Artykuł metodologiczny

Elektrochemioterapia w sferoidach czerniaka oka 3D przy użyciu niestandardowej elektrody

DOI:

10.3791/60611

⸱

21 kwietnia 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University Hospital Halle (Saale), Martin-Luther University Halle-Wittenberg, 2Department of Ophthalmology, University Hospital Essen, Duisburg Essen University, 3Department of Ophthalmology, Saarland University Medical Center, 4Liverpool Ocular Oncology Research Group, Department of Molecular and Clinical Cancer Medicine, Institute of Translational Medicine, University of Liverpool

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju sferoidów czerniaka spojówek i błony naczyniowej oka w 3D oraz użycia ręcznych elektrod dostosowanych do potrzeb pacjenta do elektrochemioterapii in vitro sferoidów 3D w studni hodowlanej. Otwiera to nowe perspektywy w zastosowaniu elektrochemioterapii w leczeniu czerniaka gałki ocznej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektrochemioterapia (ECT) to połączenie przejściowego tworzenia się porów po zastosowaniu impulsu elektrycznego z podawaniem leków cytotoksycznych, co wzmacnia cytotoksyczne działanie zastosowanego środka z powodu zmian w błonie. Systemy hodowli 3D in vitro symulują wzrost guza in vivo i zachowują biologiczne cechy guzów dokładniej niż konwencjonalne jednowarstwowe hodowle komórkowe. Opisujemy protokół rozwoju organoidów nowotworowych 3D przy użyciu linii komórkowych czerniaka spojówki (CM) i czerniaka błony naczyniowej gałki ocznej (UM), a także przy użyciu ręcznych elektrod dostosowanych do potrzeb klienta, odpowiednich do elektrowstrząsów in vitro w hodowli bez niszczenia środowiska guza. Protokół ten analizuje hodowlę i wzrost sferoid 3D CM i UM oraz ich reakcję na samą bleomycynę (2,5 μg / ml), elektroporację (EP) (750 woltów / cm, 8 impulsów, 100 μs, 5 Hz) samodzielnie i ECT jako połączenie EP i bleomycyny. Stężenie leku i ustawienia EP użyte w tym protokole zostały ustalone jako preferowane warunki ECT zgodnie z wcześniejszymi eksperymentami. Test stosowany do określenia żywotności sferoidów przeprowadzono 3-7 dni po leczeniu. Wpływ na żywotność i wzrost sferoid guza 3D był istotny dopiero po EW. Dostosowane elektrody są szczegółowo opisane, aby ułatwić stosowanie impulsów w hodowli. To nowatorskie leczenie sferoid 3D UM i CM stanowi kamień milowy dla przyszłych zastosowań klinicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czerniak błony naczyniowej gałki ocznej (UM) jest najczęstszym pierwotnym nowotworem wewnątrzgałkowym u dorosłych, podczas gdy czerniak spojówki (CM) stanowi 2% wszystkich czerniaków gałki ocznej1,2,3,4,5,6. Brachyterapia, radioterapia wiązką protonów i fototerapia są zabiegami pierwszego rzutu w UM, podczas gdy enukleacja kuli ziemskiej może być konieczna1,2,3. Leczenie CM różni się w zależności od ośrodka onkologii okulistycznej; Biopsja wycinająca, po której następuje miejscowa chemioterapia i/lub radioterapia, jest najczęstszym podejściem do leczenia4. Pomimo leczenia, CM wiąże się ze śmiertelnością na poziomie 25%–30%5.

Istnieje niedostatek literatury na temat powstawania sferoid CM i UM oraz zastosowania ECT w czerniaku gałki ocznej6,7,8. Sferoidy nowotworowe mają lepsze cechy biologiczne niż konwencjonalne hodowle komórek 2D i zostały zaproponowane jako użyteczne narzędzie do naśladowania środowiska guza in vivo9. Elektrochemioterapia (ECT) łączy stosowanie nieprzepuszczalnych leków cytotoksycznych z elektroporacją (EP)10. EP to lokalne zastosowanie krótkich i intensywnych impulsów elektrycznych, które przejściowo przenikają do komórek w celu miejscowego zwiększenia wychwytu leków przeciwnowotworowych w komórkach nowotworowych i powodują zwiększoną śmierć komórki11. W niniejszym badaniu ustanowiono protokół opisujący rozwój sferoid CM i UM oraz zbadano wyniki po ECT z bleomycyną. Protokół ten może pomóc badaczom w dziedzinie onkologii okulistycznej przy użyciu innych metod terapeutycznych na sferoidach lub w badaniu dalszych skutków EW. Ze względu na ograniczone zastosowanie elektrowstrząsów w okulistyce wiedza na temat efektu i procesu tej modalności jest niewielka; W związku z tym eksperyment ten może poszerzyć spektrum opcji leczenia w przyszłości. Proponujemy nowatorskie, dostosowane do potrzeb klienta ręczne ustawienie elektrody płytkowej, które umożliwia ECT sferoidy w studzienkach hodowlanych bez niszczenia środowiska guza.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Formacja sferoidów

  1. Użyj przylegająco rosnących linii komórek rakowych do tworzenia sferoidów.
  2. Zapewnić wszystkie etapy związane z hodowlą komórkową w sterylnych warunkach laboratoryjnych.
  3. Przygotować wzorcową, kompletną pożywkę hodowlaną zgodnie z zaleceniami dla interesujących linii komórkowych i ogrzać do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
    UWAGA: W tym przypadku zastosowano ludzkie linie komórkowe spojówek CM2005.1, CRMM1, CRMM2, a także linie komórkowe czerniaka błony naczyniowej gałki ocznej 92.1, OMM1 i OMM2 i hodowano je w pożywce Ham F-12 zawierającej odpowiednio 10% płodowej surowicy bydlęcej i RPMI zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej.
  4. Odłącz interesujące komórki przy użyciu standardowych metod trawienia enzymatycznego (np. roztworu trypsyny-EDTA).
  5. Aby określić liczbę ważnych komórek, należy ponownie zawiesić 10 μl zawiesiny komórek w 10 μl roztworu błękitu trypanowego (1:1) i policzyć komórki za pomocą komory (hemocytometru lub automatycznego licznika komórek) w ciągu 5 minut. Komórki powinny być w <90% zbieżności i w dobrym stanie.
  6. Aby utworzyć sferoidy, wysiewa się 5 x 103 komórek na studzienkę o łącznej objętości 200 μl kompletnej pożywki hodowlanej na 96-dołkowych płytkach o bardzo niskim mocowaniu. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2,
    UWAGA: Aby skutecznie zahamować przyczepianie się komórek, użyj ultra niskich płytek przyłączeniowych z kowalencyjnie związanym hydrofilowym, niejonowym, neutralnie naładowanym hydrożelem na powierzchni. Ten hydrożel hamuje unieśmiertelnianie komórek i zmusza je do stanu zawieszenia w celu budowy sferoid 3D.
  7. Sprawdź formację sferoidy za pomocą mikroskopu.
    UWAGA: Niektóre linie komórkowe nie tworzą okrągłych sferoid guza 3D w pierwszym pasażu. Przejdź przez kulturę sfery nowotworowej, zanim zaczną rozwijać ciemne centrum. Dysocjuj masy guza w zależności od linii komórkowej po 4-10 dniach przez trypsynizację. Następnie zasiej pojedyncze komórki w świeżej płytce 96 o bardzo niskim mocowaniu. Powtarzając tę procedurę dla kilku pasaży, komórki dostosują się do hodowli 3D.

2. Elektrochemioterapia sferoid guza

  1. Jako test kontrolny należy użyć sferoid niepoddanych działaniu substancji i sferoidów traktowanych wyłącznie EP lub samą bleomycyną.
  2. Dostosuj ustawienia elektroporatora (liczba impulsów, częstotliwość impulsów, czas trwania i napięcie; patrz Tabela materiałów). W przypadku komórek czerniaka użyj 8 impulsów elektrycznych o napięciu prostokątnym o natężeniu 750 woltów/cm, czasie trwania impulsu 100 μs, częstotliwości powtarzania 5 Hz.
  3. W 3 dniu hodowli sferoidalnej przygotować świeży roztwór siarczanu bleomycyny w sterylnym PBS o stężeniu 5 μg/ml w probówce o pojemności 15 ml.
  4. Wymienić pożywkę do hodowli komórkowych sferoid, usuwając 200 μl pożywki hodowlanej i ponownie napełniając 100 μl świeżej, kompletnej pożywki hodowlanej dla każdej studzienki.
  5. Do każdego dołka dodać 100 μl roztworu siarczanu bleomycyny (końcowe stężenie 2,5 μg/ml). Dodać 100 μl świeżej pożywki do nietraktowanych kontroli i sferoid traktowanych tylko EP zamiast roztworu siarczanu bleomycyny.
  6. Wykonaj elektroporację.
    UWAGA: Elektrody pokazane w Rysunek 1 zostały wyprodukowane w warsztacie badawczym Uniwersytetu w Halle-Wittenberdze. Wykonane są ze stali nierdzewnej i pasują do uchwytu elektroporatora. Elektrody zostały zaprojektowane do stosowania w 96-dołkowych płytkach mocujących o bardzo niskim poziomie. Podobne elektrody ze stali nierdzewnej można łatwo wyprodukować również do alternatywnych zastosowań.
    1. Wysterylizuj elektrody 70% etanolem i pozostaw elektrody do wyschnięcia. Średnica elektrod wynosi 1 mm, odstęp między dwiema elektrodami wynosi 4 mm, a długość każdej elektrody wynosi 8 mm (Rysunek 1a).
    2. Umieść elektrody na dnie studzienki, tak aby sferoidy znajdowały się między elektrodami. Pozwala to na idealne ustawienie sferoidy między dwiema elektrodami (Rysunek 1b).
    3. Potrząśnij płytką, aby sferoidy mogły przesunąć się od dna studzienki i umieścić je między elektrodami. Sferoida będzie znajdować się między elektrodami tylko przez kilka sekund.
    4. Rozpocznij elektroporację z preferowanymi ustawieniami.
    5. Zastąp roztwór siarczanu bleomycyny w studzience, wymieniając 150 μl pożywki na 150 μl świeżej pożywki.
    6. Inkubować komórki przez okres do 10 dni w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO2 . Jeśli nieleczone sferoidy zaczną rozwijać ciemny środek, zakończ eksperyment. Wymieniaj 150 μl pożywki do hodowli komórkowych co 2-3 dni. W ten sposób należy uniknąć rozerwania sferoidy, umieszczając końcówkę pipety w obszarze krawędzi studzienki, przechylając płytkę i powoli pipetując.

3. Określenie wielkości sferoidy

  1. Zmierz rozmiar sferoidy w dniu leczenia (punkt początkowy) i 3-7 dni po leczeniu za pomocą mikroskopii jasnego pola, obliczając pole przekroju poprzecznego sferoid za pomocą ImageJ Fiji11.
  2. Zrób zdjęcie pojedynczych sferoid za pomocą paska skali. Użyj powiększenia, dzięki któremu widoczna jest cała sferoida. Na przykład w przypadku CM2005.1 zastosowano 5-krotne powiększenie. Zapisz obraz w formacie JPEG.
  3. Przeanalizuj rozmiar sferoidy, obliczając pole przekroju poprzecznego za pomocą ImageJ/Fiji.
    1. Zainstaluj oprogramowanie (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
    2. Uruchom program ImageJ/Fiji. Zaimportuj obraz sferoidy: Plik > Otwórz.
    3. Aby ustawić skalę, wybierz przycisk linii na pasku narzędzi i zaznacz linię paska skali na obrazie za pomocą kliknięcia myszą: Analizuj > ustaw skalę. Używając znanej odległości, wypełnij odległość podziałki liniowej. Zmień jednostkę długości na μm. Kliknij pole globalne, aby przypisać ustawienia dla wszystkich obrazów o tym samym współczynniku powiększenia.
    4. Konwertuj obraz na 8-bitowy: Typ > obrazu > 8-bitowy.
    5. Wybierz opcję Obraz > Dostosuj > Automatyczny próg (wybierz opcję > Nie resetuj zakresu). Sferoida jest oznaczona kolorem czerwonym lub czarnym w zależności od wybranego znacznika progu. Dostosuj suwaki tak, aby piksele sferoidalne zmieniły kolor na czerwony, ale piksele niesferoidalne nie zmieniały koloru. Zamknij okno dialogowe Próg, nie klikając żadnego z przycisków.
    6. Aby obliczyć pole przekroju poprzecznego sferoidy, wybierz opcję Analizuj > Ustaw pomiary, a następnie kliknij opcję Obszar, Ogranicz do wartości progowej i Etykieta wyświetlania. Zamknij okno dialogowe Ustawianie miar, klikając przycisk OK.
    7. Aby wyświetlić wyniki, wybierz Analizuj > Analizuj cząstki i zmień rozmiar (μm2) = 10000-nieskończoność, aby usunąć szum. Kliknij przycisk Wyświetl wyniki i zamknij okno, klikając OK. W polu Wyniki wyświetlane są sferoidy z etykietą i obszarem. Powtarzając analizy kilku sferoid, wyniki są wyświetlane w oknie Wyniki.
    8. Aby określić względną odpowiedź na leczenie sferoid poddanych ECT w porównaniu z kontrolami nieleczonymi i leczonymi pojedynczo, należy obliczyć procentowe zmiany pola przekroju poprzecznego.

4. Określenie żywotności sferoidy

  1. Zmierzyć żywotność sferoidów 3-7 dni po poddaniu działaniu substancji, stosując test żywotności komórek odpowiedni dla kultur komórkowych 3D zgodnie z instrukcjami producenta. Test musi penetrować i lizować duże sferoidy, aby umożliwić wykrycie żywotności poprzez ilościowe określenie ATP, które sygnalizuje obecność komórek aktywnych metabolicznie.
    UWAGA: W tym eksperymencie zastosowano test oparty na luminescencji jako metodę odczytu. Żywotność sferoid poddanych zabiegom ECT porównano z grupą kontrolną siedem dni po leczeniu.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty zostały przeprowadzone za pomocą niestandardowych elektrod ręcznych, które są wykonane z wysokiej jakości stali nierdzewnej. Grubość elektrod wynosi 1 mm, szerokość 4 mm, odstęp między dwiema elektrodami wynosi 4 mm, a długość każdej elektrody wynosi 8 mm (Rysunek 1). Same EP i bleomycyna nie mają znaczącego wpływu na żywotność i wzrost sferoid guza zarówno UM, jak i CM. Elektrowstrząsy wykazują znaczne zmniejszenie żywotności guza i wielkości sferoidy. Po zastosowaniu bleomycyny zaobserwowano utratę architektury sferoidalnej ze zdekonstruowanymi fragmentami komórek wokół sferoid oraz nekrozę w obszarze centralnym i obwodowym wszystkich badanych sferoidów. Rysunek 2 pokazuje wyniki linii komórkowych CM2005.1. Przerzutowe linie komórkowe UM wykazały wyższą odpowiedź w porównaniu z pierwszorzędowymi liniami komórkowymi po ECT8.

figure-results-1
Rysunek 1: Dostosowane elektrody ręczne. Elektrody wykonane są z wysokiej jakości stali nierdzewnej. Uchwyt elektrod jest wyposażony w elektroporator. Grubość elektrod wynosi 1 mm, szerokość 4 mm, odstęp między dwiema elektrodami wynosi 4 mm, a długość każdej elektrody 8 mm (a); Elektroporacja sferoid w formacie 96-dołkowym (B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Cytotoksyczny wpływ elektrochemioterapii na sferoidy guza linii komórkowej czerniaka spojówki CM2005.1. Elektrochemioterapia (ECT, 750 V/cm po zastosowaniu 2,5 μg/ml bleomycyny) powodowała silniejsze działanie cytotoksyczne w sferoidach w porównaniu z samą elektroporacją (EP) lub chemioterapią z użyciem samej bleomycyny (2,5 g/ml). Efekt cytotoksyczny mierzono, obliczając zarówno pole przekroju poprzecznego, jak i test żywotności jako procent nieleczonej grupy kontrolnej siedem dni po leczeniu. Wykresy pudełkowe pokazują średnią powierzchnię przekroju poprzecznego sferoid (a); średnia żywotność sferoid (b); Reprezentatywne obrazy sferoid, podziałka = 200 μm (C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EP jest stosowany w różnych zastosowaniach biotechnologicznych i klinicznych12. Nowe osiągnięcia technologiczne, takie jak specjalnie zaprojektowane elektrody o wysokiej swoistości dla każdej komórki docelowej i miejsca, mogą pomóc ECT w docelowym tkance w dowolnym miejscu ciała12. Konstrukcja i umiejscowienie elektrod muszą umożliwiać pełną dostępność guza i zapewniać, że zdrowa tkanka jest tylko minimalnie dotknięta lub nie jest uszkodzona w wyniku leczenia13.

Wcześniejsze publikacje wykazały wpływ elektrowstrząsów w zawiesinach ludzkich komórek czerniaka in vitro 7,8. Literatura odnosząca się do zastosowania elektrowstrząsów w modelach komórek gałki ocznej 3D lub innych podobnych środowiskach in vivo, umożliwiających bezpieczniejsze wykorzystanie terapeutyczne, jest ograniczona. Brun i wsp. postulują, że komórki 3D w rusztowaniu podczas analizy morfologicznej mają okrągły kształt różniący się od wydłużonego kształtu pokazanego w hodowlach 2D, ale niezwykle podobny do komórek z biopsji pacjentów9. Udoskonalenie ustawień terapeutycznych i narzędzi stosowanych w hodowlach 3D może prowadzić do optymalizacji parametrów ECT, umożliwiając dokładniejsze podejście kliniczne9.

Opisujemy rozwój technologiczny dotyczący nowych elektrod do zastosowania ECT w hodowlach komórkowych 3D. Bleomycyna jest najczęściej podawanym lekiem cytotoksycznym w skojarzeniu z ECT11. Wcześniejsze badania naszej grupy wykazały, że zastosowane ustawienia EP (750 woltów/cm, 8 impulsów, 100 ms, 5 Hz) były odpowiednie do leczenia nowotworów oka in vitro. Kluczowe etapy tej techniki obejmują krótki czas potrzebny do wykonania ECT, gdy sferoida opada po mobilizacji, a także dokładny wymiar elektrod. Konieczność zastosowania elektrod na zamówienie wynikała z trudności w wykonaniu elektrowstrząsów w studniach za pomocą dostępnych instrumentów. Niepublikowane dane z naszej grupy wykazały zwiększone uszkodzenia sferoidów podczas przenoszenia sferoid do większej studzienki lub do kuwety w celu przygotowania ich do leczenia, a następnie z powrotem do dołka hodowlanego. Zaletą opisywanej techniki jest brak manipulacji sferoidami w celu wykonania zabiegu, ponieważ organoidy nie są przenoszone do większych płytek lub studzienek. Dlatego wszystkie sferoidy zachowują swoją formę. Kolejną zaletą jest zastosowanie bardziej wiarygodnych testów żywotności 3D do określenia cytotoksyczności ECT w porównaniu ze standardowymi testami żywotności, takimi jak test MTT. W ten sposób wszystkie komórki sferoidy są poddawane lizie i wymagane jest dodatkowe mycie komórek, usunięcie pożywki i wiele etapów pipetowania.

Ograniczeniem opisanych metod jest krótka żywotność sferoid, co wpływa na wielkość guza, a także na martwicę komórek, co widać w środku organoidu guza. Związana z tym wysoka śmiertelność zarówno w przypadku CM, jak i UM oraz ograniczone możliwości terapeutyczne wymagają wzbogacenia istniejących możliwości terapeutycznych. Elektrowstrząsy mogą stanowić metodę uzupełniającą w celu poprawy jakości życia pacjenta i przedłużenia jego przeżycia. Te warunki in vitro imitują warunki in vivo z większą precyzją, oferując obiecujące wyniki do dalszego stosowania u ludzi. Przyszłe badania z wykorzystaniem sferoid przygotowanych z kultur pierwotnych mogą dostarczyć bardziej reprezentatywnych wyników w celu optymalizacji ustawień ECT dla ukierunkowanego leczenia.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sprawozdanie to nie otrzymało żadnej konkretnej dotacji od żadnej agencji finansującej w sektorze publicznym, komercyjnym lub nienastawionym na zysk.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Dr. Rolf M. Schwiete-Stiftung. Autorzy dziękują Martine J. Jager (Laboratorium Okulistyki w LUMC, Lejda, Holandia) i Helen Kalirai (Liverpool Ocular Oncology Research Group, Molecular and Clinical Cancer Medicine, University of Liverpool, Wielka Brytania) za dostarczenie linii komórkowych UM. Chcielibyśmy również podziękować Sabine Hecht (Oddział Okulistyki, Szpital Uniwersytecki w Halle (Saale), Niemcy) za pomoc techniczną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Siarczan bleomycynyEnzoBML-AP302-001010 mg
Kolba do hodowli komórkowych 75 cmTPPTPP90076
Kolba do hodowli komórkowych TC175 cmSarstedt83,39,12,002Standard z filtrem
KliniporatorIGEAEPS01Elektroporator
Corning Costar Ultra-Low Attachment Płytka wielodołkowa, 96-dołkowa, okrągła dennaCorning700796Well przezroczyste okrągłe dno, Ultra niskie płytki mocujące
EGF 1MGSigma-AldrichE4127-.1MG
F-12 K Nut Mix (1x)Gibco21127-022
Surowica bydlęca płodu, Ameryka PołudniowaCorning35-079-CVLOT Nr. 35079010, Reservierungsnummer: EU00478541
FKS
KGM-2LonzaCC-3103
PBS bez CaCl i MgClPromoCellC-40232500 ml
Penicylina-StreptomycynaSigma-AldrichP4333-100ml
RPMI 1640Gibco11504566modyfikacją ATCC, HEPES, płyn, 500 ml
Tecan Infinity M PlexTecan
Trypsin-EDTA 1x RoztwórSigma-Aldrich59430C-100ml

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaliki, S., Shields, C. L. Uveal melanoma: relatively rare but deadly cancer. Eye (Lond). 31 (2), 241-257 (2017).
  2. Chang, A. E., Karnell, L. H., Menck, H. R. The National Cancer Data Base report on cutaneous and noncutaneous melanoma: a summary of 84,836 cases from the past decade. The American College of Surgeons Commission on Cancer and the American Cancer Society. Cancer. 83 (8), 1664-1678 (1998).
  3. Dogrusoz, M., Jager, M. J., Damato, B. Uveal Melanoma Treatment and Prognostication. Asia-Pacific Journal of Ophthalmology. 6 (2), 186-196 (2017).
  4. Damato, B., Coupland, S. E. Management of conjunctival melanoma. Expert Review of Anticancer Therapy. 9 (9), 1227-1239 (2009).
  5. Norregaard, J. C., Gerner, N., Jensen, O. A., Prause, J. U. Malignant melanoma of the conjunctiva: occurrence and survival following surgery and radiotherapy in a Danish population. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 234 (9), 569-572 (1996).
  6. Fiorentzis, M., et al. Electrochemotherapy with bleomycin and cisplatin enhances cytotoxicity in primary and metastatic uveal melanoma cell lines in vitro. Neoplasma. 65 (2), 210-215 (2018).
  7. Fiorentzis, M., et al. Conjunctival melanoma and electrochemotherapy: preliminary results using 2D and 3D cell culture models in vitro. Acta Ophthalmologica. 97 (4), 632-640 (2019).
  8. Fiorentzis, M., et al. The Potential Use of Electrochemotherapy in the Treatment of Uveal Melanoma: In vitro Results in 3D Tumor Cultures and In vivo Results in a Chick Embryo Model. Cancers (Basel). 11 (9), (2019).
  9. Brun, P., et al. Cell-seeded 3D scaffolds as in vitro models for electroporation. Bioelectrochemistry. 125, 15-24 (2019).
  10. Sersa, G., et al. Electrochemotherapy in treatment of tumours. European Journal of Surgical Oncology. 34 (2), 232-240 (2008).
  11. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  12. Miklavcic, D., et al. Electrochemotherapy: technological advancements for efficient electroporation-based treatment of internal tumors. Medical & Biological Engineering & Computing. 50 (12), 1213-1225 (2012).
  13. Miklavcic, D., Corovic, S., Pucihar, G., Pavselj, N. Importance of tumour coverage by sufficiently high local electric field for effective electrochemotherapy. EJC Supplements. 4 (11), 45-51 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tr jwymiarowe sferoidy czerniaka ga ki ocznejczerniak spoj wkiczerniak naczyniakowyleczenie bleomycynparametry elektroporacjitest ywotno ci sferoid wrozw j organoid w nowotworowychECT in vitro
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły