Artykuł metodologiczny

Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ścian komórkowych do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych

24.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60613

⸱

28 listopada 2019

 , 
1Department of Microbiology, University of Innsbruck

W tym artykule

Podsumowanie

Niezbędne barwniki fluorescencyjne są niezbędnymi narzędziami do analiz obrazowania żywych komórek w nowoczesnej biologii komórek grzybów. W artykule szczegółowo opisano zastosowanie znanych i mniej znanych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamiki błony plazmatycznej, endo-/egzocytozy i morfogenezy ściany komórkowej u grzybów strzępkowych.

Streszczenie

Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych do analiz obrazowania żywych komórek dynamiki organelli w komórkach grzybów rozpoczęło się dwie dekady temu i od tego czasu nadal przyczynia się w znacznym stopniu do naszego zrozumienia stylu życia grzybów nitkowatych. Niniejszy artykuł zawiera praktyczny przewodnik dotyczący stosowania dwóch barwników membranowych FM 1-43 i FM 4-64 oraz czterech barwników ściany komórkowej: Calcofluor White M2R, Solophenyl Flavine 7GFE 500, Pontamine Fast Scarlet 48 i Congo Red. Nacisk kładziony jest na ich zastosowanie w niskich dawkach w celu zapewnienia barwienia wolnego od artefaktów, ich właściwości współobrazowania i oceny ilościowej. Przedstawione metody mają zastosowanie do wszystkich próbek grzybów nitkowatych, które można przygotować w opisany sposób. Podstawowe podejścia do barwienia mogą służyć jako punkty wyjścia do adaptacji do gatunków, które mogą wymagać różnych warunków uprawy. Po pierwsze, dokonuje się przeglądu właściwości biofizycznych i biochemicznych, ponieważ ich zrozumienie jest niezbędne do stosowania tych barwników jako naprawdę ważnych barwników fluorescencyjnych. Po drugie, przedstawiono protokoły krok po kroku, które szczegółowo opisują przygotowanie różnych typów próbek grzybów do obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek. Wreszcie, przykładowe eksperymenty ilustrują różne podejścia do: (1) identyfikacji defektów w czasoprzestrzennej organizacji endocytozy w mutantach genetycznych, (2) porównawczego scharakteryzowania wspólnej i odrębnej kolokalizacji białek docelowych znakowanych GFP w szlaku endocytarnym, (3) identyfikacji morfogenetycznych defektów ściany komórkowej w mutancie genetycznej oraz (4) monitorowania biogenezy ściany komórkowej w czasie rzeczywistym.

Wprowadzenie

Dwadzieścia lat temu, sposób, w jaki morfogeneza strzępek i leżąca u jej podstaw molekularna biologia komórki mogły być wizualizowane u grzybów strzępkowych, został zrewolucjonizowany przez zastosowanie membranowego selektywnego barwnika fluorescencyjnego Fei Mao FM 4-641. Później zrealizowano korzyści płynące z barwnika wiążącego chitynę Calcofluor White jako istotnego markera fluorescencyjnego dynamiki ściany komórkowej grzyba2. Od tego czasu zarówno barwniki, jak i ich warianty stały się nieodłączną częścią analiz obrazowania żywych komórek dynamiki organelli u grzybów i nadal dostarczają bezprecedensowych informacji na temat stylu życia grzybów nitkowatych. W artykule szczegółowo opisano zastosowanie uznanych i mniej znanych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamiki błony plazmatycznej, endo- i egzocytozy oraz morfogenezy ściany komórkowej u grzybów strzępkowych. Testy śledzenia endocytozy pozwalają na odniesienie się do różnych pytań biologicznych związanych z ogólnym badaniem endocytozy3. W tym celu lokalizacja, szybkość i następstwo barwionych komór po dodaniu barwnika FM są rejestrowane za pomocą mikroskopii poklatkowej i ilościowo porównywane między badanymi szczepami grzybów4. Barwniki ściany komórkowej wyznaczają zewnętrzną granicę komórki i umożliwiają śledzenie zdarzeń morfogenetycznych, w tym spolaryzowanego wzrostu końcówki strzępki2, rozgałęzianie strzępek5, fuzja strzępek6,7 i tworzenie przegrody8. Ponadto ułatwiają ilościowe określanie miejscowego odkładania się ściany komórkowej i identyfikację defektów podczas biogenezy ściany komórkowej9. Ponieważ szczegółowa wiedza na temat właściwości biochemicznych i biofizycznych każdego markera fluorescencyjnego jest podstawowym warunkiem wstępnym jego udanego zastosowania in vivo, cechy te zostały najpierw podsumowane dla sześciu barwników przedstawionych w tym artykule.

Barwniki selektywne membranowe
Barwniki styrylowe FM (Fei Mao) to małe amfifilowe cząsteczki, które nie mogą przejść, ale odwracalnie łączą się z zewnętrzną ulotką dwuwarstwy lipidowej błon biologicznych10. Są praktycznie niefluorescencyjne w roztworze wodnym, ale stają się intensywnie fluorescencyjne po integracji z błoną plazmatyczną, generując doskonałe proporcje sygnału do szumu (S/N)11. Te właściwości sprawiają, że idealnie nadają się do wizualizacji dynamiki błony plazmatycznej i organelli wewnątrzkomórkowych, w tym śledzenia endo- i egzocytozy12. Zielono-fluorescencyjny FM 1-43 i czerwony-fluorescencyjny FM 4-64 to dwa najczęściej stosowane fluorescencyjne markery membranowe do tych celów. SynaptoGreen C4 i SynaptoRed C2 to generyczne cząsteczki od alternatywnych dostawców, które mogą być stosowane zamiennie zamiast odpowiednio FM 1-43 i FM 4-64.

Barwniki styrylowe składają się z trzech kluczowych obszarów strukturalnych: (1) lipofilowego ogona, który ułatwia wprowadzenie barwnika do dwuwarstwy lipidowej, (2) rdzenia fluoroforowego, który określa właściwości spektralne barwnika i składa się z dwóch pierścieni aromatycznych połączonych jednym do trzech podwójnych wiązań, oraz (3) dodatnio naładowanej hydrofilowej głowicy, która zapobiega całkowitemu wprowadzeniu i przenikaniu barwnika przez membranę (Rysunek 1A).

Im dłuższy lipofilowy ogon, tym wyższa jest hydrofobowość barwnika, a tym samym powinowactwo wiązania z membraną, ale tym niższa jest jego rozpuszczalność w wodzie i szybkość odbarwiania membrany. W związku z tym różne warianty barwnika FM dają różną dynamikę i wzory barwienia. Wyższa hydrofobowość FM 1-43 z ogonem C4 zapewnia silniejszy i bardziej stabilny sygnał fluorescencyjny na błonach plazmatycznych i organellach wewnętrznych szybciej niż krótszy FM 4-64 z ogonem C2, gdy jest stosowany w stężeniach równomolowych (Rysunek 2).

Co ważne, stałe i wysokie wskaźniki asocjacji/dysocjacji obu 11 ze średnimi czasami retencji 1–6 s na pojedynczą cząsteczkę barwnika13 zmniejszają ryzyko miejscowego zakłócenia funkcji błony, na przykład poprzez modyfikację płynności błony lub wymuszoną stałą interakcję białek błonowych. Jest to prawdopodobnie główny powód, dla którego cząsteczki te mogą być używane jako niezbędne barwniki. Niemniej jednak stężenia barwnika FM powyżej 50 μM są toksyczne dla komórek grzybów i roślin2,14, a dowody z protoplastów tytoniu BY-2 wskazują, że więcej niż 20 μM barwnika FM prowadzi do nasycenia błony plazmatycznej14. Dlatego zaleca się, aby nie przekraczać tego limitu, zwłaszcza biorąc pod uwagę fakt, że doskonałe obrazowanie osiągnięto już przy 2–5 μM15,16.

Warto zauważyć, że właściwości spektralne barwników FM różnią się znacznie w zależności od konkretnego mikrośrodowiska membrany (reviewed14). Ogólnie rzecz biorąc, widma wzbudzenia i emisji barwników FM w czystych roztworach rozpuszczalników (zwykle podawane w informacjach o produkcie) różnią się znacznie od widm w środowiskach komórkowych i w większości przypadków nie można się bezpośrednio konsultować przy wyborze ustawień obrazowania żywych komórek. Na przykład maksima wzbudzenia/emisji FM 1-43 i FM 4-64 ulegają przesunięciu ku błękitowi odpowiednio o 37/46 nm i 43/64 nm po związaniu z błonami grzybowymi w porównaniu z ich roztworami w metanolu (tabela 1).

Przełomowe podstawy użycia FM 4-64 i FM 1-43 do śledzenia błony komórkowej, endo/egzocytozy i dynamiki organelli, w tym Spitzenkörpera i mitochondriów, zostały już kompleksowo udokumentowane dla szerokiej gamy nitkowatych gatunków grzybów2,4,17,18,19. Zalecane ustawienia obrazowania dla obu barwników FM, które działają w różnych gatunkach grzybów nitkowatych, przedstawiono na stronie Rysunek 1B. Ograniczenia techniczne dostępnego sprzętu lub szczególne warunki komórkowe i eksperymentalne, takie jak pożywka hodowlana, pH lub temperatura, mogą jednak wymagać pewnych dostosowań. Na szczęście barwniki FM działają w szerokim zakresie spektralnym, a bardzo dobre wyniki obrazowania osiąga ekscytujący FM 1-43 o długości fali 514 nm lub FM 4-64 o długości fali 488 nm. W związku z tym optymalne ustawienia obrazowania muszą być określane indywidualnie dla każdego typu próbki i zamierzonego zastosowania.

Znaczne przesunięcie Stoke'a o ponad 135 nm FM 4-64 pozwala na doskonałe, jednoczesne obrazowanie z fluoroforami emitującymi zielone światło; jest to często wykorzystywane do oceny wewnątrzkomórkowej dynamiki lokalizacji białek fuzyjnych znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) względem błony plazmatycznej i szlaku endocytarnego9,20.

Barwniki selektywne dla ścian komórkowych
Calcofluor White M2R (CFW), sprzedawany również jako Fluorescencyjny Rozjaśniacz 28, jest prawdopodobnie najbardziej znanym barwnikiem fluorescencyjnym używanym do barwienia ścian komórkowych bakterii, grzybów, glonów, roślin wyższych i owadów. Początkowo stosowany jako optyczny środek wybielający w przemyśle papierniczym, tekstylnym i detergentowym, jego korzyści dla klinicznej diagnostyki infekcji grzybiczych zostały wcześnie dostrzeżone21,22. Ponieważ CFW nieodwracalnie interkaluje się w powstający łańcuch chitynowy, zakłóca normalne składanie mikrofibryli chityny podczas biogenezy ściany komórkowej, generując w ten sposób stres w ścianie komórkowej23. To z kolei uruchamia mechanizm naprawy uszkodzeń ściany komórkowej, prowadzący do miejscowo zwiększonego odkładania się ściany komórkowej w wyniku aktywacji glukanu i syntazy chityny24,25. Zjawisko to może wystąpić w przypadku każdego barwnika, który działa poprzez stabilne wiązanie się z polimerami ściany komórkowej, jest zależny od stężenia i jest najbardziej zauważalny na końcach strzępek, które reprezentują najbardziej płodnie rosnące, a tym samym najbardziej wrażliwe części grzybni (Rysunek 3). Niedawno udostępniono obszerne podsumowanie maszynerii molekularnej, która reaguje na uszkodzenia ściany komórkowej26.

Przedawkowanie barwnika w połączeniu z fototoksycznością może prowadzić do szybkiej lizy komórek w przedziałach strzępkowych (Film 1). Niemniej jednak, zwiększona wrażliwość na stężenia barwnika, które są "niezbędne" u typu dzikiego, może być wykorzystana do identyfikacji defektów w biosyntezie ściany komórkowej mutantów z utratą funkcji genów9. Dla CFW i czerwieni Kongo (CR), innego barwnika tekstylnego, znanego również jako czerwień bezpośrednia 28 i stosowanego jako barwnik ściany komórkowej specyficzny dla α i β-chityny dla grzybów i owadów27,28, stężenia progowe, które silnie indukują syntazy chityny, określono odpowiednio za pomocą > 60 μM CFW i > 70 μM CR, podczas gdy stężenia <15 μM żadnego barwnika nie zmieniały ani nie hamowały wzrostu grzybów29,30,31. Hickey i wsp. umieścili to stężenie progowe dla CFW na poziomie 25 μM2. Dlatego zaleca się stosowanie stężeń barwników ≤ 5 μM, aby wykluczyć artefakty związane ze stresem i zapewnić użycie tych cząsteczek jako naprawdę "niezbędnych barwników fluorescencyjnych"2,32. Dotyczy to w równym stopniu Solophenyl Flavine 7GFE 500 (SPF) i Pontamine Fast Scarlet 4B (PFS), synonimów odpowiednio Direct Yellow 86 i Direct Red 23, dwóch innych użytecznych barwników ściany komórkowej, których zastosowanie w przypadku grzybów zostało zgłoszone po raz pierwszy ponad dekadę temu33. Jednak pomimo ich niezwykłych właściwości spektralnych34,35, od tego czasu użycie obu barwników jest bardzo ograniczone36,37. Jak pokazano wcześniej dla 1,5 μM CFW2, 2 μM SPF są wystarczające do rozróżnienia dynamiki ściany komórkowej w warunkach natywnych z bardzo wysoką rozdzielczością czasową (Film 2). Te same wyniki można uzyskać przy użyciu 2 μM CR lub PFS.

Razem, te cztery barwniki, CFW, SPF, PFS i CR, tworzą zestaw selektywnych dla ściany komórkowej markerów fluorescencyjnych, które pokrywają prawie pełne spektrum światła widzialnego (400-700 nm) używane w nowoczesnych mikroskopach fluorescencyjnych (Rysunek 4). Znaczny wzrost intensywności fluorescencji po związaniu się z polimerami ściany komórkowej jest nieodłączny dla wszystkich czterech i generuje doskonałe proporcje S/N. To z kolei pozwala na utrzymanie bardzo niskich stężeń barwnika i intensywności światła wzbudzającego oraz pozwala na barwienie ścian komórkowych jako technikę obrazowania żywych komórek w "niskiej dawce"2. Ponieważ te barwniki ściany komórkowej są nieprzepuszczalne dla błony plazmatycznej, jednocześnie działają jako żywe/martwe plamy. Warto zauważyć, że ze względu na ich niezwykle szerokie widma emisyjne światła, należy dokładnie rozważyć pewne ograniczenia dotyczące właściwości współobrazowania CFW i SPF z innymi fluoroforami.

Protokół

1. Przygotowanie próbek grzybów

  1. Wstępne kultury grzybów
    1. Zaszczepić pożądany szczep na odpowiednim stałym podłożu agarowym, takim jak agar z dekstrozą ziemniaczaną (PDA) w przypadku Trichoderma atroviride lub Vogel's Minimal Medium (VMM) w przypadku Neurospora crassa. Dodaj odpowiedni znacznik wyboru podczas pracy z odkształceniami transformacyjnymi.
    2. Inkubuj kulturę wstępną w optymalnej temperaturze organizmu. Na przykład, T. atroviryd w temperaturze 25 °C i N. crassa w temperaturze 30 °C, oraz 12 godzin/12 godzin cykli światła/ciemności, aż rozwinie się grzybnia zarodnikująca, ale jeszcze nie osiągnęła krawędzi płytki. Na standardowej wielkości szalce Petriego (9,2 cm Ø) T. atroviryd typu dzikiego występuje średnio po 4–6 dniach, podczas gdy dziki typ N. crassa osiąga ten etap średnio po 3–4 dniach.
  2. Uprawa kolonii grzybów
    1. Używając sterylnego skalpela, odetnij mały blok agaru o wymiarach 3 mm x 3 mm przenoszący grzybnię niezarodnikującą z krawędzi kolonii kultury wstępnej.
    2. Umieść blok agaru na środku świeżej, stałej płytki pożywki, aby zaszczepić eksperymentalną kulturę.
    3. Inkubować kulturę doświadczalną zgodnie z etapem rozwoju, który ma być badany. Na przykład T. atroviryd typu dzikiego potrzebuje 20–22 godzin w temperaturze 25 °C w ciemności, aby rozwinąć kolonie o średnicy około 2 cm na PDA, podczas gdy N. crassa typu dzikiego osiąga średnicę kolonii około 4 cm po 14–16 godzinach inkubacji w temperaturze 30 °C w ciemności na VMM.
      UWAGA: Inkubacja w ciemności zapobiega tworzeniu się pigmentów, które mogą wprowadzać autofluorescencję. W celu wyeliminowania fluorescencji tła pożywki z hodowli doświadczalnej, należy zastąpić agar 1,5% w/v przezroczystego środka zestalającego (patrz Tabela Materiałów), a dowolne złożone podłoże określoną pożywką minimalną.
  3. Uprawa stałych kultur kiełkujących
    1. Użyj 5 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej (0,9% w/v NaCl), aby zebrać zarodniki konidialne z płytki przed hodowlą i zebrać powstałą zawiesinę zarodników w probówce z nakrętką o pojemności 15 ml.
    2. Zawiesinę zarodników dobrze wymieszać przez energiczne wirowanie, a następnie przefiltrować ją przez pasek sterylnej tkaniny filtracyjnej o wymiarach 1 cm x 5 cm (patrz Tabela materiałów) lekko włożony do końcówki pipety o pojemności 1 ml (zarówno zmontowanej, jak i wcześniej autoklawowanej) do świeżej sterylnej probówki.
    3. Określić gęstość zarodników za pomocą komory do liczenia komórek i przygotować zawiesinę zarodników 1 x 107 komórek/ml z roztworem soli fizjologicznej.
      UWAGA: Zawiesinę zarodników można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do dwóch tygodni.
    4. Przygotuj szalkę Petriego o standardowej wielkości (Ø 9,2 cm) z 20 ml stałego podłoża i dodaj 15–20 sterylnych szklanych koralików (Ø 3 mm) na wierzch.
    5. Pobrać pipetą 200 μl zawiesiny przetrwalników na pożywkę i równomiernie rozprowadzić komórki na całej płytce, delikatnie wstrząsając. Zbierz szklane koraliki do zlewki z 70% etanolem do ponownego użycia.
    6. Inkubować kulturę doświadczalną zgodnie z etapem rozwoju, który ma być badany. Na przykład dziki typ T. atroviride wymaga 5–6 godzin w temperaturze 25 °C w ciemności, aby rozwinąć kiełki konidialne na PDA, podczas gdy dziki typ N. crassa rozwija kiełki konidialne po 3–4 godzinach inkubacji w temperaturze 30 °C w ciemności na VMM.
      UWAGA: W celu wyeliminowania jakiejkolwiek fluorescencji tła podłoża z hodowli doświadczalnej, należy zastąpić agar przezroczystym środkiem zestalającym o stężeniu 1,5% w/v, a wszelkie złożone podłoża określoną pożywką minimalną.
  4. Uprawa płynnych kultur kiełkujących
    1. Wlać 190 μl płynnej pożywki hodowlanej do każdego dołka 8-dołkowego mikroszkiełka.
    2. Dodać 10 μl roztworu przetrwalników o stężeniu 1 x 107 komórek/ml (przygotowanego w krokach 1.4.1–1.4.3) i wymieszać, delikatnie pipetując kilka razy w górę i w dół. Wynikowa całkowita liczba komórek wynosi 1 x 105 na studzienkę.
    3. Inkubować kulturę doświadczalną zgodnie z etapem rozwoju, który ma być badany. Na przykład dziki typ T. atroviryd wymaga 5–6 godzin w temperaturze 25 °C w ciemności, aby rozwinąć kiełki konidialne w bulionie z dekstrozy ziemniaczanej (PDB), podczas gdy dziki typ N. crassa rozwija kiełki konidialne po 3–4 godzinach inkubacji w temperaturze 30 °C w ciemności w płynnym VMM.

2. Przygotowanie roztworów roboczych barwnika

  1. Aby zagwarantować pełną rozpuszczalność każdego barwnika, należy przygotować 2 mM roztwory podstawowe w dimetylosulfotlenku (DMSO), dodając odpowiednią ilość (patrz dokładna waga w Tabeli 1) do 1 ml 100% DMSO i dobrze wymieszać przez wirowanie.
    UWAGA: Upewnij się, że bierzesz DMSO z butelki z uszczelką przegrodową; Powinien to być klarowny, przezroczysty płyn. W kontakcie z powietrzem DMSO brązowieje - prawdopodobnie z powodu utleniania śladowych zanieczyszczeń - i może negatywnie wpływać na wzrost komórek lub barwienie barwnikiem.
  2. Filtr Wysterylizuj roztwór podstawowy przez filtr membranowy strzykawkowy 0,2 μm do świeżej sterylnej probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml. Aby zminimalizować wybielanie barwnikiem, owiń tubkę folią aluminiową.
    UWAGA: Podstawowy roztwór barwnika można podzielić na mniejsze objętości, aby uniknąć cykli rozmrażania/zamrażania, i przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.
  3. Przygotować 20 μM wodny roztwór roboczy barwnika, rozpuszczając 2 μl roztworu podstawowego barwnika w 198 μl sterylnej wody destylowanej w świeżej sterylnej probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml. Aby zminimalizować wybielanie barwnikiem, owiń tubkę folią aluminiową.
    UWAGA: Roztwór roboczy barwnika powinien być przygotowany na świeżo w dniu eksperymentu.
  4. Podczas montowania próbki (patrz sekcja 3) roztwór roboczy barwnika zostanie standardowo rozcieńczony w stosunku 1:10, co spowoduje końcowe stężenie barwnika 2 μM i końcowe stężenie DMSO 0,1% w/v.
    UWAGA: Wybór różnych współczynników rozcieńczenia poprzez prostą zmianę stosunku objętości między roztworem roboczym barwnika a cieczą montażową pozwala łatwo dostosować pożądane końcowe stężenie barwnika.
    UWAGA: Aby zapobiec niepożądanym skutkom spowodowanym toksycznością barwnika lub DMSO, współczynnik rozcieńczenia nie powinien spaść poniżej 1:4, aby uzyskać maksymalne końcowe stężenia barwnika 5 μM i 0,4% w/v DMSO. Wyższe stężenia barwnika szybko nasycą system i uniemożliwią wiarygodną kwantyfikację sygnału, podczas gdy więcej niż 0,5% w/v (≥ 62,5 mM) DMSO może upośledzać rozwój komórek38.

3. Przygotowanie próbki do mikroskopii

  1. Pobrać próbki z kolonii grzybów (krok 1.2) lub stałych kultur kiełkujących (krok 1.3) metodą odwróconych bloków agarowych.
    1. Przygotuj czyste szklane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 mm x 60 mm (#1 = 0,13–0,16 mm grubości) i dodaj 18 μl płynnego minimalnego podłoża (VMM lub M9) lub roztworu soli fizjologicznej na środek.
    2. Dodać 2 μl roztworu roboczego barwnika o stężeniu 20 μM do 18 μl płynu i dobrze wymieszać, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół, unikając przy tym powstawania pęcherzyków powietrza.
      UWAGA: Podczas pracy z kilkoma próbkami zaleca się przygotowanie głównej mieszanki płynnego roztworu barwnika dla wszystkich, aby zapewnić równe stężenie barwnika podczas całego eksperymentu.
    3. Za pomocą czystego skalpela wyciąć próbkę o wymiarach 15 mm x 15 mm z obrzeży kolonii lub stałej kultury zarodkowej i umieścić ją pionowo obok kropli pożywki na szkiełku nakrywkowym.
    4. Używając skalpela do podparcia górnej krawędzi bloku i palca do przytrzymania tylnej strony bloku na miejscu, powoli opuść stronę przenoszącą grzybnię lub kiełki na płyn. Próbka jest teraz gotowa do przeniesienia na stolik mikroskopowy.
      UWAGA: Konieczne jest, aby robić to powoli i bardzo ostrożnie, aby zminimalizować naprężenia mechaniczne ogniw i uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza między próbką a szkiełkiem nakrywkowym.
  2. Zamontuj płynne kultury zarodkowe z kroku 1.4.
    UWAGA: Najwygodniej, płynne kultury kiełkujące w komorowych szkiełkach mikrodołkowych mogą być bezpośrednio przenoszone i dalej manipulowane na stoliku mikroskopowym.
    1. Dodać 22 μl roztworu roboczego barwnika do 200 μl płynnego podłoża, aby uzyskać standardowe końcowe stężenia 2 μM barwnika i 0,1% w/v DMSO.
      UWAGA: Płynne kultury kiełkujące mają tę wielką zaletę, że barwniki fluorescencyjne (lub inne chemikalia, takie jak inhibitory) mogą być dodawane w dowolnym momencie eksperymentu, również podczas nagrywania. W takim przypadku należy zachować szczególną ostrożność, aby podawać krople płynu bardzo powoli, aby nie przeszkadzać komórkom. Drgania systemu i ruchy Browna mogą już wprowadzać pewne ruchy komórek.

4. Mikroskopia żywych komórek

  1. Dostosuj podstawowe ustawienia akwizycji obrazu. Poniższe ustawienia akwizycji obrazu pozwalają uchwycić dynamikę barwienia w poszczególnych strzępkach i mają zastosowanie do obu następujących testów
    1. Zastosuj 5–10% mocy lasera z 20% pełnej mocy wyjściowej urządzenia.
    2. Użyj obiektywu Plan Apo 60x–63x do zanurzenia w glicerolu lub w wodzie o dużej aperturze numerycznej ≥ 1,2.
    3. Ogranicz obszar akwizycji obrazu do konturu strzępek, ustawiając rozmiar obrazu 1024 x 256 pikseli i używając współczynnika powiększenia optycznego 2–3.
    4. Użyj skanowania dwukierunkowego z częstotliwością odświeżania 400 Hz. Dostosuj rozmiar otworu do 1 jednostki Airy.
    5. Ustaw wzmocnienie najbardziej czułego detektora na 100%.
    6. W przypadku nagrywania poklatkowego należy rozpocząć akwizycję obrazu od jednej klatki co 15 s, aby zapewnić rozsądną rozdzielczość czasową bez powodowania wybielania barwnika lub stresu fotograficznego.
    7. W przypadku nagrywania 3D należy ustawić górną i dolną granicę przestrzenną na granicy strzępek i przestrzennych odcinków optycznych w odległości 1 μm od siebie, aby zapewnić rozsądną rozdzielczość przestrzenną.
      UWAGA: Ze względu na szybki wzrost strzępek, wysoka rozdzielczość przestrzenna w osi Z była często poświęcana na rzecz wysokiej rozdzielczości czasowej na osi X/Y lub na odwrót. Tylko bardzo nowoczesne konfokalne laserowe mikroskopy skaningowe są wystarczająco szybkie, aby spełnić oba wymagania.
  2. Testy wychwytu endocytozy
    1. Zapoznaj się z Rysunek 1 i Tabela 1, aby zidentyfikować najlepsze ustawienia wzbudzenia/emisji dla FM 1-43 i/lub FM 4-64 dostępne w systemie mikroskopowym i odpowiednio dostosować.
      UWAGA: Przy zalecanym stężeniu 2 μM wprowadzenie barwnika FM do błony plazmatycznej jest natychmiastowe w normalnych, zdrowych komórkach. Cały proces od wstępnego barwienia błony plazmatycznej do pojawienia się barwnika w wakuolach rurkowych jest zwykle zakończony w ciągu 30–45 minut w temperaturze pokojowej. Zwiększenie stężenia barwnika FM zwiększa stosunek sygnału do szumu, a tym samym szybciej tworzy obrazy o wyższym kontraście. Przyspiesza to jednak również proces etykietowania, utrudniając rozróżnienie chronologicznej kolejności barwienia organelli.
    2. Rozpocznij nagrywanie obrazu, korzystając z powyższych zalecanych podstawowych ustawień akwizycji obrazu i oceń wyniki.
    3. Zoptymalizuj ustawienia akwizycji obrazu do rozdzielczości przestrzennej i czasowej wymaganej do uchwycenia aspektu dynamiki błony plazmatycznej lub endocytozy, na którym koncentruje się eksperyment.
    4. Na przykład, aby uchwycić bardzo szybką dynamikę w X/Y, zmniejsz ogólny rozmiar obrazu, zobrazuj tylko jedną płaszczyznę ogniskową i zwiększ szybkość skanowania do 1 kl./s. Aby uzyskać wyższą rozdzielczość w osi Z, zmniejsz rozdzielczość w X/Y, zmniejsz rozmiar obrazu i zmniejsz odległość między sekcjami optycznymi do 0,5 μm.
  3. Dynamika ściany komórkowej
    1. Zapoznaj się z Rysunek 4 i Tabela 1, aby zidentyfikować najlepsze ustawienia wzbudzenia/emisji dla zastosowanego barwnika ściany komórkowej dostępnego w systemie mikroskopowym i odpowiednio dostosować.
      UWAGA: Ze względu na ich szerokie widma emisyjne, CFW i SPF nie nadają się do jednoczesnego obrazowania z innymi fluoroforami, głównie GFP. Niektóre ograniczenia dotyczą nawet metod obrazowania sekwencyjnego z użyciem tych barwników, a zatem muszą być optymalizowane indywidualnie.
    2. Rozpocznij rejestrowanie obrazu przy użyciu powyższych zalecanych podstawowych ustawień akwizycji obrazu i oceń wyniki.
      UWAGA: Przy zalecanym stężeniu 2 μM wprowadzanie barwnika do ściany komórkowej niekoniecznie jest natychmiastowe, ale dość szybkie. Na przykład cały proces tworzenia przegrody trwa średnio około 5–7 minut w temperaturze pokojowej20. Zwiększenie stężenia barwnika w ścianie komórkowej zwiększa stosunek sygnału do szumu, a tym samym szybciej tworzy obrazy o wyższym kontraście. Jednak szybko wprowadza również artefakty z powodu indukowanej naprawy uszkodzeń ściany komórkowej.
    3. Zoptymalizuj ustawienia akwizycji obrazu do rozdzielczości przestrzennej i czasowej wymaganej do uchwycenia aspektu morfogenezy ściany komórkowej, na którym koncentruje się eksperyment, jak opisano w sekcji 4.2.3.

Wyniki

Ilościowa analiza obrazu
Oprócz „samej” wizualizacji procesów komórkowych, obrazowanie żywych komórek pozwala na wyodrębnienie informacji ilościowych z zarejestrowanych danych. Zasadniczo ilościowa analiza obrazu jest złożonym zagadnieniem, którego pełne omówienie wykracza poza zakres niniejszego artykułu, dlatego czytelnika odsyła się do specjalistycznych podręczników i artykułów39,40,41. Niemniej jednak przedstawiono kilka podstawowych wytycznych związanych z poniższymi przykładowymi danymi. Aby umożliwić kwantyfikację obrazu, muszą zostać spełnione kilka kluczowych warunków wstępnych, w tym: (1) do wszystkich próbek należy zastosować określone stężenia molowe barwników fluorescencyjnych, aby umożliwić dokładne porównanie względne; (2) ustawienia akwizycji obrazu muszą być dostosowane w taki sposób, aby detektory światła emisyjnego nigdy nie uległy nasyceniu, w przeciwnym razie maksymalne intensywności zostaną ucięte; (3) ustawienia akwizycji obrazu muszą pozostać stałe w trakcie spójnego zestawu eksperymentalnego, w przeciwnym razie zostaną wprowadzone sztuczne zmiany intensywności; (4) dane obrazowe muszą być zapisane w bezstratnym formacie pliku wraz z metadanymi zawierającymi wszystkie ustawienia instrumentu; oraz (5) analiza obrazu powinna ograniczać się do minimalnej liczby kroków postprocessingu niezbędnych do wyodrębnienia pożądanych informacji ilościowych.

Zazwyczaj w żywych komórkach nie są dostępne zdefiniowane wzorce, które pozwoliłyby na absolutną kwantyfikację rejestrowanych sygnałów. W związku z tym, w swojej najprostszej formie, ilościowa analiza obrazu opiera się na względnym porównaniu intensywności pikseli w obrębie tego samego obrazu lub pomiędzy różnymi obrazami zarejestrowanymi przy identycznych ustawieniach. Oprogramowanie sterujące mikroskopem producenta zazwyczaj zawiera podstawowe narzędzia do postprocessingu obrazów i analizy ilościowej lub może zostać rozszerzone o dodatkowe funkcje segmentacji obrazu, progowania, obrazowania stosunkowego (ratio imaging) itp. Dostępnych jest kilka otwartoźródłowych platform do przetwarzania obrazów, w różnym stopniu dostosowanych do różnych typów danych obrazowych, w tym ImageJ (https://imagej.net; https://imagej.nih.gov/ij/), icy (http://icy.bioimageanalysis.org/), CMEIAS Bioimage Informatics (http://cme.msu.edu/cmeias/) oraz Wimasis (https://www.wimasis.com/en/).

Przedstawione przykładowe dane zostały przetworzone i przeanalizowane przy użyciu platformy ImageJ. W skrócie, konkretne obszary w komórce, takie jak wierzchołek strzępki lub przegrody, są zaznaczane za pomocą narzędzi do wyboru obszarów o określonej wielkości, a następnie intensywność wszystkich zawartych pikseli jest odczytywana za pomocą wbudowanego w oprogramowanie „narzędzia pomiarowego”. Dane dotyczące intensywności z próbek kontrolnych i eksperymentalnych są przenoszone do pliku arkusza kalkulacyjnego, analizowane matematycznie i opracowywane w formie wykresu. Dalsze szczegóły można znaleźć w cytowanych publikacjach oryginalnych.

Przykładowe dane 1: Testy pobierania FM 4-64
Próbki grzybów hodowano w postaci kolonii (krok 1.2) i montowano metodą odwróconego bloku agaru (krok 3.1). Końcowe stężenie FM 4-64 wynosiło 1,67 µM. Ustawienia obrazowania: obiektyw imersyjny glicerynowy HCX PL APO 63x/1.3 NA w odwróconym konfokalnym skaningowym mikroskopie laserowym (patrz Tabela materiałów); wzbudzenie FM 4-64 przy 488 nm i emisja w zakresie 600–700 nm; jedna klatka co minutę przez maksymalnie 150 min. Testy pobierania FM 4-64 pozwoliły zidentyfikować defekty w organizacji czasowo-przestrzennej endocytozy u mutantów z delecją genu oraz mutantów z nadekspresją genu białka 2 z rodziny Sur7 (Sfp2) specyficznego dla grzybów u T. atroviride9 (Rysunek 5).

Przykład danych 2: Podwójne barwienie FM 4-64 fluorescencyjnych białek fuzyjnych skierowanych do przedziałów endocytycznych
Próbki grzybowe hodowano w postaci kolonii (krok 1.2) i montowano metodą odwróconego bloku agarowego (krok 3.1). Końcowe stężenie FM 4-64 wynosiło 2 µM. Ustawienia obrazowania: obiektyw imersyjny w wodzie CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC w odwróconym konfokalnym skaningowym mikroskopie laserowym (patrz Tabela materiałów); wzbudzenie GFP przy 488 nm i emisja przy 500–530 nm, wzbudzenie FM 4-64 przy 488 nm i emisja przy 600–700 nm oraz pole jasne z detektorem światła przechodzącego, wszystko jednocześnie; jedna klatka co 15 s przez maksymalnie 15 min. Podwójne barwienie FM 4-64 zastosowano w celu powiązania subkomórkowej dystrybucji dwóch białek transbłonowych Sfp2 i Gpr1 z tagiem wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego (EGFP) ze szlakiem endocytycznym u T. atroviride (Rysunek 6, Film 3, Film 4).

Przykładowe dane 3: barwienie współbieżne FM 4-64 w celu identyfikacji różnic morfogenetycznych
Próbki grzybów hodowano w formie kolonii (krok 1.2) i montowano metodą odwróconego bloku agaru (krok 3.1). Końcowe stężenie FM 4-64 wynosiło 2 µM. Ustawienia obrazowania: obiektyw imersyjny olejowy Plan Apochromat 63x/1.4 NA w odwróconym konfokalnym skaningowym mikroskopie laserowym (patrz Tabela materiałów); wzbudzenie GFP przy 488 nm i emisja przy 505–550 nm, wzbudzenie FM 4-62 przy 488 nm i emisja przy 574–691 nm oraz pole jasne z detektorem światła przechodzącego, wszystko jednocześnie; jedna klatka co 8,5 s przez maksymalnie 15 min. Barwienie współbieżne FM4-64 pozwoliło powiązać dynamikę lokalizacji subkomórkowej fluorescencyjnie znakowanego białka kompleksu polarisomu BUD-6 z procesami zależnymi od transportu endosomów, takimi jak tworzenie przegród i spolaryzowany wzrost wierzchołka strzępki, oraz scharakteryzować różnice w organizacji subkomórkowej i architekturze strzępek między szczepem dzikim a mutantami N. crassa (Rysunek 7, Film 5).

Przykładowe dane 4: Barwienie ściany komórkowej ujawnia różnice morfogenetyczne
Próbki grzybów hodowano w postaci kolonii (krok 1.2) i montowano metodą odwróconego bloku agaru (krok 3.1). Zastosowano końcowe stężenia 2 µM CFW, 20 µM SPF oraz 100 µM CR. Ustawienia obrazowania: obiektyw imersyjny w wodzie CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC w odwróconym konfokalnym skaningowym mikroskopie laserowym (patrz Tabela Materiałów); wzbudzenie CFW i SPF przy 405 nm i emisja przy 430–470 nm, wzbudzenie CR przy 543 nm i emisja przy 580–620 nm. Różne właściwości oddziaływania CFW, SPF i CR z polimerami ściany komórkowej podkreślają różnice morfogenetyczne między mutantem Δsfp2 a szczepem dzikim T. atroviride9. Wzrost stresu ściany komórkowej wywołany zwiększonymi stężeniami barwników następuje szybciej i jest bardziej wyraźny u mutanta w porównaniu ze szczepem dzikim. Ponadto te same obrazy pozwalają na ilościowe określenie różnic morfogenetycznych w zakresie średnicy strzępek i odległości między przegrodami dla obu szczepów (Rycina 8).

Przykładowe dane 5: Monitorowanie biosyntezy ściany komórkowej w czasie rzeczywistym
Kiełki hodowano w formie hodowli płynnej (krok 1.4) w 8-dołkowych mikropreparatach komorowych (krok 3.2). Końcowe stężenie CFW wynosiło 0,12 µM. Ustawienia obrazowania: obiektyw imersyjny wodny CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC w odwróconym konfokalnym skaningowym mikroskopie laserowym; wzbudzenie CFW przy 405 nm i emisja przy 420–470 nm; jedna klatka co 20 s przez maksymalnie 35 min. Bardzo niskie stężenie CFW zapobiega nasyceniu ściany komórkowej cząsteczkami barwnika i umożliwia ilościowe monitorowanie biosyntezy ściany komórkowej w czasie rzeczywistym. Wykazuje to, że odkładanie nowego materiału ściany komórkowej nie jest równomierne, lecz bardzo szybko reaguje na lokalne naprężenia fizyczne wynikające z względnego przesunięcia jednej komórki podczas przylegania komórka-komórka przed fuzją kiełków u N. crassa (Rysunek 9, Film 6).

Schemat struktury fluoroforu, widma absorpcji/emisji, porównanie cząsteczek, właściwości chemiczne.
Rysunek 1: Właściwości biochemiczne i biofizyczne barwników FM.(A) Struktury chemiczne FM 1-43/SynaptoGreen C4 oraz FM 4-64/SynaptoRed C2. (B) Widma absorpcji i emisji obu barwników FM, naniesione na optymalne ustawienia obrazowania dla barwników związanych z błonami u grzybów nitkowatych: niebieskie światło 445–495 nm wzbudzi FM 1-43 z wydajnością 100–80%, podczas gdy laser argonowy 488 nm wzbudzi barwnik z wydajnością 91%. Ze względu na przesunięcie w stronę niebieską po związaniu z błoną (*), optymalny zakres detekcji emisji FM 1-43 mieści się między 520–590 nm. Analogicznie, optymalne ustawienia obrazowania dla FM 4-64 u grzybów to 471–541 nm (wydajność 100–80%) przy użyciu polichromatycznego źródła światła wzbudzenia lub 514 nm (wydajność 99%) przy użyciu lasera argonowego, oraz 650–750 nm dla detekcji światła emisji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia: projekcja Z fluorescencji FM1-43 i FM4-64, nałożenie obrazów błon, porównanie w polu jasnym.
Rysunek 2: Jednoczesne obrazowanie FM 1-43 i FM 4-64. Do płynnej hodowli kiełków N. crassa dodano ekvimolarną mieszaninę obu barwników, osiągając stężenie końcowe 10 µM. W 25 minucie po dodaniu barwnika FM 1-43 zabarwił błonę plazmatyczną i zgromadził się już w błonach wewnętrznych, w tym w silnie zabarwionych mitochondriach (m), wykluczając w dużej mierze błony wakuolarne (v); jego intensywność jest ponad ośmiokrotnie silniejsza w porównaniu do FM 4-64 (średnie intensywności fluorescencji odpowiednio 176 i 21), którego niższa hydrofobowość/wyższa hydrofilowość spowalnia tempo internalizacji, prowadząc do dłuższego czasu przebywania w błonie plazmatycznej. Pasek skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Mikroskopia: barwienie ściany komórkowej, cytoplazmatyczne GFP, nałożenie obrazów, światło przechodzące; schemat analizy fluorescencyjnej.
Rycina 3: Indukowane stresem ściany komórkowej odkładanie polimerów ściany komórkowej w wierzchołku często prowadzi do autolizy komórek.Strzępki T. atroviride ekspresyjące cytoplazmatyczne GFP zostały zabarwione 10 µM Solophenyl Flavine 7GFE 500 (SPF) i obrazowane natychmiast po zamontowaniu. Strzępki niepoddane stresowi (a), strzępki poddane stresowi z lekko zwiększonym odkładaniem glukanu/chityny w wierzchołku i postępującą autolizą (b) oraz silnie zestresowane strzępki z wyraźną wierzchołkową czapką glukanu/chityny (gwiazdka) i terminalną autolizą (c), widoczną poprzez całkowitą utratę fluorescencji GFP i rozległą wakuolizację. Pasek skali = 10 µm. Pełny przebieg czasowy przedstawiono w Filmie 1. Należy zauważyć, że trzy strzępki znajdowały się faktycznie obok siebie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Widma absorpcji i emisji barwników fluorescencyjnych oraz struktury chemiczne; schemat z danymi dotyczącymi długości fali.
Rysunek 4: Właściwości biochemiczne i biofizyczne barwników selektywnych wobec ściany komórkowej. Podane cechy chemiczne dotyczą soli sodowych każdego barwnika. Widma absorpcji i emisji odpowiadają tym w środowiskach komórkowych. Wskazane monochromatyczne linie wzbudzenia laserowego (zapisane w kolorze), polichromatyczne zakresy wzbudzenia stosowane w mikroskopach epifluorescencyjnych oraz zakresy detekcji światła emisji to wartości zalecane do obrazowania grzybów nitkowatych. Dwie linie wzbudzenia laserowego są wskazane, gdy obie działają równie skutecznie. (*) Widmo emisji PFS związanego ze ścianą komórkową jest znacznie bardziej przesunięte w stronę czerwieni niż wcześniej odnotowano33, co jednak skutkuje bardzo dobrym stosunkiem S/N przy niższych stężeniach barwnika niż stosowane wcześniej. Pełne widmo CR jest obecnie niedostępne, dlatego przedstawiono widmo Nile Red (CAS No: 7385-67-3) jako najbliższy odpowiednik. Szczegółowe informacje na temat właściwości spektralnych CR można znaleźć w innym źródle42. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Kinetyka poboru barwnika FM4-64, etapy endocytozy, mikroskopia fluorescencyjna z barwieniem błon.
Rycina 5: Wpływ Sfp2 na endocytowy pobór FM4-64. Trzy kolejne kluczowe etapy poboru barwnika FM są łatwo rozróżnialne u typu dzikiego (wt). Etap I: wyłączne barwienie błony plazmatycznej, etap II: pierwsze pojawienie się barwnika FM w pęcherzykach endocytowych oraz etap III: wyłączne barwienie pęcherzyków endocytowych i endomembran. Odpowiadające im wzory barwienia przedstawiono w najwcześniejszym punkcie czasowym ich wystąpienia. W porównaniu do typu dzikiego T. atroviride, endocytoza jest lekko przyspieszona u mutanta z nadekspresją sfp2 (OEsfp2), natomiast pobór barwnika jest drastycznie opóźniony u mutanta z delecją sfp2 (Δsfp2). Na przykład pobór barwnika do błony plazmatycznej następuje natychmiastowo w OEsfp2, ale trwa 2 min u typu dzikiego; a całkowna internalizacja barwnika FM z błony plazmatycznej zachodzi 10x szybciej w OEsfp2 w porównaniu do Δsfp2. Paski skali = 5 μm. Rycina powielona z Atanasova et al.9 zgodnie z licencją Creative Commons (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna, Sfp2-mEGFP, Gpr1-mEGFP, barwienie FM 4-64, nałożenie obrazów, obraz mikroskopowy, analiza.
Rysunek 6: Współbarwienie białek błonowych znakowanych EGFP z FM 4-64 ułatwia rozróżnienie odmiennych dynamik lokalizacji subkomórkowej w T. atroviride. (A) Białko z czterema domenami transbłonowymi Sfp2 kolokuje się z organellami znakowanymi FM4-64, w tym z błoną plazmatyczną i wrzecionami, Spitzenkörper (Spk; strzałka) oraz prawdopodobnie z wakuolami rurkowatymi. (B) Białko Gpr1 z siedmioma domenami transbłonowymi, podobne do GPCR, kolokuje się z FM4-64 w tych samych organellach co Sfp2, z wyjątkiem Spk. Paski skali, 10 µm. Pełne sekwencje przebiegu czasowego znajdują się w Filmie 3 oraz Filmie 4. Rysunek został zmodyfikowany z Atanasova et al.9 zgodnie z licencją Creative Commons. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia wzrostu komórek grzybów, porównanie typu dzikiego i Δbud-6, wizualizacja spk, seria time-lapse.
Rysunek 7: Barwienie FM 4-64 różnicuje mutant Δbud-6 od typu dzikiego i lokalizuje BUD-6 w obrączce septalnej.(A) Barwienie FM 4-64 strzępek typu dzikiego N. crassa (strzałki wskazują przegrody; groty strzałek wskazują Spk). (B) Przegrody i Spk nie występują w ∆bud-6. Paski skali, 50 µm. (C i D) Powiększenie wierzchołka i podwierzchołka strzępek typu dzikiego (C) oraz ∆bud-6 (D). Spk (grot strzałki) różnicuje się w typie dzikim, ale nie w ∆bud-6. Nawiasy wskazują strefę wykluczenia jąder, która nie tworzy się w ∆bud-6. Paski skali = 5 µm. (E) Rekrutacja BUD-6-GFP do miejsca powstającej przegrody poprzedzająca inwaginację błony plazmatycznej (groty strzałek) i towarzyszące jej zwężenie przegrody. Paski skali = 5 µm. Pełne sekwencje czasowe znajdują się w Filmie 5a i Filmie 5b. Rysunek został powielony z modyfikacjami z pracy Lichius et al.16 zgodnie z licencją Creative Commons. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obrazowanie komórek grzyba, mikrografie(A), dane o średnicy(B), analiza wierzchołków(C), model 3D(D), ilościowe oznaczenie barwienia(E).
Rycina 8: Delecja sfp2 zmienia wzorzec osadzania materiału ściany komórkowej i wpływa na morfogenezę strzępek T. atroviride. (A) Barwienie CFW i SPF ujawnia zwiększone osadzanie ściany komórkowej w Δsfp2 (strzałki) w porównaniu z typem dzikim (wt). Barwienie CR indukuje rozległe pęcznienie wierzchołków tylko w Δsfp2 (groty strzałek). Paski skali = 10 µm. (B) Defekty morfogenetyczne w Δsfp2 obejmują znacznie zmniejszone odległości między przegrodami (Δsfp2 = 26.0 µm, typ dziki = 85 µm; n = 60; ANOVA Pr < 2−16) oraz mniejsze średnice strzępek (∆sfp2 = 5.6 µm, typ dziki = 12.6 µm; n = 100; ANOVA Pr < 2−16). (C) Zwiększona fluorescencja barwnika w samym wierzchołku w porównaniu z obszarem podwierzchołkowym. Pasek skali = 5 µm. (D) Powierzchniowy wykres 3D z kodowaniem intensywności dla (C). (E) Ilościowe oznaczenie względnych intensywności fluorescencji w Δsfp2 i typie dzikim (n = 55). Rycina została powielona z pracy Atanasova et al.9 zgodnie z licencją Creative Commons. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Biosynteza ściany komórkowej, mikroskopia fluorescencyjna time-lapse, projekcja t konidium, wykres biosyntezy.
Rycina 9: Monitorowanie biosyntezy ściany komórkowej w czasie rzeczywistym.(A) Fuzja rurek anastomoz konidialnych (CAT) pomiędzy kiełkującymi zarodnikami N. crassa. Kontakt fizyczny staje się widoczny poprzez reakcję skrętową kiełkującego zarodnika (21–28 min). Intensywność fluorescencji CFW zakodowana kolorami wskazuje obszary o małym (ciemnoniebieski) i intensywnym (żółty) odkładaniu ściany komórkowej. Początkowo niebarwiony wierzchołek prowadzący (grot strzałki) odkłada nowy materiał ściany komórkowej po kontakcie wierzchołków oraz w obszarze poddanym największemu stresowi fizycznemu (strzałka). Pasek skali = 5 μm. Pełny przebieg czasowy przedstawiono w Filmie 6. Rycina powielona z38 za zgodą autora. (B) Projekcja z (A) wskazująca cztery okrągłe obszary, w których zmierzono intensywność fluorescencji. Pasek skali = 5 μm. (C) Wykres dla wskazanych obszarów pokazujący gwałtowny wzrost lokalnej biosyntezy ściany komórkowej w odpowiedzi na stres fizyczny (CAT 1, strzałka). W rurce kiełkowej (GT) i ciele zarodnika (konidium) biosynteza ściany komórkowej wzrasta stopniowo. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schematy mikroskopii fluorescencyjnej pokazujące lokalizację GFP w cytoplazmie oraz SPF, a także światło przechodzące.
Film 1: Stres ściany komórkowej wywołany barwnikiem. Do strzępek T. atroviride wykazujących ekspresję cytoplazmatycznego GFP (magenta) dodano 10 µM SPF (cyjan). Natychmiast następuje intensywne barwienie wierzchołków, a następnie w ciągu 2 min dochodzi do szybkiej lizy przedziałów strzępek, co objawia się zanikiem fluorescencji GFP. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Mikroskopia fluorescencyjna dynamiki błony komórkowej, porównanie w trybie time-lapse; analiza obrazowania komórkowego.
Film 2: Barwienie żywych komórek SPF. 2 µM SPF (cyjan) pozwala na śledzenie wzrostu wierzchołkowego strzępek T. atroviride z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową, bez wywoływania artefaktów związanych ze stresem ściany komórkowej w samym wierzchołku. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Mikroskopia konfokalna dynamiki błony komórkowej, pokazująca obrazy BF, Sfp2-GFP, FM4-64 oraz obraz scalony.
Film 3: Podwójne barwienie Sfp2-GFP barwnikiem FM 4-64. Podwójne barwienie T. atroviride wykazującego ekspresję Sfp2-mEGFP (zielony) z użyciem 1.67 µM FM 4-64 (czerwony) ujawnia nakładającą się oraz odrębną lokalizację białka błonowego w obrębie szlaku endocytozy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Mikroskopia fluorescencyjna, obrazowanie komórek w trzech kanałach, Gpr1-GFP, barwnik FM4-64, analiza błony, nałożenie obrazów.
Film 4: Podwójne barwienie FM 4-64 i Gpr1-GFP. Podwójne barwienie T. atroviride wykazującego ekspresję Gpr1-mEGFP (zielony) za pomocą 1.67 µM FM 4-64 (czerwony) ujawnia nakładającą się i odmienną lokalizację białka błonowego względem szlaku endocytowego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Mikroskopia fluorescencyjna BUD-6-GFP i FM4-64 w strukturach komórkowych; analiza dynamiki błon.
Film 5: Współbarwienie BUD-6-GFP barwnikiem FM 4-64. (5a) Współbarwienie N. crassa wykazującego ekspresję BUD-6-GFP (zielony) za pomocą 2 µM FM 4-64 (czerwony) pozwala na śledzenie dynamiki BUD-6 podczas tworzenia przegrody w odniesieniu do powiązanej inwaginacji błony plazmatycznej. (5b) Przycięty i nałożony obraz z (5a). Kliknij tutaj, aby pobrać Film 5a
Kliknij tutaj, aby pobrać Film 5b.

Schemat mikroskopii fluorescencyjnej komórek grzybów przedstawiający marker GFP oraz analizę intensywności CFW.
Film 6: Monitorowanie biosyntezy ściany komórkowej w czasie rzeczywistym. N. crassa kiełki wykazujące ekspresję MAK-1-GFP (zielony) poddano współbarwieniu za pomocą 0.12 µM CFW (niebieski) w celu uwidocznienia lokalnej biogenezy ściany komórkowej podczas fuzji kiełków zapośredniczonej przez CAT. Należy zauważyć, że występuje pewien przesiew sygnału CFW do kanałów GFP, co pokazuje, że SPF lub CR są odpowiednio lepszymi wyborami jako barwniki do sekwencyjnego i jednoczesnego obrazowania współistniejącego z GFP. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Tabela 1: Właściwości selektywnych barwników fluorescencyjnych do błon i ścian komórkowych. * = wartości mg/mL skorygowane o obniżoną czystość/zawartość barwnika w celu uzyskania ekvimolarności we wszystkich roztworach; n.i.a. = brak dostępnych informacji. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

Artykuł ten jest kontynuacją przełomowych prac, które ustaliły zastosowanie różnych barwników fluorescencyjnych jako ważnych markerów organelli dla grzybów strzępkowychna początku lat 2000 2,4,43 i próbują omówić fotofizyczne i biologiczne właściwości komórek barwników FM i wybranych barwników ściany komórkowej bardziej szczegółowo niż wcześniej. Zwłaszcza w odniesieniu do niepożądanych efektów komórkowych, takich jak nasycenie błony lub uszkodzenie ściany komórkowej, które występują powyżej pewnych stężeń barwnika. To, co wcześniej było uważane za nietoksyczne na poziomie komórkowym, teraz jest uważane za toksyczne na poziomie molekularnym. Nawet jeśli efekty te mogą być bardzo subtelne i nie są bezpośrednio widoczne w oczywistych zmianach w zachowaniu organelli lub komórek, wszelkie możliwe zakłócenia w stosowaniu barwnika inne niż wizualizacja muszą być zminimalizowane w celu zbadania natywnej funkcji molekularnej. Na szczęście zwiększona czułość i wydajność kwantowa nowoczesnych detektorów, takich jak detektory fotodiod lawinowych krzemowych (Si-APD)44 czy detektor obszarowy Airyscan45, ułatwiają stosowanie jeszcze mniejszych ilości barwnika niż dotychczas. Kolejnym kluczowym celem artykułu jest zilustrowanie właściwości współobrazowania tych barwników z innymi fluoroforami, a przede wszystkim z GFP jako najczęściej stosowanym białkiem fluorescencyjnym w biologii. Powinno to pomóc w projektowaniu eksperymentów obrazowych, które mają na celu skorelowanie dynamiki lokalizacji subkomórkowej białek fuzyjnych z dynamiką ściany komórkowej grzyba, błony komórkowej lub szlaku endo- i egzocytozy itp.

Obrazowanie w naturalnych i bezstresowych warunkach jest kluczem do uzyskania wiarygodnych danych. Niektóre praktyczne rozważania dotyczące pożywki hodowlanej i przygotowania próbki mają na celu zapewnienie punktu wyjścia do znalezienia optymalnych warunków, które umożliwią wolną od artefaktów, długotrwałą obserwację zdrowych, niezestresowanych komórek o najwyższym możliwym stosunku S/N dla danej próbki. Nie ma uniwersalnego sposobu na uzyskanie wiarygodnych i miarodajnych wyników obrazowania. Nieodłącznym elementem tego podejścia jest to, że biologiczna zmienność próbki, subiektywność i oczekiwania mikroskopisty, a także przetwarzanie obrazu po przetworzeniu mają znaczący wpływ odpowiednio na pozyskiwanie i interpretację danych. W związku z tym praktyczne doświadczenie mikroskopisty, jego/jej dogłębna wiedza na temat biologii komórki badanego grzyba, a także umiejętne przygotowanie próbki w celu stworzenia warunków jak najbardziej "naturalnych" i niezakłóconych w warunkach laboratoryjnych, mają zasadnicze znaczenie dla uzyskania i oceny danych obrazowych, które wiernie odzwierciedlają badane zjawiska komórkowe. Z reguły występowaniu niepożądanych skutków ubocznych barwników fluorescencyjnych, począwszy od subtelnej, a zatem nie widocznej w oczywisty sposób aktywacji szlaków reakcji na stres błony komórkowej lub ściany komórkowej, aż po prostą cytotoksyczną indukcję autolizy komórek, można bezpiecznie zapobiec tylko poprzez zastosowanie niskich stężeń barwnika ≤2 μM.

Aplikacja barwników fluorescencyjnych jest prosta, jednak ich specyfika jest słabo scharakteryzowana. Kluczową zaletą stosowania barwników fluorescencyjnych jest przygotowawcza prostota protokołów eksperymentalnych. Uprawa i pobieranie próbek grzyba, dodawanie barwnika (barwników) i montaż na stoliku mikroskopowym są (przy wprawie) proste. Regulacja podstawowych ustawień obrazowania, w tym długości fal wzbudzenia i emisji, czasów naświetlania, ustawień przebiegu czasowego itp., odbywa się zgodnie z prostymi zasadami biofizyki mikroskopu i zasadami biologicznymi stosowanych barwników fluorescencyjnych wewnątrz komórek. Tabela 1 ma na celu ułatwienie identyfikacji najodpowiedniejszego barwnika lub kombinacji barwników do celów doświadczalnych. Co więcej, barwniki fluorescencyjne są przystępne cenowo, łatwo dostępne i zapewniają niezawodnie wysoką jakość, a tym samym zapewniają wysoce powtarzalną aplikację.

Dwa główne ograniczenia stosowania barwników fluorescencyjnych selektywnych dla błony lub ściany komórkowej to (często) ograniczona wiedza na temat ich precyzyjnych właściwości barwiących, które w większości przypadków są niespecyficzne na poziomie organelli i molekularnym, oraz ich zależne od stężenia niepożądane skutki uboczne. Barwniki FM są specyficzne dla dwuwarstw lipidowych uczestniczących w endo- i egzocytozie. Jednak dokładne znakowanie organelli subkomórkowych w badanych warunkach nie jest od razu oczywiste i wymaga porównania różnych wariantów barwnika FM oraz wspólnego znakowania z dodatkowymi markerami specyficznymi dla organelli. Jednym z przykładów jest preferencja FM 1-43 dla błon mitochondrialnych w porównaniu do FM 4-64. Barwniki selektywne w ścianie komórkowej wykazują różną specyficzność dla trzech głównych polimerów ściany komórkowej grzyba. Uważa się, że CFW jest niespecyficznym barwnikiem dla β-glukanów i chityny, SPF jest uważany za najbardziej selektywny dla β-1,4-glukanów, a CR jest uważany za wysoce selektywny dla α- i β-chityny. Informacje na temat swoistości wiązania PFS z polisacharydami ściany komórkowej grzybów nie są obecnie dostępne. W jakim stosunku polimer ściany komórkowej grzyba jest najskuteczniej znakowany przy danym stężeniu barwnika w badanych gatunkach grzybów, nie jest łatwo odpowiedzieć, a zastosowanie szczegółowych pomiarów uzyskanych in vitro lub in vivo na innych organizmach lub innych gatunkach grzybów musi być bardzo dokładnie przemyślane. Niestety, informacje te są skąpe i mocno rozproszone w literaturze 35,42,46. Nowsze zapisy, które byłyby zgodne z poprzednimi badaniami33, aby dostarczyć nowych informacji na temat precyzyjnych właściwości barwiących prezentowanych barwników, szczególnie w grzybach, nie są obecnie dostępne.

Kontrole obrazowania są niezbędne do dokładnej oceny wzorców barwienia i odpowiedzi komórkowych. Prawdopodobnie najtrudniejszą częścią jest jednak poznanie biologii komórki grzyba tak dobrze, że zarejestrowane zmiany w subkomórkowej lokalizacji selektywnych barwników fluorescencyjnych błony i ściany komórkowej, zmiany w architekturze komórkowej lub wzorzec wzrostu strzępek mogą być wyłącznie i pewnie powiązane z zamierzonymi efektami eksperymentalnego leczenia. W tym celu ważne jest, aby mieć dobre kontrole wraz z każdym nowym eksperymentem z obrazowaniem żywych komórek. Obejmują one nieleczony typ dziki jako negatywną kontrolę obrazowania w celu wykluczenia autofluorescencji tła i szumu detektora z uzyskanego obrazu oraz posiadania komparatora morfologicznego podczas pracy z mutantami. Ponadto pozytywna kontrola obrazowania, na przykład szczepu, który wykazuje ekspresję GFP lub RFP w cytoplazmie lub innym dobrze znanym białku markera fluorescencyjnego, jest niezbędna do ustawienia intensywności światła wzbudzającego na wymagane minimum i kontroli żywotności komórek. Po ustawieniu tych kontroli, stosowanie barwników fluorescencyjnych nie ogranicza się tylko do zadań wizualizacji, ale ich zależna od stężenia dynamika barwienia, a także skutki uboczne zależne od stężenia mogą być analitycznie wykorzystane; Na przykład do ilościowego monitorowania biosyntezy ściany komórkowej w czasie rzeczywistym lub do identyfikacji fenotypów specyficznych dla mutantów w testach wrażliwości47.

Ulepszone przyszłe zastosowania zależą od szczegółowych analiz funkcjonalnych właściwości barwienia barwnikiem. Głównym bieżącym wyzwaniem jest dalsze ulepszanie i automatyzacja ilościowych analiz obrazów w celu przyspieszenia funkcjonalnej oceny subkomórkowej dynamiki selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ściennych w grzybach strzępkowych. W tym celu najpierw wymagane są szeroko zakrojone, ilościowe badania kolokalizacyjne tych barwników ze znanymi markerami polimerowymi organelli i ścian komórkowych w połączeniu ze zmutowanymi szczepami z niedoborem określonych szlaków transportowych lub pozbawionymi określonych składników strukturalnych. Dostępnych jest kilka markerów endocytozy do analiz porównawczych z barwnikami FM48,49, a w odniesieniu do wciąż słabo scharakteryzowanej specyficzności wiązania barwników ściany komórkowej u grzybów, zastosowanie znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał specyficznych dla glukanu50 może stanowić jedną z możliwości rozwiązania tego problemu.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych i nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Podziękowania należą się Tyrolskiemu Funduszowi Naukowemu (TWF) za udzielenie grantu #256524 dla AL, Wiedeńskiemu Funduszowi Nauki i Technologii (WWTF) za udzielenie grantu #LS13-086 dla SZ oraz Funduszowi Publikacji Uniwersytetu w Innsbrucku za wsparcie publikacji w otwartym dostępie. Autorzy dziękują również Wydziałowi Zoologii Uniwersytetu w Innsbrucku za udostępnienie konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego Leica TCS SP5 II.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komora zliczania komórekmarki MerckBR718005format
Thoma Calcofluor White M2RMerck/Sigma-AldrichF3543barwnik ściany komórkowej
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WINikonMRD07602cel zanurzenia w wodzie
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WINikonMRD07602cel do zanurzenia w wodzie
Kongo CzerwonyMerck/ Sigma-AldrichC6277barwnik ściany komórkowej
DimetylosulfotlenekVWR8,36,73,230rozpuszczalnik organiczny
Eclipse TE2000-E z jednostką skanującą C1Niestandardowa konfiguracjaNikon odwrócony laserowy skaningowy mikroskop konfokalny używany do pozyskiwania przykładowych danych 2 i 4
Eclipse TE2000-U z jednostką skanującą Bio-Rad Radiance 2100Niestandardowa konfiguracjaNikonodwrócony laserowy skaningowy mikroskop konfokalny służący do pozyskiwania przykładowych danych 5
FM 1-43Barwnik membranowyMerck/Sigma-AldrichS6814
FM 4-64Barwnik membranowyMerck/Sigma-AldrichS6689
Koraliki szklaneRettberg1340691030mm Koraliki
szklane Nakrywki szklaneThermo Fisher ScientificBB02400600A113MNT024 x 60 #1 szkiełka nakrywkowe
HCX PL APO 63x/1.3 NA GlycLeica15506353Glycerol Obiektyw immersyjny
LSM 510 MetaZeissniestandardowa konfiguracjaodwrócony laserowy skaningowy mikroskop konfokalny używany do pozyskiwania przykładowych danych 3
M9 Minimalny średniMerck/Sigma-AldrichM6030generyczne podłoże do wzrostu grzybów
Micro-slide 8-dołkowyibidi80826polimer ibiTreat #1.5 szkiełko nakrywkowe
MiraclothMerck/Millipore475855-1Rpoliestrowy materiał filtracyjny
szalka PetriegoSarstedt8,21,47292 x 16 mm naczynie hodowlane bez krzywek
PhytagelMerck/Sigma-AldrichP8169przezroczysty środek żelujący
Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DICZeiss440762-9904-000obiektyw
zanurzeniowy w olejuPontamine Fast Scarlet 4BMerck/Sigma-Aldrich212490barwnik do ścian komórkowych
Agar z dekstrozą ziemniaczaną (PDA)BD Difco213400pożywka do wzrostu grzybów T. atroviride
Bulion z dekstrozy ziemniaczanej (PDB)BD Difco254920pożywka do wzrostu grzybów T. atroviride
Probówka reakcyjnaSarstedt72,7061,5 ml probówka SafeSeal
SkalpelB.Braun5518016Cutfix sterylny skalpel #23
Rurka z nakrętkąSarstedt6,25,54,50215 ml probówka polipropylenowa
Solophenyl Flavine 7GFE 500CIBA1485385V6do ścian komórkowych
SynaptoGreen C4Biotum70020membranowy
SynaptoRed C2Biotum70021membranowy
Filtr membranowy strzykawkowyThermo Fisher Scientific723-99450,45 &mikro; m Filtr strzykawkowy SFCA
TCS SP5 IINiestandardowa konfiguracjaodwróconego laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego Leica służącego do pozyskiwania przykładowych danych 1
Pożywka Vogel's Minimal Medium (VMM)FGSCFungal Genetics Stock Centredla N. crassa
3 barwnik barwnik barwnik

Bibliografia

  1. Read, N. D., Fischer, S., Parton, R. M. Imaging Spitzenkörper, pH and calcium dynamics in growing fungal hyphae. Pesticide Science. 54 (2), 179-181 (1998).
  2. Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell imaging of filamentous fungi using vital fluorescent dyes and confocal microscopy. Microbial Imaging. , Elsevier. 63-87 (2004).
  3. Jelínková, A., et al. Probing plant membranes with FM dyes: tracking, dragging or blocking. The Plant Journal. 61 (5), 883-892 (2010).
  4. Fischer-Parton, S., et al. Confocal microscopy of FM4-64 as a tool for analysing endocytosis and vesicle trafficking in living fungal hyphae. Journal of Microscopy. 198 (3), 246-259 (2000).
  5. Harris, S. D. Branching of fungal hyphae: regulation, mechanisms and comparison with other branching systems. Mycologia. 100 (6), 823-832 (2008).
  6. Roca, M. G., Arlt, J., Jeffree, C. E., Read, N. D. Cell biology of conidial anastomosis tubes in Neurospora crassa. Eukaryotic Cell. 4 (5), 911-919 (2005).
  7. Becker, Y., et al. The fungal cell-wall integrity MAPK cascade is crucial for hyphal network formation and maintenance of restrictive growth of Epichloë festucae in symbiosis with Lolium perenne. Molecular Plant-Microbe Interactions. 28 (1), 69-85 (2015).
  8. Justa-Schuch, D., Heilig, Y., Richthammer, C., Seiler, S. Septum formation is regulated by the RHO4-specific exchange factors BUD3 and RGF3 and by the landmark protein BUD4 in Neurospora crassa. Molecular Microbiology. 76 (1), 220-235 (2010).
  9. Atanasova, L., et al. The Gpr1-regulated Sur7 family protein Sfp2 is required for hyphal growth and cell wall stability in the mycoparasite Trichoderma atroviride. Scientific Reports. 8 (1), 12064(2018).
  10. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 12 (2), 363-375 (1992).
  11. Wu, Y., Yeh, F. L., Mao, F., Chapman, E. R. Biophysical characterization of styryl dye-membrane interactions. Biophysical Journal. 97 (1), 101-109 (2009).
  12. Betz, W. J., Mao, F., B, S. C. Imaging exocytosis and endocytosis. Current Opinion in Neurobiology. 6, 365-371 (1996).
  13. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (1), 77-83 (2012).
  14. Bolte, S., et al. FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells. Journal of Microscopy. 214, Pt 2 159-173 (2004).
  15. Riquelme, M., et al. Spitzenkorper localization and intracellular traffic of green fluorescent protein-labeled CHS-3 and CHS-6 chitin synthases in living hyphae of Neurospora crassa. Eukayotic Cell. 6 (10), 1853-1864 (2007).
  16. Lichius, A., Yáñez-Gutiérrez, M. E., Read, N. D., Castro-Longoria, E. Comparative live-cell imaging analyses of SPA-2, BUD-6 and BNI-1 in Neurospora crassa reveal novel features of the filamentous fungal polarisome. PloS one. 7 (1), 30372(2012).
  17. Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
  18. Dijksterhuis, J., Molenaar, D. Vesicle trafficking via the Spitzenkörper during hyphal tip growth in Rhizoctonia solani. Antonie van Leeuwenhoek. 103 (4), 921-931 (2013).
  19. Hickey, P. C., Read, N. D. Imaging living cells of Aspergillus in vitro. Medical Mycology. 47, 110-119 (2009).
  20. Delgado-Álvarez, D. L., Bartnicki-García, S., Seiler, S., Mouriño-Pérez, R. R. Septum development in Neurospora crassa: the septal actomyosin tangle. PLoS One. 9 (5), 96744(2014).
  21. Hageage, G. J., Harrington, B. J. Use of Calcofluor White in clinical mycology. Laboratory Medicine. 15 (2), 109-112 (1984).
  22. Monheit, J. E., Cowan, D. F., Moore, D. G. Rapid detection of fungi in tissues using Calcofluor White and fluorescence microscopy. Archives of Pathology and Laboratory. 108 (8), 616-618 (1984).
  23. Herth, W., Schnepf, E. The fluorochrome Calcofluor White binds oriented to structural polysaccharide fibrils. Protoplasma. 105 (1-2), 129-133 (1980).
  24. Elorza, M. V., Rico, H., Sentandreu, R. Calcofluor White alters the assembly of chitin fibrils in Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans cells. Journal of General Microbiology. 129 (5), 1577-1582 (1983).
  25. Lagorce, A., et al. Genome-wide analysis of the response to cell wall mutations in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 20345-20357 (2003).
  26. Sanz, A. B., García, R., Rodríguez-Peña, J. M., Arroyo, J. The CWI Pathway: regulation of the transcriptional adaptive response to cell wall stress in yeast. Journal of Fungi. 4 (1), (2017).
  27. Slifkin, M., Cumbie, R. Congo Red as a fluorochrome for the rapid detection of fungi. Journal of Clinical Microbiology. 26 (5), 827-830 (1988).
  28. Michels, J., Büntzow, M. Assessment of Congo Red as a fluorescence marker for the exoskeleton of small crustaceans and the cuticle of polychaetes. Journal of Microscopy. 238 (2), 95-101 (2010).
  29. Pancaldi, S., Poli, F., Dall'Olio, G., Vannini, G. L. Morphological anomalies induced by Congo Red in Aspergillus niger. Archives of Microbiology. 137 (3), 185-187 (1984).
  30. Roncero, C., Durán, A. Effect of Calcofluor White and Congo Red on fungal cell wall morphogenesis: in vivo activation of chitin polymerization. Journal of Bacteriology. 163 (3), 1180-1185 (1985).
  31. Kopeck, M., Gabriel, M. The influence of Congo Red on the cell wall and (1,3)- β-d-glucan microfibril biogenesis in Saccharomyces cerevisiae. Archives of Microbiology. 158 (2), 115-126 (1992).
  32. Heilmann, C. J., et al. Surface stress induces a conserved cell wall stress response in the pathogenic fungus Candida albicans. Eukayotic Cell. 12 (2), 254-264 (2013).
  33. Hoch, H. C., Galvani, C. D., Szarowski, D. H., Turner, J. N. Two new fluorescent dyes applicable for visualization of fungal cell walls. Mycologia. 97 (3), 580-588 (2005).
  34. Liesche, J., Ziomkiewicz, I., Schulz, A. Super-resolution imaging with Pontamine Fast Scarlet 4BS enables direct visualization of cellulose orientation and cell connection architecture in onion epidermis cells. BMC Plant Biology. 13, 226(2013).
  35. Ursache, R., Andersen, T. G., Marhavý, P., Geldner, N. A protocol for combining fluorescent proteins with histological stains for diverse cell wall components. The Plant Journal. 93 (2), 399-412 (2018).
  36. Knight, N. L., Sutherland, M. W. A rapid differential staining technique for Fusarium pseudograminearum in cereal tissues during crown rot infections. Plant Pathology. 60 (6), 1140-1143 (2011).
  37. Fajardo-Somera, R. A., et al. Dissecting the function of the different chitin synthases in vegetative growth and sexual development in Neurospora crassa. Fungal Genetics and Biology. 75, 30-45 (2015).
  38. Lichius, A. Cell Fusion in Neurospora crassa. , The University of Edinburgh. Edinburgh (UK). Doctor of Philosophy (Ph.D.) (2010).
  39. Chen, W., Li, W., Dong, X., Pei, J. A Review of Biological Image Analysis. Current Bioinformatisc. 13 (4), 337-343 (2018).
  40. Live cell imaging: A laboratory manual. Goldman, R. D., Swedlow, J., Spector, D. L. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2010).
  41. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature methods. 9 (7), 697-710 (2012).
  42. Zemanek, G., Jagusiak, A., Chłopaś, K., Piekarska, B., Stopa, B. Congo Red fluorescence upon binding to macromolecules - a possible explanation for the enhanced intensity. Bio-Algorithms and Med-Systems. 13 (2), 1187(2017).
  43. Hickey, P. C., Jacobson, D. J., Read, N. D., Louise Glass, N. Live-cell imaging of vegetative hyphal fusion in Neurospora crassa. Fungal Genetics and Biology. 37 (1), 109-119 (2002).
  44. Hamamatsu Si APD - high sensitivity photodiodes having an internal gain mechanism: Avalanche photodiode selection guide 2019. , Available from: https://www.hamamatsu.com/resources/pdf/ssd/si_apd_kapd0001e.pdf (2019).
  45. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, 1205(2015).
  46. Thomas, J., Idris, N. A., Collings, D. A. Pontamine Fast Scarlet 4B bifluorescence and measurements of cellulose microfibril angles. Journal of Microscopy. 268 (1), 13-27 (2017).
  47. Ram, A. F. J., Klis, F. M. Identification of fungal cell wall mutants using susceptibility assays based on Calcofluor White and Congo Red. Nature Protocols. 1 (5), 2253-2256 (2006).
  48. Toshima, J. Y., et al. Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives. Proceedings of the National Academy of Science of the USA. 103 (15), 5793-5798 (2006).
  49. Kilaru, S., Schuster, M., Latz, M., Guo, M., Steinberg, G. Fluorescent markers of the endocytic pathway in Zymoseptoria tritici. Fungal Genetics and Biology. 79, 150-157 (2015).
  50. Fu, C., Tanaka, A., Free, S. J. Neurospora crassa 1,3-α-glucan synthase, AGS-1, is required for cell wall biosynthesis during macroconidia development. Microbiology. 160, Pt 8 1618-1627 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Barwienie b onbarwienie cian kom rkowychFM 1 43FM 4 64Calcofluor Whiteczerwie kongowadynamika organelli
Zastosowanie selektywnych barwników fluorescencyjnych błonowych i ścian komórkowych do obrazowania żywych komórek grzybów strzępkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.