Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów danio pręgowanego

7.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60671

⸱

3 marca 2020

 ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, University of California, Davis, 2Integrative Genetics and Genomics Graduate Group, University of California, Davis

W tym artykule

Podsumowanie

Rozprzestrzenianie się powierzchni jądrowej jest niezbędnym narzędziem do badania zdarzeń chromosomowych podczas mejozy. Tutaj demonstrujemy metodę przygotowania i wizualizacji chromosomów mejotycznych podczas profazy I ze spermatocytów danio pręgowanego.

Streszczenie

Mejoza jest kluczowym procesem komórkowym wymaganym do tworzenia haploidalnych gamet do rozmnażania płciowego. Organizmy modelowe odegrały zasadniczą rolę w zrozumieniu zdarzeń chromosomowych, które zachodzą podczas profazy mejotycznej, w tym zdarzeń parowania, synapsy i rekombinacji, które zapewniają prawidłową segregację chromosomów. Chociaż mysz była ważnym modelem dla zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tych procesów, nie wszystkie zdarzenia mejotyczne w tym systemie są analogiczne do mejozy u ludzi. Niedawno zademonstrowaliśmy ekscytujący potencjał danio pręgowanego jako modelu ludzkiej spermatogenezy. Tutaj szczegółowo opisujemy nasze metody wizualizacji chromosomów mejotycznych i związanych z nimi białek w preparatach do rozprzestrzeniania chromosomów. Preparaty te mają tę zaletę, że umożliwiają analizę struktur chromosomowych w wysokiej rozdzielczości. Najpierw opisujemy procedurę preparowania jąder od dorosłego danio pręgowanego, a następnie dysocjacji komórek, lizy i rozprzestrzeniania chromosomów. Następnie opisujemy procedurę wykrywania lokalizacji mejotycznych białek chromosomowych przez detekcję immunofluorescencyjną i sekwencje kwasów nukleinowych przez fluorescencyjną hybrydyzację in situ (FISH). Techniki te stanowią użyteczny zestaw narzędzi do cytologicznej analizy architektury chromatyny mejotycznej w systemie danio pręgowanego. Naukowcy zajmujący się społecznością danio pręgowanego powinni być w stanie szybko opanować te techniki i włączyć je do swoich standardowych analiz funkcji rozrodczych.

Wprowadzenie

Rozmnażanie płciowe przebiega poprzez połączenie dwóch haploidalnych gamet, z których każda zawiera połowę chromosomu komórki somatycznej. Mejoza to wyspecjalizowany podział komórki, który wytwarza haploidalne gamety poprzez jedną rundę replikacji DNA i dwie kolejne rundy segregacji chromosomów. W profazie I chromosomy homologiczne (homologi) muszą przejść parowanie, rekombinację i synapsę, z których ta ostatnia charakteryzuje się tworzeniem kompleksu synaptonemalnego, który składa się z dwóch osi homologu połączonych poprzecznym włóknem Sycp1 (ryc. 1A, B). Niewłaściwe wykonanie tych procesów może prowadzić do produkcji gamet aneuploidalnych, które są główną przyczyną poronień u ludzi1. Nasza wiedza na temat koordynacji między parowaniem, rekombinacją i synapsą została ułatwiona dzięki badaniom na szerokiej gamie organizmów, takich jak między innymi drożdże, C. elegans, myszy i Drosophila2. Podczas gdy ogólny proces parowania chromosomów homologicznych, po którym następuje segregacja, jest dobrze zachowany, jego zależność od rekombinacji i synapsy oraz kolejność tych zdarzeń są różne.

Powstawanie dwuniciowego pęknięcia mejotycznego (DSB), które inicjuje rekombinację homologiczną, występuje w pobliżu telomerów skupionych w bukiecie podczas leptotenu, a synapsa następuje wkrótce potem3,4. Ta konfiguracja tworzenia DSB i inicjacji synapsy jest również charakterystyczna dla męskiej mejozy u ludzi, ale nie u myszy5,6,7,8, co sugeruje, że danio pręgowany może służyć jako model ludzkiej spermatogenezy. Istnieje również kilka praktycznych zalet badania mejozy danio pręgowanego. Zarówno samce, jak i samice przechodzą gametogenezę przez całe dorosłe życie, ich gonady są łatwo dostępne, a z jednej krzyżówki powstają setki potomstwa. Dodatkowo zarodki są przezroczyste i rozwijają się zewnętrznie, co ułatwia wczesne wykrycie aberracji w rozwoju embrionalnym spowodowanych aneuploidalnymi gametami3,9. Wadą stosowania danio pręgowanego jest to, że powoli osiągają dojrzałość płciową (~60 dni), a ilość materiału potrzebnego do rozprzestrzeniania się na powierzchni jądrowej należy zebrać od ~10-20 dorosłych zwierząt, w zależności od ich wielkości.

Preparaty do rozprzestrzeniania się chromosomów mejotycznych są niezbędnym narzędziem do badania dynamiki chromosomów we wszystkich organizmach modelowych, ponieważ można badać kluczowe sygnatury dynamiki chromosomów mejotycznych. U danio pręgowanego kluczowe aspekty postępu programu mejotycznego i organizacji jądrowej zostały przeanalizowane poprzez sondowanie rozprzestrzeniania się powierzchni jądrowej, określane tutaj jako rozprzestrzenianie się chromosomów, z przeciwciałami do immunofluorescencyjnego wykrywania białek i/lub kwasów nukleinowych przez FISH3,4,9,10,11,12. Rzeczywiście, spolaryzowana lokalizacja skupionych telomerów w bukiecie może być zachowana w preparacie do smarowania (ryc. 1C). Ostatnio wykorzystaliśmy rozprzestrzenianie się chromosomów spermatocytów danio pręgowanego wraz z metodami wykrywania fluorescencji i mikroskopią superrozdzielczą, aby wyjaśnić szczegółową progresję dynamiki telomerów danio pręgowanego, homologicznego parowania chromosomów, lokalizacji pęknięć dwuniciowych i synapsy w kluczowych przejściach mejotycznych3. W tym miejscu przedstawiamy metody przygotowania rozsiewów chromosomowych ze spermatocytów jąder danio pręgowanego, a następnie barwienia ich sondami fluorescencyjnego peptydu z kwasami nukleinowymi (PNA) do powtarzania sekwencji telomerów i wykrywania immunofluorescencji białek związanych z chromosomami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie metody z udziałem danio pręgowanego zostały przeprowadzone przy użyciu standardów etycznych zatwierdzonych przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na UC Davis.

1. Procedura rozprzestrzeniania chromosomów

UWAGA: Poniższy protokół jest przeznaczony do tworzenia 4-6 szkiełek, z setkami rozproszonych jąder mejotycznych na każdym slajdzie. Liczba użytych jąder będzie zależeć od wielkości ryby. Spodziewaj się użycia 20 zwierząt po ~60 dniach od zapłodnienia (dpf) i 15 zwierząt po ~6 miesiącach po zapłodnieniu (mpf). W przypadku dużych danio pręgowanych (np. 12 mpf) powinno wystarczyć 10 zwierząt. Należy pamiętać, że jądra niektórych mutantów mejotycznych (np. spo11-/-) będą nieco mniejsze3. W tym protokole jedna pula jąder jest traktowana jako pojedyncza próbka. Zaleca się, aby równolegle przygotować nie więcej niż 4 próbki.

  1. Przed rozpoczęciem procedury rozsiewania należy wykonać następujące roztwory
    UWAGA: Wygodnie jest przygotować następujące roztwory w ilościach określonych do użycia w przyszłych eksperymentach z rozsiewaniem.
    1. Przygotować 0,1 M roztwór sacharozy, rozpuszczając 3,42 g sacharozy w 100 ml wody destylowanej. Doprowadź roztwór sacharozy do pH 8 za pomocą 1 M Tris-HCl, który również ma pH 8. Następnie przefiltruj roztwór sacharozy, wysterylizuj go. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
    2. Przygotować 10-krotny roztwór podstawowy soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) do końcowego stężenia 1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 73 mM Na2HPO4 i 27,6 mM KH2PO4 w 1,8 l wody destylowanej. Mieszaj do rozpuszczenia, a następnie dostosuj pH do 7,3 za pomocą NaOH i autoklawu. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
    3. Przygotować 400 μg/ml roztworu DNazy I w sterylnej wodzie destylowanej. Przechowywać w temperaturze -20 °C. Zaleca się przygotowanie 5 ml tego roztworu, a następnie przechowywanie w postaci 100 μl porcji.
  2. Wykonaj następujące roztwory w dniu protokołu rozsiewu
    UWAGA: Aby zaoszczędzić czas, najlepiej jest przygotować roztwór kolagenazy natychmiast po wypreparowaniu wszystkich jąder, a następnie przygotować roztwory trypsyny i inhibitora trypsyny w czasie, gdy próbki są poddawane obróbce kolagenazą.
    1. Rozpuścić 4 mg kolagenazy w 200 μl zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco na próbkę (końcowe stężenie 2% w/v kolagenazy). Trzymaj na lodzie, aż będzie potrzebny. Kolagenaza rozdzieli jądra.
    2. Rozpuścić 1,4 mg trypsyny w 200 μl DMEM na próbkę (końcowe stężenie 0,7% w/v trypsyny). Trzymaj na lodzie, aż będzie potrzebny. Trypsyna pomoże oddzielić komórki.
    3. Rozpuścić 10 mg inhibitora trypsyny w 500 μl DMEM na próbkę (2% w/v inhibitora trypsyny stężenie końcowe). Trzymaj na lodzie, aż będzie potrzebny. Inhibitor trypsyny zapobiega degradacji komórek przez trypsynę.
    4. Przygotuj 1% roztwór formaldehydu (z 16% gotowego roztworu) z 0,15% Triton X-100 w sterylnej wodzie destylowanej. Trzymaj na lodzie, aż będzie potrzebny. 1% formaldehyd można przygotować, podczas gdy jądra są poddawane działaniu trypsyny i DNazy I (tj. podczas kroku 1.4.7 procedury rozprowadzania).
      UWAGA: Formaldehyd jest niebezpieczny.
  3. Sekcja jąder od dorosłego samca danio pręgowanego
    1. Poddaj eutanazji samce danio pręgowanego (> 60 dpf), zanurzając je w lodowatej wodzie. Ryby można trzymać w lodowatej wodzie, dopóki nie będą gotowe do sekcji, jednak należy je wyciąć tak szybko, jak to możliwe.
      UWAGA: Do tej procedury używany jest szczep typu dzikiego AB, ale inne szczepy typu dzikiego również powinny być dopuszczalne. Najdłuższy czas, w którym trzymaliśmy ryby w lodowatej wodzie przed preparacją, to 3 godziny bez zauważalnego wpływu na protokół.
    2. Odetnij głowę jednej ryby na raz małymi nożyczkami, a następnie użyj mikronożyczek, aby przeciąć wzdłuż brzusznej linii środkowej, aby odsłonić jamę ciała.
    3. Wypreparuj jądro za pomocą kleszczy (patrz tabela materiałów) w powiększeniu 1,65x pod mikroskopem. Przeprowadzić rozbiory na pokrytej silikonem szalce Petriego z przykrytą płytką kałużą 1x PBS.
      UWAGA: Jądro znajduje się pomiędzy pęcherzem pławnym a jelitem i będzie wydawać się lżejsze niż tkanka mięśniowa (Rysunek 2A). Jądro powinno mieć 2 płaty po usunięciu z danio pręgowanego (Rysunek 2B).
    4. Usuń jak najwięcej tłuszczu i otaczającej tkanki z jądra. Następnie dodaj każde wypreparowane jądro bezpośrednio do probówki o pojemności 5 ml z 2 ml DMEM i trzymaj na lodzie.
      UWAGA: Kroki 1.3.3 i 1.3.4 należy opanować przed wykonaniem jakichkolwiek eksperymentów.
  4. Dysocjacja komórek jąder
    1. Podgrzej 100 ml 0,1 M roztworu sacharozy do temperatury 37 °C.
    2. Dodać 200 μl roztworu kolagenazy do probówki o pojemności 5 ml z jądrami. Wymieszaj roztwór, odwracając go kilka razy.
    3. Delikatnie potrząsać jądrami w inkubatorze wytrząsarki poziomo z prędkością 100 obr./min w temperaturze 32 °C przez 50 minut do godziny, aż DMEM stanie się mętny, a jądra podzielą się na małe kawałki. Szybko odwracaj rurkę co 10 minut, aby ułatwić dysocjację.
    4. Aby wypłukać kolagenazę, dodaj DMEM do końcowej objętości 5 ml i kilkakrotnie odwróć probówkę. Granulować jądra w temperaturze ~200 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Usunąć 3 ml supernatantu, tak aby pozostały tylko 2 ml.
      UWAGA: Dodawanie, usuwanie i przenoszenie DMEM odbywa się za pomocą plastikowych pipet transferowych przez całą procedurę rozprzestrzeniania chromosomów.
    5. Powtórz krok 1.4.4 jeszcze dwa razy, co daje w sumie 3 prania DMEM. Nie zawieszaj ponownie granulatu między praniami DMEM. Po ostatnim przepłukaniu DMEM usuń 4 ml supernatantu, tak aby pozostał tylko 1 ml.
    6. Dodać 1 ml DMEM do całkowitej objętości 2 ml i dodać 200 μl roztworu trypsyny i 20 μl roztworu DNazy I. Odwróć probówkę kilka razy, aby wymieszać roztwór.
    7. Potrząsać probówką w poziomie w temperaturze 32 °C przez 5-15 minut przy 100 obr./min, aż roztwór DMEM będzie zawierał tylko kilka grudek. Szybko odwracaj rurkę co 5 minut, aby ułatwić dysocjację.
      UWAGA: Grudki powinny być znacznie mniejsze po wstrząśnięciu.
    8. Dodać 500 μl roztworu inhibitora trypsyny i 50 μl roztworu DNazy I. Odwróć probówkę kilka razy, aby wymieszać, a następnie krótko odwiruj przy ~200 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, aby usunąć płyn lub grudki, które mogą przylegać do nakrętki probówki lub boku tuby.
    9. Umieścić probówkę na lodzie i ponownie zawiesić zawiesinę komórek, wielokrotnie pipetując w górę i w dół plastikową pipetą transferową przez 2 minuty, aby ułatwić dysocjację pozostałych grudek. Nie pozwól, aby zawiesina ogniwa dostała się do bańki pipety transferowej. Po upływie 2 minut odpipetować zawiesinę z powrotem do probówki o pojemności 5 ml.
    10. Wstępnie zwilż sitko o pojemności 100 μm DMEM i umieść je na probówce o pojemności 50 ml na lodzie.
    11. Przenieś zawiesinę komórek przez sitko po jednej kropli na raz za pomocą plastikowej pipety transferowej. Upewnij się, że zawiesina kuwety nie dostaje się do gruszki pipety transferowej.
    12. Przenieść filtrat za pomocą plastikowej pipety transferowej do nowej probówki o pojemności 5 ml i dodać DMEM do końcowej objętości 5 ml. Pamiętaj, aby zebrać zebrane komórki przymocowane do spodu filtra za pomocą czystej plastikowej pipety transferowej. Granuluj komórki w temperaturze ~200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    13. Usunąć jak najwięcej supernatantu, nie naruszając osadu.
    14. Dodać 5 μl roztworu DNazy I bezpośrednio do osadu. Następnie wymieszaj osad z roztworem DNazy I, delikatnie zeskrobując zewnętrzne dno probówki 4-5 razy wzdłuż pustego stojaka na probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Zbyt ostre skrobanie może spowodować zmniejszenie odzyskanych spreadów.
    15. Dodać DMEM do końcowej objętości 5 ml i wymieszać roztwór, kilkakrotnie odwracając probówkę. Często zdarza się, że grudki są nadal obecne po pierwszym zabiegu DNazy I.
    16. Zawiesinę komórek osadzać w temperaturze ~200 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    17. Powtórzyć kroki 1.4.13-1.4.16 dodatkowo 1-3 razy, aż zawieszony osad nie zbryli się po dodaniu DMEM. Po ostatnim wirowaniu usunąć jak najwięcej supernatantu, nie naruszając osadu.
      UWAGA: Spodziewaj się zmniejszenia wielkości osadu przy każdym zabiegu DNazy I; przekroczenie 4 całkowitych płukań DNazy I może spowodować znaczną utratę komórek. Jeśli po etapach leczenia DNazą I nie jest widoczny osad, nie należy kontynuować zabiegu. Odrzuć wszystkie nieużywane DNazy I.
    18. Dodaj 1 ml 1x PBS i ponownie zawieś granulkę, delikatnie zeskrobując zewnętrzne dno probówki wzdłuż pustego stojaka na probówki o pojemności 1,5 ml.
    19. Zawiesinę komórkową osadzać na poziomie ~200 x g przez 5 minut, a następnie usunąć jak najwięcej supernatantu bez naruszania osadu.
    20. Odciąć ~3 mm od końca końcówki pipety o pojemności 200 μl, aby poszerzyć otwór i ponownie zawiesić osad w ~80 μl 0,1 M roztworu sacharozy, pipetując w górę iw dół za pomocą odciętej końcówki pipety. Pozostaw zawiesinę komórek w temperaturze pokojowej na 3 minuty.
  5. Rozkładanie chromosomów na szkiełkach
    1. Pokryć jedno szkiełko 100 μl 1% formaldehydu z 0,15% Triton X-100 bokiem końcówki pipety. Następnie dodać 18 μl zawiesiny komórek sacharozy na środek szkiełka w linii prostej prostopadłej do dłuższej krawędzi. Przechyl suwak do przodu i do tyłu (~60°), aby ułatwić rozłożenie zawieszenia ogniw na wszystkie rogi.
    2. Umieść szkiełka płasko w lekko popękanej, otwartej komorze wilgotnościowej (Rysunek 3), aby zapobiec wysychaniu roztworu formaldehydu. Umieść komorę wilgotności w ciemnej szufladzie na noc.
    3. Zdejmij pokrywę z komory wilgotności i poczekaj, aż szkiełka całkowicie wyschną.
    4. Umieść szkiełka w słoiku Coplin, a następnie napełnij słoik Coplin wodą destylowaną i inkubuj przez 5 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Szkiełka można umieścić w słoiku Coplin w zygzakowaty wzór, aby zmaksymalizować liczbę szkiełek na słoik Coplin. Upewnij się, że między wszystkimi szkiełkami jest miejsce na przepływ płynu.
    5. Wylej wodę i napełnij słoik środkiem zwilżającym w proporcji 1:250 (patrz Tabela Materiałów). Prać 2 razy po 5 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
    6. Pozostawić szkiełka do całkowitego wyschnięcia i przechowywać w temperaturze -20 °C, aż zostaną poplamione.
      UWAGA: Najdłużej przechowujemy preparaty bez zauważalnej degradacji chromosomów ~2 miesiące.

2. Barwienie sondy PNA telomerów

UWAGA: Powtórzenia telomerów mogą być barwione za pomocą sond PNA z fluoroforem sprzężonymi z teloforami, które hybrydyzują z powtórzeniami telomerów nici wiodącej (CCCTAA). Sondy PNA mają neutralny szkielet, który zwiększa powinowactwo do hybrydyzacji do ujemnie naładowanego DNA, co skutkuje niewielkim lub zerowym tłem. Krok sondowania telomerów jest opcjonalny. Aby przejść do barwienia przeciwciałami, należy ponownie uwodnić szkiełka w 1x PBS, jak wskazano w kroku 2.2.2, a następnie przejść bezpośrednio do "Barwienia przeciwciał pierwotnych".

  1. Przygotuj odczynniki do sondy PNA przed rozpoczęciem barwienia telomerów
    UWAGA: Wygodnie jest przygotować następujące roztwory w ilościach określonych do wykorzystania w przyszłych eksperymentach. Warunki przechowywania podano poniżej.
    1. Przygotować 2 l 20-krotnego roztworu soli fizjologicznej cytrynianu sodu (SSC) o końcowym stężeniu 3 M NaCl i 0,3 M cytrynianu sodu. Autoklaw i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    2. Przygotować 50 ml roztworu do wstępnej hybrydyzacji zawierającego transfer RNA do końcowego stężenia 50% formamidu, 5x SSC, 50 μg / ml heparyny, 500 μg / ml transferowego RNA, 0,1% Tween 20 i dodać 460 μl 1 M kwasu cytrynowego, aby doprowadzić roztwór do pH ~ 6. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Formamid jest niebezpieczny. Przygotować roztwór w dygestorium.
    3. Przygotować 50 ml roztworu do wstępnej hybrydyzacji przygotowanego w taki sam sposób, jak w kroku 2.1.2, bez dodawania transferowego RNA. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
    4. Sondy telomerowe PNA TelC-Cy3 i TelC-Alexa647 są przygotowane jako zapasy 50 μM z formamidu zgodnie z instrukcjami producenta. Przechowywać sondy PNA w postaci 8 μl porcji w temperaturze -80 °C.
    5. Przygotować co najmniej 1 ml 100 mg/ml roztworu podstawowego albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w sterylnej wodzie destylowanej. Przechowywać w temperaturze -20 °C. W przypadku przygotowania więcej niż 1 ml podstawowego BSA, należy przechowywać roztwór w postaci 1 ml porcji.
    6. Używając probówki o pojemności 2 ml, przygotuj 2 ml roztworu hybrydyzacyjnego, dodając 27 μl 100 mg/ml BSA i 8 μl 50 μM sondy PNA do 1,965 ml roztworu do hybrydyzacji zawierającego transfer RNA. Przechowywać w ciemności w temperaturze -20 °C.
  2. Barwienie sondy telomerowej PNA
    1. Rozgrzej piec do hybrydyzacji do 82 °C.
    2. Ponownie nawodnić szkiełka za pomocą 500 μl 1x PBS na szkiełko przez 5 minut w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej. Wyjmij PBS, stukając w bok szkiełka ręcznikiem papierowym.
    3. Podgrzewać szkiełka podstawowe i probówkę o pojemności 2 ml zawierającą roztwór do hybrydyzacji bezpośrednio na metalowej powierzchni w rozgrzanym piecu do hybrydyzacji przez 2 minuty.
    4. Trzymając szkiełka na metalowej powierzchni, dodaj 100 μl roztworu hybrydyzacyjnego na szkiełko, a następnie przykryj szkiełka plastikowymi szkiełkami nakrywkowymi (~25 mm x 75 mm) wyciętymi do kształtu z worka autoklawu. Pozostaw szkiełka w temperaturze 82 °C na 10-12 minut.
    5. Umieść szkiełka w komorze wilgotnościowej w ciemności w temperaturze 37 °C na 16-24 godziny. Od tego momentu, a także w przypadku barwienia przeciwciałami pierwotnymi i wtórnymi, szkiełka muszą być przechowywane w ciemności, aby uniknąć fotowybielania sygnału fluorescencji. Po okresie inkubacji, odczynniki do barwienia przeciwciał mogą być przygotowane na etapie 2.2.9.
    6. Usunąć szkiełka nakrywkowe za pomocą końcówki do pipet.
      UWAGA: Aby ułatwić usunięcie szkiełka nakrywkowego, ~50-100 μl roztworu hybrydyzacyjnego bez transferu RNA można delikatnie dozować między szkiełko nakrywkowe a szkiełko nakrywkowe podczas podnoszenia szkiełka nakrywkowego.
    7. Odpipetować 500 μl roztworu do wstępnej hybrydyzacji bez przenoszenia RNA na każde szkiełko i umieścić szkiełka w komorze wilgotnościowej na 15 minut w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór, stukając w bok szkiełka ręcznikiem papierowym.
      UWAGA: Roztwór do hybrydyzacji bez transferu RNA nie jest wstępnie podgrzewany przed dodaniem do każdej szkiełka.
    8. Odpipetować 500 μl 50% roztworu do wstępnej hybrydyzacji bez przenoszenia RNA w 1x PBS do każdego szkiełka i umieścić szkiełka w komorze wilgotnościowej na 15 minut w temperaturze pokojowej. Usuń roztwór, stukając w bok szkiełka ręcznikiem papierowym.
    9. Przenieś szkiełka do słoika Coplin i umyj 3 razy w 1x PBS z delikatnym potrząsaniem przez 15 minut na pranie w temperaturze pokojowej.
    10. Wyjmij szkiełka ze słoika Coplin i usuń nadmiar PBS, stukając w bok szkiełka ręcznikiem papierowym. Następnie przejdź do kroku 3.2 "Barwienie przeciwciał pierwotnych".

3. Barwienie przeciwciał

UWAGA: Przeciwciała podwyższone do znanych białek mejotycznych mogą być używane do wykrywania immunofluorescencji w preparatach chromosomów rozprzestrzeniania. Przeciwciała drugorzędowe sprzężone z różnymi fluoroforami pozwalają na jednoczesne barwienie wielu białek, jeśli przeciwciała pierwszorzędowe zostały wyhodowane u różnych zwierząt.

  1. Przygotować następujące roztwory w dniu barwienia przeciwciał pierwszorzędowych i wtórnych
    1. Przygotuj 1 l PBT z 1x PBS i 0,1% Triton X-100 rozcieńczony w wodzie destylowanej. Przechowywać w temperaturze pokojowej. Można to przygotować z wyprzedzeniem i w dużych ilościach do przyszłych eksperymentów z rozprzestrzenianiem.
    2. Przygotować 500 μl bloku przeciwciał na szkiełko do końcowego stężenia 2 mg/ml BSA i 2% koziej surowicy w PBT.
    3. Aby przygotować 100 μl pierwszorzędowej lub drugorzędowej mieszaniny przeciwciał na szkiełko, dodaj odpowiednie przeciwciała o odpowiednim stężeniu (patrz tabela materiałów) do bloku przeciwciał.
      UWAGA: Może być konieczne empiryczne określenie stężenia przeciwciał. W dyskusji dołączamy listę przeciwciał, które wypróbowaliśmy z powodzeniem (z rozcieńczeniem/stężeniem) i tych, które wypróbowaliśmy bez powodzenia.
  2. Barwienie przeciwciałami pierwotnymi
    UWAGA: Królik anty-ludzki SCP3 i kurczak anty-danio pręgowany Sycp1 są zwykle używane do barwienia przeciwciał pierwotnych.
    1. Po usunięciu nadmiaru PBS ze szkiełek należy dodać 500 μl bloku przeciwciał na szkiełko i umieścić szkiełka w komorze wilgotnościowej o temperaturze pokojowej na minimum 20 minut.
    2. Usuń blok przeciwciała, stukając w bok szkiełka w ręcznik papierowy.
    3. Dodać 100 μl mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych do bloku przeciwciał na szkiełko podstawowe i przykryć szkiełka plastikowym szkiełkiem nakrywkowym wykonanym z worka do autoklawu. Umieścić szkiełka w komorze wilgotnościowej na noc w temperaturze 4 °C.
    4. Usuń szkiełka nakrywkowe za pomocą końcówki pipety i umyj szkiełka 2 razy przez co najmniej 5 minut za pomocą 1x PBS w słoiku Coplin z delikatnym wstrząsem w temperaturze pokojowej.
    5. Wyjmij PBS, stukając w bok szkiełka ręcznikiem papierowym.
  3. Wtórne barwienie przeciwciałami
    UWAGA: Sprzężone kozie przeciwciała przeciwko królikom i kurczakom przeciwko różnym fluoroforom są używane do barwienia w stężeniu 1:1000.
    1. Dodać 500 μl bloku przeciwciał na szkiełko podstawowe i umieścić szkiełka w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej na co najmniej 5 minut.
    2. Usuń blok przeciwciała, stukając w bok szkiełka o ręcznik papierowy.
    3. Dodać 100 μl mieszaniny przeciwciał wtórnych do bloku przeciwciał na szkiełku podstawowym i przykryć szkiełka plastikowym szkiełkiem nakrywkowym wykonanym z worka do autoklawu. Umieścić szkiełka w komorze wilgotnościowej na 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    4. Usuń szkiełka nakrywkowe za pomocą końcówki pipety i umyj szkiełka 3 razy przez minimum 5 minut za pomocą 1x PBS w słoiku z Coplin delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
    5. Opłucz szkiełka jednorazowo przez minimum 2 minuty wodą destylowaną w słoiku Coplin z delikatnym wstrząsem w temperaturze pokojowej.
    6. Suszyć na powietrzu szkiełka pochylone, aby ułatwić suszenie.
    7. Umieść 20 μl impregnatu zapobiegającego blaknięciu z DAPI lub bez (patrz tabela materiałów) jako 3 równomiernie rozmieszczone kropki na szklanych szkiełkach nakrywkowych (24 mm x 60 mm).
    8. Umieść szkiełka ekranem do dołu na szklanych szkiełkach nakrywkowych, a następnie uszczelnij szkiełka nakryte lakierem do paznokci na krawędzi zachodzącej na matowy koniec szkiełka.
    9. Przygotowane preparaty należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą gotowe do obrazowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisaliśmy metodę przygotowania i wizualizacji preparatów rozproszonych spermatocytów ryby zebrafish. Prawidłowo przeprowadzona procedura pozwala uzyskać dobrze rozproszone, nienakładające się jądra komórkowe. Aby odzyskać takie jądra, istotne jest zastosowanie odpowiedniej ilości materiału wyjściowego (tj. jąder), poddanie jąder działaniu trypsyny przez wystarczająco długi czas oraz przeprowadzenie odpowiedniej liczby inkubacji z DNaza I. Takie preparaty rozproszone mogą być następnie ba...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy metody badania lokalizacji telomerów i białek związanych z chromosomami w rozprzestrzenianiu się powierzchni jądrowej ze spermatocytów wyizolowanych z jąder danio pręgowanego. Spodziewamy się, że metody te będą miały zastosowanie do analizy spermatocytów u innych gatunków teleostów z dostosowaniem do wielkości jądra.

Chociaż tylko kilka przeciwciał zostało podniesionych do białek mejotycznych danio pręgowanego, odnieśliśmy sukces przy użyciu następujących przeciwciał po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Trentowi Newmanowi i Masudzie Sharifi za komentarze do manuskryptu oraz An Nguyenowi za pomoc w optymalizacji metod rozprzestrzeniania i barwienia chromosomów z mejocytów danio pręgowanego. Praca ta była wspierana przez NIH R01 GM079115 przyznany SMB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki wirówkowe 1,5 ml Dostępnychjest kilka marek komercyjnych
Stojak na probówki do mikrowirówek 1,5 mlDostępnych
16% formaldehydu, bez metanoluThermoFisher Scientific28908
2 mlkilka marek komercyjnych
Szkiełka nakrywkowe szklane 24 x 50 mmCorning2980-245
Szkiełka nakrywkowe 24 x 60 mmVWR International16004-312
Stożkowe probówki wirówkowe 50 mlThermoFisher Scientific363696
Torba do autoklawuDostępnychSłuży do produkcji plastikowych szkiełek nakrywkowych.
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Fisher ScientificBP1605-100Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 100 mg/ml w sterylnej wodzie destylowanej.
Sitko komórkowe, 100 i mikro; mFisher Scientific08-771-19
CF405M koza anty-kurczak IgY (H + L), wysoce adsorbowany krzyżowoBiotium203775-500uLUżyj w 1:1000
Kurczak anty-zfSycp1Generowany przez laboratorium BurgessNiedotyczy Użyj w 1:100
Kolagenaza z Clostridium histolyticumSigma-AldrichC0130-500MG
Słoik CoplinKilka dostępne
DNaza I, stopień II z trzustki bydlęcejRoche Diagnostics10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Fisher ScientificMT10014CV
Dumont No. 5 KleszczeFine Science Tools11252-30Do preparowania jąder wymagane są dwa.
Probówki Eppendorf, 5 mlVWR International89429-308
FormamidFisher ScientificBP228-100
Kozie przeciwciało drugorzędowe anty-kurczaka IgY (H+L), Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-11039Stosować w stosunku 1:1000
Przeciwciało drugorzędowe przeciw kurczakom IgY (H+L) kozie, Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA-11042Stosować w 1:1000
Kozia anty-hDMC1Santa Cruz Biotechnologysc-8973Nie działa w naszych rękach
Kozie przeciwciało wtórne anty-królicze IgG (H + L) adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-11008Użyj w 1:1000
Kozie przeciwciało wtórne anty-królicze IgG (H + L), Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA-11012Użyj w 1:1000
Kozia surowicaSigma-AldrichG9023-10mL
Sól sodowa heparynySigma-AldrichH3393-100KU
Komora wilgotnościowaFisher Scientific50-112-3683
Piec hybrydowyVWR International230401V (model 5420)
Wytrząsarka do inkubatoraNew Brunswick ScientificModel Classic C25
KClFisher ScientificP217-500
KimwipesKimerbly-Clark Professional34155Używany do komory wilgotnościowej
KH2PO4Fisher ScientificP285-500
jest kilka marek komercyjnychKażdy standardowy mikroskop zdolny do powiększenia co najmniej ~1,65X jest wystarczający.
Szkiełka mikroskopoweFisher Scientific12-544-7
Mysz anty-chomikSCP3Abcamab97672Nie działa w naszych rękach
Mysz anty-hMLH1BD Biosciences550838Nie działa w naszych rękach
Mysz anty-hRPASigma-AlrichMABE285Nie działa w naszych rękach
Na2HPO4 · 7 H2OFisher ScientificS373-500
NaClFisher ScientificS271-3
Photo-Flo 200roztwór Mikroskopia elektronowa Nauki74257
Plastikowe pipety transferoweDostępnych
PNA TelC-Alexa647PNA Bio IncF1013Przygotuj zgodnie z wymaganiami producenta s instrukcje.
PNA TelC-Cy3PNA Bio IncF1002Przygotować zgodnie z instrukcjami producenta.
ProLong Diamond Anti-FadeThermoFisher ScientificP36970
ProLong, Diamond, Anti-Fade, Mountant z DAPIThermoFisher ScientificP36971
Królik anty-hRPABethylA300-244AUżyj w 1:300
Królik anty-hSCP3Abcamab150292Użyj w 1:200
Królik anty-hRad51GeneTexGTX100469Użyj o 1:300
Cytrynian soduFisher ScientificS279-500
SacharozaNożyczki Fisher ScientificS5-500
Supercut, kąt 30&, 10 cmFisher Scientific50-822-353Można również użyć dowolnej pary małych nożyczek.
ZestawSylgard Fisher ScientificNC9897184Przygotuj zgodnie z instrukcjami producenta.
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100Rozcieńczyć w sterylnej wodzie destylowanej, aby uzyskać 20% roztwór roboczy. Przechowywać w temperaturze pokojowej. Triton X-100 tworzy osad po rozcieńczeniu w wodzie; Osad rozpuszcza się w ciągu nocy.
TrypsynaWorthington BiochemicalLS003708
Inhibitor trypsyny z białka jaja kurzegoSigma-AldrichT9253-500MG
Tween 20Bio-Rad170-6531Rozcieńczyć w sterylnej wodzie destylowanej, aby uzyskać 20% roztwór roboczy. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
Nożyczki sprężynowe Vannas - 4 mm (mikronożyczki)Narzędzia do nauki o naukach15018-10
jest kilka marek komercyjnych Dostępnych jest jest kilka marek komercyjnych marki handlowe Dostępnych jest kilka marek komercyjnych,

Bibliografia

  1. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
  2. Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).
  3. Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio. PLoS Genetics. 15, e1007730(2019).
  4. Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish. Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).
  5. Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. Temporal progression of recombination in human males. Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).
  6. Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks. PLoS One. 8, e85075(2013).
  7. Pratto, F., et al. Recombination initiation maps of individual human genomes. Science. 346, 1256442(2014).
  8. Brown, P. W., et al. Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male. American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).
  9. Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).
  10. Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants. Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).
  11. Sansam, C. L., Pezza, R. J. Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination. Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).
  12. Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females. Genetics. 175, 1561-1569 (2007).
  13. Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes. Journal of Visualized Experiments. (129), e55378(2017).
  14. Moens, P. B. Zebrafish: chiasmata and interference. Genome. 49, 205-208 (2006).
  15. Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies. Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).
  16. Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene. Chromosome Research. 17 (6), 773(2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Disekccja jąderdysocjacja komórekrozprzestrzenianie chromosomówdetekcja immunofluorescencyjnafluorescencyjna hybrydyzacja in situtraktowanie DNazą Iroztwór sacharozyformaldehyd Triton X-100
Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.