Przygotowanie kompleksów modelowych SNS z kleszczami kobaltu(II) dehydrogenazy alkoholowej wątroby jest przedstawione tutaj. Kompleksy można otrzymać w reakcji prekursora liganda z CoCl2·6H2O, a następnie można je rekrystalizować, pozwalając eterowi dietylowemu powoli dyfundować do roztworu acetonitrylu zawierającego kompleks kobaltu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Otrzymywanie kompleksów modelu cęgowego SNS kobaltu(II) dehydrogenazy alkoholowej wątroby
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kompleksy modeli chemicznych są przygotowane do reprezentowania miejsca aktywnego enzymu. W tym protokole rodzina prekursorów ligandów kleżkowych z trójzębem (z których każdy posiada dwie funkcje atomu donora siarki i jednego atomu donora azotu (SNS) i jest oparta na związkach bis-imidazolowych lub bis-triazolowych) jest metalizowana CoCl2·6H2O, aby uzyskać trójzębne kompleksy SNS szczypcowe kobalt(II). Przygotowanie kompleksów modelowych kobaltu(II) dla dehydrogenazy alkoholowej w wątrobie jest łatwe. W oparciu o szybką zmianę koloru po dodaniu CoCl2·6H2O do roztworu acetonitrylu, który zawiera prekursor ligandu, kompleks tworzy się szybko. Tworzenie kompleksu metalu jest zakończone po pozostawieniu roztworu do refluksu przez noc. Te kompleksy kobaltu(II) służą jako modele miejsca aktywnego w dehydrogenazie alkoholowej wątroby (LADH). Kompleksy scharakteryzowano za pomocą dyfrakcji rentgenowskiej monokryształów, spektrometrii mas elektrorozpylania, spektroskopii ultrafioletowej w świetle widzialnym i analizy pierwiastkowej. Aby dokładnie określić strukturę kompleksu, należy określić jego strukturę monokrystaliczną. Monokryształy kompleksów, które nadają się do dyfrakcji rentgenowskiej, są następnie hodowane przez powolną dyfuzję par eteru dietylowego do roztworu acetonitrylu zawierającego kompleks kobaltu(II). W przypadku kryształów wysokiej jakości rekrystalizacja zwykle trwa 1 tydzień lub dłużej. Metoda może być stosowana do przygotowania innych modelowych kompleksów koordynacyjnych i może być stosowana w laboratoriach dydaktycznych na studiach licencjackich. Wreszcie, uważa się, że inni mogą uznać tę metodę rekrystalizacji za korzystną dla ich badań w celu uzyskania monokryształów.
Wprowadzenie
Celem prezentowanej metody jest przygotowanie małocząsteczkowych analogów LADH w celu lepszego zrozumienia katalitycznej aktywności metaloenzymów. LADH jest enzymem dimerycznym, który zawiera domenę wiążącą kofaktor i domenę katalityczną zawierającą metal(II)1. LADH, w obecności kofaktora NADH, może redukować ketony i aldehydy do ich odpowiednich pochodnych alkoholowych2. W obecności NAD+, LADH może przeprowadzić odwrotną katalizę utleniania alkoholi do ketonów i aldehydów2. Struktura krystaliczna miejsca aktywnego LADH pokazuje, że jego metaliczny środek(II) jest związany z jednym atomem azotu, dostarczanym przez łańcuch boczny histydyny i dwa atomy siarki oraz oferowanym przez dwa ligandy cysteiny3. Dalsze badania wykazały, że centrum metalicznego jest podwiązane labilną cząsteczką wody, co skutkuje geometrią pseudo-czworościenną wokół środka metalu4.
Wcześniej opisywaliśmy i wykorzystywaliśmy prekursory ligandów SNS z ZnCl2, a także metalizowaliśmy prekursory ligandów za pomocą ZnCl 2 w celu utworzenia kompleksów Zn(II), które zawierają prekursor ligandu trójzębnego5,xref"6,7. Te prekursory ligandów są pokazane w Rysunek 1. Te kompleksy(II) wykazywały aktywność w zakresie stechiometrycznej redukcji aldehydów ubogich w elektrony, a zatem są kompleksami modelowymi dla LADH. Następnie opisano syntezę i charakterystykę szeregu kompleksów miedzi(I) i miedzi(II), które zawierają prekursory ligandów SNS8,9,10.
Chociaż LADH jest enzymem cynkowym(II), jesteśmy zainteresowani przygotowaniem kompleksów modelowych kobaltu(II) LADH w celu uzyskania większej ilości informacji spektroskopowych na temat analogów kobaltu(II) LADH. Kompleksy kobaltu(II) są barwione, podczas gdy kompleksy(II) są białawe. Ponieważ kompleksy kobaltu(II) są zabarwione, można uzyskać widma kompleksów w ultrafiolecie widzialnym, w których można również zebrać informacje o sile pola ligandowego w kompleksach kobaltu(II). Wykorzystując informacje z obliczeń Gaussa i eksperymentalnie uzyskanych widm widzialnych w ultrafiolecie, można wydedukować informacje o natężeniu pola ligandowego. Kobalt(II) jest dobrym substytutem(II), ponieważ oba jony mają podobne promienie jonowe i podobną kwasowość Lewisa11,12.
Przedstawiona metoda polega na syntezie i charakterystyce kompleksów modelowych w celu naśladowania naturalnego zachowania katalitycznego LADH5,6. Wcześniej metalizowaliśmy rodzinę prekursorów ligandów za pomocą ZnCl2 w celu utworzenia kompleksów modelowych(II) LADH, które modelowały strukturę i reaktywność miejsca aktywnego w LADH4. Dzięki wielu eksperymentom te ligandy cęgowe okazały się wytrzymałe w różnych warunkach środowiskowych i pozostały stabilne dzięki różnorodnemu zbiorowi przyłączonych grup R. 5,6
Ligandy trójzębne są preferowane w porównaniu do ligandów jednozębnych, ponieważ stwierdzono, że są one bardziej skuteczne w metalizacji ze względu na silne działanie chelatowe ligandów trójzębnych. Ta obserwacja wynika z bardziej korzystnej entropii tworzenia liganda szczypcowego trójzębnego w porównaniu z ligandem jednozębnym13. Co więcej, trójzębne ligandy cęgowe prawdopodobnie zapobiegają dimeryzacji kompleksów metali, co jest korzystne, ponieważ dimeryzacja prawdopodobnie spowolni aktywność katalityczną kompleksu14. W związku z tym udowodniono, że stosowanie trójzębnych ligandów szczypcowych jest skuteczne w chemii metaloorganicznej w otrzymywaniu katalitycznych aktywnych i wytrzymałych kompleksów. Kompleksy szczypcowe SNS zostały mniej zbadane niż inne systemy szczypcowe, ponieważ kompleksy cęgowe zwykle zawierają metale przejściowe drugiego i trzeciego rzędu15.
Te badania nad metaloenzymami mogą pomóc w lepszym zrozumieniu ich aktywności enzymatycznej, która może być zastosowana w innych dziedzinach biologii. Ta metoda syntezy kompleksów modelowych w porównaniu z metodą alternatywną (synteza całego białka LADH) jest korzystna z wielu powodów. Pierwszą zaletą jest to, że kompleksy modelowe mają niską masę cząsteczkową i nadal są w stanie dokładnie odwzorować aktywność katalityczną i warunki środowiskowe naturalnego miejsca aktywnego enzymu. Po drugie, kompleksy modeli są prostsze w obsłudze i generują wiarygodne i powiązane dane.
Ten manuskrypt opisuje syntetyczne przygotowanie i charakterystykę dwóch kompleksów modelu szczypcowego kobaltu(II) LADH. Oba kompleksy zawierają ligand cęgowy, który zawiera atomy donora siarki, azotu i siarki. Pierwszy kompleks (4) oparty jest na prekursorze imidazolu, a drugi (5) oparty jest na prekursorze triazolu. Kompleksy wykazują reaktywność w zakresie redukcji stechiometrycznej aldehydów ubogich w elektrony w obecności donora wodoru. Wyniki tej reaktywności zostaną przedstawione w kolejnym manuskrypcie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Synteza chloro-(n 3-S,S,N)-[2,6-bis(N-izopropylo-N'-metylenoimidazol-2-tion)pirydyny]kobalt(II)tetrachlorokobaltanian [4]
- Aby przygotować kompleks 4, dodać 0,121 g (3,12 x 10-4 mol) 2,6-bis(N-izopropylo-N'-metylenoimidazolo-2-tion)pirydyny (C19H25N5S2)6 do 15 ml acetonitrylu w kolbie okrągłodennej o pojemności 100 ml. Następnie do tego roztworu dodać 0,0851 g (3,58 x 10-4 mol) sześciowodnego chlorku kobaltu(II) (CoCl2·6H2O). Roztwór reakcyjny powinien zmienić barwę z jasnożółtej na szmaragdowozieloną natychmiast po dodaniu sześciowodnego chlorku kobaltu(II).
- Dodaj mieszadło do kolby. Refluks i mieszaj reakcję przez 20 godzin, aby zapewnić pełną reakcję. Usunąć rozpuszczalnik za pomocą rotovapu pod zmniejszonym ciśnieniem.
2. Rekrystalizacja chloro-(n 3-S,S,N)-[2,6-bis(N-izopropylo-N'-metylenoimidazol-2-tion)pirydyno]kobalt(II)tetrachlorokobaltan [4] przez powolną dyfuzję par
- Rozpuścić substancję rozpuszczoną w acetonitrylu (7,5 ml), przefiltrować roztwór i równomiernie umieścić roztwór w 1 fiolkach dram. Napełnij każdą fiolkę 1,5 ml roztworu acetonitrylu.
- Dodaj bawełnę do zakrętki fiolek, co pozwala na powolną dyfuzję pary. Umieścić bawełnę w otworze w górnej części fiolki.
- Umieścić fiolki w słoiku o pojemności 240 ml zawierającym 50 ml eteru dietylowego. Zamknij słoik nakrętką.
- Pozwól kryształom rosnąć przez okres 1 tygodnia.
UWAGA: Rekrystalizacja może trwać dłużej niż 1 dzień.
3. Synteza chloro-(n 3-S,S,N)-[2,6-bis(N-izopropylo-N'-metylenotriazol-2-tion)pirydyny]kobaltu(II)tetrachlorokobaltanianu [5]
- Aby przygotować kompleks 5, dodać 0,183 g (4,70 x 10-4 mol) 2,6-bis(N-izopropylo-N'-metylenotriazolo-2-tion)pirydyny (C17H23N7S2)6 do 15 ml acetonitrylu w kolbie okrągłodennej o pojemności 100 ml. Do tego roztworu dodać 0,223 g (9,37 x 10-4 mol) sześciowodnego chlorku kobaltu (CoCl2·6H2O). Roztwór reakcyjny powinien zmienić barwę z jasnożółtej na królewski błękitną natychmiast po dodaniu sześciowodnego chlorku kobaltu(II).
- Dodaj mieszadło do kolby. Refluks i mieszaj reakcję przez 20 godzin, aby zapewnić pełną reakcję. Usunąć rozpuszczalnik za pomocą rotovapu pod zmniejszonym ciśnieniem.
4. Rekrystalizacja chloro-(n 3-S,S,N)-[2,6-bis(N-izopropylo-N'-metylenotriazol-2-tion)pirydyno]kobalt(II)tetrachlorokobaltanian [5] przez powolną dyfuzję par
- Rozpuścić substancję rozpuszczoną w acetonitrylu (9,0 ml), przefiltrować roztwór i równomiernie umieścić roztwór w 1 fiolkach dram. Napełnij każdą fiolkę 1,5 ml roztworu acetonitrylu.
- Dodaj bawełnę do zakrętki fiolek, co pozwala na powolną dyfuzję pary. Umieścić bawełnę w otworze w górnej części fiolki.
- Umieścić fiolki w słoiku zawierającym 50 ml eteru dietylowego. Zamknąć fiolkę nakrętką.
- Pozwól kryształom rosnąć przez okres 1 tygodnia.
UWAGA: Rekrystalizacja może trwać dłużej niż 1 dzień.
5. Krystalografia rentgenowska
- Zamontuj kryształ o średnicy 4 na nylonowej pętli. Zbierz dane za pomocą dyfraktometru dyfrakcyjnego Rigaku Oxford. Tutaj dane dyfrakcji rentgenowskiej są zbierane w temperaturze 173(2) K. Rozwiąż strukturę krystaliczną za pomocą Olex216 i ShelXT17 roztworów strukturalnych przy użyciu metod bezpośrednich. Uściślij strukturę za pomocą pakietu uściślającego ShelXL18 przy użyciu minimalizacji metodą najmniejszych kwadratów.
- Zamontuj kryształ o średnicy 5 na nylonowej pętli. Zbierz dane dyfrakcji rentgenowskiej na dyfraktometrze dyfrakcyjnym Rigaku Oxford. Tutaj dane dyfrakcji rentgenowskiej są zbierane w temperaturze 173(2) K. Rozwiąż strukturę krystaliczną za pomocą Olex216 i ShelXT17 roztworów strukturalnych przy użyciu metod bezpośrednich. Uściślij strukturę za pomocą pakietu uściślającego ShelXL18 przy użyciu minimalizacji metodą najmniejszych kwadratów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Synteza
Syntezy kompleksów 4 i 5 przeprowadzono pomyślnie poprzez reakcję roztworu w acetonitrylu zawierającego prekursor liganda bis-tionowego z sześcionawodnikiem chlorku kobaltu(II) (Ryc. 2). Reakcja ta zachodziła w temperaturze wrzenia z powrotem w obecności powietrza. Ogólnie stwierdzono, że kompleksy 4 i 5 są rozpuszczalne w acetonitrylu, dimetylosulfotlenku, dichlorometanie i metanolu. Kompleks
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przygotowanie kompleksów 4 i 5 jest łatwe. Kluczowym krokiem jest dodanie stałego CoCl2·6H2O do roztworu acetonitrylu, który zawiera odpowiedni prekursor ligandu. Roztwór zmienia kolor na ciemnozielony w ciągu kilku sekund po dodaniu CoCl2·6H2O, tworząc kompleks 4. Roztwór zmienia kolor na jasnoniebieski po dodaniu CoCl2·6H2O, tworząc kompleks 5. Aby zapewnić pełną reakcję, roztwór umieszc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
John Miecznikowski otrzymał wsparcie finansowe od następujących organizacji: Connecticut NASA Space Grant Alliance (numer nagrody P-1168), Fairfield University Science Institute, College of Arts and Sciences Publication Fund, Fairfield University Faculty Summer Research Scholarship oraz National Science Foundation-Major Research Instrumentation Program (numer grantu CHE-1827854) na fundusze na zakup spektrometru NMR 400 MHz. Dziękuje również Terence'owi Wu (Uniwersytet Yale) za pomoc w uzyskaniu widm masowych elektrorozpylania. Jerry Jasinski dziękuje Narodowej Fundacji Nauki - Głównemu Programowi Oprzyrządowania Badawczego (numer grantu CHE-1039027) za fundusze na zakup dyfraktometru rentgenowskiego. Sheila Bonitatibus, Emilse Almanza, Rami Kharbouch i Samantha Zygmont dziękują programowi Hardiman Scholars za zapewnienie im letniego stypendium naukowego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 100 ml kolby z okrągłym dnem | Szkło chemiczne | CG150691 | 100 ml kolba okrągłodenna z pojedynczą szyjką, 19/22 Złącze zewnętrzne |
| Acetonitryl | Fisher | HB9823-4 | |
| Agregat chłodniczy klasy HPLC do roto-vap | Lauda | L000638 | Alpha RA 8 |
| Sześciowodny chlorek kobaltu | Acros Organics | AC423571000 | Acros Organics |
| Eter | dietylowyFisher | E-138-1 | Eter dietylowy Anhydorus |
| Cylinder z podziałką | Fisher | S63456 | 25 mL cylindryczna płyta |
| grzejna | z | 11-100-49SH | Isotemp Basic Mieszadło Słoiki z płytą grzejną |
| Fisher | 05-719-481 | Słoiki 250 ml | |
| Ligand | ----- | ----- | Zsyntetyzowany wcześniej przez profesora Miecznikowskiego |
| pożywka waciki | Fisher | 22-456-80 | średnie waciki |
| fiolka dram | Fisher | 03-339 | fiolki one dram z nasadką TFE |
| Fisher | 13-678-20B | 5,75 cala pipety | |
| żarówki do pipet | Fisher | 03-448-21 | Fisher Brand Lateks Żarówka do pipet |
| naczynie rekrystalizujące do kąpieli piaskowej | Fisher | 08-741 D | 325 mL naczynie rekrystalizujące do kąpieli piaskowej |
| skraplacz zwrotny | Chem Glass | CG-1218-A-22 | Skraplacz z wewnętrznym złączem 19/22 |
| Rotovap | Heidolph Collegiate | 36000090 | Brinkmann; Parownik obrotowy Heidolph Collegiate z wanną ekologiczną Heidolph WB Parownik obrotowy Heidolph |
| morski do kąpieli piaskowej | Acros Organics | 612355000 | płukany piasek morski do kąpieli piaskowej |
| Mieszadło | Fisher | 07-910-23 | Magnetyczny pręt |
| Smar próżniowy | Fisher | 14-635-5D | Dow Corning Pompa |
| próżniowa do smaru wysokopróżniowego do rotovap | Heidolph Collegiate | 36302830 | Sterowanie zaworem Heidolph Rotovac |
Bibliografia
- Holm, R. H., Kennepohl, P., Solomon, E. I. Structural and Functional Aspects of Metal Sites in Biology. Chemical Reviews. 96 (7), 2239-2314 (1996).
- Ibers, J. A., Holm, R. H. Modeling coordination sites in metallobiomolecules. Science. 209 (4453), 223-235 (1980).
- Kannan, K. K., et al. Crystal structure of human erythrocyte carbonic anhydrase B. Three-dimensional structure at a nominal 2.2-A resolution. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 72 (1), 51-55 (1975).
- Eklund, H., Brändén, C. I. Structural differences between apo- and holoenzyme of horse liver alcohol dehydrogenase. Journal of Biological Chemistry. 254, 3458-3461 (1979).
- Miecznikowski, J. R., et al. Syntheses, Characterization, Density Functional Theory Calculations and Activity of Tridentate SNS Zinc Pincer Complexes. Inorganica Chimica Acta. 376, 515-524 (2011).
- Miecznikowski, J. R., et al. Syntheses, Characterization, Density Functional Theory Calculations, and Activity of Tridentate SNS Zinc Pincer Complexes Based on Bis-Imidazole or Bis-Triazole Precursors. Inorganica Chimica Acta. 387, 25-36 (2012).
- Sunderland, J. R., et al. Investigation of liver alcohol dehydrogenase catalysis using an NADH biomimetic and comparison with a synthetic zinc model complex. Polyhedron. 114, 145-151 (2016).
- Miecznikowski, J. R., et al. Synthesis and characterization of three- and five-coordinate copper(II) complexes based SNS ligand precursors. Polyhedron. 80, 157-165 (2014).
- Miecznikowski, J. R., et al. Synthesis, Characterization, and Computational Study of Three-Coordinate SNS Copper(I) Complexes based on Bis-Thione Ligand Precursors. Journal of Coordination Chemistry. 67, 29-44 (2014).
- Lynn, M. A., et al. Copper(I) SNS Pincer Complexes: Impact of Ligand Design and Solvent Coordination on Conformer Interconversion from Spectroscopic and Computational Studies. Inorganica Chimica Acta. 495, (2019).
- Web Elements. , Available from: https://www.webelements.com/zinc/atom_sizes.html (2019).
- Web Elements. , Available from: https://www.webelements.com/cobalt/atom_sizes.html (2019).
- Caballero, A., Díez-Barra, E., Jalón, F. A., Merino, S., Tejeda, J. 1,1'-(pyridine-2,6-diyl)bis(3-benzyl-2,3-dihydro-1H-imidazol-2-ylidine), a new multidentate N-heterocyclic bis-carbene and its silver(I) complex derivative. Journal of Organometallic Chemistry. 617-618, 395-398 (2001).
- Albrecht, M., van Koten, G. Platinum Group Organometallics Based on "Pincer" Complexes: Sensors, Switches, and Catalysis. Angewandte Chemie International Edition. 40 (20), 3750-3781 (2001).
- Peris, E., Crabtree, R. H. Key factors in pincer ligand design. Chemistry Society Reviews. 47, 1959-1968 (2018).
- Dolomanov, O. V., Bourhis, L. J., Gildea, R. J., Howard, J. A. K., Puschmann, H. A complete structure, solution, refinement, and analysis program. Journal of Applied Crystallography. 42, 339-341 (2009).
- Sheldrick, G. M. Integrated Space Group and Crystal Structure Determination. Acta Crystallography. 71, 3-8 (2015).
- Sheldrick, G. M. Crystal Structure Refinement with SHELXL. Acta Crystallography. 71, 3-8 (2015).
- Pauling, L. Metal-metal bond lengths in complexes of transition metals. Proceedings of the National Academies of the Sciences of the United States of America. 73, 4290-4293 (1976).
- Trzhtsinskaya, B. V., Abramova, N. D. Imidazole-2-Thiones: Synthesis, Structure, Properties. Sulfur Reports. 10 (4), 389(1991).
- Schneider, G., Eklund, H., Cedergren-Zeppezauer, E., Zeppezauer, M. Crystal structure of the active site in specifically metal-depleted and cobalt substituted horse liver alcohol dehydrogenase derivatives. Proceedings of the National Academies of the Sciences of the United States of America. 80, 5289-5293 (1983).
- Yang, L., Powell, D. R., Houser, R. P. Structural variation in copper(I) complexes with pyridylmethylamide ligands: structural analysis with a new four-coordinate geometry index, τ4. Dalton Transactions. , 955-964 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
