) lub długich (do ~16 godzin) eksperymentów z obrazowaniem poklatkowym. Korzystając z promotora szoku cieplnego danio pręgowanego 70 (hsp70, hsp), wyrażenie Brainbow może być kontrolowane czasowo28,29. Dodatkowo, wyrażenie mozaiki indukowane przez ten promotor dobrze nadaje się do etykietowania i śledzenia wielu klonów11.

Możliwość wizualnej identyfikacji wielu klonów w żywym mózgu jest zaletą tej metody. Ważne wcześniejsze badania, które badały rolę klonów w rozwoju układu nerwowego, wykorzystywały wektory retrowirusowe do znakowania pojedynczej komórki progenitorowej i jej potomstwa za pomocą pojedynczego FP lub innego łatwego do wizualizacji białka. Takie etykietowanie pozwala badaczom obserwować pojedynczy klon w czasie, zarówno in vitro, jak i in vivo2,30,31,32,33,34,35,36,37,38. W przeciwieństwie do metod śledzenia zachowania komórek w obrębie jednego klonu, wyraźne kolory Brainbow pozwalają naukowcom obserwować dynamikę wśród klonów. Dodatkowo, używając Brainbow do oznaczania wielu klonów w mózgu, zbierane są dodatkowe dane na temat zachowania klonów w stosunku do technik, które oznaczają pojedynczy klon11. Co ważne, opisane tutaj podejścia można rozszerzyć w celu wygenerowania porównań rozwojowych między rybami, które zostały poddane różnym manipulacjom genetycznym lub farmakologicznym18. Ogólnie rzecz biorąc, te zalety sprawiają, że poklatkowe obrazowanie konfokalne in vivo danio pręgowanego z ekspresją Brainbow jest idealne dla badaczy badających rozwój układu nerwowego kręgowców, szczególnie tych zainteresowanych rolą klonów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) w Lewis & Clark College.

1. Mikroiniekcja zarodków danio pręgowanego

  1. Poprzedniego popołudnia przed wykonaniem mikroiniekcji umieść dorosłe danio pręgowane dzikiego typu w zbiornikach do kojarzenia z podziałem na płeć39,40.
  2. Przygotuj roztwór DNA w dniu mikroiniekcji. Rozcieńcz plazmidowe DNA hsp:Zebrabow11 do stężenia ~10 ng/μL w 0,1 mM KCl, z dodatkiem 2,5% czerwieni fenolowej i 3,75U enzymu rekombinazy Cre.
  3. Wykonaj mikroiniekcje roztworu DNA do jednokomórkowych embrionów danio pręgowanych w ciągu 45 min od zapłodnienia39,41. Wstrzyknij do każdego embrionu około 4,2 nL tego roztworu, co odpowiada ~42 pg plazmidowego DNA.
    UWAGA: Krok mikroiniekcji można pominąć, jeśli zamiast tego skrzyżowano transgeniczną linię danio pręgowanych wykazującą ekspresję Brainbow, taką jak Tg(ubi:Zebrabow)15 oraz Tg(neurod:Zebrabow)18. Wykonanie mikroiniekcji może być korzystne, ponieważ pozwala badaczom na miareczkowanie liczby kopii i gęstości znakowania. Ponadto, jeśli jest to pożądane, wraz z Brainbow można wstrzyknąć drugą konstrukcję DNA, która znakuje lub manipuluje konkretnym produktem genu (np. białko fluorescencyjne dalekiej czerwieni uzupełniające Brainbow18).
  4. Przechowuj wstrzyknięte embriony w szalkach Petriego z medium E339 w inkubatorze w temperaturze 28 °C przez 24 h.

2. Szok termiczny w celu indukowania ekspresji Brainbow

UWAGA: Jeśli wstrzyknięty plazmid DNA lub ekspresowany transgen nie wykorzystuje promotora hsp70 do sterowania ekspresją, etap szoku termicznego można pominąć, a zdrowe embriony należy niezwłocznie przenieść do fenylotiomocznika (PTU) 24 h po zapłodnieniu (hpf).

  1. W 24 hpf odrzuć martwe i zdeformowane zarodki z grupy zarodków po iniekcji. Następnie przenieś zdrowe zarodki do probówek 50 mL, mieszcząc do 20 zarodków w jednej probówce.
  2. Napełnij probówki 10 mL medium E3. Przykryj każdą probówkę zakrętką, ale nie zamykaj jej szczelnie.
  3. Umieść statyw z probówkami 50 mL w pozycji pionowej w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Upewnij się, że poziom wody w kąpieli jest wyższy niż poziom medium E3 w probówkach i pozostaw je na 80 do 90 min.
  4. Wyjmij statyw z zarodkami z kąpieli wodnej i ponownie umieść go w pozycji pionowej w inkubatorze o temperaturze 28 °C. Odczekaj do 1 h, aż medium E3 ostygnie, a zarodki stopniowo zaaklimatyzują się do temperatury. Następnie przenieś zarodki do szalek Petri zawierających 0,2 mM PTU w medium E3, podgrzanym w inkubatorze, aby zapobiec pigmentacji zarodków.
    OSTRZEŻENIE: PTU jest toksyczną substancją chemiczną, z którą należy obchodzić się ostrożnie i którą należy odpowiednio utylizować. Zaleca się stosowanie rękawiczek.

3. Przesiewowe badanie embrionów pod kątem ekspresji Brainbow

  1. Od 2 do 4 h po szoku termicznym należy zbadać zarodki pod standardowym fluorescencyjnym mikroskopem sekcyjnym w celu sprawdzenia ekspresji CFP lub YFP, co wskazuje na pomyślną rekombinację Brainbow (wobec domyślnej ekspresji dTomato).
    UWAGA: Jeśli dostępne jest wiele opcji filtrów fluorescencyjnych, przesiewanie pod kątem CFP jest najskuteczniejszym sposobem identyfikacji ryb z prawidłową rekombinacją. W przypadku braku filtrów CFP i YFP, YFP może być również słabo widoczna przy użyciu filtrów do zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) ze względu na nakładanie się ich profili spektralnych.
  2. Należy wybrać zarodki z silną ekspresją FP w całym organizmie i przenieść je do oddzielnego naczynia z PTU. Zarodki należy obrazować w 1. dniu po zapłodnieniu (dpf; 28 hpf lub później) albo utrzymywać w PTU i obrazować w 2. lub 3. dpf.

4. Montowanie zarodków do obrazowania in vivo

  1. Przed dniem eksperymentu należy przygotować komorę obrazowania oraz narzędzie do manipulacji zarodkami.
    1. Przygotuj komorę obrazowania, ostrożnie przyklejając za pomocą kleju cjanoakrylowego plastikowy pierścień do środka szalki Petriego o średnicy 60 mm.
    2. Opcjonalnie przygotuj niestandardowy manipulator do zarodków, aby przesuwać zarodki wewnątrz szalki i orientować je podczas montowania. Zbuduj manipulator, przyklejając krótki odcinek nylonowej żyłki wędkarskiej (~1/2 cala, ~6 lb) do końca drewnianego patyczka do przesmarowania z watą, który został przycięty do długości ~4 cali.
  2. W razie potrzeby (np. obrazowanie w 2 dpf lub wcześniej), przed zamontowaniem zarodków przeprowadź dechorionację przy użyciu strzykawek pod mikroskopem sekcyjnym.
  3. Znieczul zarodki danio pręgowanego.
    1. Wypełnij szalkę Petriego o średnicy 60 mm do połowy roztworem E3 i dodaj 5–6 kropli MS-222 Tricaine-S w stężeniu 4 mg/mL do końcowego stężenia ~0.2 mM. Zamieszaj ruchem wirowym.
      UWAGA: Trikain należy obsługiwać ostrożnie i utylizować w odpowiedni sposób.
    2. Przenieś zarodki z PTU do roztworu trikainy, dbając o to, aby przenieść jak najmniejszą ilość PTU. Chociaż odruchy ryb powinny ustąpić po 1–2 min, pozostaw zarodki w trikainie do 10 min, aby zapewnić pełne znieczulenie na potrzeby eksperymentów z obrazowaniem time-lapse.
    3. Potwierdź, że zarodki są odpowiednio znieczulone. Oceń odruch przestrachu, delikatnie dotykając ogonów zarodków manipulatorem. Jeśli zaobserwowany zostanie ruch odruchowy, dodaj do szalki dodatkową kroplę trikainy jak najdalej od zarodków i zamieszaj ruchem wirowym. Obserwuj częstotliwość uderzeń serca zarodka pod mikroskopem sekcyjnym. Jeśli jest ona nienaturalnie wolna, dodaj do szalki dodatkowe krople E3, aby zmniejszyć stężenie trikainy.
  4. Zamontuj znieczulone zarodki w agarozie.
    1. Przenieś ryby do środka plastikowego pierścienia w komorze obrazowania i usuń jak najwięcej nadmiaru E3 za pomocą pipety transferowej z cienką końcówką.
    2. Używając czystej pipety transferowej, przykryj ryby 1,0% agarozą niskotopliwą (LMA) w E3 przechowywaną w temperaturze 42 °C i wypełnij cały plastikowy pierścień cienką warstwą agarozy. Użyj pipety transferowej, aby delikatnie wciągnąć zarodki do końcówki pipety i wypchnąć je z powrotem do agarozy, nie wprowadzając pęcherzyków powietrza.
    3. Zanim agaroza stwardnieje, szybko użyj manipulatora do zarodków, aby odpowiednio zorientować ryby. W przypadku obrazowania za pomocą mikroskopu pionowego, umieść zarodki jak najbliżej górnej powierzchni agarozy. Ustaw zarodki równolegle do dna komory obrazowania z wyprostowanym ogonem.
      UWAGA: W przypadku obrazowania tylnego mózgu zarodki można ustawić w widoku grzbietowym lub strzałkowym. Należy zadbać o to, aby głowy zarodków nie zapadły się, gdy agaroza jest jeszcze w stanie ciekłym. Inne orientacje mogą być odpowiednie w celu obrazowania innych rozwijających się tkanek. W przypadku mikroskopów odwróconych montowanie odbywa się inaczej, zazwyczaj poprzez umieszczenie ryb blisko dna szalki Petriego z przeszklonym dnem.
  5. Odczekaj, aż agaroza stwardnieje, a następnie wypełnij komorę obrazowania roztworem E3. Dodaj jak najwięcej E3, aby zrekompensować parowanie w trakcie obrazowania.

5. Obrazowanie konfokalne w trybie time-lapse rozwijającego się rąbka mózgu danio pręgowanego

  1. Umieść komorę obrazową na mikroskopie konfokalnym w celu przygotowania do obrazowania.
    1. Umieść komorę obrazową z rybą i roztworem E3 na mikroskopie konfokalnym.
    2. Wybierz obiektyw o wysokiej aperturze numerycznej i długim dystansie roboczym, np. obiektyw imersyjny wodny 20x (1.0 NA).
    3. Znajdź obszar z odpowiednio gęstym i jasnym znakowaniem interesujących typów komórek.
      UWAGA: Do regulacji temperatury i wilgotności podczas długich sesji obrazowania można również zastosować stół/urządzenie z kontrolą temperatury na mikroskopie. Pozwala to zmniejszyć parowanie.
  2. Skonfiguruj parametry akwizycji dla obrazowania Brainbow.
    1. Obrazuj poszczególne kanały FP sekwencyjnie. W przypadku korzystania z komercyjnego oprogramowania (np. oprogramowania Zen) wykonuje się to poprzez przygotowanie trzech „ścieżek” (tracks). Użyj lasera argonowego do wzbudzenia CFP przy 458 nm i YFP przy 514 nm. Użyj lasera DPSS 561 nm do wzbudzenia dTomato. Zbieraj emisję w zakresie 463–509 nm dla CFP, 519–555 nm dla YFP oraz 566–691 nm dla dTomato.
    2. W ustawieniach wyświetlania na ekranie przypisz CFP kolor niebieski, YFP kolor żółty, a dTomato kolor czerwony.
      UWAGA: Ustawienia te będą się różnić w zależności od tego, jakie linie laserowe i inne funkcje są dostępne w mikroskopie konfokalnym. Aby zwiększyć prędkość obrazowania, kanały CFP i dTomato mogą być obrazowane jednocześnie bez znaczącego przenikania sygnału (bleed-through). Jeśli obrazowane jest dodatkowe FP, np. FP dalekiej czerwieni, można je obrazować sekwencyjnie lub jednocześnie z YFP.
    3. Ustaw ogólne parametry obrazowania tak, aby uzyskiwać obrazy 16-bitowe o rozdzielczości co najmniej 1024 x 1024 z dwukrotnym uśrednianiem. Dostosuj zoom w zależności od obszaru i interesującego typu komórek (np. dla obrazowania tylnego mózgu z obiektywem 20x zoom będzie wynosić od 1.0 do 2.5). Zmaksymalizuj pole widzenia, aby uwzględnić wzrost ryby w czasie.
    4. Przeglądając każdą ścieżkę pojedynczo (i wyłączając pozostałe lasery, aby zapobiec fotobleachingowi), zoptymalizuj ustawienia akwizycji dla każdego FP z osobna (np. moc lasera, rozmiar otworu pinhole, wzmocnienie lampy fotopowielacza itp.).
    5. Wybierz zakres stosu Z (Z-stack) do obrazowania.
      UWAGA: W przypadku długich sesji obrazowania (>2 h) należy wziąć pod uwagę, że ryba będzie nadal rosnąć w trakcie obrazowania, dlatego zarówno pole XY, jak i zakres stosu Z powinny uwzględniać to z zapasem miejsca. Jeśli obrazujesz tylny mózg, zostaw w polu miejsce na przesuwanie się tkanki w kierunku rostralnym podczas okresu obrazowania. Należy również uwzględnić miejsce na wzrost w wymiarze Z. Uwzględnij w obrazie około 10–20 μm powyżej obszaru zainteresowania, niezależnie od tego, czy ryba jest ustawiona w widoku strzałkowym, czy grzbietowym.
  3. Skonfiguruj parametry obrazowania w odstępach czasu (time-lapse).
    1. Wybierz interwał czasowy. Długość interwału wynosi od 10 do 30 min w celu śledzenia zdarzeń mitotycznych i apoptotycznych w rozwijającym się tylnym mózgu. Długość interwału będzie zależeć od prędkości interesujących zdarzeń oraz całkowitego czasu potrzebnego na zarejestrowanie pojedynczego stosu Z.
    2. Wybierz długość sesji obrazowania. Sesje obrazowania time-lapse zazwyczaj odbywają się w nocy i mogą trwać co najmniej 16 h.
  4. Przeprowadź eksperyment.
    UWAGA:     Rybę można uśmiercić natychmiast po obrazowaniu lub ostrożnie wyciąć z agarozy za pomocą strzykawek i przenieść z powrotem do roztworu E3 w celu regeneracji. Odzyskane ryby można obrazować ponownie w późniejszym czasie, choć pozycja i głębokość komórek zmienią się w tym okresie z powodu ogólnego wzrostu.

6. Zarządzanie plikami time-lapse

  1. Zaimportuj plik obrazu do oprogramowania analitycznego.
    1. W przypadku korzystania z oprogramowania Zen, po zakończeniu akwizycji obrazu zapisz plik w formacie .czi. Upewnij się, że surowe dane są zapisane w formacie kompatybilnym z Fiji42 i/lub innym oprogramowaniem.
    2. Zaimportuj plik do oprogramowania Fiji, korzystając z modułu BioFormats Importer.
      UWAGA: Pliki z filmami time-lapse będą duże i mogą wymagać znacznej ilości czasu oraz pamięci podczas otwierania do analizy. Dlatego warto strategicznie podejść do sposobu ich zapisywania i otwierania. Przydatne może być zapisanie wersji o niższej jakości, którą można łatwiej otworzyć, aby wzrokowo wyszukać interesujące zdarzenia.
  2. W przypadku korzystania z Fiji, utwórz mniejsze, łatwiejsze do zarządzania podzbiory plików time-lapse. Generuj podzbiory według czasu (np. przeglądając pełny stos Z w pierwszym punkcie czasowym) lub według głębokości (np. przeglądając pierwsze 50 sekcji Z w każdym punkcie czasowym), klikając Image|Stacks|Tools|Make Substack.

7. Ilościowa analiza kolorystyczna klonów na obrazach Brainbow

  1. Zmierz średnie wartości intensywności kolorów czerwonego, zielonego i niebieskiego (RGB) dla wybranych komórek w programie Fiji.
    UWAGA:     Niniejsze instrukcje dotyczą analizy obrazów w programie Fiji. Badacze mogą jednak preferować uzyskiwanie średnich wartości intensywności RGB w innym programie komputerowym.
    1. Upewnij się, że plik jest prawidłowo przycięty, tak aby wokół krawędzi obrazu nie było czarnych obszarów. Czarne przestrzenie sztucznie obniżą pomiary minimalnej intensywności niezbędne do analizy. Jeśli plik wymaga przycięcia, wybierz Rectangle Selection Button (przycisk zaznaczania prostokątnego) i obrysuj obszar zainteresowania (ROI) wokół pola widzenia, wykluczając wszystkie czarne obszary. Kliknij Image|Crop.
    2. Skonfiguruj narzędzie pomiarowe tak, aby mierzyło średnią, minimalną i maksymalną wartość szarości. Kliknij Analyze|Set Measurements. Upewnij się, że zaznaczone są pola Min & Max Gray Value oraz Mean Gray Value.
    3. Przeglądając surowe pliki danych lub wyselekcjonowane stosy Z (Z-stacks) w programie Fiji, znajdź komórki do analizy koloru klonalnego. W rdzeniu przedłużonym domniemane klony można zidentyfikować wizualnie po wspólnym odcieniu oraz orientacji radialnej. Nie wybieraj komórek, które znajdują się w bliskim kontakcie z sąsiednimi komórkami innego koloru, przez co trudno je rozdzielić. Ilościowe określenie ich odcienia może być utrudnione.
    4. Znajdź środkową płaszczyznę Z wybranej komórki, używając paska przewijania Z-scrollbar. Kliknij prawym przyciskiem myszy Oval Selection Button i wybierz Elliptical Selection Button. Inne narzędzia zaznaczania będą odpowiednie dla różnych typów komórek. Obrysuj eliptyczny obszar ROI wokół centralnych ~2/3 ciała komórki.
    5. Używając paska przewijania C-scrollbar, wybierz kanał czerwony (dTomato). Zmierz średnią intensywność dla tego kanału, wybierając Analyze|Measure. Powtórz czynność dla tego samego ROI i płaszczyzny ogniskowej dla kanałów zielonego (YFP) i niebieskiego (CFP), a następnie zapisz wszystkie wartości średniej intensywności.
    6. Kliknij w dowolnym miejscu obrazu, aby usunąć eliptyczny ROI wybranej komórki.
    7. Aby zmierzyć poziom tła do normalizacji, użyj paska C-scrollbar i wybierz kanał czerwony (dTomato). Zmierz minimalną intensywność dla całego pola w tym kanale, wybierając Analyze|Measure. Powtórz czynność dla tej samej płaszczyzny ogniskowej dla kanałów zielonego (YFP) i niebieskiego (CFP) i zapisz wszystkie wartości minimalnej intensywności.
  2. Oblicz względne wagi kanałów RGB dla wybranych komórek.
    UWAGA:     Obliczanie względnych wag kanałów RGB z tych wartości intensywności można przeprowadzić w różnych programach, takich jak Microsoft Excel lub R43.
    1. Znormalizuj pomiar średniej intensywności ROI komórki dla każdego kanału, odejmując minimalną intensywność z całego pola w danym kanale i płaszczyźnie ogniskowej.
    2. Zsumuj znormalizowane średnie wartości intensywności RGB z każdego kanału, aby uzyskać całkowitą znormalizowaną intensywność RGB dla komórki.
    3. Oblicz względną wagę każdego kanału, dzieląc znormalizowaną średnią wartość intensywności dla tego kanału przez całkowitą znormalizowaną intensywność RGB.
  3. Przedstaw względne wagi kanałów RGB w formie wykresów trójkątnych (ternary plots), używając pakietu Ternary dla języka R43,44. Wykresy trójkątne są użyteczne do wizualizacji grupowania podobnych kolorów w trójwymiarowej przestrzeni RGB.
  4. Oblicz współczynnik rozpiętości kolorów, aby określić różnicę między kolorami komórek.
    1. Oblicz odległość euklidesową między dwoma kolorami w 3D RGB, korzystając z następującego równania:
      figure-protocol-1
      gdzie R, G i B to względne wagi kanałów RGB obliczone w punkcie 7.2.
    2. Dla ułatwienia interpretacji znormalizuj odległość kolorystyczną, dzieląc ją przez √2 (maksymalna możliwa odległość między kolorami), aby uzyskać współczynnik rozpiętości kolorów w zakresie od 0 do 1, gdzie 0 oznacza dokładnie ten sam kolor, a 1 wskazuje na kolory całkowicie różne (np. czysta czerwień i czysty niebieski).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tej sekcji przedstawiono przykłady wyników, jakie można uzyskać przy użyciu opisanego tutaj podejścia do wielokolorowego obrazowania time-lapse in vivo. Pokazujemy kolorowo zakodowane klony komórek Brainbow w proliferacyjnej strefie komorowej rozwijającego się rządu tylnego mózgu danio pręgowanego14 (Rysunek 1).

Zazwyczaj, gdy komórki oznakowane metodą Brainbow były rozmieszczone wzdłuż konkretnego włókna radialnego, posiadały one ten sam...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje metodę wizualizacji klonów komórek progenitorowych i neuronów w rozwijającym się tyłomózgowiu danio pręgowanego i śledzenia ich in vivo za pomocą Brainbow i poklatkowej mikroskopii konfokalnej11. Główną zaletą tego protokołu w porównaniu z badaniami in vitro lub ex vivo jest możliwość bezpośredniej obserwacji strefy proliferacyjnej mózgu kręgowców w jego naturalnym środowisku w czasie. Technika ta opiera się na wcześniejszych badaniach, w których znakowano pojedynczy klon za p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Y. A. Pan, J. Livet i Z. Tobias za wkład techniczny i intelektualny. Praca ta była wspierana przez National Science Foundation (Award 1553764) oraz M.J. Murdock Charitable Trust.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pipeta transferowa 1,5 ml (cienka końcówka)Globe Scientific, Inc.134020
1-fenylo-2-tiomocznik (PTU)Alfa AesarL06690Rozcieńczony do 0,2 mM w E3 w celu zapobiegania pigmentacji zarodków
50 ml stożkowe rurkiCorning352070Do szokujących termicznie zarodków
Nylonowa żyłka wędkarska 6 funtówSecureLineNMT250Do produkcji manipulatorów zarodków
7,5 ml pipeta transferowaGlobe Scientific, Inc.135010
CaCl2SigmaC3881Do
wacików bawełnianychPuritan867-WC BEZ KLEJUDo wytwarzania manipulatorów zarodków
Cre rekombinaza NewEngland BiolabsM0298M
Cyfrowa sucha kąpielGenemate490016-616Służy do przechowywania LMA w temperaturze 42 &; C
preparacji epifluorescencji
Szklane rurki kapilarneWorld Precision InstrumentsTW100F-4
InkubatorForma Scientific3158Aby utrzymać zarodki w temperaturze 28 & stopni; C
Formy do płytek wtryskowychAdaptacyjne narzędzia naukoweTU-1
Kąpiel wodna izotempowaFisher Scientific2320Do szokujących termicznie zarodków
KClAMRESCO0395Do E3 i do roztworu DNA do wstrzykiwań
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyZeissLSM710
LE agarozaGenemateE3120Tworzyć Płytki wtryskowe agarozy
Agaroza niskotopliwa (LMA)AMRESCOJ234
Zbiorniki łącząceAquaneering, Inc.
Błękit metylenowySigmaM9140Dla E3
MgSO4< / sub>Sigma9397Dla
E3 MicromanipulatorWorld Precision InstrumentsM3301
Ściągacz do mikropipetSutter Instrument Co.P-97
MS-222 Trikaina-SWestern Chemical, Inc.Wywar wykonany w dawce 4 mg/ml w wodzie z odwróconej osmozy (RO), a następnie dodany kroplami do E3 do końcowego stężenia 0,2 mM w celu znieczulenia zarodków
NaClJ.T. Baker4058-01Do
szalek Petriego E3 (90 mm, 60 mm)Genesee Scientific32-107GDo przechowywania zarodków i tworzenia komory obrazowania (60 mm)
Czerwień fenolowaSigmaP0290
Markery pierścieniowe z miękkim ściegiemKoniczyna Needlecraft, Inc.354Do tworzenia komory obrazowania z szalką Petriego
Super klej (Ultra gel control)Loctite1363589Do wykonywania manipulatorów zarodków
Igły strzykawkoweBeckton DickinsonBD329412Do dekorionacji zarodków
E3 Zakres ZHCT100

Bibliografia

  1. Lyons, D. A., Guy, A. T., Clarke, J. D. W. Monitoring neural progenitor fate through multiple rounds of division in an intact vertebrate brain. Development. 130, 3427-3436 (2003).
  2. Noctor, S. C., Flint, A. C., Weissman, T. A., Dammerman, R. S., Kriegstein, A. R. Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature. 409 (6821), 714-720 (2001).
  3. Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
  4. Florio, M., Huttner, W. B. Neural progenitors, neurogenesis and the evolution of the neocortex. Development. 141, 2182-2194 (2014).
  5. Mcconnell, S. K. Constructing the Cerebral Cortex: Neurogenesis and Fate Determination Review. Neuron. 15, 761-768 (1995).
  6. Schmidt, R., Strähle, U., Scholpp, S. Neurogenesis in zebrafish - from embryo to adult. Neural Development. 8, 3(2013).
  7. Chenn, A., Walsh, C. Regulation of Cerebral Cortical Size by Control of Cell Cycle Exit in Neural Precursors. Science. 297 (5580), 365-369 (2002).
  8. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and Evolution of the Human Neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  9. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32, 1817-1828 (2013).
  10. Homem, C. C. F., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nature Reviews Neuroscience. 16 (11), 647-659 (2015).
  11. Brockway, N. L., et al. Multicolor lineage tracing using in vivo time-lapse imaging reveals coordinated death of clonally related cells in the developing vertebrate brain. Developmental Biology. 453 (2), 130-140 (2019).
  12. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  13. Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: New resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199 (2), 293-306 (2015).
  14. Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
  15. Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
  16. Ko, S. K., Chen, X., Yoon, J., Shin, I. Zebrafish as a good vertebrate model for molecular imaging using fluorescent probes. Chemical Society Reviews. 40, 2120(2011).
  17. Kesavan, G., Hammer, J., Hans, S., Brand, M. Targeted knock-in of CreERT2 in zebrafish using CRISPR/Cas9. Cell and Tissue Research. 372, 41-50 (2018).
  18. Cook, Z. T., et al. Combining near-infrared fluorescence with Brainbow to visualize expression of specific genes within a multicolor context. Molecular Biology of the Cell. 30 (4), 491-505 (2019).
  19. Kuwata, M., Nikaido, M., Hatta, K. Local heat-shock mediated multi-color labeling visualizing behaviors of enteric neural crest cells associated with division and neurogenesis in zebrafish gut. Developmental Dynamics. 248, 437-448 (2019).
  20. Kinkhabwala, A., et al. A structural and functional ground plan for neurons in the hindbrain of zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (3), 1164-1169 (2011).
  21. Heap, L. A., Goh, C. C., Kassahn, K. S., Scott, E. K. Cerebellar Output in Zebrafish: An Analysis of Spatial Patterns and Topography in Eurydendroid Cell Projections. Frontiers in Neural Circuits. 7, 53(2013).
  22. Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise Lamination of Retinal Axons Generates Multiple Parallel Input Pathways in the Tectum. The Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
  23. Dirian, L., et al. Spatial Regionalization and Heterochrony in the Formation of Adult Pallial Neural Stem Cells. Developmental Cell. 30, 123-136 (2014).
  24. Chen, X. A., et al. Behavioral/Cognitive QRFP and Its Receptors Regulate Locomotor Activity and Sleep in Zebrafish. The Journal of Neuroscience. 36 (6), 1823-1840 (2016).
  25. Albadri, S., De Santis, F., Di Donato, V., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-Mediated Knockin and Knockout in Zebrafish. Genome Editing in Neurosciences. Jaenisch, R., Zhang, F., Gage, F. , Springer. Cham, Switzerland. 41-49 (2017).
  26. Furlan, G., et al. Life-Long Neurogenic Activity of Individual Neural Stem Cells and Continuous Growth Establish an Outside-In Architecture in the Teleost Pallium. Current Biology. 27, 3288-3301 (2017).
  27. Herget, U., Arturo Gutierrez-Triana, J., Salazar Thula, O., Knerr, B., Ryu, S. Single-cell reconstruction of oxytocinergic neurons reveals separate hypophysiotropic and encephalotropic subtypes in larval zebrafish Brainbow-guided morphology of oxytocinergic cells. eNeuro. 4 (1), (2017).
  28. Halloran, M. C., et al. Laser-targeted gene expression. Development. 127, 1953-1960 (2000).
  29. Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50, 401-406 (2008).
  30. Luskin, M. B., Pearlman, A. L., Sanes, J. R. Cell lineage in the cerebral cortex of the mouse studied in vivo and in vitro with a Recombinant Retrovirus. Neuron. 1 (8), 635-647 (1988).
  31. Price, J., Thurlow, L. Cell lineage in the rat cerebral cortex: a study using retroviral-mediated gene transfer. Development. 104, 473-482 (1988).
  32. Walsh, C., Cepko, C. L. Widespread dispersion of neuronal clones across functional regions of the cerebral cortex. Science. 255 (5043), 434-441 (1992).
  33. Walsh, C., Cepko, C. L. Clonal dispersion in proliferative layers of developing cerebral cortex. Nature. 362 (6421), 632-635 (1993).
  34. Cai, L., Hayes, N. L., Nowakowski, R. S. Synchrony of Clonal Cell Proliferation and Contiguity of Clonally Related Cells: Production of Mosaicism in the Ventricular Zone of Developing Mouse Neocortex. The Journal of Neuroscience. 17 (6), 2088-2100 (1997).
  35. Reznikov, K., Acklin, S. E., Van Der Kooy, D. Clonal Heterogeneity in the Early Embryonic Rodent Cortical Germinal Zone and the Separation of Subventricular From Ventricular Zone Lineages. Developmental Dynamics. 210, 328-343 (1997).
  36. Qian, X., Goderie, S., Shen, Q., Stern, J., Temple, S. Intrinsic programs of patterned cell lineages in isolated vertebrate CNS ventricular zone cells. Development. 125, 3143-3152 (1998).
  37. McCarthy, M., Turnbull, D. H., Walsh, C. A., Fishell, G. Telencephalic Neural Progenitors Appear to Be Restricted to Regional and Glial Fates before the Onset of Neurogenesis. The Journal of Neuroscience. 21 (17), 6772-6781 (2001).
  38. Yu, Y. C., Bultje, R. S., Wang, X., Shi, S. H. Specific synapses develop preferentially among sister excitatory neurons in the neocortex. Nature. 458 (7237), 501-504 (2009).
  39. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2002).
  40. Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish Breeding in the Laboratory Environment. ILAR Journal. 53 (2), 161-168 (2012).
  41. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. Journal of Visualized Experiments. 25, e1115(2009).
  42. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  43. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , (2017).
  44. Smith, M. R. Ternary: an R package to generate ternary plots. , (2017).
  45. Baye, L. M., Link, B. A. Development/Plasticity/Repair Interkinetic Nuclear Migration and the Selection of Neurogenic Cell Divisions during Vertebrate Retinogenesis. The Journal of Neuroscience. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  46. Leung, L., Klopper, A. V., Grill, S. W., Harris, W. A., Norden, C. Apical migration of nuclei during G2 is a prerequisite for all nuclear motion in zebrafish neuroepithelia. Development. 139, 2635(2012).
  47. Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H., Curriet, A. R. Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon with Wide-ranging Implications in Tissue Kinetics. British Journal of Cancer. 26, 239(1972).
  48. Cole, L. K., Ross, L. S. Apoptosis in the Developing Zebrafish Embryo. Developmental Biology. 240, 123-142 (2001).
  49. Liao, J., He, J., Yan, T., Korzh, V., Gong, Z. A Class of NeuroD-Related Basic Helix-Loop-Helix Transcription Factors Expressed in Developing Central Nervous System in Zebrafish. DNA and Cell Biology. 18 (4), 333-344 (1999).
  50. Trevarrow, B., Marks, D. L., Kimmel, C. B. Organization of hindbrain segments in the zebrafish embryo. Neuron. 4 (5), 669-679 (1990).
  51. Yabu, T., Todoriki, S., Yamashita, M. Stress-induced apoptosis by heat shock, UV and gamma-ray irradiation in zebrafish embryos detected by increased caspase activity and whole-mount TUNEL staining. Fisheries Science. 67, 333-340 (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie Brainbowukład nerwowy danio przebraniegokomórki progenitorowe neuronówanaliza linii klonalnychwielokolorowa fluorescencjaobrazowanie in vivośledzenie podziałów komórkowychdetekcja apoptozyinterkinetyczna migracja jąder
Wizualizacja rozwijającego się mózgu u żyjących danio pręgowanych za pomocą Brainbow i poklatkowego obrazowania konfokalnego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.