Artykuł metodologiczny

Połączenie mikrodysekcji wychwytu laserowego i mikroprzepływowego qPCR w celu analizy profili transkrypcyjnych pojedynczych komórek: podejście biologii systemowej do uzależnienia od opioidów

DOI:

10.3791/60612

⸱

8 marca 2020

 ,  ,  ,  , 
1Daniel Baugh Institute for Functional Genomics and Computational Biology, Department of Pathology, Anatomy, and Cell Biology, Thomas Jefferson University, 2Sidney Kimmel Medical College, Thomas Jefferson University, 3Department of Pharmacology & Physiology, Drexel University College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół wyjaśnia, jak zbierać pojedyncze neurony, mikroglej i astrocyty z centralnego jądra ciała migdałowatego z dużą dokładnością i anatomiczną specyficznością za pomocą mikrodysekcji laserowej. Dodatkowo wyjaśniamy nasze zastosowanie mikroprzepływowego RT-qPCR do pomiaru podzbioru transkryptomu tych komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głęboka heterogeniczność transkrypcji w anatomicznie sąsiadujących pojedynczych komórkach sugeruje, że dzięki różnorodności fenotypów komórkowych można osiągnąć solidną funkcjonalność tkanki. Eksperymenty na pojedynczych komórkach badające dynamikę sieci systemów biologicznych pokazują odpowiedzi komórkowe i tkankowe na różne warunki w biologicznie znaczącej rozdzielczości. W tym miejscu wyjaśniamy nasze metody zbierania pojedynczych komórek z anatomicznie określonych lokalizacji i dokładnego pomiaru podzbioru ich profili ekspresji genów. Łączymy mikrodysekcję wychwytu laserowego (LCM) z ilościowymi reakcjami łańcuchowymi polimerazy z odwrotną transkrypcją mikroprzepływową (RT-qPCR). Używamy również tej mikroprzepływowej platformy RT-qPCR do pomiaru obfitości mikrobiologicznej treści jelitowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomiar profili ekspresji genów w pojedynczych komórkach wykazał dużą niejednorodność fenotypową w tkance. Ta złożoność skomplikowała nasze zrozumienie sieci biologicznych, które zarządzają funkcjonowaniem tkanek. Nasza grupa i inni badali to zjawisko w wielu tkankach i warunkach1,2,3,4,5,6. Eksperymenty te nie tylko sugerują, że regulacja sieci ekspresji genów leży u podstaw takiej heterogeniczności, ale także, że rozdzielczość pojedynczej komórki ujawnia złożoność funkcji tkanki, której rozdzielczość na poziomie tkanki nie jest w stanie docenić. Rzeczywiście, tylko niewielka mniejszość komórek może reagować na określony stan lub wyzwanie, ale wpływ tych komórek na ogólną fizjologię może być znaczny. Ponadto podejście oparte na biologii systemowej, które stosuje metody wielowymiarowe do wielowymiarowych zestawów danych z wielu typów komórek i tkanek, może wyjaśnić efekty leczenia w całym systemie.

Łączymy LCM i mikroprzepływowy RT-qPCR, aby uzyskać takie zestawy danych. Przyjmujemy tutaj to podejście, w przeciwieństwie do zbierania pojedynczych komórek za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) i używania sekwencjonowania RNA (RNA-seq) do pomiaru ich transkryptomu. Przewagą LCM nad FACS jest to, że dokładna specyficzność anatomiczna pojedynczych komórek może być udokumentowana za pomocą LCM, względnie i bezwzględnie. Co więcej, podczas gdy sekwencja RNA może mierzyć więcej cech niż RT-qPCR, mikroprzepływowy RT-qPCR jest tańszy i ma wyższą czułość i swoistość7.

W tym reprezentatywnym eksperymencie badaliśmy wpływ uzależnienia od opioidów i odstawienia opioidów wywołanego naltreksonem na ekspresję genów neuronalnych, mikrogleju i astrocytów szczurów w centralnym jądrze ciała migdałowatego (CeA) i obfitość mikroflory jelitowej4. Przeanalizowano cztery grupy leczenia: 1) placebo, 2) morfina, 3) naltrekson i 4) odstawienie (ryc. 1). Odkryliśmy, że uzależnienie od opioidów nie zmieniło znacząco ekspresji genów, ale odstawienie opioidów indukowało ekspresję genów zapalnych, w szczególności Tnf. Astrocyty były najbardziej dotkniętym typem komórek. Odstawienie opioidów miało głęboki wpływ na mikrobiom jelitowy, na co wskazuje spadek stosunku Firmicutes do Bacteroides, który jest uznanym markerem dysbiozy jelitowej8,9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zaleceniami Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu Thomasa Jeffersona oraz Drexel University College of Medicine. Protokół został zatwierdzony przez Uniwersytet Thomasa Jeffersona i Drexel University College of Medicine IACUC.

1. Model zwierzęcy

  1. Wprowadzić podskórnie dwa granulki siarczanu morfiny o powolnym uwalnianiu po 75 mg lub dwie granulki placebo dorosłym samcom szczurów Sprague-Dawley.
    1. Używaj fartucha i rękawiczek odpowiednio do drobnych sterylnych operacji. W razie potrzeby ogol grzbiet szczura maszynką do strzyżenia.
    2. Nałóż maść weterynaryjną na oczy zwierzęcia. Znieczulić szczura około 20 s inhalacji izofluranu. Znieczulenie potwierdza utrata przytomności.
    3. Wykonaj nacięcie w linii środkowej grzbietu szczura nożyczkami wysterylizowanymi koralikami i oddziel skórę właściwą od ściany ciała za pomocą sondy wysterylizowanej koralikami. Włóż granulki pod skórę właściwą za pomocą kleszczy wysterylizowanych koralikami. Zszyć nacięcie zamknięte sterylną igłą.
      UWAGA: Cała procedura trwa około 5 minut na szczura. Dla każdego szczura używane są świeże sterylne rękawiczki.
    4. Umieść szczura w klatce izolacyjnej w celu rekonwalescencji pooperacyjnej. Sprawdź bicie serca i regularny rytm oddechowy. Obserwuj szczura, aż odzyskasz przytomność. Oceń ból pooperacyjny.
    5. Oceń szczury 8 godzin po operacji i co 12 godzin po niej pod kątem rekonwalescencji i infekcji. Umieść szczury w klatce z resztą kohorty, gdy w pełni wyzdrowieją po operacji, około 24 godziny po operacji.
  2. Podać dootrzewnowe wstrzyknięcie naltreksonu (75 mg/kg) kohortom G i Withdrawal po 6 dniach ekspozycji na morfinę.
    UWAGA: W tym reprezentatywnym eksperymencie wzięły udział cztery kohorty szczurów (patrz Rysunek 1).

2. Pobieranie próbek

  1. Mózg należy pobrać 6 dni po wprowadzeniu osadu lub 24 godziny po wstrzyknięciu naltreksonu.
    1. Umieścić zwierzę w komorze izofluranu na około 30 s lub do momentu wystąpienia utraty przytomności, co wskazuje na brak ruchu i zmniejszoną częstość oddechów.
    2. Użyj ostrej gilotyny, aby szybko odciąć głowę zwierzęciu.
    3. Wypreparuj mózg z czaszki zwierzęcia.
    4. Użyj ostrej ręcznej brzytwy, aby wykonać następujące poważne nacięcia w usuniętym mózgu: Najpierw odetnij móżdżek i wyrzuć. Po drugie, oddziel pień mózgu od przodomózgowia za pomocą poprzecznego nacięcia. Po trzecie, wyciąć przodomózgowie i/lub pień mózgu z nacięciem strzałkowym w linii środkowej.
    5. Umieść przodomózgowie i pień mózgu w plastikowej formie do zatapiania tkanek z 3-4 cm środka o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) na dnie formy. Pozostałą część próbki pokryć OCT.
    6. Natychmiast umieścić plastikową formę do zatapiania tkanek z próbką pokrytą OCT w kąpieli zawierającej suchy lód i metanol. Nie pozwól, aby metanol rozlał się do formy do zatapiania tkanek. Formę do zatapiania wraz z próbką mózgu należy przechowywać w kąpieli metanolowo-lodowej do momentu zakończenia pobierania tkanek (maksymalnie ~10-15 minut).
    7. Umieść próbkę mózgu w zamrażarce o temperaturze -80 °C tak szybko, jak to możliwe.
  2. Pobieraj próbki jelit jednocześnie.
    1. Po szybkim ścięciu głowy wykonaj nacięcie w linii środkowej brzucha zwierzęcia za pomocą skalpela.
    2. Znajdź jelito ślepe i przerwij jego połączenie z okrężnicą wstępującą.
    3. Wyciśnij zawartość jelita ślepego do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    4. Natychmiast umieść stożkową rurkę na suchym lodzie i jak najszybciej włóż do zamrażarki o temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Treść z jelita cienkiego można również pobrać tymi samymi metodami, co w przypadku kontroli ujemnej.

3. Krojenie

  1. Pokrój półmózgowie szczura z półkulsekcją za pomocą kriostatu.
    1. Wyjmij plastikową formę do zatapiania z przodomózgowiem z zamrażarki w temperaturze -80 °C i umieść w kriostacie o temperaturze -20 °C.
    2. Usuń próbkę półwyciętego przodomózgowia z osadzonym w OCT z formy do zatapiania. W razie potrzeby użyj brzytwy, aby pokroić rogi plastikowej formy do osadzania w pionie. Zamontuj przodomózgowie w celu rostralnego i ogonowego cięcia koronalnego na uchwycie kriostatowym za pomocą OCT.
      UWAGA: Anatomiczne punkty orientacyjne identyfikujące CeA obejmują drogę wzrokową i prążek końcowy (Rysunek 2B). Przewód wzrokowy rozgałęzia się od skrzyżowania wzrokowego i biegnie grzbietowo-bocznie, gdy mózg jest cięty rostralnie do ogonowego. Gdy przewód wzrokowy ma morfologię podobną do tej, którą można zaobserwować w atlasie mózgu szczura bregma -2,12 mm10, próbki testowe można oglądać pod mikroskopem. Morfologię drogi wzrokowej i końcówki prążka można sprawdzić w atlas10, aby zidentyfikować bregmę i czy CeA otacza zakończenia prążkowia.
    3. Pokrój skrawki koronalne o grubości 10 μm od półprzodomózgowia rostralnego do ogonowego, aż do uzyskania sekcji zawierających CeA.
      UWAGA: Szerokość i wysokość sekcji wynoszą około 200 mm.
    4. Zbierz skrawki 10 μm zawierające CeA lub preferowany obszar mózgu, rozmrażając skrawki 10 μm na zwykłych szkiełkach podstawowych. Natychmiast umieść szkiełka podstawowe na metalowej patelni spoczywającej na suchym lodzie. Szkiełka z sekcjami mózgu należy jak najszybciej umieścić w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Na tym samym slajdzie można umieścić wiele plasterków. Jeśli używasz barwnika innego typu komórek do plasterków na tym samym szkiełku, pozostaw około 100 mm między plasterkami, aby można było użyć hydrofobowego pisaka do oddzielenia roztworów przeciwciał specyficznych dla typu komórki na szkiełku. Pozostaw około 20 mm od krawędzi szkiełka z każdej strony plastra.

4. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Zabarwić sekcje przodomózgowia pod kątem wybranej komórki mózgowej (np. neuronu, mikrogleju, astrocytu itp.) za pomocą immunofluorescencji.
    1. Wyjąć jedno lub więcej szkiełek z sekcjami CeA o grubości 10 μm z zamrażarki w temperaturze -80 °C.
    2. Zamocuj szkiełka 75% etanolem przez 30 s. Usuń nadmiar płynu.
    3. Zablokuj plastry na 30 s z 2% bydlęcym antygenem surowicy (BSA) w 1x bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS). Umyć 1x PBS.
    4. Dodać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego do szkiełka na 2 minuty. Przemyć 1x 2% roztworem BSA.
      UWAGA: Roztwór przeciwciała pierwszorzędowego składa się z 2% przeciwciała pierwszorzędowego, 1% RNazy Out i 96% tego samego roztworu PBS BSA dla powyższego kroku blokowania (krok 4.1.3). W reprezentatywnym eksperymencie wykorzystano przeciwciało anty-NeuN, przeciwciało anty-Cd11β i przeciwciało anty-GFAP w następujących ilościach: 3 μl pierwszorzędowego, 1,88 μl inhibitora RNA i 145,12 μl roztworu BSA.
    5. Dodać drugorzędowy roztwór przeciwciała do szkiełka na 3 minuty. Przemyć 1x PBS.
      UWAGA: Roztwór przeciwciała drugorzędowego składa się z 1 μl koziego znacznika fluorescencyjnego anty-mysiego 488 nm (1:500), 2,5 μl inhibitora RNA, 1,3 μl DAPI (1:10 000) i 196,5 μl 2% BSA.

5. Seria odwadniania etanolu i ksylenu

  1. Zanurz szkiełka w 75% etanolu na 30 s. Natychmiast po tym zanurz szkiełka w 95% etanolu na 30 s. Natychmiast po tym zanurz szkiełka w 100% etanolu na 30 s. Natychmiast po tym zanurz szkiełka w drugim pojemniku zawierającym 100% etanolu na 30 s.
  2. Po serii odwadniania etanolu zanurz szkiełka w świeżo nalanym ksylenie na 1 minutę. Natychmiast po tym zanurz szkiełka w drugim pojemniku z ksylenem na 4 minuty.
  3. Wyjmij szkiełka z kąpieli ksylenowej i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu w ciemności przez 5 minut.
  4. Umieść szkiełka w eksykatorze na 5 minut, aby dalej wyschły.

6. Mikrodysekcja laserowa

  1. W przypadku zabarwienia umieść szkiełko w mikroskopie i znajdź obszar zainteresowania (CeA) za pomocą anatomicznych punktów orientacyjnych (tj. skrzyżowania wzrokowego i prążka końcowego).
  2. Użyj fluorescencji, aby zidentyfikować wybarwiony typ komórki i jej jądro w obszarze zainteresowania. Wybierz jedną komórkę lub wiele komórek, jeśli wykonujesz próbki z puli pojedynczej komórki. Zaznacz interesujące Cię komórki za pomocą oprogramowania LCM.
  3. Umieść nasadkę LCM na wierzchu plasterka w obszarze zainteresowania.
  4. Użyj próbnych strzałów lasera na podczerwień (IR), aby dostosować siłę, rozmiar i czas trwania lasera IR tak, aby klej do nasadki LCM topił się tylko na obszarze wybranej pojedynczej komórki. Gwarantuje to, że nie zostaną zebrane żadne inne komórki poza wybranymi.
    UWAGA: W tym reprezentatywnym eksperymencie 10 pul komórek tego samego typu komórek użyto jako pojedynczej próbki, aby ograniczyć zmienność ekspresji genów między komórkami między próbkami poddanymi temu samemu traktowaniu. Jednak ta metoda może być używana do prawdziwych eksperymentów z pojedynczymi komórkami1,3.
  5. Wybierz poszczególne komórki, które mają zostać zebrane do analizy za pomocą narzędzi programowych LCM (Rysunek 2C). Wybrane komórki muszą znajdować się w anatomicznym obszarze CeA (lub wybranym regionie mózgu) na podstawie atlasu mózgu szczura i bregma10. Komórki powinny znajdować się w odległości co najmniej 3 μm od sąsiednich barwionych jąder.
  6. Uruchom laser na podczerwień, aby zebrać zidentyfikowane pojedyncze komórki.
  7. Umieść nasadkę w stacji kontroli jakości (QC) i view ją, aby upewnić się, że wybrano tylko żądane komórki. Jeśli inne komórki zostały błędnie wybrane, laser ultrafioletowy może być użyty do zniszczenia niechcianych komórek, podczas gdy nasadka pozostaje w stacji kontroli jakości.
  8. Zrób zdjęcie wycinka tkanki, z którego pobrano komórkę, aby udokumentować jej anatomiczną specyficzność. W razie potrzeby zapisz odległość wycinka od bregmy, korzystając z atlasu mózgu szczura jako odniesienia10.
  9. Zdejmij nasadkę LCM ze stacji kontroli jakości, podłącz urządzenie do ekstrakcji próbki i odpipetuj 5,5 μl buforu do lizy na próbkę.
    UWAGA: Roztwór buforowy do lizy składa się z 0,5 μl wzmacniacza lizy i 5 μl buforu do ponownego zawieszenia.
  10. Zamontuj urządzenie ExtracSure na probówce do mikrowirówek o pojemności 0,5 ml i umieść na płycie grzejnej w temperaturze 75 °C na 15 minut.
  11. Odwirować próbkę i bufor do lizy przez 30 s z niską prędkością (0,01-0,02 x g) i umieścić pobraną próbkę w zamrażarce o temperaturze -80 °C.

7. Jednokomórkowy mikroprzepływowy RT-qPCR

  1. Wstępna amplifikacja mRNA pojedynczej komórki dla 96.96 Dynamic Array Chip
    1. Połącz startery genów qPCR mRNA do przodu i do tyłu dla wszystkich genów poddawanych testom w puli starterów do wstępnej amplifikacji (stężenie 500 nM dla każdego startera). Na przykład 1 μl starterów 100 μM w 80 μL plus 120 μl buforu zawiesiny DNA.
      UWAGA: Sekwencje starterów użyte w reprezentatywnym eksperymencie można znaleźć w O'Sullivan et al.4.
    2. Na nowej płytce PCR o wymiarach 96 x 96 dodaj 1 μl 5x VILO do każdej studzienki.
    3. Pobrać próbki jednokomórkowe LCM z próbek przechowywanych w temperaturze -80 °C, pozostawić do krótkiego rozmrożenia, krótko odwirować z małą prędkością (0,01-0,02 x g) i dodać 5,5 μl lizowanej próbki jednokomórkowej do płytki PCR. Każda próbka jest dodawana do osobnej studzienki.
    4. Umieścić płytkę PCR z próbkami i VILO w termocyklerze i podgrzewać w temperaturze 65 °C przez 1,5 minuty. Obracać płytkę przez 1 minutę w temperaturze 1 300 x g w temperaturze 4 °C i umieścić płytkę na lodzie.
    5. Do każdego dołka dodać 0,15 μl 10-krotnej mieszanki głównej syntezy cDNA, 0,12 μl białka T4 Gene 32 i 0,73 μl buforu zawiesiny DNA.
    6. Umieść płytkę PCR w termocyklerze i uruchom następujący protokół: 25 °C przez 5 min, 50 °C przez 30 min, 55 °C przez 25 min, 60 °C przez 5 min, 70 °C przez 10 min, 4 °C do końca.
    7. Do każdego dołka dodać 7,5 μl głównej mieszanki polimerazy Taq.
    8. Dodaj 1,5 μl puli starterów (patrz wyżej) do każdej studzienki.
    9. Umieść płytkę PCR w termocyklerze i uruchom następujący protokół preamplifikacji: 95 °C przez 10 minut, a następnie 22 cykle po 96 °C przez 5 sekund, 60 °C przez 4 minuty.
    10. Do każdej studzienki dodać 0,6 μl buforu reakcyjnego egzonukleazy I, 1,2 μl egzonukleazy I i 4,2 μl buforu zawiesiny DNA.
    11. Umieść płytkę PCR w termocyklerze i uruchom następujący protokół: 37 °C przez 30 min, 80 °C przez 15 min.
    12. Dodać 54 μl buforu TE do każdej studzienki. Odwirować płytkę PCR w temperaturze 1 300 x g przez 5 min. Przechowywać w temperaturze 4 °C, jeśli natychmiast przejdziesz do następnego etapu. Przechowywać w temperaturze -20 °C, jeśli na następny krok czeka się dłużej niż 12 godzin.
  2. Przygotuj płytkę próbną dla układu 96.96 Dynamic Array.
    1. W nowej 96-dołkowej płytce do PCR dodaj 0,45 μl 20x barwnika wiążącego DNA i 4,55 μl mastermixu o niskiej ROX do każdej studzienki.
    2. Dodać 3 μl wstępnie amplifikowanej próbki do każdego dołka, obrócić płytkę PCR przy 1 300 x g, a następnie umieścić płytkę na lodzie.
  3. Przygotuj płytkę testową dla układu 96.96 Dynamic Array.
    1. W nowej 96-dołkowej płytce PCR dodaj 3,75 μl 2x odczynnika ładującego test GE i 1,25 μl buforu zawiesiny DNA do każdego dołka.
    2. Dodać 2,5 μl 10 μM startera qPCR do każdego odpowiedniego dołka. Obracać płytkę PCR o masie 1 300 x g przez 5 minut.
  4. Załaduj i uruchom układ 96.96 Dynamic Array.
    1. Zalać chip płynem do przewodów kontrolnych.
    2. Umieść chip w kontrolerze IFC HX i uruchom skrypt Prime (136X).
    3. Dodać 6 μl próbki z płytki do PCR do odpowiednich dołków na próbki w układzie 96.96 Dynamic Array.
    4. Dodać 6 μl próbki z płytki testowej PCR do odpowiednich dołków testowych w układzie 96.96 Dynamic Array.
    5. Użyj igieł, aby przebić wszelkie pęcherzyki powietrza w studzienkach układu 96.96 Dynamic Array.
    6. Umieść układ 96.96 Dynamic Array Chip w kontrolerze IFC HX i uruchom skrypt Load Mix (136x).
    7. Wyjmij chip z kontrolera IFC HX, odklej naklejkę ochronną i umieść chip 96.96 Dynamic Array w mikroprzepływowej platformie RT-qPCR. Uruchom protokół GE Fast 96 x 96 PCR (30 cykli).
      UWAGA: Jakość RNA i ważność wyników ocenia się za pomocą wielu metod, w tym walidacji testu za pomocą elektroforezy żelowej, krzywych temperatury topnienia, kontrprób próbek i testów oraz wykresów serii rozcieńczeń wzorcowych. Ponadto wyniki transkrypcji można zweryfikować za pomocą niezależnych metod hemisekcji mózgu, w tym testów Western blot i immunofluorescencji.

8. Pomiar liczebności bakterii za pomocą mikroprzepływowego RT-qPCR

  1. Wyodrębnij DNA bakterii zgodnie ze wskazówkami zestawu do ekstrakcji DNA kału.
  2. Oszacuj stężenie DNA bakterii za pomocą qPCR.
  3. Dodaj wyekstrahowane bakteryjne DNA do nowej płytki PCR. Dodać 1 μl wyekstrahowanego bakteryjnego DNA i 9 μl buforu zawiesiny DNA.
  4. Przygotuj płytkę testową dla układu 48.48 Dynamic Array (patrz kroki 7.2.1-7.2.2)
  5. Przygotuj próbkę płytki dla układu 48.48 Dynamic Array Chip (patrz kroki 7.3.1-7.3.2)
    1. W nowej 96-dołkowej płytce do PCR dodaj 0,45 μl 20-krotnego barwnika wiążącego DNA i 4,55 μl mieszanki głównej o niskiej ROX do 48 dołków.
    2. Dodać 3 μl próbki z płytki PCR zawierającej bakteryjne DNA do 48 dołków i wirować płytkę PCR przy 1 300 x g przez 5 minut. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  6. Załaduj i uruchom układ 48.48 Dynamic Array Chip (patrz kroki 7.4.1-7.4.7).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wybór pojedynczych komórek został zweryfikowany zarówno wizualnie, jak i molekularnie. Wizualnie morfologia komórek była oglądana przed pobraniem komórek. Pobrane komórki były następnie oglądane w stacji kontroli jakości, a barwienie jąder komórkowych (DAPI) nakładało się na fluorescencję markera selekcji pojedynczej komórki. Rysunek 2A pokazuje reprezentatywne obrazy slajdu z półwyciętym przodomózgowiem szczura zawierającym CeA. Kolejne obra...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biologia pojedynczej komórki wykazała niejednorodność fenotypów komórkowych i solidność funkcji tkanek. Odkrycia te dostarczyły informacji na temat organizacji systemów biologicznych zarówno w skali makro, jak i mikro. W tym miejscu opisujemy połączenie dwóch metod, LCM i mikroprzepływowego qPCR, w celu uzyskania pomiarów transkryptomu pojedynczej komórki, które zapewniają swoistość anatomiczną i dokładność transkrypcji przy stosunkowo niskich kosztach (ryc. 1). Nasza grupa przyjmuje podejśc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca tutaj prezentowana została sfinansowana przez NIH HLB U01 HL133360 przyznany JS i RV, NIDA R21 DA036372 przyznany JS i EVB, oraz T32 AA-007463 przyznany Janowi Hoekowi na rzecz SJO'S.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
20X Barwnik wiążący DNAFluidigm100-7609NA
2x Test GE Ładowanie odczynnikaFluidigm85000802-RNA
48.48 Dynamiczna tablica IFC do płynu do ekspresji genówBMK-M-48.48NA
96.96 Dynamiczna tablica IFC do płynu do ekspresji genówBMK-M-96.96NA
Anti-CD11β PrzeciwciałoGenway BiotechCCEC48Microglea Stain
, klon A60EMD MilliporeMAB377Barwienie neuronalne
ArcturusXT System mikrodysekcjiprzechwytywania ArcturusNANA NA
Biomark HDFluidigmNAPlatforma RT-qPCR
Antygen surowicy bydlęcejSigma-AldrichB4287
CapSure Macro LCM CapsThermoFisher ScientificLCM0211NA
CellDirect One-Step qRT-PCR KitThermoFisher Scientific11753500Składniki roztworu buforowego do lizy
DAPIThermoFisher Scientific62248Bufor zawiesinowy DNA do barwienia jądra
TEKnovaT0221
Egzonukleaza INowość Englnad BioLabs, Inc.M0293SNA
Urządzenie do ekstrakcji próbek ExtracSureThermoFisher ScientificLCM0208NA
Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand Superfrost PlusThermoFisher Scientific22-037-246Szkiełka podstawowe
zwykłe Rurka reakcyjna cienkościenna GeneAmpThermoFisher ScientificN8010611
Przeciwciało monoklonalne GFAPThermoFisher ScientificA-21294Astrocyty Barwiące
kozę anty-mysie IgG (H + L), Superklonalne i handel; Rekombinowane przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA28175Seconadry Antibody
IFCController FluidigmNANA NA
RNaseOutThermoFisher Scientific10777019
SsoFast EvaGreen Supermix with Low RoxBio-RadPN 172-5211Rox master mix
SuperScript VILO Zestaw do syntezy cDNAThermoFisher Scientific11754250zawiera białko VILO i SuperScript
T4 Gene 32New Englnad BioLabs, Inc.M0300SNA
TaqMan PreAmp Master MixThermoFisher Scientific4391128NA
TE BufferTEKnovaT0225NA
Przeciwciało anty-NeuN laserowego

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, J., et al. Inputs drive cell phenotype variability. Genome Research. 24, 930-941 (2014).
  2. Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).
  3. Park, J., et al. Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock. Frontiers in Neuroscience. 10, 481(2016).
  4. O'Sullivan, S. J., et al. Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis. Frontiers in Neuroscience. 13, 665(2019).
  5. Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).
  6. Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).
  7. SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium. Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).
  8. Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease. Physiological Reports. 5, (2017).
  9. Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. Dysbiosis in inflammatory bowel disease. Gut. 53, 1-4 (2004).
  10. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition. , (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza pojedynczych kom rekprofilowanie transkrypcyjnej dro centralne cia a migda owategoekspresja gen wmikroprzep ywowe RT PCRizolacja kom reksekcjonowanie tkanek

Powiązane artykuły