Monitorowanie przeciwciał blokujących PD-1 związanych z limfocytami T pochodzącymi z kropli krwi obwodowej

Podsumowanie

Opracowaliśmy prosty test cytometrii przepływowej do oceny wiązania przeciwciał blokujących PD-1 z limfocytami T, wymagający jedynie kropli krwi obwodowej od pacjentów z rakiem.

Streszczenie

Inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych, w tym przeciwciała blokujące PD-1, znacznie poprawiły wyniki leczenia różnych rodzajów raka. Skuteczność farmakologiczna tych immunoterapii jest długotrwała, wykraczająca nawet poza przerwanie ich wstrzykiwań, ze względu na utrzymujące się stężenia we krwi. W tym miejscu opracowaliśmy prosty test cytometrii przepływowej w celu oceny statusu wiązania limfocytów T przeciwciał blokujących PD-1 niwolumabu i pembrolizumabu. Podobnie jak test glukozy, test ten wymaga tylko jednej kropli krwi obwodowej. Wizualizacja wiązania przeciwciał na limfocytach T jest bardziej wiarygodna niż pomiar stężenia przeciwciał we krwi. Ponadto, jeśli to konieczne, możemy potencjalnie przeanalizować wiele charakterystycznych markerów związanych z odpornością na limfocytach T związanych z przeciwciałami blokującymi PD-1. Jest to zatem prosta i minimalnie inwazyjna strategia analizy farmakologicznego efektu przeciwciał blokujących PD-1 u pacjentów z rakiem.

Wprowadzenie

Przeciwciała blokujące PD-1 stały się standardowym wyborem w leczeniu różnych rodzajów raka, w tym niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC)^1,2,3,4. Wykazują one niezwykły efekt terapeutyczny w podgrupie pacjentów z rakiem, którzy nie zareagowali na konwencjonalne chemioterapii cytotoksyczne. Jednak inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych (ICI), które zawierają przeciwciała blokujące PD-1, mogą powodować unikalne i odrębne spektrum zdarzeń niepożądanych, określanych jako zdarzenia niepożądane związane z odpornością (irAEs)⁵. Chociaż irAE mogą wpływać na prawie wszystkie tkanki, najczęściej obserwuje się je w przewodzie pokarmowym, gruczołach dokrewnych, skórze i wątrobie, a także mogą powodować świąd, wysypkę, nudności, biegunkę i zaburzenia tarczycy^6,7. Ogólnie rzecz biorąc, większość irAE pojawia się w ciągu 1 do 2 miesięcy po rozpoczęciu ICI. Jednak w niektórych przypadkach mogą wystąpić później niż 1 rok po rozpoczęciu leczenia lub nawet po zaprzestaniu leczenia^6,7. Powodują również różne objawy, które mogą być trudne do odróżnienia od innych patologii. W związku z tym szybkie zdiagnozowanie irAE i odpowiednie ich leczenie może być trudne. irAE mogą wpływać na wszystkie tkanki, a na ich wystąpienie duży wpływ mają krążące komórki odpornościowe, zwłaszcza limfocyty T związane z przeciwciałami blokującymi PD-1. Dlatego prosta i minimalnie inwazyjna metoda monitorowania limfocytów T ukierunkowanych na przeciwciała jest ważna w warunkach klinicznych.

Tutaj opracowaliśmy prostą metodę oceny wiązania przeciwciał blokujących PD-1 z limfocytami T za pomocą kropli pełnej krwi obwodowej od pacjentów z rakiem, którzy otrzymywali niwolumab lub pembrolizumab. Stosując to podejście, byliśmy w stanie monitorować każde z poniższych: 1) czas wiązania przeciwciał z limfocytami T, 2) zajmowanie cząsteczek PD-1 limfocytów T przez przeciwciała terapeutyczne oraz 3) stan aktywacji i cechy immunologiczne limfocytów T. Ta metoda jest modyfikacją wcześniej zgłoszonej techniki⁸. Wymagana ilość krwi jest prawie taka sama, jak ta potrzebna do badania glukozy, a podejście to nie wymaga wzbogacania komórek jednojądrzastych ani kohodowli przeciwciałami blokującymi PD-1. Potwierdziliśmy, że metodę tę można również przeprowadzić przy użyciu zamrożonych próbek, w tym komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) oraz komórek z wysięku opłucnowego, wysięku osierdziowego, płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i płynu mózgowo-rdzeniowego, co sugeruje, że strategia ta może być przydatna w kontekście badania wieloośrodkowego. Metoda ta może ułatwić wczesną diagnostykę irAEs, a także pomóc w ustaleniu odpowiednich terapii immunosupresyjnych w celu opanowania ich objawów oraz określenia optymalnego czasu na rozpoczęcie kolejnych terapii po inhibitorach PD-1.

Protokół

Pobieranie próbek zostało przeprowadzone podczas rutynowych procedur klinicznych. Wszystkie próbki ludzkie zostały pobrane po uzyskaniu świadomej zgody uczestników, zgodnie z Deklaracją Helsińską i za zgodą komisji etycznej Graduate School of Medicine, Osaka University, Japonia (15383 i 752).

1. Przygotowanie i barwienie próbki krwi pełnej

1. Pobrać próbki krwi pełnej do probówek do pobierania krwi zawierających kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA).
   UWAGA: Pobieranie krwi można wykonać za pomocą zwykłej igły lub lancetu do krwi.
2. Przenieść 20 μl próbek krwi pełnej do 5 ml okrągłodennych probówek do cytometrii przepływowej z polistyrenu.
   UWAGA: Aby zmniejszyć niespecyficzne wiązanie komórek z probówkami, 1 ml 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) dodaje się do probówek i wiruje przez 10 s przed nałożeniem na próbki.
3. Dodaj 20 μl 2% FBS do PBS.
4. Dodać 10 μl specyficznego dla człowieka odczynnika blokującego FcR. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
5. Dodać 500 μl buforu do lizy czerwonych krwinek. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
6. Dodać 4 ml 2% FBS do PBS i odwirowywać komórki przy 400 x g (1 500 obr./min) przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant przez aspirację.
7. Powtórz proces mycia i aspiracji opisany w kroku 1.6.
8. Ponownie zawieś komórki w 100 μl 2% FBS w PBS i podziel na dwie probówki po 50 μl każda.
9. Dodać przeciwciała markerowe powierzchniowe (Tabela 1). Dobrze wymieszać i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
   UWAGA: Podczas profilowania statusu immunologicznego limfocytów T liczbę markerów można zwiększyć w oparciu o jakość cytometrii przepływowej.
10. Umyj próbki 2 razy, jak opisano w kroku 1.6.
11. Zawieś komórki w 200 μl 2% FBS w PBS.

2. Analiza cytometryczna przepływowa

1. Włóż probówki do cytometru przepływowego i pobierz komórki, zasadniczo postępując zgodnie z zalecanym protokołem⁹.
2. Zarejestruj 10 000 zdarzeń jako bramkę limfocytów (Rysunek 1A) i wyeksportuj dane przepływu jako pliki .fcs do analizy.
3. Otwórz pliki w oprogramowaniu analitycznym. Wizualizuj komórki na wykresie limfocytów z rozproszeniem do przodu (FSC) (A) i rozrzuceniu bocznym (SSC) (A) oraz na wykresie bramki (Rysunek 1A).
4. Po wybraniu pojedynczych komórek za pomocą FSC (H) vs. FSC (W) i SSC (H) vs. SSC (W) (Rysunek 1B) i wyświetleniu ich na wykresie CD3 vs. CD8 lub CD3 vs. CD4, bramka odpowiednio komórek T CD8 i limfocytów T CD4 (Rysunek 1C).
5. Po wybraniu bramkowanych komórek i wyświetleniu ich na wykresie PD-1 w porównaniu z ludzką IgG4, zidentyfikuj komórki T CD8 i CD4 związane z przeciwciałem blokującym PD-1 na podstawie kontroli izotypu (Figura 1D).

Wyniki

Strategia bramkowania i analiza cytometryczna (Rysunek 1) pozwalają na wykrycie wiązania przeciwciała blokującego PD-1 z limfocytami T uzyskanymi z jednej kropli krwi obwodowej pacjenta z NSCLC. Przed podaniem przeciwciała blokującego PD-1 nie stwierdza się obecności ludzkich limfocytów T CD8 lub CD4 wykazujących dodatni wynik dla IgG4, a ekspresję PD-1 można potwierdzić za pomocą przeciwciała wykrywającego PD-1 (EH12.1) (Rysunek 2A). Po podaniu...

Dyskusja

W tym artykule przedstawiamy metodę wykorzystującą cytometr przepływowy do wykrywania przeciwciał blokujących PD-1 związanych z limfocytami T pochodzącymi z kropli krwi obwodowej, którą pierwotnie opracowaliśmy do wykrywania niwolumabu¹⁰. Chociaż ta technika jest bardzo prosta i łatwa do wykonania, należy zwrócić uwagę na dwa ważne punkty, aby uzyskać dokładne wyniki. Jednym z nich jest to, że do wykrywania cząsteczek PD-1 należy zastosować odpowiednie przeciwciało, które konkuruje z niwolumabem i...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10X bufor do lizy RBC (wielogatunkowy)	Thermo Fisher Scientific	00-4300-54	50 ml
przeciwciało anty-ludzkie CD4 APC/Cyjaniny7	Klon BioLegend	300518	RPA-T4
BD FACS Canto II Cytometr
Brilliant Violet 510 anty-ludzkie przeciwciało CD8a	BioLegend	301048	Klon RPA-T8
Fosforan Dulbecco Buforowana sól fizjologiczna	nacalai tesque	14249-95	500 ml
Falcon Probówki z polistyrenu okrągłodennego	STEMCELL Technologies	352058	5 ml
Odczynnik blokujący FcR, ludzki	Miltenyi Biotec	130-059-901	2 mL
FLOWJO	BD
Gibco Płodowa surowica bydlęca	Thermo Fisher Scientific	12676029	500 ml
Mysz monoklonalna IgG1 - kontrola izotypu	abcam	ab81200
Mysz monoklonalna anty-ludzka IgG4 Fc	abcam	ab99825	Klon HP6025
Pacific Blue Mysz anty-ludzka CD3	BD 558117		Klon UCHT1
PE-Cy7 Mysz anty-ludzka CD279 (PD-1)	BD	561272	Klon EH12.1
PE-Cy7 Mysz IgG1 κ Isotype Control	BD	557646

przepływowy BD