Method Article

Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ścian komórkowych do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych

DOI:

10.3791/60613

⸱

November 28th, 2019

 , 
1Department of Microbiology, University of Innsbruck

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niezbędne barwniki fluorescencyjne są niezbędnymi narzędziami do analiz obrazowania żywych komórek w nowoczesnej biologii komórek grzybów. W artykule szczegółowo opisano zastosowanie znanych i mniej znanych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamiki błony plazmatycznej, endo-/egzocytozy i morfogenezy ściany komórkowej u grzybów strzępkowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych do analiz obrazowania żywych komórek dynamiki organelli w komórkach grzybów rozpoczęło się dwie dekady temu i od tego czasu nadal przyczynia się w znacznym stopniu do naszego zrozumienia stylu życia grzybów nitkowatych. Niniejszy artykuł zawiera praktyczny przewodnik dotyczący stosowania dwóch barwników membranowych FM 1-43 i FM 4-64 oraz czterech barwników ściany komórkowej: Calcofluor White M2R, Solophenyl Flavine 7GFE 500, Pontamine Fast Scarlet 48 i Congo Red. Nacisk kładziony jest na ich zastosowanie w niskich dawkach w celu zapewnienia barwienia wolnego od artefaktów, ich właściwości współobrazowania i oceny ilościowej. Przedstawione metody mają zastosowanie do wszystkich próbek grzybów nitkowatych, które można przygotować w opisany sposób. Podstawowe podejścia do barwienia mogą służyć jako punkty wyjścia do adaptacji do gatunków, które mogą wymagać różnych warunków uprawy. Po pierwsze, dokonuje się przeglądu właściwości biofizycznych i biochemicznych, ponieważ ich zrozumienie jest niezbędne do stosowania tych barwników jako naprawdę ważnych barwników fluorescencyjnych. Po drugie, przedstawiono protokoły krok po kroku, które szczegółowo opisują przygotowanie różnych typów próbek grzybów do obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek. Wreszcie, przykładowe eksperymenty ilustrują różne podejścia do: (1) identyfikacji defektów w czasoprzestrzennej organizacji endocytozy w mutantach genetycznych, (2) porównawczego scharakteryzowania wspólnej i odrębnej kolokalizacji białek docelowych znakowanych GFP w szlaku endocytarnym, (3) identyfikacji morfogenetycznych defektów ściany komórkowej w mutancie genetycznej oraz (4) monitorowania biogenezy ściany komórkowej w czasie rzeczywistym.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwadzieścia lat temu, sposób, w jaki morfogeneza strzępek i leżąca u jej podstaw molekularna biologia komórki mogły być wizualizowane u grzybów strzępkowych, został zrewolucjonizowany przez zastosowanie membranowego selektywnego barwnika fluorescencyjnego Fei Mao FM 4-641. Później zrealizowano korzyści płynące z barwnika wiążącego chitynę Calcofluor White jako istotnego markera fluorescencyjnego dynamiki ściany komórkowej grzyba2. Od tego czasu zarówno barwniki, jak i ich warianty stały się nieodłączną częścią analiz obrazowania żywych komórek dynamiki organelli u grzybów i nadal dostarczają bezprecedensowych informacji na temat stylu życia grzybów nitkowatych. W artykule szczegółowo opisano zastosowanie uznanych i mniej znanych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamiki błony plazmatycznej, endo- i egzocytozy oraz morfogenezy ściany komórkowej u grzybów strzępkowych. Testy śledzenia endocytozy pozwalają na odniesienie się do różnych pytań biologicznych związanych z ogólnym badaniem endocytozy3. W tym celu lokalizacja, szybkość i następstwo barwionych komór po dodaniu barwnika FM są rejestrowane za pomocą mikroskopii poklatkowej i ilościowo porównywane między badanymi szczepami grzybów4. Barwniki ściany komórkowej wyznaczają zewnętrzną granicę komórki i umożliwiają śledzenie zdarzeń morfogenetycznych, w tym spolaryzowanego wzrostu końcówki strzępki2, rozgałęzianie strzępek5, fuzja strzępek6,7 i tworzenie przegrody8. Ponadto ułatwiają ilościowe określanie miejscowego odkładania się ściany komórkowej i identyfikację defektów podczas biogenezy ściany komórkowej9. Ponieważ szczegółowa wiedza na temat właściwości biochemicznych i biofizycznych każdego markera fluorescencyjnego jest podstawowym warunkiem wstępnym jego udanego zastosowania in vivo, cechy te zostały najpierw podsumowane dla sześciu barwników przedstawionych w tym artykule.

Barwniki selektywne membranowe
Barwniki styrylowe FM (Fei Mao) to małe amfifilowe cząsteczki, które nie mogą przejść, ale odwracalnie łączą się z zewnętrzną ulotką dwuwarstwy lipidowej błon biologicznych10. Są praktycznie niefluorescencyjne w roztworze wodnym, ale stają się intensywnie fluorescencyjne po integracji z błoną plazmatyczną, generując doskonałe proporcje sygnału do szumu (S/N)11. Te właściwości sprawiają, że idealnie nadają się do wizualizacji dynamiki błony plazmatycznej i organelli wewnątrzkomórkowych, w tym śledzenia endo- i egzocytozy12. Zielono-fluorescencyjny FM 1-43 i czerwony-fluorescencyjny FM 4-64 to dwa najczęściej stosowane fluorescencyjne markery membranowe do tych celów. SynaptoGreen C4 i SynaptoRed C2 to generyczne cząsteczki od alternatywnych dostawców, które mogą być stosowane zamiennie zamiast odpowiednio FM 1-43 i FM 4-64.

Barwniki styrylowe składają się z trzech kluczowych obszarów strukturalnych: (1) lipofilowego ogona, który ułatwia wprowadzenie barwnika do dwuwarstwy lipidowej, (2) rdzenia fluoroforowego, który określa właściwości spektralne barwnika i składa się z dwóch pierścieni aromatycznych połączonych jednym do trzech podwójnych wiązań, oraz (3) dodatnio naładowanej hydrofilowej głowicy, która zapobiega całkowitemu wprowadzeniu i przenikaniu barwnika przez membranę (Rysunek 1A).

Im dłuższy lipofilowy ogon, tym wyższa jest hydrofobowość barwnika, a tym samym powinowactwo wiązania z membraną, ale tym niższa jest jego rozpuszczalność w wodzie i szybkość odbarwiania membrany. W związku z tym różne warianty barwnika FM dają różną dynamikę i wzory barwienia. Wyższa hydrofobowość FM 1-43 z ogonem C4 zapewnia silniejszy i bardziej stabilny sygnał fluorescencyjny na błonach plazmatycznych i organellach wewnętrznych szybciej niż krótszy FM 4-64 z ogonem C2, gdy jest stosowany w stężeniach równomolowych (Rysunek 2).

Co ważne, stałe i wysokie wskaźniki asocjacji/dysocjacji obu 11 ze średnimi czasami retencji 1–6 s na pojedynczą cząsteczkę barwnika13 zmniejszają ryzyko miejscowego zakłócenia funkcji błony, na przykład poprzez modyfikację płynności błony lub wymuszoną stałą interakcję białek błonowych. Jest to prawdopodobnie główny powód, dla którego cząsteczki te mogą być używane jako niezbędne barwniki. Niemniej jednak stężenia barwnika FM powyżej 50 μM są toksyczne dla komórek grzybów i roślin2,14, a dowody z protoplastów tytoniu BY-2 wskazują, że więcej niż 20 μM barwnika FM prowadzi do nasycenia błony plazmatycznej14. Dlatego zaleca się, aby nie przekraczać tego limitu, zwłaszcza biorąc pod uwagę fakt, że doskonałe obrazowanie osiągnięto już przy 2–5 μM15,16.

Warto zauważyć, że właściwości spektralne barwników FM różnią się znacznie w zależności od konkretnego mikrośrodowiska membrany (reviewed14). Ogólnie rzecz biorąc, widma wzbudzenia i emisji barwników FM w czystych roztworach rozpuszczalników (zwykle podawane w informacjach o produkcie) różnią się znacznie od widm w środowiskach komórkowych i w większości przypadków nie można się bezpośrednio konsultować przy wyborze ustawień obrazowania żywych komórek. Na przykład maksima wzbudzenia/emisji FM 1-43 i FM 4-64 ulegają przesunięciu ku błękitowi odpowiednio o 37/46 nm i 43/64 nm po związaniu z błonami grzybowymi w porównaniu z ich roztworami w metanolu (tabela 1).

Przełomowe podstawy użycia FM 4-64 i FM 1-43 do śledzenia błony komórkowej, endo/egzocytozy i dynamiki organelli, w tym Spitzenkörpera i mitochondriów, zostały już kompleksowo udokumentowane dla szerokiej gamy nitkowatych gatunków grzybów2,4,17,18,19. Zalecane ustawienia obrazowania dla obu barwników FM, które działają w różnych gatunkach grzybów nitkowatych, przedstawiono na stronie Rysunek 1B. Ograniczenia techniczne dostępnego sprzętu lub szczególne warunki komórkowe i eksperymentalne, takie jak pożywka hodowlana, pH lub temperatura, mogą jednak wymagać pewnych dostosowań. Na szczęście barwniki FM działają w szerokim zakresie spektralnym, a bardzo dobre wyniki obrazowania osiąga ekscytujący FM 1-43 o długości fali 514 nm lub FM 4-64 o długości fali 488 nm. W związku z tym optymalne ustawienia obrazowania muszą być określane indywidualnie dla każdego typu próbki i zamierzonego zastosowania.

Znaczne przesunięcie Stoke'a o ponad 135 nm FM 4-64 pozwala na doskonałe, jednoczesne obrazowanie z fluoroforami emitującymi zielone światło; jest to często wykorzystywane do oceny wewnątrzkomórkowej dynamiki lokalizacji białek fuzyjnych znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) względem błony plazmatycznej i szlaku endocytarnego9,20.

Barwniki selektywne dla ścian komórkowych
Calcofluor White M2R (CFW), sprzedawany również jako Fluorescencyjny Rozjaśniacz 28, jest prawdopodobnie najbardziej znanym barwnikiem fluorescencyjnym używanym do barwienia ścian komórkowych bakterii, grzybów, glonów, roślin wyższych i owadów. Początkowo stosowany jako optyczny środek wybielający w przemyśle papierniczym, tekstylnym i detergentowym, jego korzyści dla klinicznej diagnostyki infekcji grzybiczych zostały wcześnie dostrzeżone21,22. Ponieważ CFW nieodwracalnie interkaluje się w powstający łańcuch chitynowy, zakłóca normalne składanie mikrofibryli chityny podczas biogenezy ściany komórkowej, generując w ten sposób stres w ścianie komórkowej23. To z kolei uruchamia mechanizm naprawy uszkodzeń ściany komórkowej, prowadzący do miejscowo zwiększonego odkładania się ściany komórkowej w wyniku aktywacji glukanu i syntazy chityny24,25. Zjawisko to może wystąpić w przypadku każdego barwnika, który działa poprzez stabilne wiązanie się z polimerami ściany komórkowej, jest zależny od stężenia i jest najbardziej zauważalny na końcach strzępek, które reprezentują najbardziej płodnie rosnące, a tym samym najbardziej wrażliwe części grzybni (Rysunek 3). Niedawno udostępniono obszerne podsumowanie maszynerii molekularnej, która reaguje na uszkodzenia ściany komórkowej26.

Przedawkowanie barwnika w połączeniu z fototoksycznością może prowadzić do szybkiej lizy komórek w przedziałach strzępkowych (Film 1). Niemniej jednak, zwiększona wrażliwość na stężenia barwnika, które są "niezbędne" u typu dzikiego, może być wykorzystana do identyfikacji defektów w biosyntezie ściany komórkowej mutantów z utratą funkcji genów9. Dla CFW i czerwieni Kongo (CR), innego barwnika tekstylnego, znanego również jako czerwień bezpośrednia 28 i stosowanego jako barwnik ściany komórkowej specyficzny dla α i β-chityny dla grzybów i owadów27,28, stężenia progowe, które silnie indukują syntazy chityny, określono odpowiednio za pomocą > 60 μM CFW i > 70 μM CR, podczas gdy stężenia <15 μM żadnego barwnika nie zmieniały ani nie hamowały wzrostu grzybów29,30,31. Hickey i wsp. umieścili to stężenie progowe dla CFW na poziomie 25 μM2. Dlatego zaleca się stosowanie stężeń barwników ≤ 5 μM, aby wykluczyć artefakty związane ze stresem i zapewnić użycie tych cząsteczek jako naprawdę "niezbędnych barwników fluorescencyjnych"2,32. Dotyczy to w równym stopniu Solophenyl Flavine 7GFE 500 (SPF) i Pontamine Fast Scarlet 4B (PFS), synonimów odpowiednio Direct Yellow 86 i Direct Red 23, dwóch innych użytecznych barwników ściany komórkowej, których zastosowanie w przypadku grzybów zostało zgłoszone po raz pierwszy ponad dekadę temu33. Jednak pomimo ich niezwykłych właściwości spektralnych34,35, od tego czasu użycie obu barwników jest bardzo ograniczone36,37. Jak pokazano wcześniej dla 1,5 μM CFW2, 2 μM SPF są wystarczające do rozróżnienia dynamiki ściany komórkowej w warunkach natywnych z bardzo wysoką rozdzielczością czasową (Film 2). Te same wyniki można uzyskać przy użyciu 2 μM CR lub PFS.

Razem, te cztery barwniki, CFW, SPF, PFS i CR, tworzą zestaw selektywnych dla ściany komórkowej markerów fluorescencyjnych, które pokrywają prawie pełne spektrum światła widzialnego (400-700 nm) używane w nowoczesnych mikroskopach fluorescencyjnych (Rysunek 4). Znaczny wzrost intensywności fluorescencji po związaniu się z polimerami ściany komórkowej jest nieodłączny dla wszystkich czterech i generuje doskonałe proporcje S/N. To z kolei pozwala na utrzymanie bardzo niskich stężeń barwnika i intensywności światła wzbudzającego oraz pozwala na barwienie ścian komórkowych jako technikę obrazowania żywych komórek w "niskiej dawce"2. Ponieważ te barwniki ściany komórkowej są nieprzepuszczalne dla błony plazmatycznej, jednocześnie działają jako żywe/martwe plamy. Warto zauważyć, że ze względu na ich niezwykle szerokie widma emisyjne światła, należy dokładnie rozważyć pewne ograniczenia dotyczące właściwości współobrazowania CFW i SPF z innymi fluoroforami.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbek grzybów

  1. Wstępne kultury grzybów
    1. Zaszczepić pożądany szczep na odpowiednim stałym podłożu agarowym, takim jak agar z dekstrozą ziemniaczaną (PDA) w przypadku Trichoderma atroviride lub Vogel's Minimal Medium (VMM) w przypadku Neurospora crassa. Dodaj odpowiedni znacznik wyboru podczas pracy z odkształceniami transformacyjnymi.
    2. Inkubuj kulturę wstępną w optymalnej temperaturze organizmu. Na przykład, T. atroviryd w temperaturze 25 °C i N. crassa w temperaturze 30 °C, oraz 12 godzin/12 godzin cykli światła/ciemności, aż rozwinie się grzybnia zarodnikująca, ale jeszcze nie osiągnęła krawędzi płytki. Na standardowej wielkości szalce Petriego (9,2 cm Ø) T. atroviryd typu dzikiego występuje średnio po 4–6 dniach, podczas gdy dziki typ N. crassa osiąga ten etap średnio po 3–4 dniach.
  2. Uprawa kolonii grzybów
    1. Używając sterylnego skalpela, odetnij mały blok agaru o wymiarach 3 mm x 3 mm przenoszący grzybnię niezarodnikującą z krawędzi kolonii kultury wstępnej.
    2. Umieść blok agaru na środku świeżej, stałej płytki pożywki, aby zaszczepić eksperymentalną kulturę.
    3. Inkubować kulturę doświadczalną zgodnie z etapem rozwoju, który ma być badany. Na przykład T. atroviryd typu dzikiego potrzebuje 20–22 godzin w temperaturze 25 °C w ciemności, aby rozwinąć kolonie o średnicy około 2 cm na PDA, podczas gdy N. crassa typu dzikiego osiąga średnicę kolonii około 4 cm po 14–16 godzinach inkubacji w temperaturze 30 °C w ciemności na VMM.
      UWAGA: Inkubacja w ciemności zapobiega tworzeniu się pigmentów, które mogą wprowadzać autofluorescencję. W celu wyeliminowania fluorescencji tła pożywki z hodowli doświadczalnej, należy zastąpić agar 1,5% w/v przezroczystego środka zestalającego (patrz Tabela Materiałów), a dowolne złożone podłoże określoną pożywką minimalną.
  3. Uprawa stałych kultur kiełkujących
    1. Użyj 5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej (0,9% w/v NaCl), aby zebrać zarodniki konidialne z płytki przed hodowlą i zebrać powstałą zawiesinę zarodników w probówce z nakrętką o pojemności 15 ml.
    2. Zawiesinę zarodników dobrze wymieszać przez energiczne wirowanie, a następnie przefiltrować ją przez pasek sterylnej tkaniny filtracyjnej o wymiarach 1 cm x 5 cm (patrz Tabela materiałów) lekko włożony do końcówki pipety o pojemności 1 ml (zarówno zmontowanej, jak i wcześniej autoklawowanej) do świeżej sterylnej probówki.
    3. Określić gęstość zarodników za pomocą komory do liczenia komórek i przygotować zawiesinę zarodników 1 x 107 komórek/ml z roztworem soli fizjologicznej.
      UWAGA: Zawiesinę zarodników można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni.
    4. Przygotuj szalkę Petriego o standardowej wielkości (Ø 9,2 cm) z 20 ml stałego podłoża i dodaj 15–20 sterylnych szklanych koralików (Ø 3 mm) na wierzch.
    5. Pobrać pipetą 200 μl zawiesiny przetrwalników na pożywkę i równomiernie rozprowadzić komórki na całej płytce, delikatnie wstrząsając. Zbierz szklane koraliki do zlewki z 70% etanolem do ponownego użycia.
    6. Inkubować kulturę doświadczalną zgodnie z etapem rozwoju, który ma być badany. Na przykład dziki typ T. atroviride wymaga 5–6 godzin w temperaturze 25 °C w ciemności, aby rozwinąć kiełki konidialne na PDA, podczas gdy dziki typ N. crassa rozwija kiełki konidialne po 3–4 godzinach inkubacji w temperaturze 30 °C w ciemności na VMM.
      UWAGA: W celu wyeliminowania jakiejkolwiek fluorescencji tła podłoża z hodowli doświadczalnej, należy zastąpić agar przezroczystym środkiem zestalającym o stężeniu 1,5% w/v, a wszelkie złożone podłoża określoną pożywką minimalną.
  4. Uprawa płynnych kultur kiełkujących
    1. Wlać 190 μl płynnej pożywki hodowlanej do każdego dołka 8-dołkowego mikroszkiełka.
    2. Dodać 10 μl roztworu przetrwalników o stężeniu 1 x 107 komórek/ml (przygotowanego w krokach 1.4.1–1.4.3) i wymieszać, delikatnie pipetując kilka razy w górę i w dół. Wynikowa całkowita liczba komórek wynosi 1 x 105 na studzienkę.
    3. Inkubować kulturę doświadczalną zgodnie z etapem rozwoju, który ma być badany. Na przykład dziki typ T. atroviryd wymaga 5–6 godzin w temperaturze 25 °C w ciemności, aby rozwinąć kiełki konidialne w bulionie z dekstrozy ziemniaczanej (PDB), podczas gdy dziki typ N. crassa rozwija kiełki konidialne po 3–4 godzinach inkubacji w temperaturze 30 °C w ciemności w płynnym VMM.

2. Przygotowanie roztworów roboczych barwnika

  1. Aby zagwarantować pełną rozpuszczalność każdego barwnika, należy przygotować 2 mM roztwory podstawowe w dimetylosulfotlenku (DMSO), dodając odpowiednią ilość (patrz dokładna waga w Tabeli 1) do 1 ml 100% DMSO i dobrze wymieszać przez wirowanie.
    UWAGA: Upewnij się, że bierzesz DMSO z butelki z uszczelką przegrodową; Powinien to być klarowny, przezroczysty płyn. W kontakcie z powietrzem DMSO brązowieje - prawdopodobnie z powodu utleniania śladowych zanieczyszczeń - i może negatywnie wpływać na wzrost komórek lub barwienie barwnikiem.
  2. Filtr Wysterylizuj roztwór podstawowy przez filtr membranowy strzykawkowy 0,2 μm do świeżej sterylnej probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml. Aby zminimalizować wybielanie barwnikiem, owiń tubkę folią aluminiową.
    UWAGA: Podstawowy roztwór barwnika można podzielić na mniejsze objętości, aby uniknąć cykli rozmrażania/zamrażania, i przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.
  3. Przygotować 20 μM wodny roztwór roboczy barwnika, rozpuszczając 2 μl roztworu podstawowego barwnika w 198 μl sterylnej wody destylowanej w świeżej sterylnej probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml. Aby zminimalizować wybielanie barwnikiem, owiń tubkę folią aluminiową.
    UWAGA: Roztwór roboczy barwnika powinien być przygotowany na świeżo w dniu eksperymentu.
  4. Podczas montowania próbki (patrz sekcja 3) roztwór roboczy barwnika zostanie standardowo rozcieńczony w stosunku 1:10, co spowoduje końcowe stężenie barwnika 2 μM i końcowe stężenie DMSO 0,1% w/v.
    UWAGA: Wybór różnych współczynników rozcieńczenia poprzez prostą zmianę stosunku objętości między roztworem roboczym barwnika a cieczą montażową pozwala łatwo dostosować pożądane końcowe stężenie barwnika.
    UWAGA: Aby zapobiec niepożądanym skutkom spowodowanym toksycznością barwnika lub DMSO, współczynnik rozcieńczenia nie powinien spaść poniżej 1:4, aby uzyskać maksymalne końcowe stężenia barwnika 5 μM i 0,4% w/v DMSO. Wyższe stężenia barwnika szybko nasycą system i uniemożliwią wiarygodną kwantyfikację sygnału, podczas gdy więcej niż 0,5% w/v (≥ 62,5 mM) DMSO może upośledzać rozwój komórek38.

3. Przygotowanie próbki do mikroskopii

  1. Pobrać próbki z kolonii grzybów (krok 1.2) lub stałych kultur kiełkujących (krok 1.3) metodą odwróconych bloków agarowych.
    1. Przygotuj czyste szklane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 60 mm (#1 = 0,13–0,16 mm grubości) i dodaj 18 μl płynnego minimalnego podłoża (VMM lub M9) lub roztworu soli fizjologicznej na środek.
    2. Dodać 2 μl roztworu roboczego barwnika o stężeniu 20 μM do 18 μl płynu i dobrze wymieszać, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół, unikając przy tym powstawania pęcherzyków powietrza.
      UWAGA: Podczas pracy z kilkoma próbkami zaleca się przygotowanie głównej mieszanki płynnego roztworu barwnika dla wszystkich, aby zapewnić równe stężenie barwnika podczas całego eksperymentu.
    3. Za pomocą czystego skalpela wyciąć próbkę o wymiarach 15 mm x 15 mm z obrzeży kolonii lub stałej kultury zarodkowej i umieścić ją pionowo obok kropli pożywki na szkiełku nakrywkowym.
    4. Używając skalpela do podparcia górnej krawędzi bloku i palca do przytrzymania tylnej strony bloku na miejscu, powoli opuść stronę przenoszącą grzybnię lub kiełki na płyn. Próbka jest teraz gotowa do przeniesienia na stolik mikroskopowy.
      UWAGA: Konieczne jest, aby robić to powoli i bardzo ostrożnie, aby zminimalizować naprężenia mechaniczne ogniw i uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza między próbką a szkiełkiem nakrywkowym.
  2. Zamontuj płynne kultury zarodkowe z kroku 1.4.
    UWAGA: Najwygodniej, płynne kultury kiełkujące w komorowych szkiełkach mikrodołkowych mogą być bezpośrednio przenoszone i dalej manipulowane na stoliku mikroskopowym.
    1. Dodać 22 μl roztworu roboczego barwnika do 200 μl płynnego podłoża, aby uzyskać standardowe końcowe stężenia 2 μM barwnika i 0,1% w/v DMSO.
      UWAGA: Płynne kultury kiełkujące mają tę wielką zaletę, że barwniki fluorescencyjne (lub inne chemikalia, takie jak inhibitory) mogą być dodawane w dowolnym momencie eksperymentu, również podczas nagrywania. W takim przypadku należy zachować szczególną ostrożność, aby podawać krople płynu bardzo powoli, aby nie przeszkadzać komórkom. Drgania systemu i ruchy Browna mogą już wprowadzać pewne ruchy komórek.

4. Mikroskopia żywych komórek

  1. Dostosuj podstawowe ustawienia akwizycji obrazu. Poniższe ustawienia akwizycji obrazu pozwalają uchwycić dynamikę barwienia w poszczególnych strzępkach i mają zastosowanie do obu następujących testów
    1. Zastosuj 5–10% mocy lasera z 20% pełnej mocy wyjściowej urządzenia.
    2. Użyj obiektywu Plan Apo 60x–63x do zanurzenia w glicerolu lub w wodzie o dużej aperturze numerycznej ≥ 1,2.
    3. Ogranicz obszar akwizycji obrazu do konturu strzępek, ustawiając rozmiar obrazu 1024 x 256 pikseli i używając współczynnika powiększenia optycznego 2–3.
    4. Użyj skanowania dwukierunkowego z częstotliwością odświeżania 400 Hz. Dostosuj rozmiar otworu do 1 jednostki Airy.
    5. Ustaw wzmocnienie najbardziej czułego detektora na 100%.
    6. W przypadku nagrywania poklatkowego należy rozpocząć akwizycję obrazu od jednej klatki co 15 s, aby zapewnić rozsądną rozdzielczość czasową bez powodowania wybielania barwnika lub stresu fotograficznego.
    7. W przypadku nagrywania 3D należy ustawić górną i dolną granicę przestrzenną na granicy strzępek i przestrzennych odcinków optycznych w odległości 1 μm od siebie, aby zapewnić rozsądną rozdzielczość przestrzenną.
      UWAGA: Ze względu na szybki wzrost strzępek, wysoka rozdzielczość przestrzenna w osi Z była często poświęcana na rzecz wysokiej rozdzielczości czasowej na osi X/Y lub na odwrót. Tylko bardzo nowoczesne konfokalne laserowe mikroskopy skaningowe są wystarczająco szybkie, aby spełnić oba wymagania.
  2. Testy wychwytu endocytozy
    1. Zapoznaj się z Rysunek 1 i Tabela 1, aby zidentyfikować najlepsze ustawienia wzbudzenia/emisji dla FM 1-43 i/lub FM 4-64 dostępne w systemie mikroskopowym i odpowiednio dostosować.
      UWAGA: Przy zalecanym stężeniu 2 μM wprowadzenie barwnika FM do błony plazmatycznej jest natychmiastowe w normalnych, zdrowych komórkach. Cały proces od wstępnego barwienia błony plazmatycznej do pojawienia się barwnika w wakuolach rurkowych jest zwykle zakończony w ciągu 30–45 minut w temperaturze pokojowej. Zwiększenie stężenia barwnika FM zwiększa stosunek sygnału do szumu, a tym samym szybciej tworzy obrazy o wyższym kontraście. Przyspiesza to jednak również proces etykietowania, utrudniając rozróżnienie chronologicznej kolejności barwienia organelli.
    2. Rozpocznij nagrywanie obrazu, korzystając z powyższych zalecanych podstawowych ustawień akwizycji obrazu i oceń wyniki.
    3. Zoptymalizuj ustawienia akwizycji obrazu do rozdzielczości przestrzennej i czasowej wymaganej do uchwycenia aspektu dynamiki błony plazmatycznej lub endocytozy, na którym koncentruje się eksperyment.
    4. Na przykład, aby uchwycić bardzo szybką dynamikę w X/Y, zmniejsz ogólny rozmiar obrazu, zobrazuj tylko jedną płaszczyznę ogniskową i zwiększ szybkość skanowania do 1 kl./s. Aby uzyskać wyższą rozdzielczość w osi Z, zmniejsz rozdzielczość w X/Y, zmniejsz rozmiar obrazu i zmniejsz odległość między sekcjami optycznymi do 0,5 μm.
  3. Dynamika ściany komórkowej
    1. Zapoznaj się z Rysunek 4 i Tabela 1, aby zidentyfikować najlepsze ustawienia wzbudzenia/emisji dla zastosowanego barwnika ściany komórkowej dostępnego w systemie mikroskopowym i odpowiednio dostosować.
      UWAGA: Ze względu na ich szerokie widma emisyjne, CFW i SPF nie nadają się do jednoczesnego obrazowania z innymi fluoroforami, głównie GFP. Niektóre ograniczenia dotyczą nawet metod obrazowania sekwencyjnego z użyciem tych barwników, a zatem muszą być optymalizowane indywidualnie.
    2. Rozpocznij rejestrowanie obrazu przy użyciu powyższych zalecanych podstawowych ustawień akwizycji obrazu i oceń wyniki.
      UWAGA: Przy zalecanym stężeniu 2 μM wprowadzanie barwnika do ściany komórkowej niekoniecznie jest natychmiastowe, ale dość szybkie. Na przykład cały proces tworzenia przegrody trwa średnio około 5–7 minut w temperaturze pokojowej20. Zwiększenie stężenia barwnika w ścianie komórkowej zwiększa stosunek sygnału do szumu, a tym samym szybciej tworzy obrazy o wyższym kontraście. Jednak szybko wprowadza również artefakty z powodu indukowanej naprawy uszkodzeń ściany komórkowej.
    3. Zoptymalizuj ustawienia akwizycji obrazu do rozdzielczości przestrzennej i czasowej wymaganej do uchwycenia aspektu morfogenezy ściany komórkowej, na którym koncentruje się eksperyment, jak opisano w sekcji 4.2.3.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ilościowa analiza obrazu
Oprócz "tylko" wizualizacji procesów komórkowych, obrazowanie żywych komórek pozwala na wydobycie informacji ilościowych z zarejestrowanych danych. Ogólnie rzecz biorąc, ilościowa analiza obrazu jest złożonym tematem, którego właściwe omówienie wykracza daleko poza zakres tego artykułu, stąd czytelnik odsyłany jest do dedykowanych podręczników i artykułów39,40,41. Niemniej jednak podano kilka podstawowych wskazówek związanych z poniższymi przykładowymi danymi. Aby umożliwić kwantyfikację obrazu, musi być spełnionych kilka kluczowych warunków wstępnych, w tym: (1) określone molowość barwników fluorescencyjnych muszą być stosowane do wszystkich próbek, aby umożliwić dokładne względne porównanie; (2) ustawienia akwizycji obrazu muszą być dostosowane w taki sposób, aby detektory emisji światła nigdy nie były nasycone, w przeciwnym razie maksymalne natężenia są odcięte; (3) ustawienia akwizycji obrazu muszą pozostać stałe w trakcie spójnego zestawu doświadczalnego, w przeciwnym razie wprowadzane są sztuczne zmiany intensywności; (4) dane obrazu muszą być zapisane w bezstratnym formacie pliku wraz z metainformacjami zawierającymi wszystkie ustawienia instrumentu; oraz (5) analiza obrazu powinna być ograniczona do minimalnej liczby etapów przetwarzania końcowego wymaganych do wyodrębnienia pożądanych informacji ilościowych.

Zazwyczaj, zdefiniowane standardy, które pozwoliłyby na absolutną kwantyfikację zarejestrowanych sygnałów, nie są dostępne w żywej komórce. Tak więc, w najprostszej formie, ilościowa analiza obrazu opiera się na względnym porównaniu intensywności pikseli w obrębie tego samego obrazu lub między różnymi obrazami zarejestrowanymi przy identycznych ustawieniach. Oprogramowanie sterujące mikroskopem producenta zwykle zawiera podstawowe narzędzia do obróbki końcowej obrazu i analizy ilościowej lub może być rozszerzone o dodatkowe funkcje segmentacji obrazu, progowania, obrazowania proporcjowego itp. Dostępnych jest kilka platform przetwarzania obrazów typu open source, w różny sposób dostosowanych do różnych typów danych obrazowych, w tym ImageJ (https://imagej.net; https://imagej.nih.gov/ij/), icy (http://icy.bioimageanalysis.org/), CMEIAS Bioimage Informatics (http://cme.msu.edu/cmeias/) i Wimasis (https://www.wimasis.com/en/).

Przedstawione przykładowe dane zostały przetworzone i przeanalizowane za pomocą platformy ImageJ. Krótko mówiąc, określone obszary w komórce, takie jak wierzchołek końcówki strzępki lub przegroda, są oznaczane za pomocą narzędzi do zaznaczania dużych obszarów, a intensywność wszystkich zawartych pikseli jest odczytywana za pomocą zaimplementowanego w oprogramowaniu "narzędzia pomiarowego". Dane o intensywności z próbek kontrolnych i eksperymentalnych są przenoszone do pliku arkusza kalkulacyjnego, analizowane matematycznie i przygotowywane jako wykres. Więcej szczegółów można znaleźć w cytowanych publikacjach oryginalnych.

Przykładowe dane 1: Testy absorpcji FM 4-64
Próbki grzybów hodowano jako kolonie (krok 1.2) i montowano metodą odwróconych bloków agarowych (etap 3.1). Końcowe stężenie FM 4-64 wynosiło 1,67 μM. Ustawienia obrazowania: obiektyw zanurzeniowy z glicerolem HCX PL APO 63x/1,3 NA na odwróconym konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym (patrz tabela materiałów); wzbudzenie FM 4-64 przy 488 nm i emisja przy 600–700 nm; jedna klatka co minutę przez maksymalnie 150 minut. Testy wychwytu FM 4-64 wykazały defekty w czasoprzestrzennej organizacji endocytozy w delecji genów i nadekspresji genów mutantów specyficznego dla grzyba białka z rodziny Sur7 2 (Sfp2) T. atroviride9 (Ryc. 5).

Przykładowe dane 2: Współbarwienie FM 4-64 fluorescencyjnych białek fuzyjnych ukierunkowane na przedziały endocytarne
Próbki grzybów hodowano jako kolonie (krok 1.2) i montowano metodą odwróconych bloków agarowych (etap 3.1). Końcowe stężenie FM 4-64 wynosiło 2 μM. Ustawienia obrazowania: CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC obiektyw zanurzeniowy w wodzie na odwróconym konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym (patrz tabela materiałów); wzbudzenie GFP przy długości fali 488 nm i emisja przy długości fali 500–530 nm, wzbudzenie FM 4–64 przy długości fali 488 nm i emisja przy długości fali 600–700 nm oraz światło jasne z detektorem światła przechodzącego, wszystkie jednocześnie; jedna klatka co 15 s przez okres do 15 minut. Współbarwienie FM4-64 zastosowano w celu powiązania subkomórkowej dystrybucji dwóch białek transbłonowych znakowanych białkiem zielonej fluorescencji (EGFP) Sfp2 i Gpr1 do szlaku endocytarnego w T. atrowiryd (Figura 6, Film 3, Film 4).

Przykładowe dane 3: Współbarwienie FM 4-64 w celu identyfikacji różnic morfogenetycznych
Próbki grzybów hodowano jako kolonie (krok 1.2) i montowano metodą odwróconych bloków agarowych (etap 3.1). Końcowe stężenie FM 4-64 wynosiło 2 μM. Ustawienia obrazowania: Obiektyw zanurzeniowy w oleju Plan Apochromat 63x/1,4 NA na odwróconym konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym (patrz tabela materiałów); wzbudzenie GFP przy długości fali 488 nm i emisja przy długości fali 505–550 nm, wzbudzenie FM 4–62 przy długości fali 488 nm i emisja przy długości fali 574–691 nm oraz pole jasne z detektorem światła przechodzącego, wszystkie jednocześnie; Jedna klatka co 8,5 s przez maksymalnie 15 minut. Współbarwienie FM4-64 pozwoliło powiązać dynamikę lokalizacji subkomórkowej znakowanego fluorescencyjnie białka kompleksu polarysomów BUD-6 z procesami zależnymi od transportu endosomów, takimi jak tworzenie przegród i wzrost spolaryzowanych końcówek strzępek, oraz scharakteryzować różnice w organizacji subkomórkowej i architekturze strzępek między szczepami N. crassa typu dzikiego i zmutowanymi (Ryc. 7, Film 5).

Przykładowe dane 4: Barwienie ściany komórkowej ujawnia różnice morfogenetyczne
Próbki grzybów hodowano jako kolonie (krok 1.2) i montowano metodą odwróconych bloków agarowych (etap 3.1). Zastosowano stężenia końcowe 2 μM CFW, 20 μM SPF i 100 μM CR. Ustawienia obrazowania: CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC do zanurzenia w wodzie na odwróconym konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym (patrz tabela materiałów); Wzbudzenie CFW i SPF przy 405 nm i emisja przy 430–470 nm, wzbudzenie CR przy 543 nm i emisja przy 580–620 nm. Różne właściwości interakcji CFW, SPF i CR z polimerami ściany komórkowej podkreślają różnice morfogenetyczne między mutantem Δsfp2 a szczepem typu dzikiego T. atroviride9. Zwiększenie stresu w ścianie komórkowej wywołanego podwyższonym stężeniem barwnika występuje szybciej i wyraźniej u mutanta w porównaniu z typem dzikim. Ponadto te same obrazy pozwalają na ilościowe określenie różnic morfogenetycznych dotyczących średnicy strzępek i odległości przegrody między oboma szczepami (Rysunek 8).

Przykładowe dane 5: Monitorowanie biosyntezy ściany komórkowej w czasie rzeczywistym
Zalążki hodowano jako płynną kulturę (krok 1.4) w 8-dołkowych mikroszkiełkach komorowych (krok 3.2). Końcowe stężenie CFW wyniosło 0,12 μM. Ustawienia obrazowania: CFI Plan Apo VC 60x/1,2 NA XC obiektyw zanurzeniowy w wodzie na odwróconym konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym; wzbudzenie CFW przy 405 nm i emisja przy 420–470 nm; Jedna klatka co 20 s przez maksymalnie 35 min. Bardzo niskie stężenie CFW zapobiega nasyceniu ściany komórkowej cząsteczkami barwnika i umożliwia ilościowe monitorowanie biosyntezy ściany komórkowej w czasie rzeczywistym. Ujawnia to, że osadzanie się nowego materiału ściany komórkowej nie jest jednorodne, ale bardzo szybko reaguje na zlokalizowane naprężenia fizyczne wynikające ze względnego przemieszczenia jednej komórki po przyczepieniu komórka-komórka przed fuzją zarodkową u N. crassa (Rysunek 9, Film 6).

figure-results-1
Rysunek 1: Właściwości biochemiczne i biofizyczne barwników FM. (A) Struktura chemiczna FM 1-43/SynaptoGreen C4 i FM 4-64/SynaptoRed C2. (B) Widma absorpcyjne i emisyjne obu barwników FM, nałożone na optymalne ustawienia obrazowania dla barwników związanych z błoną w grzybach strzępkowych: niebieskie światło 445–495 nm wzbudzi FM 1-43 ze 100–80% wydajnością, podczas gdy 488 nm lasera argonowego wzbudzi barwnik z 91% wydajnością. Ze względu na przesunięcie ku błękitowi po związaniu membrany (*), optymalny zakres detekcji emisji FM 1-43 wynosi od 520 do 590 nm. Podobnie, optymalne ustawienia obrazowania dla FM 4-64 u grzybów to 471–541 nm (100–80% wydajności) w przypadku korzystania z polichromatycznego źródła światła wzbudzającego lub 514 nm (wydajność 99%) w przypadku korzystania z lasera argonowego i 650–750 nm w przypadku wykrywania światła emisyjnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Jednoczesne jednoczesne obrazowanie FM 1-43 i FM 4-64. Równomolową mieszaninę obu barwników dodano do płynnej kultury kiełkowania N. crassa, uzyskując końcowe stężenie 10 μM. Po 25 minutach od dodania barwnika, FM 1-43 zabarwił błonę plazmatyczną i już zgromadził się w błonach wewnętrznych, w tym w silnie zabarwionych mitochondriach (m), ale w dużej mierze z wyłączeniem błon wakuolarnych (v), i jest ponad ośmiokrotnie silniejszy w porównaniu z FM 4-64 (średnia intensywność fluorescencji odpowiednio 176 do 21), którego niższa hydrofobowość/wyższa hydrofilowość spowalnia tempo internalizacji, co prowadzi do wydłużenia czasu przebywania w błonie plazmatycznej. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Ryc. 3: Indukowane stresem odkładanie się polimerów ściany komórkowej na wierzchołku końcówki często pociąga za sobą autolizę komórki. Strzępki T. atrowirydu wykazujące ekspresję cytoplazmatycznego GFP wybarwiono 10 μM Solophenyl Flavine 7GFE 500 (SPF) i zobrazowano natychmiast po zamontowaniu. Strzępki nienaprężone (a), strzępki zestresowane z nieznacznie zwiększonym odkładaniem się glukanu/chityny na wierzchołku i postępującą autolizą (b) oraz silnie zestresowane strzępki z wyraźną wierzchołkową czapeczką glukanu/chityny (gwiazdka) i autolizą końcową (c) widoczne przez całkowitą utratę fluorescencji GFP i rozległą wakuolizację. Podziałka = 10 μm. Zobacz film 1, aby zapoznać się z sekwencją kursu w pełnym wymiarze godzin. Zauważ, że trzy strzępki rzeczywiście znajdowały się obok siebie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Właściwości biochemiczne i biofizyczne barwników selektywnych dla ściany komórkowej. Podane cechy chemiczne to cechy soli sodowych każdego barwnika. Widma absorpcyjne i emisyjne odpowiadają widmom występującym w środowiskach komórkowych. Wskazane monochromatyczne linie wzbudzenia laserowego (zapisane kolorem), polichromatyczne zakresy wzbudzenia mające zastosowanie do mikroskopów epifluorescencyjnych oraz zakresy detekcji światła emisyjnego są zalecane do obrazowania w grzybach strzępkowych. Dwie linie wzbudzenia laserowego są wskazane, gdy obie działają równie dobrze. (*) Widmo emisyjne PFS związanego ze ścianą komórkową jest znacznie bardziej przesunięte ku czerwieni niż wcześniej zauważono33, co skutkuje bardzo dobrymi stosunkami S/N przy niższych stężeniach barwnika niż stosowane wcześniej. Pełne spektrum CR jest obecnie niedostępne, stąd Nile Red (nr CAS: 7385-67-3) jest pokazany jako najbliższy odpowiednik. Szczegółowe informacje na temat właściwości spektralnych CR można znaleźć gdzie indziej42. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5: Wpływ Sfp2 na wychwyt endocytarny FM4-64. Trzy następujące po sobie kluczowe etapy wchłaniania barwnika FM są łatwo dostrzegalne w typie dzikim (wt). Etap I: wyłączne barwienie błony plazmatycznej, etap II: pierwsze pojawienie się barwnika FM w pęcherzykach endocytarnych i etap III: wyłączne barwienie pęcherzyków endocytarnych i endomembran. Równoważne wzory barwienia są pokazane w najwcześniejszym momencie ich pojawienia się. W porównaniu z typem dzikim T. atrowiryd, endocytoza jest nieznacznie przyspieszona w mutancie z nadekspresją sfp2 (OEsfp2), podczas gdy wychwyt barwnika jest dramatycznie opóźniony w mutancie delecji sfp2 (Δsfp2). Na przykład wchłanianie barwnika do błony plazmatycznej następuje natychmiast w OEsfp2, ale trwa 2 minuty w typie dzikim; a całkowita internalizacja barwnika FM z błony plazmatycznej zachodzi 10 razy szybciej w OEsfp2 w porównaniu do Δsfp2. Podziałka = 5 μm. Rysunek jest reprodukowany z Atanasova et al.9 w zgodzie z licencją Creative Commons (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Ryc. 6: Współbarwienie białek błonowych znakowanych EGFP za pomocą FM 4-64 ułatwia różnicowanie odrębnej dynamiki lokalizacji subkomórkowej w T. atrowirydzie. (A) Białko domeny czterobłonowej Sfp2 kolokalizuje się z organellami znakowanymi FM4-64, w tym błoną plazmatyczną i przegrodami, Spitzenkörperem (Spk; strzałka) i przypuszczalnymi wakuolami rurkowymi. (B) Podobne do GPCR siedmiobłonowe białko Gpr1 kolokalizuje się z FM4-64 do tych samych organelli co Sfp2, z wyjątkiem Spk. Paski skali, 10 μm. Zobacz Film 3 i Film 4, aby zapoznać się z sekwencjami kursów w pełnym wymiarze godzin. Rysunek został zmodyfikowany z Atanasova et al.9 zgodnie z licencją Creative Commons. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Ryc. 7: Barwienie FM 4-64 odróżnia mutanta Δbud-6 od typu dzikiego i lokalizuje BUD-6 w pierścieniu przegrody. (A) Barwienie FM 4-64 strzępek dzikiego typu N. crassa (strzałki wskazują przegrody; groty strzałek wskazują Spk). (B) Septa i Spk są nieobecne w ∆bud-6. Podziałka skali, 50 μm. (C i D) Zbliżenie wierzchołka i podwierzchołka strzępki typu dzikiego (C) i ∆bud-6 (D). Spk (grot strzały) rozróżnia się w typie dzikim, ale nie ∆bud-6. W nawiasach zaznaczono jądrową strefę wykluczenia, która nie została ustanowiona w ∆bud-6. Podziałka = 5 μm. (E) Rekrutacja BUD-6-GFP do początkowego miejsca przegrody poprzedzającej wgłębienie błony plazmatycznej (groty strzałek) i towarzyszące zwężenie przegrody. Podziałka = 5 μm. Zobacz Film 5a i Film 5b, aby zapoznać się z pełnymi sekwencjami kursu czasowego. Rysunek został odtworzony z modyfikacjami przez Lichius et al.16 w zgodzie z licencją Creative Commons. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rycina 8: Delecja sfp2 zmienia wzorzec osadzania się materiału ściany komórkowej i wpływa na morfogenezę strzępek T. atrowirydu. (A) Barwienie CFW i SPF ujawnia zwiększone odkładanie się ściany komórkowej w Δsfp2 (strzałki) w porównaniu z typem dzikim (wt). Barwienie CR wywołuje rozległe pęcznienie końcówki tylko w Δsfp2 (groty strzałek). Podziałka = 10 μm. (B) Wady morfogenetyczne w Δsfp2 obejmują znacznie zmniejszone odległości przegrody (Δsfp2 = 26,0 μm, typ dziki = 85 μm; n = 60; ANOVA Pr < 2−16) i mniejsze średnice strzępek (∆sfp2 = 5,6 μm, typ dziki = 12,6 μm; n = 100; ANOVA Pr < 2−16). (C) Zwiększona fluorescencja barwnika w wierzchołku końcówki w porównaniu z wierzchołkiem podwierzchołkowym. Podziałka liniowa = 5 μm. (D) Wykres powierzchni 3D kodowany intensywnością (C). (E) Kwantyfikacja względnych intensywności fluorescencji w Δsfp2 i typie dzikim (n = 55). Rysunek został powielony z Atanasova et al.9 w zgodzie z licencją Creative Commons. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rycina 9: Monitorowanie biosyntezy ściany komórkowej w czasie rzeczywistym. (A) Fuzja rurki zespolenia konidialnego (CAT) między zarodkami N. crassa. Kontakt fizyczny staje się widoczny w reakcji momentu obrotowego (21–28 min). Intensywność fluorescencji CFW oznaczona kolorami wskazuje obszary z niewielką (ciemnoniebieską) i intensywną (żółtą) depozycją ściany komórkowej. Początkowo niezabarwiona końcówka naprowadzająca (grot strzałki) osadza nowy materiał ściany komórkowej przy kontakcie z końcówką i w obszarze doświadczającym największego obciążenia fizycznego (strzałka). Podziałka = 5 μm. Zobacz film 6, aby zapoznać się z pełną sekwencją kursu. Rysunek reprodukowany z38 za zgodą. (B) Rzut (A) wskazujący cztery obszary kołowe, w których zmierzono intensywność fluorescencji. Podziałka skali = 5 μm. (C) Wykres wskazanych regionów pokazujący szybki wzrost zlokalizowanej biosyntezy ściany komórkowej w odpowiedzi na stres fizyczny (CAT 1, strzałka). W zbożu zarodkowym (GT) i ciele zarodników (konidium) biosynteza ściany komórkowej stale rośnie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-10
Film 1: Stres ściany komórkowej wywołany barwnikiem. 10 μM SPF (cyjan) dodano do strzępek T. atrowirydów wyrażających cytoplazmatyczne GFP (magenta). Natychmiast następuje rozległe barwienie końcówek, po których następuje szybka liza przedziałów strzępkowych w ciągu 2 minut; widoczne w zaniku fluorescencji GFP. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

figure-results-11
Film 2: Barwienie z filtrem SPF. 2 μM SPF (cyjan) pozwalają śledzić wzrost końcówki strzępek T. atrowirydu z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową bez wywoływania artefaktów naprężeń ściany komórkowej na wierzchołku końcówki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

figure-results-12
Film 3: Współbarwienie FM 4-64 Sfp2-GFP. Jednoczesne barwienie T. atrowirydu eksprymującego Sfp2-mEGFP (kolor zielony) z 1,67 μM FM 4-64 (czerwony) ujawnia nakładającą się i wyraźną lokalizację białka błonowego ze szlakiem endocytarnym. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

figure-results-13
Film 4: Współbarwienie FM 4-64 Gpr1-GFP. Jednoczesne barwienie T. atrowirydu eksprymującego Gpr1-mEGFP (kolor zielony) z 1,67 μM FM 4-64 (kolor czerwony) ujawnia nakładającą się i wyraźną lokalizację białka błonowego ze szlakiem endocytarnym. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

figure-results-14
Film 5: Współbarwienie FM 4-64 BUD-6-GFP. (5a) Współbarwienie N. crassa eksprymującego BUD-6-GFP (kolor zielony) za pomocą 2 μM FM 4-64 (kolor czerwony) umożliwia śledzenie dynamiki BUD-6 podczas tworzenia przegrody w stosunku do powiązanej intruzji błony komórkowej. (5b) Przycięty i scalony obraz (5a). Kliknij tutaj, aby pobrać film 5a
Kliknij tutaj, aby pobrać film 5b.

figure-results-15
Film 6: Monitorowanie biosyntezy ściany komórkowej w czasie rzeczywistym. Zarodki N. crassa wyrażające MAK-1-GFP (zielony) były barwione współczynnikiem 0,12 μM CFW (niebieskim), aby ujawnić zlokalizowaną biogenezę ściany komórkowej podczas fuzji zarodków za pośrednictwem CAT. Należy zauważyć, że występuje pewne przebijanie sygnału CFW do kanałów GFP, co ilustruje, że SPF lub CR są lepszym wyborem jako sekwencyjne i jednoczesne barwniki do wspólnego obrazowania dla GFP, odpowiednio. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Tabela 1: Właściwości selektywnych barwników fluorescencyjnych membranowych i ścian komórkowych. * = wartości mg/ml skorygowane o obniżoną czystość/zawartość barwnika w celu uzyskania równowagi we wszystkich roztworach; n.i.a. = brak dostępnych informacji. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Artykuł ten jest kontynuacją przełomowych prac, które ustaliły zastosowanie różnych barwników fluorescencyjnych jako ważnych markerów organelli dla grzybów strzępkowychna początku lat 2000 2,4,43 i próbują omówić fotofizyczne i biologiczne właściwości komórek barwników FM i wybranych barwników ściany komórkowej bardziej szczegółowo niż wcześniej. Zwłaszcza w odniesieniu do niepożądanych efektów komórkowych, takich jak nasycenie błony lub uszkodzenie ściany komórkowej, które występują powyżej pewnych stężeń barwnika. To, co wcześniej było uważane za nietoksyczne na poziomie komórkowym, teraz jest uważane za toksyczne na poziomie molekularnym. Nawet jeśli efekty te mogą być bardzo subtelne i nie są bezpośrednio widoczne w oczywistych zmianach w zachowaniu organelli lub komórek, wszelkie możliwe zakłócenia w stosowaniu barwnika inne niż wizualizacja muszą być zminimalizowane w celu zbadania natywnej funkcji molekularnej. Na szczęście zwiększona czułość i wydajność kwantowa nowoczesnych detektorów, takich jak detektory fotodiod lawinowych krzemowych (Si-APD)44 czy detektor obszarowy Airyscan45, ułatwiają stosowanie jeszcze mniejszych ilości barwnika niż dotychczas. Kolejnym kluczowym celem artykułu jest zilustrowanie właściwości współobrazowania tych barwników z innymi fluoroforami, a przede wszystkim z GFP jako najczęściej stosowanym białkiem fluorescencyjnym w biologii. Powinno to pomóc w projektowaniu eksperymentów obrazowych, które mają na celu skorelowanie dynamiki lokalizacji subkomórkowej białek fuzyjnych z dynamiką ściany komórkowej grzyba, błony komórkowej lub szlaku endo- i egzocytozy itp.

Obrazowanie w naturalnych i bezstresowych warunkach jest kluczem do uzyskania wiarygodnych danych. Niektóre praktyczne rozważania dotyczące pożywki hodowlanej i przygotowania próbki mają na celu zapewnienie punktu wyjścia do znalezienia optymalnych warunków, które umożliwią wolną od artefaktów, długotrwałą obserwację zdrowych, niezestresowanych komórek o najwyższym możliwym stosunku S/N dla danej próbki. Nie ma uniwersalnego sposobu na uzyskanie wiarygodnych i miarodajnych wyników obrazowania. Nieodłącznym elementem tego podejścia jest to, że biologiczna zmienność próbki, subiektywność i oczekiwania mikroskopisty, a także przetwarzanie obrazu po przetworzeniu mają znaczący wpływ odpowiednio na pozyskiwanie i interpretację danych. W związku z tym praktyczne doświadczenie mikroskopisty, jego/jej dogłębna wiedza na temat biologii komórki badanego grzyba, a także umiejętne przygotowanie próbki w celu stworzenia warunków jak najbardziej "naturalnych" i niezakłóconych w warunkach laboratoryjnych, mają zasadnicze znaczenie dla uzyskania i oceny danych obrazowych, które wiernie odzwierciedlają badane zjawiska komórkowe. Z reguły występowaniu niepożądanych skutków ubocznych barwników fluorescencyjnych, począwszy od subtelnej, a zatem nie widocznej w oczywisty sposób aktywacji szlaków reakcji na stres błony komórkowej lub ściany komórkowej, aż po prostą cytotoksyczną indukcję autolizy komórek, można bezpiecznie zapobiec tylko poprzez zastosowanie niskich stężeń barwnika ≤2 μM.

Aplikacja barwników fluorescencyjnych jest prosta, jednak ich specyfika jest słabo scharakteryzowana. Kluczową zaletą stosowania barwników fluorescencyjnych jest przygotowawcza prostota protokołów eksperymentalnych. Uprawa i pobieranie próbek grzyba, dodawanie barwnika (barwników) i montaż na stoliku mikroskopowym są (przy wprawie) proste. Regulacja podstawowych ustawień obrazowania, w tym długości fal wzbudzenia i emisji, czasów naświetlania, ustawień przebiegu czasowego itp., odbywa się zgodnie z prostymi zasadami biofizyki mikroskopu i zasadami biologicznymi stosowanych barwników fluorescencyjnych wewnątrz komórek. Tabela 1 ma na celu ułatwienie identyfikacji najodpowiedniejszego barwnika lub kombinacji barwników do celów doświadczalnych. Co więcej, barwniki fluorescencyjne są przystępne cenowo, łatwo dostępne i zapewniają niezawodnie wysoką jakość, a tym samym zapewniają wysoce powtarzalną aplikację.

Dwa główne ograniczenia stosowania barwników fluorescencyjnych selektywnych dla błony lub ściany komórkowej to (często) ograniczona wiedza na temat ich precyzyjnych właściwości barwiących, które w większości przypadków są niespecyficzne na poziomie organelli i molekularnym, oraz ich zależne od stężenia niepożądane skutki uboczne. Barwniki FM są specyficzne dla dwuwarstw lipidowych uczestniczących w endo- i egzocytozie. Jednak dokładne znakowanie organelli subkomórkowych w badanych warunkach nie jest od razu oczywiste i wymaga porównania różnych wariantów barwnika FM oraz wspólnego znakowania z dodatkowymi markerami specyficznymi dla organelli. Jednym z przykładów jest preferencja FM 1-43 dla błon mitochondrialnych w porównaniu do FM 4-64. Barwniki selektywne w ścianie komórkowej wykazują różną specyficzność dla trzech głównych polimerów ściany komórkowej grzyba. Uważa się, że CFW jest niespecyficznym barwnikiem dla β-glukanów i chityny, SPF jest uważany za najbardziej selektywny dla β-1,4-glukanów, a CR jest uważany za wysoce selektywny dla α- i β-chityny. Informacje na temat swoistości wiązania PFS z polisacharydami ściany komórkowej grzybów nie są obecnie dostępne. W jakim stosunku polimer ściany komórkowej grzyba jest najskuteczniej znakowany przy danym stężeniu barwnika w badanych gatunkach grzybów, nie jest łatwo odpowiedzieć, a zastosowanie szczegółowych pomiarów uzyskanych in vitro lub in vivo na innych organizmach lub innych gatunkach grzybów musi być bardzo dokładnie przemyślane. Niestety, informacje te są skąpe i mocno rozproszone w literaturze 35,42,46. Nowsze zapisy, które byłyby zgodne z poprzednimi badaniami33, aby dostarczyć nowych informacji na temat precyzyjnych właściwości barwiących prezentowanych barwników, szczególnie w grzybach, nie są obecnie dostępne.

Kontrole obrazowania są niezbędne do dokładnej oceny wzorców barwienia i odpowiedzi komórkowych. Prawdopodobnie najtrudniejszą częścią jest jednak poznanie biologii komórki grzyba tak dobrze, że zarejestrowane zmiany w subkomórkowej lokalizacji selektywnych barwników fluorescencyjnych błony i ściany komórkowej, zmiany w architekturze komórkowej lub wzorzec wzrostu strzępek mogą być wyłącznie i pewnie powiązane z zamierzonymi efektami eksperymentalnego leczenia. W tym celu ważne jest, aby mieć dobre kontrole wraz z każdym nowym eksperymentem z obrazowaniem żywych komórek. Obejmują one nieleczony typ dziki jako negatywną kontrolę obrazowania w celu wykluczenia autofluorescencji tła i szumu detektora z uzyskanego obrazu oraz posiadania komparatora morfologicznego podczas pracy z mutantami. Ponadto pozytywna kontrola obrazowania, na przykład szczepu, który wykazuje ekspresję GFP lub RFP w cytoplazmie lub innym dobrze znanym białku markera fluorescencyjnego, jest niezbędna do ustawienia intensywności światła wzbudzającego na wymagane minimum i kontroli żywotności komórek. Po ustawieniu tych kontroli, stosowanie barwników fluorescencyjnych nie ogranicza się tylko do zadań wizualizacji, ale ich zależna od stężenia dynamika barwienia, a także skutki uboczne zależne od stężenia mogą być analitycznie wykorzystane; Na przykład do ilościowego monitorowania biosyntezy ściany komórkowej w czasie rzeczywistym lub do identyfikacji fenotypów specyficznych dla mutantów w testach wrażliwości47.

Ulepszone przyszłe zastosowania zależą od szczegółowych analiz funkcjonalnych właściwości barwienia barwnikiem. Głównym bieżącym wyzwaniem jest dalsze ulepszanie i automatyzacja ilościowych analiz obrazów w celu przyspieszenia funkcjonalnej oceny subkomórkowej dynamiki selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ściennych w grzybach strzępkowych. W tym celu najpierw wymagane są szeroko zakrojone, ilościowe badania kolokalizacyjne tych barwników ze znanymi markerami polimerowymi organelli i ścian komórkowych w połączeniu ze zmutowanymi szczepami z niedoborem określonych szlaków transportowych lub pozbawionymi określonych składników strukturalnych. Dostępnych jest kilka markerów endocytozy do analiz porównawczych z barwnikami FM48,49, a w odniesieniu do wciąż słabo scharakteryzowanej specyficzności wiązania barwników ściany komórkowej u grzybów, zastosowanie znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał specyficznych dla glukanu50 może stanowić jedną z możliwości rozwiązania tego problemu.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych i nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podziękowania należą się Tyrolskiemu Funduszowi Naukowemu (TWF) za udzielenie grantu #256524 dla AL, Wiedeńskiemu Funduszowi Nauki i Technologii (WWTF) za udzielenie grantu #LS13-086 dla SZ oraz Funduszowi Publikacji Uniwersytetu w Innsbrucku za wsparcie publikacji w otwartym dostępie. Autorzy dziękują również Wydziałowi Zoologii Uniwersytetu w Innsbrucku za udostępnienie konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego Leica TCS SP5 II.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Komora zliczania komórekmarki MerckBR718005format
Thoma Calcofluor White M2RMerck/Sigma-AldrichF3543barwnik ściany komórkowej
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WINikonMRD07602cel zanurzenia w wodzie
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WINikonMRD07602cel do zanurzenia w wodzie
Kongo CzerwonyMerck/ Sigma-AldrichC6277barwnik ściany komórkowej
DimetylosulfotlenekVWR8,36,73,230rozpuszczalnik organiczny
Eclipse TE2000-E z jednostką skanującą C1Niestandardowa konfiguracjaNikon odwrócony laserowy skaningowy mikroskop konfokalny używany do pozyskiwania przykładowych danych 2 i 4
Eclipse TE2000-U z jednostką skanującą Bio-Rad Radiance 2100Niestandardowa konfiguracjaNikonodwrócony laserowy skaningowy mikroskop konfokalny służący do pozyskiwania przykładowych danych 5
FM 1-43Barwnik membranowyMerck/Sigma-AldrichS6814
FM 4-64Barwnik membranowyMerck/Sigma-AldrichS6689
Koraliki szklaneRettberg1340691030mm Koraliki
szklane Nakrywki szklaneThermo Fisher ScientificBB02400600A113MNT024 x 60 #1 szkiełka nakrywkowe
HCX PL APO 63x/1.3 NA GlycLeica15506353Glycerol Obiektyw immersyjny
LSM 510 MetaZeissniestandardowa konfiguracjaodwrócony laserowy skaningowy mikroskop konfokalny używany do pozyskiwania przykładowych danych 3
M9 Minimalny średniMerck/Sigma-AldrichM6030generyczne podłoże do wzrostu grzybów
Micro-slide 8-dołkowyibidi80826polimer ibiTreat #1.5 szkiełko nakrywkowe
MiraclothMerck/Millipore475855-1Rpoliestrowy materiał filtracyjny
szalka PetriegoSarstedt8,21,47292 x 16 mm naczynie hodowlane bez krzywek
PhytagelMerck/Sigma-AldrichP8169przezroczysty środek żelujący
Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DICZeiss440762-9904-000obiektyw
zanurzeniowy w olejuPontamine Fast Scarlet 4BMerck/Sigma-Aldrich212490barwnik do ścian komórkowych
Agar z dekstrozą ziemniaczaną (PDA)BD Difco213400pożywka do wzrostu grzybów T. atroviride
Bulion z dekstrozy ziemniaczanej (PDB)BD Difco254920pożywka do wzrostu grzybów T. atroviride
Probówka reakcyjnaSarstedt72,7061,5 ml probówka SafeSeal
SkalpelB.Braun5518016Cutfix sterylny skalpel #23
Rurka z nakrętkąSarstedt6,25,54,50215 ml probówka polipropylenowa
Solophenyl Flavine 7GFE 500CIBA1485385V6do ścian komórkowych
SynaptoGreen C4Biotum70020membranowy
SynaptoRed C2Biotum70021membranowy
Filtr membranowy strzykawkowyThermo Fisher Scientific723-99450,45 &mikro; m Filtr strzykawkowy SFCA
TCS SP5 IINiestandardowa konfiguracjaodwróconego laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego Leica służącego do pozyskiwania przykładowych danych 1
Pożywka Vogel's Minimal Medium (VMM)FGSCFungal Genetics Stock Centredla N. crassa
3 barwnik barwnik barwnik

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Read, N. D., Fischer, S., Parton, R. M. Imaging Spitzenkörper, pH and calcium dynamics in growing fungal hyphae. Pesticide Science. 54 (2), 179-181 (1998).
  2. Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell imaging of filamentous fungi using vital fluorescent dyes and confocal microscopy. Microbial Imaging. , Elsevier. 63-87 (2004).
  3. Jelínková, A., et al. Probing plant membranes with FM dyes: tracking, dragging or blocking. The Plant Journal. 61 (5), 883-892 (2010).
  4. Fischer-Parton, S., et al. Confocal microscopy of FM4-64 as a tool for analysing endocytosis and vesicle trafficking in living fungal hyphae. Journal of Microscopy. 198 (3), 246-259 (2000).
  5. Harris, S. D. Branching of fungal hyphae: regulation, mechanisms and comparison with other branching systems. Mycologia. 100 (6), 823-832 (2008).
  6. Roca, M. G., Arlt, J., Jeffree, C. E., Read, N. D. Cell biology of conidial anastomosis tubes in Neurospora crassa. Eukaryotic Cell. 4 (5), 911-919 (2005).
  7. Becker, Y., et al. The fungal cell-wall integrity MAPK cascade is crucial for hyphal network formation and maintenance of restrictive growth of Epichloë festucae in symbiosis with Lolium perenne. Molecular Plant-Microbe Interactions. 28 (1), 69-85 (2015).
  8. Justa-Schuch, D., Heilig, Y., Richthammer, C., Seiler, S. Septum formation is regulated by the RHO4-specific exchange factors BUD3 and RGF3 and by the landmark protein BUD4 in Neurospora crassa. Molecular Microbiology. 76 (1), 220-235 (2010).
  9. Atanasova, L., et al. The Gpr1-regulated Sur7 family protein Sfp2 is required for hyphal growth and cell wall stability in the mycoparasite Trichoderma atroviride. Scientific Reports. 8 (1), 12064(2018).
  10. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 12 (2), 363-375 (1992).
  11. Wu, Y., Yeh, F. L., Mao, F., Chapman, E. R. Biophysical characterization of styryl dye-membrane interactions. Biophysical Journal. 97 (1), 101-109 (2009).
  12. Betz, W. J., Mao, F., B, S. C. Imaging exocytosis and endocytosis. Current Opinion in Neurobiology. 6, 365-371 (1996).
  13. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 77-83 (2012).
  14. Bolte, S., et al. FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells. Journal of Microscopy. 214, Pt 2 159-173 (2004).
  15. Riquelme, M., et al. Spitzenkorper localization and intracellular traffic of green fluorescent protein-labeled CHS-3 and CHS-6 chitin synthases in living hyphae of Neurospora crassa. Eukayotic Cell. 6 (10), 1853-1864 (2007).
  16. Lichius, A., Yáñez-Gutiérrez, M. E., Read, N. D., Castro-Longoria, E. Comparative live-cell imaging analyses of SPA-2, BUD-6 and BNI-1 in Neurospora crassa reveal novel features of the filamentous fungal polarisome. PloS one. 7 (1), 30372(2012).
  17. Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
  18. Dijksterhuis, J., Molenaar, D. Vesicle trafficking via the Spitzenkörper during hyphal tip growth in Rhizoctonia solani. Antonie van Leeuwenhoek. 103 (4), 921-931 (2013).
  19. Hickey, P. C., Read, N. D. Imaging living cells of Aspergillus in vitro. Medical Mycology. 47, 110-119 (2009).
  20. Delgado-Álvarez, D. L., Bartnicki-García, S., Seiler, S., Mouriño-Pérez, R. R. Septum development in Neurospora crassa: the septal actomyosin tangle. PLoS One. 9 (5), 96744(2014).
  21. Hageage, G. J., Harrington, B. J. Use of Calcofluor White in clinical mycology. Laboratory Medicine. 15 (2), 109-112 (1984).
  22. Monheit, J. E., Cowan, D. F., Moore, D. G. Rapid detection of fungi in tissues using Calcofluor White and fluorescence microscopy. Archives of Pathology and Laboratory. 108 (8), 616-618 (1984).
  23. Herth, W., Schnepf, E. The fluorochrome Calcofluor White binds oriented to structural polysaccharide fibrils. Protoplasma. 105 (1-2), 129-133 (1980).
  24. Elorza, M. V., Rico, H., Sentandreu, R. Calcofluor White alters the assembly of chitin fibrils in Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans cells. Journal of General Microbiology. 129 (5), 1577-1582 (1983).
  25. Lagorce, A., et al. Genome-wide analysis of the response to cell wall mutations in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 20345-20357 (2003).
  26. Sanz, A. B., García, R., Rodríguez-Peña, J. M., Arroyo, J. The CWI Pathway: regulation of the transcriptional adaptive response to cell wall stress in yeast. Journal of Fungi. 4 (1), (2017).
  27. Slifkin, M., Cumbie, R. Congo Red as a fluorochrome for the rapid detection of fungi. Journal of Clinical Microbiology. 26 (5), 827-830 (1988).
  28. Michels, J., Büntzow, M. Assessment of Congo Red as a fluorescence marker for the exoskeleton of small crustaceans and the cuticle of polychaetes. Journal of Microscopy. 238 (2), 95-101 (2010).
  29. Pancaldi, S., Poli, F., Dall'Olio, G., Vannini, G. L. Morphological anomalies induced by Congo Red in Aspergillus niger. Archives of Microbiology. 137 (3), 185-187 (1984).
  30. Roncero, C., Durán, A. Effect of Calcofluor White and Congo Red on fungal cell wall morphogenesis: in vivo activation of chitin polymerization. Journal of Bacteriology. 163 (3), 1180-1185 (1985).
  31. Kopeck, M., Gabriel, M. The influence of Congo Red on the cell wall and (1,3)- β-d-glucan microfibril biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Archives of Microbiology. 158 (2), 115-126 (1992).
  32. Heilmann, C. J., et al. Surface stress induces a conserved cell wall stress response in the pathogenic fungus Candida albicans. Eukayotic Cell. 12 (2), 254-264 (2013).
  33. Hoch, H. C., Galvani, C. D., Szarowski, D. H., Turner, J. N. Two new fluorescent dyes applicable for visualization of fungal cell walls. Mycologia. 97 (3), 580-588 (2005).
  34. Liesche, J., Ziomkiewicz, I., Schulz, A. Super-resolution imaging with Pontamine Fast Scarlet 4BS enables direct visualization of cellulose orientation and cell connection architecture in onion epidermis cells. BMC Plant Biology. 13, 226(2013).
  35. Ursache, R., Andersen, T. G., Marhavý, P., Geldner, N. A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components. The Plant Journal. 93 (2), 399-412 (2018).
  36. Knight, N. L., Sutherland, M. W. A rapid differential staining technique for Fusarium pseudograminearum in cereal tissues during crown rot infections. Plant Pathology. 60 (6), 1140-1143 (2011).
  37. Fajardo-Somera, R. A., et al. Dissecting the function of the different chitin synthases in vegetative growth and sexual development in Neurospora crassa. Fungal Genetics and Biology. 75, 30-45 (2015).
  38. Lichius, A. Cell Fusion in Neurospora crassa. , The University of Edinburgh. Edinburgh (UK). Doctor of Philosophy (Ph.D.) (2010).
  39. Chen, W., Li, W., Dong, X., Pei, J. A Review of Biological Image Analysis. Current Bioinformatisc. 13 (4), 337-343 (2018).
  40. Live cell imaging: A laboratory manual. Goldman, R. D., Swedlow, J., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2010).
  41. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature methods. 9 (7), 697-710 (2012).
  42. Zemanek, G., Jagusiak, A., Chłopaś, K., Piekarska, B., Stopa, B. Congo Red fluorescence upon binding to macromolecules - a possible explanation for the enhanced intensity. Bio-Algorithms and Med-Systems. 13 (2), 1187(2017).
  43. Hickey, P. C., Jacobson, D. J., Read, N. D., Louise Glass, N. Live-cell imaging of vegetative hyphal fusion in Neurospora crassa. Fungal Genetics and Biology. 37 (1), 109-119 (2002).
  44. Hamamatsu Si APD - high sensitivity photodiodes having an internal gain mechanism: Avalanche photodiode selection guide 2019. , Available from: https://www.hamamatsu.com/resources/pdf/ssd/si_apd_kapd0001e.pdf (2019).
  45. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, 1205(2015).
  46. Thomas, J., Idris, N. A., Collings, D. A. Pontamine Fast Scarlet 4B bifluorescence and measurements of cellulose microfibril angles. Journal of Microscopy. 268 (1), 13-27 (2017).
  47. Ram, A. F. J., Klis, F. M. Identification of fungal cell wall mutants using susceptibility assays based on Calcofluor White and Congo Red. Nature Protocols. 1 (5), 2253-2256 (2006).
  48. Toshima, J. Y., et al. Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives. Proceedings of the National Academy of Science of the USA. 103 (15), 5793-5798 (2006).
  49. Kilaru, S., Schuster, M., Latz, M., Guo, M., Steinberg, G. Fluorescent markers of the endocytic pathway in Zymoseptoria tritici. Fungal Genetics and Biology. 79, 150-157 (2015).
  50. Fu, C., Tanaka, A., Free, S. J. Neurospora crassa 1,3-α-glucan synthase, AGS-1, is required for cell wall biosynthesis during macroconidia development. Microbiology. 160, Pt 8 1618-1627 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescent DyesLive Cell ImagingFilamentous FungiMembrane StainingCell Wall StainingFM 1 43FM 4 64Calcofluor WhiteCongo RedOrganelle Dynamics

Related Articles