Kwantyfikacja cytotoksyczności Staphylococcus aureus w stosunku do ludzkich leukocytów wielojądrzastych

Summary

Ten protokół opisuje metodę oczyszczania leukocytów wielojądrzastych z pełnej krwi ludzkiej oraz dwa odrębne testy, które określają cytotoksyczność Staphylococcus aureus przeciwko tym ważnym wrodzonym komórkom odpornościowym.

Abstract

Staphylococcus aureus jest zdolny do wydzielania szerokiej gamy leukocydyn, które atakują i zakłócają integralność błony leukocytów wielojądrzastych (PMN lub neutrofili). Protokół ten opisuje zarówno oczyszczanie ludzkich PMN, jak i ilościowe oznaczanie cytotoksyczności S. aureus wobec PMN w trzech różnych sekcjach. Sekcja 1 szczegółowo opisuje izolację PMN i surowicy z krwi ludzkiej za pomocą wirowania gęstości. W sekcji 2 bada się cytotoksyczność białek zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez S. aureus w stosunku do tych oczyszczonych ludzkich PMN. Sekcja 3 mierzy cytotoksyczność w stosunku do ludzkich PMN po fagocytozie żywych S. aureus. Procedury te mierzą przerwanie integralności błony plazmatycznej PMN przez leukocydyny S. aureus za pomocą analizy cytometrii przepływowej PMN traktowanych jodkiem propidyny, fluoroforem wiążącym DNA, który jest nieprzepuszczalny dla błony komórkowej. Łącznie metody te mają tę zaletę, że pozwalają na szybkie testowanie cytotoksyczności S. aureus w stosunku do pierwotnych ludzkich PMN i można je łatwo dostosować do badania innych aspektów interakcji gospodarz-patogen.

Introduction

Staphylococcus aureus to bakteria Gram-dodatnia, która powoduje szerokie spektrum chorób u ludzi. Ten wybitny patogen wytwarza liczne czynniki wirulencji, które przyczyniają się do różnych aspektów infekcji. Należą do nich cząsteczki powierzchniowe, które pozwalają S. aureus przylegać do różnych typów tkanek gospodarza¹, białka zewnątrzkomórkowe, które zakłócają odpowiedź immunologiczną gospodarza², oraz szereg wydzielanych toksyn, które celują w różne typy komórek gospodarza³. W tym raporcie opisujemy metodę, która określa ilościowo cytotoksyczność białek zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez S. aureus wobec ludzkich leukocytów wielojądrzastych (PMN lub neutrofili), pierwotnych komórek efektorowych wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza.

PMN są najliczniejszymi leukocytami u ssaków. Te krążące komórki odpornościowe są szybko rekrutowane do miejsca uszkodzenia tkanki gospodarza w odpowiedzi na sygnały niebezpieczeństwa wytwarzane przez komórki rezydentne lub przez związki unikalne dla atakujących drobnoustrojów. Zewnątrzkomórkowy wkład z tych cząsteczek oraz z bezpośrednich kontaktów z aktywowanymi rezydującymi komórkami gospodarza podczas wynaczynienia zwiększa stan aktywacji PMN w procesie znanym jako priming^4,5. Przygotowane PMN, które dotarły do uszkodzonej tkanki, wykonują następnie ważne wrodzone odpowiedzi immunologiczne mające na celu zapobieganie powstaniu infekcji. Należą do nich wiązanie i internalizacja, czyli fagocytoza, inwazyjnych mikroorganizmów, która wyzwala kaskadę zdarzeń wewnątrzkomórkowych kumulujących się w niszczeniu drobnoustrojów przez baterię silnych związków przeciwdrobnoustrojowych⁵.

PMN odgrywają kluczową rolę w ochronie ludzi przed inwazją patogenów i są szczególnie ważne dla zapobiegania infekcji S. aureus⁴. Jednak bakteria ta wytwarza szeroki zakres genów wirulencji, które utrudniają różne funkcje PMN. Należą do nich białka zewnątrzkomórkowe, które blokują rozpoznawanie cząsteczek sygnałowych, zapobiegają przyleganiu do tkanki gospodarza, hamują produkcję związków przeciwdrobnoustrojowych i naruszają integralność błony plazmatycznej⁴. S. aureus koordynuje czasową ekspresję tych genów wirulencji poprzez zbiorowe dane wejściowe z wielu dwuskładnikowych systemów sensorycznych, które rozpoznają określone sygnały środowiskowe. Dwuskładnikowy system SaeR/S jest głównym regulatorem zwiększającym transkrypcję genu wirulencji S. aureus podczas infekcji^{6,7,8,9,10,11}. W szczególności wykazano, że ten dwuskładnikowy system ma kluczowe znaczenie dla produkcji dwuskładnikowych leukocydyn, które są specyficznie ukierunkowane na ludzkie PMNs¹².

Ten protokół jest podzielony na trzy różne sekcje. Pierwsza sekcja opisuje oczyszczanie PMN z ludzkiej krwi za pomocą wirowania w gradionym gradiencie gęstości przy użyciu protokołu, który został zaadaptowany z metod opracowanych przez Bøyum¹³ i Nauseef¹⁴. Druga i trzecia sekcja szczegółowo opisują dwie różne techniki badania cytotoksyczności S. aureus; jeden odurza PMN białkami zewnątrzkomórkowymi wytwarzanymi przez S. aureus, podczas gdy drugi bada zdolność żywych bakterii do uszkadzania PMN po fagocytozie. Procedury te wykorzystują jodek propidyny do pomiaru utraty integralności błony plazmatycznej PMN spowodowanej przez toksyny tworzące pory S. aureus. Jodek propidyny jest fluoroforem wiążącym DNA, który zwykle jest nieprzepuszczalny dla błony komórkowej, ale może przenikać przez błony plazmatyczne, które zostały naruszone przez toksyny S. aureus. Analiza cytometrii przepływowej pozwala na szybkie określenie ilościowe PMN dodatnich pod względem jodku propidyny w celu zmierzenia względnej cytotoksyczności szczepów S. aureus. Oporny na metycylinę S. aureus (MRSA), zidentyfikowany jako elektroforeza żelowa w polu pulsacyjnym typu USA300 i izogeniczny mutant delecji saeR/S w tym szczepie (USA300ΔsaeR/S) zostały wykorzystane jako modele do pokazania, w jaki sposób procedury te mogą określić ilościowo cytotoksyczność S. aureus wobec ludzkich PMN.

Protocol

Heparynizowana krew żylna od zdrowych dawców została pobrana zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Institutional Review Board for Human Subjects na Uniwersytecie Stanowym Montany. Wszyscy dawcy wyrazili pisemną zgodę na udział w tym badaniu.

1. Oczyszczanie ludzkich leukocytów wielojądrzastych i izolacja ludzkiej surowicy

UWAGA: Wszystkie odczynniki powinny być rutynowo sprawdzane pod kątem obecności endotoksyn za pomocą dostępnego na rynku zestawu do wykrywania endotoksyn i powinny zawierać <25,0 pg/ml endotoksyny, aby zapobiec niepożądanemu zalewaniu PMN.

1. Przynieś 50 ml 3% dekstranu-0,9% NaCl (w/v), 35 ml 0,9% NaCl (w/v), 20 ml 1,8% NaCl (w/v), 12 ml 1,077 g/ml roztworu gradientu gęstości i 20 ml wody do wstrzykiwań lub nawadniania do temperatury pokojowej.
2. Aby wyizolować surowicę ludzką, należy inkubować 4 ml świeżo pobranej krwi ludzkiej bez antykoagulantu w temperaturze 37 °C w szklanej probówce o pojemności 15 ml przez 30 minut. Po inkubacji odwirować próbkę o masie 2 000–3 000 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś górną warstwę surowicy do świeżej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i umieść na lodzie.
3. Połączyć 25 ml świeżo pobranej heparynizowanej (1000 jednostek/ml) pełnej krwi ludzkiej z 25 ml 3% dekstronu-0,9% NaCl o temperaturze pokojowej (stosunek 1:1) w dwóch powtórzonych stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml (całkowita objętość 50 ml na probówkę). Wymieszaj, delikatnie kołysząc każdą stożkową probówkę o pojemności 50 ml, a następnie odstaw w temperaturze pokojowej na 30 minut.
4. Po inkubacji w temperaturze pokojowej pojawią się dwie oddzielne warstwy. Przenieść wierzchnią warstwę każdej mieszaniny dekstranu i krwi do nowych stożkowych probówek o pojemności 50 ml i wirować przy 450 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej z niskimi hamulcami lub bez hamulców.
5. Ostrożnie odessać oba supernatanty i wyrzucić, nie naruszając osadów komórkowych. Delikatnie ponownie zawiesić każdą komórkę w 2 ml 0,9% NaCl o temperaturze pokojowej, połączyć zawieszone granulki w jednej stożkowej probówce o pojemności 50 ml, a następnie dodać pozostałe 0,9% NaCl (końcowa objętość 35 ml).
6. Ostrożnie umieścić 10 ml roztworu gradientu gęstości o temperaturze pokojowej 1,077 g/ml pod zawiesiną komórek za pomocą pipety ręcznej. Wirować z prędkością 450 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej z niskimi hamulcami lub bez hamulców. Delikatnie zassać supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Supernatant będzie zawierał jednojądrzaste komórki krwi obwodowej, które można pobrać zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁴.
7. Lizować czerwone krwinki, ponownie zawieszając osad komórkowy w 20 ml wody o temperaturze pokojowej. Mieszaj delikatnie, kołysząc rurką przez 30 sekund. Lizie czerwonych krwinek będzie towarzyszyć wyraźne zmniejszenie zmętnienia.
8. Natychmiast dodać 20 ml 1,8% NaCl (w temperaturze pokojowej [RT]) i odwirować próbkę o sile 450 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Ważne jest, aby zminimalizować czas, w którym PMN pozostają w samej wodzie po lizie czerwonych krwinek, aby zmaksymalizować wydajność PMN i zapobiec lizie i/lub aktywacji PMN.
9. Ostrożnie odessać supernatant, nie naruszając osadu komórkowego. Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 2 ml pożywki RT RPMI 1640 i umieścić na lodzie.
10. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Ponownie zawiesić oczyszczone PMN w stężeniu 1 x 10⁷ komórek/ml za pomocą lodowatego RPMI i przechowywać na lodzie.
11. Połączyć 100 μl oczyszczonych PMN (1 x 10⁶ komórek) z 300 μl lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco (DPBS) zawierającej 1 μl barwnika jodkiem propidyny w dwóch probówkach do cytometrii przepływowej. W celu uzyskania pozytywnej kontroli uszkodzenia błony plazmatycznej należy dodać 40 μl 0,5% roztworu Triton X-100 do jednej z probówek cytometrii przepływowej i dokładnie wymieszać.
12. Użyj cytometrii przepływowej, aby zmierzyć rozproszenie do przodu, rozproszenie boczne i barwienie jodkiem propidyny (maksima wzbudzenia/emisji przy 535/617 nm) oczyszczonych komórek (Rysunek 1).
    UWAGA: Analiza rozproszenia do przodu i z boku pozwoli zidentyfikować niepożądane populacje limfocytów i monocytów. Jodek propidyny barwi tylko komórki z naruszoną błoną plazmatyczną i nie należy stosować oczyszczonych PMN, które mają wyraźne populacje komórek dodatnich jodku propidyny. W tych badaniach oczyszczone PMN stosowano tylko wtedy, gdy zawierały >98% oczyszczonych komórek i <5% barwionych na obecność jodku propidyny.
13. Przygotować 96-dołkową płytkę do oznaczania cytotoksyczności PMN, pokrywając poszczególne studzienki, które zostaną użyte w tym teście, 100 μl 20% izolowanej ludzkiej surowicy, która została rozcieńczona DPBS.
    UWAGA: Powlekanie PMN bezpośrednio na plastiku lub szkle spowoduje aktywację ogniw. Należy pamiętać o dołączeniu co najmniej jednej studzienki kontroli ujemnej, która będzie otrzymywać tylko pożywkę, oraz co najmniej jednej studzienki kontroli pozytywnej, która otrzyma 0,05% Triton X-100.
14. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po inkubacji należy dwukrotnie przemyć pokryte studzienki lodowatym DPBS, aby usunąć nadmiar surowicy. Delikatnie postukaj w talerz do góry nogami, aby usunąć resztki DPBS i umieść na lodzie.
15. Delikatnie dodać 100 μl oczyszczonych ludzkich PMN o stężeniu 1 x 10⁷ komórek/ml do każdej powlekanej studzienki (1 x 10⁶ PMN/studzienkę). Pozwól PMN osiąść w studzienkach, inkubując płytkę na lodzie przez co najmniej 5 minut. Utrzymuj płytkę poziomo, aby umożliwić równomierne rozmieszczenie komórek w każdym dołku i pozostaw na lodzie, aby uniknąć niepożądanej aktywacji PMN.

2. Test cytotoksyczności białek zewnątrzkomórkowych S. aureus przeciwko ludzkim leukocytom wielojądrzastym

1. Hodowlę S. aureus przez noc w tryptycznym bulionie sojowym (TSB) w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na temperaturę 37 °C. W tych badaniach 20 ml TSB w oddzielnych 150 ml kolbach Erlenmeyera zaszczepiono zamrożonymi kulturami szczepów S. aureus USA300 lub USA300ΔsaeR/S i hodowano przez około 14 godzin z wytrząsaniem przy 250 obr./min.
2. Subkultura S. aureus, wykonując rozcieńczenie 1:100 nocnej kultury bakteryjnej ze świeżą pożywką. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem, aż bakterie osiągną wczesną fazę wzrostu stacjonarnego.
   UWAGA: W tych eksperymentach 20 ml tryptycznego bulionu sojowego w 150 ml kolbach Erlenmeyera zaszczepiono 200 μl nocnej hodowli USA300 lub USA300ΔsaeR/S i inkubowano w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min przez 5 godzin.
3. Gdy bakterie osiągną wczesną fazę wzrostu stacjonarnego, przenieś 1 ml subkulturowanego S. aureus do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwiruj przy 5 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
4. Po odwirowaniu przenieść supernatant do strzykawki o pojemności 3 ml. Przepuść supernatanty przez filtr 0,22 μm i do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml na lodzie.
5. Przeprowadzić seryjne rozcieńczenia supernatantów lodowatymi pożywkami używanymi do hodowli S. aureus.
   UWAGA: W pokazanych eksperymentach supernatanty z USA300 i USA300ΔsaeR/S poddano czterem kolejnym rozcieńczeniom 1/2 log lodowatym TSB.
6. Delikatnie dodać próbki sklarowanego osadu lub same pożywki (do kontroli ujemnych i dodatnich) do poszczególnych studzienek 96-dołkowej płytki zawierającej PMN na lodzie z kroku 1.15. W tych eksperymentach do każdej studzienki dodano 10 μl próbek supernatantu USA300 lub USA300ΔsaeR/S. Delikatnie kołysać płytkę, aby rozprowadzić supernatanty w studzienkach i inkubować w temperaturze 37 °C.
7. W pożądanym czasie wyjmij płytkę z inkubatora i umieść ją na lodzie. Dodać 40 μl 0,5% Triton X-100 do studzienki kontroli dodatniej.
8. Delikatnie odpipetować próbki w górę i w dół w każdej studzience, aby całkowicie usunąć wszystkie PMN przyklejone do płytki, a następnie przenieść próbki do probówek cytometrii przepływowej na lodzie, które zawierają 300 μl lodowatego DPBS z 1 μl jodku propidyny.
9. Zmierz proporcję PMN dodatnich dla jodku propidyny za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 2A). Po związaniu z DNA jodek propidyny ulega wzbudzeniu/emisji przy długości fali 535/617 nm.

3. Test cytotoksyczności S. aureus przeciwko ludzkim leukocytom wielojądrzastym po fagocytozie

UWAGA: Krzywe wzrostu zdefiniowane przez gęstość optyczną przy 600 nm (OD₆₀₀) i stężenie bakterii muszą być wyznaczone empirycznie dla szczepów S. aureus do badania przed rozpoczęciem tego testu. Powodzenie tych eksperymentów wymaga konsekwentnego zbierania równych stężeń każdego szczepu S. aureus testowanego w połowie fazy wzrostu wykładniczego przy użyciu OD₆₀₀ subkulturowanych bakterii.

1. Rozpocznij nocne hodowle szczepów S. aureus i subkultur bakterii, jak opisano w krokach 2.1.1 i 2.1.2.
2. Zbierz subkulturowany S. aureus, gdy osiągnie średni wykładniczy wzrost, przenosząc 1 ml hodowanych bakterii do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwirowując przy 5 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: W naszych warunkach wzrostu USA300 i USA300ΔsaeR/S osiągnęły średnią fazę wzrostu wykładniczego po około 135 minutach inkubacji⁶.
3. Przemyć S. aureus po odwirowaniu przez zasysanie supernatantu, ponowne zawieszenie granulowanych bakterii w 1 ml DPBS, wirowanie próbki przez 30 s i odwirowanie przy 5 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
4. Opsonizować S. aureus przez ponowne zawieszenie osadu bakteryjnego w 1 ml 20% ludzkiej surowicy rozcieńczonej DPBS i inkubację w temperaturze 37 °C z mieszaniem przez 15 min.
5. Odwirować opsonizowane bakterie w dawce 5 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć S. aureus po odwirowaniu przez zasysanie supernatantu, ponowne zawieszenie granulowanych bakterii w 1 ml DPBS, a następnie wirować próbkę, aż do całkowitego rozpadu osadu bakteryjnego plus dodatkowe 30 sekund. Odwirować bakterie w ilości 5 000 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
6. Ponownie zawiesić opsonizowane szczepy S. aureus w 1 ml RPMI, wirować próbkę, aż osad bakteryjny zostanie całkowicie rozbity, a następnie przez dodatkowe 30 s. Umieść bakterie na lodzie.
7. Rozcieńczyć opsonizowane szczepy S. aureus do pożądanego stężenia za pomocą lodowatego RPMI. Wiruj przez 30 s i umieść na lodzie.
8. Potwierdź stężenie opsonizowanego S. aureus przez posiew 1:10 seryjnych rozcieńczeń bakterii na tryptycznym agarze sojowym.
   UWAGA: Ponieważ różnice w stężeniu bakterii użytych w tym teście mogą mieć duży wpływ na późniejszą przepuszczalność błony plazmatycznej PMN (Rysunek 3A), bardzo ważne jest, aby stężenie każdego badanego szczepu było określane dla każdego eksperymentu i było równoważne między szczepami.
9. Delikatnie dodać 100 μl/basenik każdego szczepu S. aureus lub RPMI (dla kontroli dodatniej i ujemnej) do PMN na 96-dołkowej płytce na lodzie z kroku 1.14. Delikatnie kołysz płytę, aby rozprowadzić S. aureus w studzienkach.
10. Zsynchronizuj fagocytozę, odwirowując płytkę w temperaturze 500 × g przez 8 minut w temperaturze 4 °C¹⁵. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C natychmiast po odwirowaniu (T = 0).
11. W pożądanym czasie wyjąć płytkę z inkubatora i umieścić na lodzie. Dodać 40 μl 0,5% Triton X-100 do studzienki kontroli dodatniej.
12. Delikatnie odpipetować próbki w górę i w dół w każdym dołku, aby całkowicie usunąć wszystkie PMN przyklejone do płytki, a następnie przenieść próbki do probówek cytometrii przepływowej na lodzie zawierającym 200 μl lodowatego DPBS z 1 μl jodku propidyny.
13. Analizować próbki pod kątem barwienia jodkiem propidyny za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano w kroku 2.9.

Results

Pokazaliśmy, jak opisane powyżej procedury mogą być wykorzystane do względnego ilościowego określenia cytotoksyczności S. aureus przeciwko ludzkim PMN przy użyciu MRSA PFGE typu USA300 i izogenicznego mutanta delecji saeR/S w tym szczepie (USA300ΔsaeR/S) wygenerowanego w poprzednich badaniach⁶. PMN wyizolowane przy użyciu procedur opisanych w sekcji 1 niniejszego protokołu wybarwiono jodkiem propidyny i zbadano za pomocą cytometrii przepływowej. Wykresy rozproszenia przedniego i bocznego wykorzystano do zilustrowania zanieczyszczenia oczyszczonych PMN przez monocyty lub limfocyty ( Rysunek 1A, B), a integralność PMN określono za pomocą barwienia jodkiem propidyny ( Rysunek 1C). Opisana metoda oczyszczania ludzkiego PMN może konsekwentnie dawać 0,5 x 10⁷ do 1 x 10⁸ PMN, które są >98% czyste i >95% ujemne pod względem jodku propidyny.

Cytotoksyczność białek zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez USA300 i USA300ΔsaeR/S została przetestowana przeciwko oczyszczonym PMN (Rysunek 2) zgodnie z procedurami opisanymi w sekcji 2 tego protokołu. Eksperymenty te wykazują zależny od stężenia wzrost barwienia jodkiem propidyny oczyszczonych PMN po 30 minutach zatrucia białkami zewnątrzkomórkowymi wytwarzanymi przez USA300 (Rysunek 2B). Wcześniejsze badania wykazały, że dwuskładnikowy system SaeR/S jest ważny dla ekspresji licznych dwuskładnikowych leukocydyn, które są ukierunkowane na ludzkie PMNs^6,10,11,16. Zgodnie z tymi poprzednimi odkryciami, bardzo niewiele PMN dodatnich dla jodku propidu wykryto po ekspozycji na białka zewnątrzkomórkowe wytwarzane przez USA300ΔsaeR / S (Rysunek 2B). Dalsze eksperymenty wykazały stały wzrost odsetka lizowanych PMN po zatruciu białkami zewnątrzkomórkowymi USA300, które ustabilizowały się po około 30 minutach (Rysunek 2C). Minimalną lizę ludzkich PMN zaobserwowano we wszystkich punktach czasowych po ekspozycji na białka zewnątrzkomórkowe wytwarzane przez USA300ΔsaeR/S. Wyniki te ilustrują przydatność tego testu do względnej kwantyfikacji cytotoksyczności przez zewnątrzkomórkowe białka S. aureus w stosunku do ludzkich PMN.

Przetestowaliśmy USA300 i USA300ΔsaeR/S za pomocą testu cytotoksyczności S. aureus przeciwko ludzkim PMN po fagocytozie, która jest opisana w sekcji 3 tego protokołu (Rysunek 3). Zależny od stężenia wzrost odsetka dodatnich PMN z jodkiem propidyny zaobserwowano 90 minut po fagocytozie USA300 (Rysunek 3A). Zaobserwowano znaczny spadek odsetka PMN, które były dodatnie na obecność jodku propidyny po fagocytozie USA300ΔsaeR/S (Rysunek 3A), co potwierdza inne wyniki, które wskazują, że dwuskładnikowy system SaeR/S jest ważny dla cytotoksyczności S. aureus wobec ludzkich PMN (Rysunek 2)^7,11. Jak wcześniej wspomniano i wykazano w Rysunek 3A, różnice w stężeniu S. aureus mają wyraźny wpływ na lizę PMN po fagocytozie. Wyliczenie inokulum USA300 i USA300ΔsaeR/S użytego w każdym z tych eksperymentów wykazało, że kontrast w cytotoksyczności między tymi szczepami nie był spowodowany różnicami w stężeniu użytych bakterii (Rysunek 3B). Wyniki te pokazują, w jaki sposób test cytotoksyczności S. aureus wobec ludzkich PMN po fagocytozie może być wykorzystany do oceny zdolności różnych szczepów S. aureus do naruszenia integralności błony komórkowej ludzkiego PMN.

Rysunek 1: Analiza cytometrii przepływowej oczyszczonych PMN. Reprezentatywne wykresy punktowe cytometrii przepływowej (A) oczyszczonych ludzkich PMN i (B) PMN, które zostały celowo zanieczyszczone komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej. (C) Reprezentatywny histogram cytometrii przepływowej wykazujący minimalne zabarwienie jodkiem propidyny (<1%) oczyszczonych PMN (zacienionych szarych) w porównaniu z PMN poddanych działaniu 0,05% Triton X-100 (zacieniony na czerwono). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Analiza cytometrii przepływowej PMN zatrutych białkami zewnątrzkomórkowymi wytwarzanymi przez S. aureus. (A) Reprezentatywny histogram cytometrii przepływowej PMN barwionych jodkiem propidyny po 30 minutach inkubacji z kontrolą pożywki (zacieniowany na niebiesko), przefiltrowanym supernatantem USA300 o końcowym stężeniu 1:110 (zacieniowany szary) lub 0,05% Triton X-100 (zacieniowany na czerwono). (B) Proporcja PMN dodatnich pod względem jodku propidyny po 30 minutach inkubacji z różnymi stężeniami supernatantów USA300 lub USA300∆saeR/S. (C) Proporcja PMN dodatnich dla jodku propidyny w czasie po inkubacji z supernatantem USA300 lub USA300∆saeR/S przy końcowym stężeniu 1:110. Dane przedstawiono jako średnią ± SEM z co najmniej 3 oddzielnych eksperymentów z * p ≤ 0,05 i ** p ≤ 0,005, jak określono za pomocą dwustronnego testu t. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Analiza cytometrii przepływowej PMN po fagocytozie S. aureus. (A) Proporcja PMN dodatnich dla jodku propidyny 90 minut po fagocytozie o różnych stężeniach USA300 lub USA300∆saeR/S. (B) Stężenie opsonizowanych szczepów S. aureus użytych do eksperymentów pokazanych w panelu A. Dane przedstawiono jako średnią SEM ± 4 oddzielnych eksperymentów z * p ≤ 0,01, jak określono za pomocą dwustronnego testu t. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Protokół ten opisuje oczyszczanie PMN z ludzkiej krwi i dwa odrębne testy, które wykorzystują jodek propidyny do ilościowego określenia cytotoksyczności S. aureus wobec tych ważnych wrodzonych komórek odpornościowych. Powodzenie tych procedur będzie zależało od jakości oczyszczonych PMN oraz odpowiedniego przygotowania S. aureus i białek zewnątrzkomórkowych wytwarzanych przez ten patogen. W przypadku izolacji PMN ważne jest, aby zminimalizować aktywację PMN podczas i po oczyszczeniu poprzez stosowanie odczynników wolnych od zanieczyszczenia endotoksynami, delikatne traktowanie preparatów komórkowych i utrzymywanie komórek w odpowiedniej temperaturze. Oznaki wskazujące na aktywację PMN obejmują zlepianie się komórek podczas oczyszczania i gdy więcej niż 5% wyizolowanych komórek barwi się dodatnio na obecność jodku propidyny. Ze względu na stosunkowo krótką żywotność PMN, komórki te muszą zostać wyizolowane z ludzkiej krwi i przebadane tego samego dnia. PMN zaczną wykazywać oznaki spontanicznej apoptozy, jeśli zostaną pozostawione na lodzie na dłużej niż 3 godziny po oczyszczeniu. Jak wspomniano wcześniej, bardzo ważne jest, aby każdy preparat PMN był dokładnie oceniany przy użyciu analizy cytometrii przepływowej rozproszenia do przodu i bocznego, a także barwienia jodkiem propidyny, aby zapewnić czystość i integralność izolowanych komórek.

Ekspresja dwuskładnikowych leukocydyn przez S. aureus jest odpowiedzialna za większość upośledzonej integralności błony plazmatycznej PMN, którą obserwuje się za pomocą testów opisanych w niniejszym protokole. Różnice w ekspresji tych toksyn i innych peptydów tworzących pory, takich jak moduliny rozpuszczalne w fenolach, między szczepami S. aureus powodują różnice w cytotoksyczności wobec ludzkich PMN. Znaczne odchylenia podczas wzrostu in vitro między szczepami S. aureus będą również wpływać na ekspresję toksyn tworzących pory i późniejszą cytotoksyczność. Ponadto stosunek S. aureus do PMN w testach fagocytozy ma duży wpływ na późniejszą przepuszczalność błony plazmatycznej PMN (ryc. 3A), a eksperymenty te wymagają konsekwentnego zbierania równych stężeń każdego szczepu S. aureus testowanego w połowie fazy wzrostu wykładniczego przy użyciu OD₆₀₀ subkulturowanych bakterii. Biorąc pod uwagę te rozważania, bardzo ważne jest zdefiniowanie krzywych wzrostu dla wszystkich szczepów, które będą badane przed rozpoczęciem testów cytotoksyczności. Nie zalecamy stosowania tych metod do analizy cytotoksyczności S. aureus ze szczepami, które wykazują znaczące różnice we wzroście in vitro.

USA300 jest zjadliwym izolatem MRSA, o którym wiadomo, że jest wysoce cytotoksyczny wobec ludzkich PMN¹⁵, a utrata SaeR / S w tym szczepie radykalnie zmniejsza transkrypcję wielu dwuskładnikowych leukocydyn, które są ukierunkowane na ludzkie PMN ^6,12, co czyni te szczepy idealnymi modelami do porównywania cytotoksyczności przy użyciu opisanych testów. Istnieje jednak duża zmienność genetyczna między różnymi izolatami S. aureus, a parametry wyszczególnione w tych protokołach mogą nie powodować istotnych zmian w cytotoksyczności wobec ludzkich PMN podczas testowania innych szczepów S. aureus. Dostosowanie warunków wzrostu, ilości dodanych supernatantów lub stosunku bakterii do PMN może być wymagane do powodzenia tych metod przy użyciu innych szczepów S. aureus.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,9% chlorek sodu do wstrzykiwań, USP, 500 ml Plastikowy pojemnik VIAFLEX	Baxter	2B1323Q	Oczyszczanie PMN
Mikroprobówki wirówkowe 1,5 ml z zatrzaskami	VWR	89000-044	Stosowany w komórkach myjących
1,8% roztwór chlorku sodu	Sigma-Aldrich	S5150	Oczyszczanie PMN
12x75mm Probówki hodowlane	VWR	60818-430	Stosowany jako cytometria przepływowa Probówki
20% (w/w) Dextran	Sigma-Aldrich	D8802	Oczyszczanie PMN
3125 Ręczny licznik talikowy	Produkty identyfikowalne	3125CC	Do liczenia komórek
Stożkowe probówki wirówkowe 50 ml	VWR	89039-656	Do dozowania pożywki
Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium	Fischer 211823 Naukowy		Do hodowli kultur komórkowych
Jednorazowe strzykawki BD z końcówkami Luer-Lok, 3 ml	FischerScientific	BD 309657	Do filtrowania supernatantów
Hemocytometr Bright-Line	Sigma-Aldrich	Z359629	Aparat do liczenia komórek
DPBS, 1x (sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco) z wapniem i magnezem	Corning	21-030-CV	Stosowany w komórkach myjących
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	17-1440-02	Oczyszczanie PMN
Fisherbrand Sterylne jednorazowe pipety serologiczne z polistyrenu	FischerScientific	13-678-11E	Do zasysania cieczy
Greiner CELLSTAR 96-dołkowe płytki	Millipore Sigma	M0687	Płytka do przechowywania próbek eksperymentalnych
OMICRON Filtry strzykawkowe	Omicron Scientific	SFPV13R	Do filtrowania supernatantów
Propidium jodek	ThermoFisher Scientific	P3566	Membrana nieprzepuszczalna barwienie DNA
PYREX Marka 4980 Kolby Erlenmeyera	Cole-Parmer	EW-34503-24	Do hodowli kultur komórkowych
RPMI 1640, 1X bez L-glutaminy, czerwieni fenolowej	Corning	17-105-CV	Stosowany w ponownym zawieszaniu komórek
Sterylna woda do nawadniania, USP	Baxter	2F7113	Oczyszczanie
PMNPompa do pipet	Bel-Art Products	F37898	Do zasysania cieczy
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Integralność membrany kontrola pozytywna