Method Article

Nowy zestaw narzędzi do oceny funkcji genów za pomocą warunkowej stabilizacji Cas9

DOI:

10.3791/60685

⸱

September 2nd, 2021

 , 
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Faculty of Pharmacy, University of Ljubljana

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy narzędzie do edycji genomu oparte na czasowej i warunkowej stabilizacji zgrupowanego, regularnie rozmieszczonego, krótkiego białka 9 (Cas9) związanego z powtórzeniami palindromicznymi (CRISPR) pod małą cząsteczką Shield-1. Metoda może być stosowana w przypadku hodowanych komórek i modeli zwierzęcych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologia regularnie rozmieszczonego białka 9 (CRISPR/Cas9) z regularnymi odstępami między sobą (CRISPR-) stała się powszechnym narzędziem laboratoryjnym do wprowadzania dokładnych i ukierunkowanych modyfikacji w genomie. Jego ogromną popularność i szybkie rozprzestrzenianie się przypisuje się łatwemu użyciu i dokładności w porównaniu do poprzedników. Jednak konstytutywna aktywacja systemu ma ograniczone zastosowania. W artykule opisano nową metodę, która pozwala na czasową kontrolę aktywności CRISPR/Cas9 w oparciu o warunkową stabilizację białka Cas9. Fuzja zmodyfikowanego mutanta białka wiążącego rapamycynę FKBP12 z Cas9 (DD-Cas9) umożliwia szybką degradację Cas9, która z kolei może być stabilizowana przez obecność syntetycznego liganda FKBP12 (Shield-1). W przeciwieństwie do innych metod indudobiolnych, system ten można łatwo dostosować do generowania układów bi-cistronicznych do koekspresji DD-Cas9 z innym genem będącym przedmiotem zainteresowania, bez warunkowej regulacji drugiego genu. Metoda ta umożliwia generowanie identyfikowalnych systemów, a także równoległą, niezależną manipulację allelami, do których dąży nukleaza Cas9. Platforma tej metody może być wykorzystana do systematycznej identyfikacji i charakterystyki istotnych genów oraz badania funkcjonalnych interakcji genów w warunkach in vitro i in vivo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR-Cas9, co oznacza "zgrupowane, regularnie rozmieszczone, krótkie, palindromiczne powtórzenia, białko 9" zostało po raz pierwszy odkryte w ramach badań nad adaptacyjną odpornością bakteryjną1,2. Obecnie CRISPR/Cas9 stał się najbardziej rozpoznawalnym narzędziem do programowalnej edycji genów, a różne iteracje systemu zostały opracowane, aby umożliwić modulacje transkrypcyjne i epigenetyczne3. Technologia ta umożliwia bardzo precyzyjną manipulację genetyczną prawie każdą sekwencją DNA4.

Podstawowe elementy każdej edycji genów CRISPR to konfigurowalna sekwencja RNA przewodnika oraz nukleaza Cas9 class5. Przewodnik RNA wiąże się z sekwencją komplementarną celu w DNA, kierując nukleazę Cas9 do wykonania pęknięcia podwójnej nici w określonym punkcie genomu3,4. Powstałe w ten sposób miejsce rozszczepienia jest następnie naprawiane przez niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) lub naprawę ukierunkowaną na homologię (HDR), z konsekwentnym wprowadzeniem zmian w docelowej sekwencji DNA5.

Edycja genów oparta na CRISPR/Cas9 jest łatwa w użyciu i stosunkowo tania w porównaniu do poprzednich technik edycji genów i udowodniono, że jest zarówno wydajna, jak i solidna w wielu różnych systemach2,4,5. System ten ma jednak pewne ograniczenia. Często wykazano, że konstytutywna ekspresja Cas9 powoduje zwiększoną liczbę niedocelowych celów i wysoką toksyczność komórek4,6,7,8. Dodatkowo, konstytutywne ukierunkowanie na geny podstawowe i geny przetrwania komórki przez Cas9 odbiera mu zdolność do wykonywania niektórych rodzajów badań funkcjonalnych, takich jak badania kinetyczne śmierci komórki7.

Różne indukowane lub warunkowo kontrolowane narzędzia CRISPR-Cas9 zostały opracowane w celu rozwiązania tych problemów6, takie jak Tet-ON i Tet-Off9; rekombinacja specyficzna dla miejsca10; chemicznie wywołana bliskość11; slicing zależny od inteiny3; i systemy lokalizacji jądrowej oparte na receptorze estrogenowym (ER) 4-hydroksytamoksyfenu12. Ogólnie rzecz biorąc, większość z tych procedur (splicing intein i chemicznie indukowane systemy podziału zbliżeniowego) nie oferuje odwracalnej kontroli, wykazuje bardzo powolną reakcję kinetyczną na leczenie farmakologiczne (system Tet-On/Off) lub nie jest podatna na manipulację o wysokiej przepustowości6.

Aby rozwiązać te ograniczenia, opracowaliśmy nowatorski zestaw narzędzi, który nie tylko zapewnia szybką i solidną edycję genów kontrolowaną czasowo, ale także zapewnia identyfikowalność, możliwość dostrajania i ułatwienia dla wysokoprzepustowej manipulacji genami. Ta nowatorska technologia może być stosowana w liniach komórkowych, organoidach i modelach zwierzęcych. Nasz system oparty jest na domenie inżynieryjnej, która po połączeniu z Cas9 wywołuje jego szybką degradację. Można go jednak szybko ustabilizować za pomocą wysoce selektywnej, nietoksycznej, przepuszczalnej dla komórek małej cząsteczki. Mówiąc dokładniej, zaprojektowaliśmy ludzką zmutowaną "domenę destabilizującą" (DD) FKBP12 do Cas9, oznaczając Cas9 do szybkiej i konstytutywnej degradacji przez układ ubikwityna-proteasom podczas ekspresji w komórkach ssaków13. Syntetyczny ligand DD, Shield-1, może stabilizować konformację DD, zapobiegając w ten sposób degradacji białek połączonych z DD (takich jak Cas9) w bardzo skuteczny sposób i z szybką reakcją kinetyczną14,15. Warto zauważyć, że Shield-1 wiąże się o trzy rzędy wielkości ściślej ze zmutowanym FKBP12 niż ze swoim dzikim odpowiednikiem14.

Para DD-Cas9/Shield-1 może być używana do badania systematycznej identyfikacji i charakterystyki istotnych genów w hodowanych komórkach i modelach zwierzęcych, jak to wcześniej pokazaliśmy, poprzez warunkowe celowanie w gen CypD, który odgrywa ważną rolę w metabolizmie mitochondriów; EGFR – kluczowy gracz w transformacji onkogennej; i Tp53, gen centralny w odpowiedzi na uszkodzenie DNA. Oprócz czasowo i warunkowo kontrolowanej edycji genów, kolejną zaletą metody jest to, że stabilizacja DD-Cas9 jest niezależna od jego transkrypcji. Cecha ta umożliwia koekspresję, pod tym samym promotorem, identyfikowalnych markerów, a także rekombinaz, takich jak rekombinaza zależna od receptora estrogenowego, CREER. W niniejszej pracy pokazujemy, w jaki sposób nasza metoda może być z powodzeniem stosowana in vitro, do warunkowego celowania np. w gen replikacji DNA, RPA3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.Wektor DD-Cas9

  1. Uzyskaj wektor DD-Cas9 z Addgene (DD-Cas9 z sekwencją wypełniającą i Wenus (EDCPV), plazmid 90085).
    UWAGA: Jest to lentiwirusowy plazmid DD-Cas9 z promotorem U6, który napędza transkrypcję pojedynczego przewodnika RNA (sgRNA), podczas gdy promotor EFS napędza transkrypcję DD-Cas9. Sekwencja DYKDDDDK (znacznik flagowy) jest obecna na C-końcu Cas9, a następnie peptyd samorozszczepiający 2A (P2A), który oddziela DD-Cas9 i zmodyfikowane białko fluorescencyjne Venus (mVenus).

2. Projekt małego przewodnika RNA (sgRNA)

  1. Zaprojektuj mały przewodnik RNA (sgRNA), który zostanie sklonowany do wektora DD-Cas9 przy użyciu jednego z kilku algorytmów, ukierunkowanych na określony region genomu.
    UWAGA: Aby zmniejszyć efekty off-target, wybierz sekwencje sgRNA z najwyższym wynikiem, korzystając ze strony internetowej: http://crispr.mit.edu.
  2. Zaprojektuj i zamów dwa oligonukleotydy na sekwencję sgRNA, aby uzyskać kompletny sgRNA.
    UWAGA: Ponieważ plazmid zostanie strawiony przez enzym BsmBI, zaprojektuj oligonukleotyd do przodu i do tyłu, dodając zwisy trawienia BsmBI do sekwencji sgRNA. Użyj szablonu z tabeli 1.

3. Klonowanie sgRNA do lentiwirusowego wektora DD-Cas9

  1. Defosforylacja końców 5′ plazmidu DD-Cas9 za pomocą fosfatazy alkalicznej (FastAP) w reakcji trawienia enzymem restrykcyjnym.
    UWAGA: Wektory mogą ponownie krążyć podczas ligacji, zwłaszcza gdy są linearyzowane przez pojedynczy enzym restrykcyjny. Aby upewnić się, że wektor nie będzie ponownie krążył, należy odfosforylować plazmid, dodając fosfatazę bezpośrednio do reakcji trawienia.
    1. Defosforylację i trawienie plazmidu za pomocą enzymu BsmBI, przygotowanie mieszanki 5 μg plazmidu DD-Cas9, 6 μL buforu trawiącego (10x), 0,6 μL DTT (100 mM), 3 μL BsmBI, 3 μL FastAP, dodać do 60 μl wody wolnej od nukleaz, aby uzyskać 60 μl całkowitej objętości reakcji.
      UWAGA: Na końcu dodaj enzym BsmBI i FastAP do mieszaniny.
    2. Inkubować mieszaninę przez 30 minut w temperaturze 37 °C, bloku grzewczego lub termocyklera.
  2. Oczyść strawiony plazmid DD-Cas9.
    1. Przygotuj 0,8% żel agarozowy DNA, aby usunąć niecałkowicie strawiony plazmid i ślady enzymów. Użyj szerszego grzebienia żelowego dla lepszej separacji i uruchom żel pod napięciem 90 V.
    2. Wizualizuj pasma pod światłem UV 360-365 nm i wytnij większe pasmo plazmidu z żelu. Wyrzucić fragment o wielkości 2 kb, który odpowiada wypełniaczowi.
    3. Oczyść dużą opaskę żelową za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania żelu i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Związał wyżarzone oligonukleotydy z trawionym plazmidem DD-Cas9.
    1. Fosforylować i wyżarzać oligonukleotydy sgRNA.
      1. Przygotować mieszaninę 1 μl buforu ligacyjnego T4 (10x), 1 μl Oligo 1 (100 μM), 1 μL Oligo 2 (100 μM), 6,5 μl wody wolnej od nukleaz. Na koniec dodaj 0,5 μl T4 PNK. Całkowita objętość tej reakcji wynosi 10 μL.
      2. Dodać mieszaninę reakcyjną do termocyklera w następujących warunkach: 37 °C przez 30 min, 95 °C przez 5 min, a następnie zmniejszyć do 25 °C z prędkością 5 °C/min.
        UWAGA: PNK musi zostać inaktywowany termicznie przed wprowadzeniem oligonukleotydów do ligacji, w przeciwnym razie PNK spowoduje fosforylację wektora. Etap fosforylacji i etap wyżarzania są wykonywane razem w termocyklerze. Etap fosforylacji, w którym fosforan 5' jest dodawany do oligonukleotydów sgRNA, jest wymagany do zajścia ligacji.
    2. Zligowany plazmid trawiony DD-Cas9 i oligonukleotydy sgRNA.
      1. Rozcieńczyć wyżarzane oligonukleotydy w stosunku 1:200 w wodzie wolnej od nukleaz i użyć 50 ng plazmidowego DNA w reakcji ligacji.
        UWAGA: Użyj stosunku molowego wektora 6 insert : 1, aby promować integrację insertu lub użyj kalkulatora ligacji, aby obliczyć stosunek molowy: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation.
      2. Przygotować mieszaninę reakcyjną ligacji: 50 ng strawionego i oczyszczonego wektora DD-Cas9, odpowiednią objętość rozcieńczonych wyżarzonych oligonukleotydów, 1 μl buforu ligacyjnego T4 (10x), 1 μl ligazy DNA T4, do 10 μl wody wolnej od nukleaz w celu uzyskania całkowitej objętości reakcji 10 μL.
      3. W przypadku stosowania ligazy o "wysokim stężeniu" należy inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 5 minut. W przeciwnym razie inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny lub, aby uzyskać wyższą wydajność ligacji, inkubować w temperaturze 16 °C przez noc.
        UWAGA: Dezaktywuj termicznie, jeśli używasz standardowej ligazy DNA T4 w temperaturze 65 °C przez 20 minut. Nie dezaktywować termicznie, jeśli używasz głównych mieszanek ligazy.

4. Transformacja bakteryjna

  1. Podgrzej 10 cm płytki agarowe LB-ampicyliny w temperaturze pokojowej.
  2. Rozmrozić 50 μl kompetentnych komórek bakteryjnych "One shot Stbl3" na lodzie.
  3. Dodaj 2-3 μl mieszaniny do ligacji do 50 μl kompetentnych komórek bakteryjnych i delikatnie wymieszaj, przesuwając 4 razy dno probówki palcem. Inkubować na lodzie przez 30 minut.
  4. Szok termiczny komórek dokładnie w temperaturze 42 °C przez 40 sekund za pomocą timera. Schłodzić komórki bakteryjne na lodzie przez 5 minut.
  5. Dodać 500 μl pożywki SOC bez antybiotyku do komórek bakteryjnych i hodować je w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 250 obr./min przez 45 minut, w temperaturze 37 °C.
  6. Rozprowadzić 100 μl przekształconych bakterii na wstępnie ogrzanych płytkach LB-ampicyliny i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.

5. Mini/maxi-przygotowanie podwiązanego plazmidu

  1. Przygotuj kulturę starterową maxi/mini-prep.
    1. Następnego dnia wybierz pojedynczy klon bakteryjny i zaszczep kulturę starterową 8 ml pożywki LB zawierającej ampicylinę.
    2. Hodować bakterie w inkubatorze z wytrząsaniem przy 250 obr./min, 37 °C przez 10-12 godzin.
    3. Użyj 3-5 ml bakterii do mini-prep lub użyj go jako kultury starterowej do maxi-prep. Użyj reszty bakterii jako bakteryjnego glicerolu, dodając 100% glicerolu w stosunku do kultury bakteryjnej: glicerol wynosi 1:1,
      UWAGA: Tutaj opiszemy procedurę mini-przygotowania.
  2. Procedura mini-przygotowania
    1. Zbierz 3-5 ml komórek bakteryjnych i odwiruj przy 12 000 x g przez 1 minutę.
    2. Zawiesić osad komórek bakteryjnych w 200 μl buforu P1 zawierającego RNazę A i przechowywanego w temperaturze 4 °C.
    3. Dodać 200 μl buforu P2 i delikatnie wymieszać, obracając probówkę 10 razy, aż płyn się sklaruje.
    4. Dodać 300 μl buforu P3 i wymieszać, odwracając probówkę 10 razy. Płyn stanie się mętny. Natychmiast należy przystąpić do odwirowania próbek o masie 12 000 x g przez 10 minut.
    5. Przenieść klarowny supernatant do kolumny wirowej i odwirować przy 12 000 x g przez 1 min.
      Wyrzuć przepływ.
      UWAGA: Upewnij się, że supernatant jest sklarowany. Cząstki mogą zatkać kolumnę wirującą i zmniejszyć jej skuteczność.
    6. Dodać 400 μl buforu PD i odwirować przy 12 000 x g przez 1 min. Wyrzucić przepływ.
    7. Dodać 600 μl buforu PW, aby przepłukać kolumnę wirową i odwirować przy 12 000 x g przez 1 min. Wyrzucić przepływ.
    8. Ponownie odwirować kolumnę wirową z maksymalną prędkością przez 3 minuty, aby usunąć pozostałości buforu. Wyrzuć przepływ i pozostaw na 2 minuty.
    9. Umieścić kolumnę wirową w świeżej probówce i dodać 50 μl buforu elucyjnego. Inkubować przez 5 minut i wirować z maksymalną prędkością przez 2 minuty.
    10. Użyj urządzenia nanodrop, aby zmierzyć stężenie oczyszczonego plazmidu DD-Cas9 z insertem sgRNA (ng / μL).
  3. Walidacja klonowania sgRNA przez sekwencjonowanie DNA plazmidu DD-Cas9. Należy użyć sekwencji starterów U6 w Tabeli 2.

6. Preparat lentiwirusowy

  1. Przygotuj HEK293T komórki pakujące do transfekcji.
    1. Stosować zdrowe HEK293T do pasażu 10 i wysiewać je równomiernie w gęstości 1-2 x 106 komórek na 10 cm płytki do hodowli tkankowej. Użyj 10 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle Medium (DMEM) firmy Glucose Dulbecco z 10% przefiltrowaną płodową surowicą bydlęcą (FBS). Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez 20 godzin.
    2. Następnego dnia potwierdź, że komórki osiągnęły 70% konfluencji za pomocą mikroskopii jasnego pola i że są równomiernie rozproszone na płytce. Zmienić pożywkę na komórki 1 godzinę przed transfekcją z końcową objętością 10 ml.
      UWAGA: W pożywce nie powinno być antybiotyków i leków przeciwgrzybiczych.
    3. Przygotować mieszaninę 2 probówek z 500 μl ciepłego podłoża (np. OptiMEM).
      1. Dodać 25 μl odczynnika do transfekcji do probówki 1 zawierającej ciepłe 500 μl pożywki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
      2. W międzyczasie przygotuj mieszaninę plazmidów do probówki 2 zawierającej 3,5 μg DD-Cas9 zawierającej sklonowane sgRNA, 6 μg plazmidu pakującego (psPAX2) i 3 μg plazmidu otoczkowego (pMD2.G) do ciepłych 500 μl pożywki.
      3. Wymieszaj probówkę 1 z probówką 2, aby utworzyć mieszaninę transfekcji i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
      4. Kroplami mieszaninę transfekcji do HEK293T komórek i inkubować na płytce w inkubatorze do hodowli tkankowych, w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez noc.
      5. Po 18 godzinach ostrożnie zmień pożywkę na 10 ml świeżego DMEM z 10% FBS, aby usunąć odczynnik do transfekcji. Inkubować przez następne 48 godzin.
      6. Po 48 godzinach zebrać supernatant za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i przepuścić go przez filtr 0,45 μm.
      7. Podzielić i przechowywać supernatant wirusa w temperaturze -80 °C.

7. Określanie miana wirusa i skuteczności transdukcji za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Zasiać HEK293T komórki z 5 x 105 komórek/studzienką na płytce 6-dołkowej. Komórki nasienne na dwie płytki 6-dołkowe. Użyj jednej płytki do liczenia następnego dnia.
  2. Inkubować płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, wilgotności 95%, 5% CO2 przez noc, aby następnego dnia osiągnąć 50-60% zżyłości.
  3. Następnego dnia użyj jednej z 6-dołkowych płytek, aby policzyć komórki w 6 dołkach.
  4. Rozmrozić podwielokrotność wirusa, która zostanie użyta do przeprowadzenia seryjnego rozcieńczania i dodać 8 μg/ml odczynnika polibrenowego.
  5. Przygotować DMEM z 10% FBS do seryjnego rozcieńczania wirusa i dodać 8 μg/ml odczynnika polibrenowego.
  6. Przygotować 2 ml dziesięciokrotnych seryjnych rozcieńczeń lentiwirusa od 1 x 10-1 do 1 x 10-4 w pożywkach zawierających polibren.
  7. Usuń pożywkę z płytki 6-dołkowej i dodaj 1 ml rozcieńczeń wirusa do studzienek. Zostaw jedną studzienkę z pożywką w spokoju jako kontrolę negatywną, a drugą studzienkę ze 100% wirusem.
  8. Inkubować komórki z wirusem w inkubatorze przez 24 godziny.
  9. Następnego dnia usuń pożywkę z wirusem z płytek 6-dołkowych i zmień ją na 2 ml świeżego DMEM z 10% FBS. Inkubować komórki przez 48-72 godziny. Obserwuj GFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego każdego dnia.
  10. Po 48-72 h odłącz ogniwa i ponownie zawieś je w buforze MACS.
  11. Użyj cytometru przepływowego, aby określić procentową zawartość wyrażenia GFP.
  12. Oblicz miano wirusa za pomocą następującego wzoru: TU / ml = (liczba transdukowanych komórek x procent fluorescencji x współczynnik rozcieńczenia)/(objętość transdukcji w ml)

8. Transdukcja lentiwirusowa komórek docelowych

  1. Umieść linię komórkową na 10-centymetrowej płytce i inkubuj przez noc, aby następnego dnia osiągnąć konfluencję 50-60%.
    UWAGA: Użyliśmy linii komórkowej A549 eksprymującej DD-Cas9 i dwóch niezależnych sgRNA genu RPA3. Użyliśmy również wektora eksprymującego linię komórkową A549 z kontrolą Renilla. Wysialiśmy te komórki w gęstości 2 x 103komórki/cm2 i inkubowaliśmy je w temperaturze 37 °C, 95% wilgotności, 5% CO2 przez noc, aby następnego dnia osiągnąć 50-60% zbliżenia. Użyliśmy nośników RPMI z 10% filtrowanym FBS. Przystąpiliśmy do kolejnych kroków w następujący sposób:
  2. Następnego dnia należy zainfekować komórki 500-2000 μl cząstek wirusa w 10 ml całkowitej objętości pożywki hodowlanej. Inkubować pożywki wirusowe przez 24 godziny.
  3. Następnego dnia zmień pożywkę wirusową na pożywkę hodowlaną i określ procent komórek GFP dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej.
  4. Wybierz komórki GFP dodatnie przez sortowanie komórek FACS lub przy użyciu selekcji bleomycyny.
  5. Rozwiń pozytywnie wybrane komórki i zamroź zapas.

9. Warunkowa indukcja edycji genów za pośrednictwem Cas9

  1. Płytkę dodatnio wyselekcjonowane komórki 24 godziny po zakażeniu, a także komórki nietransdukowane osobno na płytkę 12-dołkową. Poczekaj, aż komórki się przyczepią i zmień pożywkę na pożywkę do hodowli komórkowych zawierającą 200 nM Shield-1. Zastąp pożywki w płytkach komórkami transdukowanymi i nietransdukowanymi, pozostawiając 2 dołki na płytkę ze zwykłymi pożywkami jako kontrolę ujemną.
  2. Inkubować i ekstrahować białka z każdej studzienki w różnych punktach czasowych: czas 0, 2 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h i 72 h po dodaniu Shield-1 do studzienek.
  3. Następnie usuń pożywkę z Shield-1 z pozostałych studzienek i zmień ją na zwykłą pożywkę komórkową.
  4. Białka należy zebrać z tych studzienek 2 godziny, 6 godzin i 12 godzin po zmianie pożywki.
  5. Wizualizacja za pomocą analizy western blot odwracalności i szybkości zdestabilizowanej regulacji białka DD-Cas9 po dodaniu i wycofaniu jego liganda, Shield-1. Użyj przeciwciała skierowanego w stronę znacznika DYKDDDDK, aby uwidocznić białka i przeciwciało kontrolne skierowane na przykład beta-tubulinę.
  6. Określić optymalną dawkę Shield-1 na podstawie krzywej dawka-odpowiedź obserwowanej za pomocą analizy Western Blot.

10. Walidacja edycji genów

UWAGA: Testy ekspresji GFP, takie jak analiza cytometrii przepływowej i marker wyboru bleomycyny, potwierdzają tylko udane dostarczenie odczynnika CRISPR, ale nie określają, czy pożądana sekwencja została pomyślnie ukierunkowana. Najczęstszymi testami potwierdzającymi skuteczne celowanie genów w eksperymencie CRISPR są sekwencjonowanie DNA Sangera, sekwencjonowanie nowej generacji, test nukleazy Surveyor, test śledzenia indelii przez rozkład (TIDE) lub analiza western blot16,17,18.

  1. Płytka dodatnio dobranych komórek i zmiana pożywki na 200 nM pożywki zawierającej Shield-1. Inkubuj komórki przez 5 dni, zmieniając pożywkę z Shield-1 co 3 dni.
  2. Zastosuj wyżej wymienione techniki walidacji 5 dni po indukcji DD-Cas9 przez Shield-1.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby umożliwić warunkową ekspresję Cas9, opracowaliśmy konstrukt podwójnego wektora lentiwirusowego, składający się z promotora napędzanego przez U6 do konstytutywnej ekspresji sgRNA oraz promotora rdzenia EF-1α do napędzania ekspresji białka fuzyjnego DD-Cas9 (Rysunek 1A)19. Jako paradygmat ilustrujący solidność i wydajność systemu, przeprowadziliśmy transdukcję linii komórkowej A549 raka płuc za pomocą konstruktu lentiwirusowego. Poziomy Cas9 w...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technologia CRISPR/Cas9 zrewolucjonizowała możliwości funkcjonalnego badania genomów2. Jednak inaktywacja genów często prowadzi do śmiertelności komórek, deficytów funkcjonalnych i wad rozwojowych, co ogranicza użyteczność takich podejść do badania funkcji genów7. Dodatkowo, konstytutywna ekspresja Cas9 może powodować toksyczność i generowanie efektów off-target6. Opracowano różne podejścia do czasowej kontroli technologii edycji genomu opartych na C...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy poprzednim członkom naszego laboratorium i naukowcowi Serifowi Senturkowi za wcześniejszą pracę. Dziękujemy Danilo Segovii za krytyczną lekturę tego manuskryptu. Badanie to było możliwe i wspierane przez Swim Across America oraz program National Cancer Institute Cancer Target Discovery and Development Center.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100mM DTTThermosfisher
10X Bufor FastDigestThermosfisherB64
10X T4 Bufor ligacyjnyNEBM0202S kolorymetryczny
zestaw BCAPierce23225
DMEM, wysoka glukoza, glutaMaxThermo Fisher10566024
FastAPThermosfisherEF0654
FastDigest BsmBIThermosfisherFD0454
Flag [M2] mysi mAbSigmaF1804-50UG
Zestaw do ekstrakcji genomowego DNAMacherey Nagel740952.1
lipofektamina 2000Invitrogen11668019
Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wiernościNEBM0530S
oligonukleotydySigma Aldrich
pMD2.GAddgene12259
polybreneSigma AldrichTR-1003-G
psPAX2Addgene12260
QIAquick PCR & Zestaw do czyszczenia żeluQiagen28506
przeciwciała drugorzędoweLICOR
Shield-1Cheminpharma
Stbl3 kompetentne komórki bakteryjneThermofisherC737303
SURVEYOR Zestaw do wykrywania mutacjiTransgenomic/IDT
T4 PNKNEBM0201S
Taq DNA PolimerazaNEBM0273S
&alfa;-tubulina [DM1A] mysi mAbMiliporyCP06-100UG

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, New York, N.Y. 816-821 (2012).
  2. Al-Attar, S., Westra, E. R., van der Oost, J., Brouns, S. J. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPRs): the hallmark of an ingenious antiviral defense mechanism in prokaryotes. Biological Chemistry. 392, 277-289 (2011).
  3. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157, 1262-1278 (2014).
  4. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, New York, N.Y. 823-826 (2013).
  5. Barrangou, R., et al. Advances in CRISPR-Cas9 genome engineering: lessons learned from RNA interference. Nucleic Acids Research. 43, 3407-3419 (2015).
  6. Zhang, J., Chen, L., Zhang, J., Wang, Y. Drug Inducible CRISPR/Cas Systems. Computational and Structural Biotechnology Journal. , (2019).
  7. Wade, M. High-Throughput Silencing Using the CRISPR-Cas9 System: A Review of the Benefits and Challenges. Journal of Biomolecular Screening. 20, 1027-1039 (2015).
  8. Egeler, E. L., Urner, L. M., Rakhit, R., Liu, C. W., Wandless, T. J. Ligand-switchable substrates for a ubiquitin-proteasome system. Journal of Biological Chemistry. 286, 31328-31336 (2011).
  9. Cao, J., et al. An easy and efficient inducible CRISPR/Cas9 platform with improved specificity for multiple gene targeting. Nucleic Acids Research. 44, 149(2016).
  10. Oakes, B. L., et al. Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch. Nature Biotechnology. 34, 646-651 (2016).
  11. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046(2016).
  12. Roper, J., et al. In vivo genome editing and organoid transplantation models of colorectal cancer and metastasis. Nature Biotechnology. 35, 569(2017).
  13. Chu, B. W., et al. Recent progress with FKBP-derived destabilizing domains. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 18 (22), 5941-5944 (2008).
  14. Banaszynski, L. A., Sellmyer, M. A., Contag, C. H., Wandless, T. J., Thorne, S. H. Chemical control of protein stability and function in living mice. Nature Medicine. 14, 1123-1127 (2008).
  15. Banaszynski, L. A., Chen, L. C., Maynard-Smith, L. A., Ooi, A. G., Wandless, T. J. A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell. 126, 995-1004 (2006).
  16. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A Survey of Validation Strategies for CRISPR-Cas9 Editing. Scientific Reports. 8, 888(2018).
  17. Hua, Y., Wang, C., Huang, J., Wang, K. A simple and efficient method for CRISPR/Cas9-induced mutant screening. Journal of Genetics and Genomics. 44 (4), 207-213 (2017).
  18. Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods in Molecular Biology. 649, 247-256 (2010).
  19. Senturk, S., et al. Rapid and tunable method to temporally control gene editing based on conditional Cas9 stabilization. Nature Communications. 8, 14370(2017).
  20. McJunkin, K., et al. Reversible suppression of an essential gene in adult mice using transgenic RNA interference. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 7113(2011).
  21. Davis, K. M., Pattanayak, V., Thompson, D. B., Zuris, J. A., Liu, D. R. Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity. Nature Chemical Biology. 11, 316-318 (2015).
  22. Dow, L., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nature Biotechnology. 33, 390-394 (2015).
  23. Wright, A. V., et al. Rational design of a split-Cas9 enzyme complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 2984-2989 (2015).
  24. Albrecht, C., et al. Comparison of Lentiviral Packaging Mixes and Producer Cell Lines for RNAi Applications. Molecular Biotechnology. 57, 499-505 (2015).
  25. Froschauer, A., Kube, L., Kegler, A., Rieger, C., Gutzeit, H. O. Tunable Protein Stabilization In Vivo Mediated by Shield-1 in Transgenic Medaka. PLOS One. , (2015).
  26. Sellmyer, M. A., et al. Intracellular context affects levels of a chemically dependent destabilizing domain. PLOS One. 7 (9), 43297(2012).
  27. Iwamoto, M., et al. A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system. Chemistry & Biology. 17 (9), 981-988 (2010).
  28. Tai, K., et al. Destabilizing domains mediate reversible transgene expression in the brain. PLOS One. 7 (9), 46269(2012).
  29. Auffenberg, E., et al. Remote and reversible inhibition of neurons and circuits by small molecule induced potassium channel stabilization. Scientific Reports. 6, 19293(2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Conditional Cas9 StabilizationCRISPR Cas9 Gene EditingShield 1 Inducible SystemDD Cas9 DestabilizationBicistronic Vector DesignFlow Cytometry AnalysisLentivirus Titer DeterminationHEK293T Cell CultureEssential Gene CharacterizationTumor Survival Gene Study

Related Articles