Method Article

Badanie hemokompatybilności implantów mających kontakt z krwią w modelu pętli przepływu naśladującym przepływ krwi u ludzi

DOI:

10.3791/60610

⸱

March 5th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Thoracic, Cardiac and Vascular Surgery, University Hospital Tuebingen, 2Acandis GmbH, 3Institute of Biomedical Engineering, University of Stuttgart, 4Institute of Macromolecular Chemistry, Academy of Sciences of the Czech Republic

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje kompleksową ocenę hemokompatybilności urządzeń mających kontakt z krwią za pomocą laserowo wycinanych implantów nerwowo-naczyniowych. Model pętli przepływu ze świeżą, heparynizowaną krwią ludzką jest stosowany w celu naśladowania przepływu krwi. Po perfuzji różne markery hematologiczne są analizowane i porównywane z wartościami uzyskanymi bezpośrednio po pobraniu krwi w celu oceny hemokompatybilności badanych urządzeń.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rosnące wykorzystanie urządzeń medycznych (np. przeszczepów naczyniowych, stentów i cewników sercowych) do tymczasowych lub stałych celów, które pozostają w układzie krążenia organizmu, wymaga niezawodnego i wieloparametrycznego podejścia, które ocenia możliwe komplikacje hematologiczne spowodowane przez te urządzenia (np. aktywacja i niszczenie składników krwi). Kompleksowe badania kompatybilności hemokompatybilności in vitro implantów mających kontakt z krwią są pierwszym krokiem w kierunku udanego wdrożenia in vivo. Dlatego przed zastosowaniem klinicznym obowiązkowa jest obowiązkowa obowiązkowa analiza zgodnie z Międzynarodową Organizacją Normalizacyjną 10993-4 (ISO 10993-4). Prezentowana pętla przepływu opisuje czuły model do analizy wydajności hemostatycznej stentów (w tym przypadku nerwowo-naczyniowych) i ujawniania działań niepożądanych. Stosowanie świeżej ludzkiej krwi pełnej i delikatne pobieranie próbek krwi jest niezbędne, aby uniknąć wstępnej aktywacji krwi. Krew jest perfundowana przez heparynizowaną rurkę zawierającą badaną próbkę za pomocą pompy perystaltycznej z szybkością 150 ml/min w temperaturze 37 °C przez 60 minut. Przed i po perfuzji analizowane są markery hematologiczne (tj. morfologia krwi, hemoglobina, hematokryt i markery plazmatyczne) wskazujące na aktywację leukocytów (elastazy wielojądrzastej [PMN]), płytek krwi (β-tromboglobulina [β-TG]), układu krzepnięcia (tombina-antytrombina III [TAT]) oraz kaskady dopełniacza (SC5b-9). Podsumowując, przedstawiamy niezbędny i niezawodny model do szeroko zakrojonych testów hemokompatybilności stentów i innych urządzeń mających kontakt z krwią przed zastosowaniem klinicznym.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowanie in vivo implantów i biomateriałów, które wchodzą w interakcję z ludzką krwią, wymaga intensywnych badań przedklinicznych skupiających się na badaniu różnych markerów układu hemostatycznego. Międzynarodowa Organizacja Normalizacyjna 10993-4 (ISO 10993-4) określa główne zasady oceny wyrobów mających kontakt z krwią (tj. stentów i przeszczepów naczyniowych) oraz uwzględnia konstrukcję urządzenia, użyteczność kliniczną i potrzebne materiały1.

Ludzka krew to płyn, który zawiera różne białka i komórki osocza, w tym leukocyty (białe krwinki [WBC]), erytrocyty (czerwone krwinki [RBC]) i płytki krwi, które pełnią....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedura pobierania próbek krwi została zatwierdzona przez Komisję Etyki wydziału medycznego Uniwersytetu w Tybindze (kod identyfikacyjny projektu: 270/2010BO1). Wszyscy uczestnicy wyrazili pisemną, świadomą zgodę na włączenie przed uczestnictwem.

1. Przygotowanie monovette z heparyną

  1. Zmieszać nierozcieńczoną heparynę (5 000 j.m./ml) z roztworem chlorku sodu (NaCl, 0,9%) i przygotować roztwór o stężeniu 15 j.m./ml heparyny.
  2. Dodać 900 μl rozcieńczonego roztworu heparyny do każdej obojętnej monowety (9 ml), aby uzyskać końcowe stężenie heparyny 1,5 j.m./ml po pobraniu próbki krwi. Przygotować trzy monowety na dawcę plus....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krótko podsumowując, ludzka pełna krew została pobrana w monowetach naładowanych heparyną, a następnie połączona i użyta do oceny wyjściowych poziomów liczby komórek, jak również markerów hemokompatybilności plazmatycznej.

Następnie rurka zawierająca próbki implantu nerwowo-naczyniowego została napełniona, a krew była perfundowana przez 60 minut przy 150 mL/min i 37 °C za pomocą pompy perystaltycznej. Ponownie przeanalizowano liczbę komórek we wszystkich grupach, a próbki osocza przygotowano d.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany protokół opisuje kompleksową i wiarygodną metodę badania hemokompatybilności implantów mających kontakt z krwią zgodnie z normą ISO 10993-4 w modelu przepływu ścinającego imitującym przepływ krwi ludzkiej. Badanie to opiera się na testach wycinanych laserowo implantów nerwowo-naczyniowych, ale można je przeprowadzić z różnymi próbkami. Wyniki pokazują, że metoda ta umożliwia szeroką analizę różnych parametrów, takich jak liczba krwinek, występowanie kilku markerów hemokompatybilności oraz mikroskopowa wizual.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Za wykonanie skaningowej mikroskopii elektronowej dziękujemy Ernstowi Schweizerowi z sekcji Nauki i Technologii Materiałów Medycznych Szpitala Uniwersyteckiego w Tybindze. Badania były wspierane przez Ministerstwo Edukacji, Młodzieży i Sportu Republiki Czeskiej w ramach Narodowego Programu Zrównoważonego Rozwoju II (Projekt BIOCEV-FAR LQ1604) oraz przez projekt Czeskiej Fundacji Naukowej nr 18-01163S.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
aqua ad iniectabiliaFresenius-Kabi, Bad-Homburg, Niemcy1088813
beta-TG ELISADiagnostica Stago, Düsseldorf, Niemcy00950
Wirówka Rotana 460 RAndreas Hettich, Tuttlingen,Niemcy-Cytraty
monovette (1,4 ml)Sarstedt, Nü mbrecht, Niemcy6,16,68,001
monovette CTAD (2,7 ml)BD Biosciences, Heidelberg, Niemcy367562
monovette EDTA (1,2 mL)Sarstedt, Nü mbrecht, Niemcy6,16,62,001
Etanol rocznie (1000 mL)AppliChem, Darmstadt, Niemcy1,31,08,61,611
Aldehyd glutarowy (25 % w wodzie)SERVA Electroforees, Heidelberg, Niemcy23114.01
Powłoka heparynowa do rurEnsion, Pittsburgh, USA-Heparyna-Natrium
(25.000 IE/ 5 mL)LEO Pharma, Neu-Isenburg, NiemcyPZN 15261203
Czytnik wielopłytkowy Mithras LB 940Berthold, Bad Wildbad,Niemcy-NaCl
0,9%Fresenius-Kabi, Bad-Homburg, Niemcy1312813
Neutralne monovette (9 mL)Sarstedt, Nü mbrecht, Niemcy2,10,63,001
Bufor PBS (bez Ca2+/Mg2+)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Niemcy70011044
Pompa perystaltyczna ISM444BCole Parmer, Wertheim, Niemcy3475
Pipeta (100 &mikro; L)Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Niemcy3124000075
Pipeta (1000 &mikro; L)Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Niemcy3123000063
Pojemnik plastikowy (100 mL)Sarstedt, Nü mbrecht, Niemcy7,55,62,300
PMN-elastaza ELISADemeditec Diagnostics, Kilonia NiemcyDEH3311
Rurka z polichlorku winyluSaint-Gobain Performance Plastics Inc., CourbevoieFrancja-Probówki
reakcyjne (1,5 ml)Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Niemcy30123328
laserowe implanty nerwowo-naczynioweAcandis GmbH, Pforzheim01-0011x
SC5b-9 ELISATECOmedical, Buende, NiemcyA029
Skaningowy mikroskopelektronowy Cambridge Instruments, Cambridge, Wielka Brytania-Taśma
uszczelniająca (płytka 96-dołkowa)Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Niemcy15036
Strzykawka 10/12 mL Norm-JectHenke-Sass-Wolf, Tuttlingen, Niemcy10080010
Zestaw TAT microSiemens Healthcare, Marburg, NiemcyOWMG15
Kąpiel wodna Typ 1083Gesellschaft fü r Labortechnik, Burgwedel, Niemcy-

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. ISO. Biological evaluation of medical devices. , ISO 10993-4 (2002).
  2. Weber, M., et al. Blood-Contacting Biomaterials: In Vitro Evaluation of the Hemocompatibility. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 99(2018).
  3. Li, Y., Boraschi, D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hemocompatibility TestingBlood Contacting ImplantsFlow Loop ModelISO 10993 4Stent EvaluationWhole Blood PerfusionPlatelet ActivationCoagulation AnalysisComplement ActivationScanning Electron Microscopy

Related Articles