Rozprzestrzenianie się powierzchni jądrowej jest niezbędnym narzędziem do badania zdarzeń chromosomowych podczas mejozy. Tutaj demonstrujemy metodę przygotowania i wizualizacji chromosomów mejotycznych podczas profazy I ze spermatocytów danio pręgowanego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów danio pręgowanego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mejoza jest kluczowym procesem komórkowym wymaganym do tworzenia haploidalnych gamet do rozmnażania płciowego. Organizmy modelowe odegrały zasadniczą rolę w zrozumieniu zdarzeń chromosomowych, które zachodzą podczas profazy mejotycznej, w tym zdarzeń parowania, synapsy i rekombinacji, które zapewniają prawidłową segregację chromosomów. Chociaż mysz była ważnym modelem dla zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tych procesów, nie wszystkie zdarzenia mejotyczne w tym systemie są analogiczne do mejozy u ludzi. Niedawno zademonstrowaliśmy ekscytujący potencjał danio pręgowanego jako modelu ludzkiej spermatogenezy. Tutaj szczegółowo opisujemy nasze metody wizualizacji chromosomów mejotycznych i związanych z nimi białek w preparatach do rozprzestrzeniania chromosomów. Preparaty te mają tę zaletę, że umożliwiają analizę struktur chromosomowych w wysokiej rozdzielczości. Najpierw opisujemy procedurę preparowania jąder od dorosłego danio pręgowanego, a następnie dysocjacji komórek, lizy i rozprzestrzeniania chromosomów. Następnie opisujemy procedurę wykrywania lokalizacji mejotycznych białek chromosomowych przez detekcję immunofluorescencyjną i sekwencje kwasów nukleinowych przez fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH). Techniki te stanowią użyteczny zestaw narzędzi do cytologicznej analizy architektury chromatyny mejotycznej w systemie danio pręgowanego. Naukowcy zajmujący się społecznością danio pręgowanego powinni być w stanie szybko opanować te techniki i włączyć je do swoich standardowych analiz funkcji rozrodczych.
Wprowadzenie
Rozmnażanie płciowe przebiega poprzez połączenie dwóch haploidalnych gamet, z których każda zawiera połowę chromosomu komórki somatycznej. Mejoza to wyspecjalizowany podział komórki, który wytwarza haploidalne gamety poprzez jedną rundę replikacji DNA i dwie kolejne rundy segregacji chromosomów. W profazie I chromosomy homologiczne (homologi) muszą przejść parowanie, rekombinację i synapsę, z których ta ostatnia charakteryzuje się tworzeniem kompleksu synaptonemalnego, który składa się z dwóch osi homologu połączonych poprzecznym włóknem Sycp1 (ryc. 1A, B). Niewłaściwe wykonanie tych procesów może prowadzić do produkcji gamet aneuploidalnych, które są....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie metody z udziałem danio pręgowanego zostały przeprowadzone przy użyciu standardów etycznych zatwierdzonych przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na UC Davis.
1. Procedura rozprzestrzeniania chromosomów
UWAGA: Poniższy protokół jest przeznaczony do tworzenia 4-6 szkiełek, z setkami rozproszonych jąder mejotycznych na każdym slajdzie. Liczba użytych jąder będzie zależeć od wielkości ryby. Spodziewaj się użycia 20 zwierząt po ~60 dniach od zapłodnienia (dpf) i 15 zwierząt po ~6 miesiącach po zapłodnieniu (mpf). W przypadku dużych danio pręgowanych (np. 12 mpf) powinno wystarczyć 10 ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Opisaliśmy metodę przygotowania i wizualizacji preparatów rozproszonych spermatocytów ryby zebrafish. Prawidłowo przeprowadzona procedura pozwala uzyskać dobrze rozproszone, nienakładające się jądra komórkowe. Aby odzyskać takie jądra, istotne jest zastosowanie odpowiedniej ilości materiału wyjściowego (tj. jąder), poddanie jąder działaniu trypsyny przez wystarczająco długi czas oraz przeprowadzenie odpowiedniej liczby inkubacji z DNaza I. Takie preparaty rozproszone mogą być następnie ba.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym miejscu opisujemy metody badania lokalizacji telomerów i białek związanych z chromosomami w rozprzestrzenianiu się powierzchni jądrowej ze spermatocytów wyizolowanych z jąder danio pręgowanego. Spodziewamy się, że metody te będą miały zastosowanie do analizy spermatocytów u innych gatunków teleostów z dostosowaniem do wielkości jądra.
Chociaż tylko kilka przeciwciał zostało podniesionych do białek mejotycznych danio pręgowanego, odnieśliśmy sukces przy użyciu następujących przeciwciał po.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Trentowi Newmanowi i Masudzie Sharifi za komentarze do manuskryptu oraz An Nguyenowi za pomoc w optymalizacji metod rozprzestrzeniania i barwienia chromosomów z mejocytów danio pręgowanego. Praca ta była wspierana przez NIH R01 GM079115 przyznany SMB.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówki wirówkowe 1,5 ml Dostępnych | jest kilka marek komercyjnych | ||
| Stojak na probówki do mikrowirówek 1,5 ml | Dostępnych | ||
| 16% formaldehydu, bez metanolu | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 2 ml | kilka marek komercyjnych | ||
| Szkiełka nakrywkowe szklane 24 x 50 mm | Corning | 2980-245 | |
| Szkiełka nakrywkowe 24 x 60 mm | VWR International | 16004-312 | |
| Stożkowe probówki wirówkowe 50 ml | ThermoFisher Scientific | 363696 | |
| Torba do autoklawu | Dostępnych | Służy do produkcji plastikowych szkiełek nakrywkowych. | |
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | Fisher Scientific | BP1605-100 | Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 100 mg/ml w sterylnej wodzie destylowanej. |
| Sitko komórkowe, 100 i mikro; m | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| CF405M koza anty-kurczak IgY (H + L), wysoce adsorbowany krzyżowo | Biotium | 203775-500uL | Użyj w 1:1000 |
| Kurczak anty-zfSycp1 | Generowany przez laboratorium Burgess | Nie | dotyczy Użyj w 1:100 |
| Kolagenaza z Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130-500MG | |
| Słoik Coplin | Kilka dostępne | ||
| DNaza I, stopień II z trzustki bydlęcej | Roche Diagnostics | 10104159001 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT10014CV | |
| Dumont No. 5 Kleszcze | Fine Science Tools | 11252-30 | Do preparowania jąder wymagane są dwa. |
| Probówki Eppendorf, 5 ml | VWR International | 89429-308 | |
| Formamid | Fisher Scientific | BP228-100 | |
| Kozie przeciwciało drugorzędowe anty-kurczaka IgY (H+L), Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11039 | Stosować w stosunku 1:1000 |
| Przeciwciało drugorzędowe przeciw kurczakom IgY (H+L) kozie, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11042 | Stosować w 1:1000 |
| Kozia anty-hDMC1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8973 | Nie działa w naszych rękach |
| Kozie przeciwciało wtórne anty-królicze IgG (H + L) adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | Użyj w 1:1000 |
| Kozie przeciwciało wtórne anty-królicze IgG (H + L), Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | Użyj w 1:1000 |
| Kozia surowica | Sigma-Aldrich | G9023-10mL | |
| Sól sodowa heparyny | Sigma-Aldrich | H3393-100KU | |
| Komora wilgotnościowa | Fisher Scientific | 50-112-3683 | |
| Piec hybrydowy | VWR International | 230401V (model 5420) | |
| Wytrząsarka do inkubatora | New Brunswick Scientific | Model Classic C25 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Kimwipes | Kimerbly-Clark Professional | 34155 | Używany do komory wilgotnościowej |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| jest kilka marek komercyjnych | Każdy standardowy mikroskop zdolny do powiększenia co najmniej ~1,65X jest wystarczający. | ||
| Szkiełka mikroskopowe | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mysz anty-chomikSCP3 | Abcam | ab97672 | Nie działa w naszych rękach |
| Mysz anty-hMLH1 | BD Biosciences | 550838 | Nie działa w naszych rękach |
| Mysz anty-hRPA | Sigma-Alrich | MABE285 | Nie działa w naszych rękach |
| Na2HPO4 · 7 H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Photo-Flo 200 | roztwór Mikroskopia elektronowa Nauki | 74257 | |
| Plastikowe pipety transferowe | Dostępnych | ||
| PNA TelC-Alexa647 | PNA Bio Inc | F1013 | Przygotuj zgodnie z wymaganiami producenta s instrukcje. |
| PNA TelC-Cy3 | PNA Bio Inc | F1002 | Przygotować zgodnie z instrukcjami producenta. |
| ProLong Diamond Anti-Fade | ThermoFisher Scientific | P36970 | |
| ProLong, Diamond, Anti-Fade, Mountant z DAPI | ThermoFisher Scientific | P36971 | |
| Królik anty-hRPA | Bethyl | A300-244A | Użyj w 1:300 |
| Królik anty-hSCP3 | Abcam | ab150292 | Użyj w 1:200 |
| Królik anty-hRad51 | GeneTex | GTX100469 | Użyj o 1:300 |
| Cytrynian sodu | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Sacharoza | Nożyczki Fisher Scientific | S5-500 | |
| Supercut, kąt 30&, 10 cm | Fisher Scientific | 50-822-353 | Można również użyć dowolnej pary małych nożyczek. |
| Zestaw | Sylgard Fisher Scientific | NC9897184 | Przygotuj zgodnie z instrukcjami producenta. |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Rozcieńczyć w sterylnej wodzie destylowanej, aby uzyskać 20% roztwór roboczy. Przechowywać w temperaturze pokojowej. Triton X-100 tworzy osad po rozcieńczeniu w wodzie; Osad rozpuszcza się w ciągu nocy. |
| Trypsyna | Worthington Biochemical | LS003708 | |
| Inhibitor trypsyny z białka jaja kurzego | Sigma-Aldrich | T9253-500MG | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 170-6531 | Rozcieńczyć w sterylnej wodzie destylowanej, aby uzyskać 20% roztwór roboczy. Przechowywać w temperaturze pokojowej. |
| Nożyczki sprężynowe Vannas - 4 mm (mikronożyczki) | Narzędzia do nauki o naukach | 15018-10 |
Bibliografia
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs dur....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
