Artykuł metodologiczny

Protokół stopniowego dozowania w celu zwiększenia przepustowości w bezznacznikowych testach GPCR opartych na impedancji

6.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60686

⸱

21 lutego 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Analytical Chemistry, Chemo- and Biosensors, University of Regensburg, 2Institute of Pharmacy, University of Regensburg, 3Department of Chemistry and Pharmacy, Friedrich-Alexander University Erlangen-Nuernberg, 4Fraunhofer Research Institution for Microsystems and Solid State Technologies EMFT

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół demonstruje rejestrowanie w czasie rzeczywistym pełnych zależności dawka-odpowiedź dla indukowanej przez agonistę aktywacji GPCR z pojedynczej warstwy komórki hodowanej na pojedynczej mikroelektrodzie przy użyciu pomiarów impedancji bez znaczników. Nowy schemat dozowania znacznie zwiększa przepustowość bez utraty rozdzielczości czasowej.

Streszczenie

Testy oparte na impedancji bez znaczników są coraz częściej używane do nieinwazyjnego badania indukowanej przez ligandy aktywacji GPCR w eksperymentach z hodowlami komórkowymi. Podejście to zapewnia monitorowanie komórek w czasie rzeczywistym z zależną od urządzenia rozdzielczością czasową do kilkudziesięciu milisekund i jest wysoce zautomatyzowane. Jednakże, gdy liczba próbek staje się wysoka (np. badania dawka-odpowiedź dla różnych ligandów), koszt jednorazowych matryc elektrod, jak również dostępna rozdzielczość czasowa dla sekwencyjnych zapisów well-by-well, mogą stać się ograniczające. Dlatego przedstawiamy tutaj protokół addycji szeregowego agonisty, który może znacznie zwiększyć wydajność testów GPCR bez znaczników. Korzystając z protokołu dodawania szeregowego agonisty, agonista GPCR jest dodawany sekwencyjnie w zwiększających się stężeniach do pojedynczej warstwy komórki, jednocześnie stale monitorując impedancję próbki (tryb agonisty). Dzięki temu seryjnemu podejściu możliwe jest teraz ustalenie pełnej krzywej dawka-odpowiedź dla agonisty GPCR z tylko jednej warstwy komórek. Protokół addycji szeregowego agonisty ma zastosowanie do różnych typów sprzężeń GPCR, Gq G i / 0 lub Gs i jest zgodny z rekombinowanymi i endogennymi poziomami ekspresji badanego receptora. Blokowanie receptorów przez antagonistów GPCR jest również możliwe do oceny (tryb antagonisty).

Wprowadzenie

Ten raport przedstawia szczegółowy opis protokołu szeregowego dodawania, opracowanego do ilościowego oznaczania indukowanej przez ligand aktywacji receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR) w przylegających do siebie komórkach za pomocą pomiarów impedancji bez znaczników. Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) są zaangażowane w wiele funkcji fizjologicznych i chorób człowieka1. Ze względu na to, a także ich dobrą dostępność na powierzchni komórki, GPCR są jednym z najważniejszych celów leków. Ocena ta znajduje odzwierciedlenie w szacunkowej liczbie ~700 zatwierdzonych leków ukierunkowanych na GPCR, co odpowiada ~35% udziałowi we wszystkich dostępnych na rynku lekach2.

Rozwój nowych leków składa się z dwóch głównych procesów: (i) identyfikacji i funkcjonalnej charakterystyki biologicznych cząsteczek docelowych, oraz (ii) odkrywania nowych substancji wiodących i przekształcania ich w leki możliwe do podawania. W obu procesach potrzebne są skuteczne metody ilościowej oceny interakcji lek-cel i późniejszej odpowiedzi biologicznej. Na różnych etapach przedklinicznego procesu opracowywania leku wykorzystuje się różne metody analizy, począwszy od badań interakcji biomolekularnych między lekiem a celem, poprzez badania funkcjonalne na komórkach w hodowli, aż po eksperymenty na wyciętym materiale narządowym lub całych zwierzętach. Zarówno znaczenie fizjologiczne, jak i złożoność biologiczna wzrastają od pierwszego do drugiego3. Chociaż ogólnym celem jest zminimalizowanie liczby eksperymentów na zwierzętach, badania farmakologiczne z wykorzystaniem wyizolowanych narządów od zwierząt laboratoryjnych lub nawet całych zwierząt są uważane za nieuniknione w celu kompleksowego scharakteryzowania nowych kandydatów na leki. Jeśli chodzi o odczyt analityczny, badania farmakologiczne narządów zapewniają dystalną, integracyjną "holistyczną" odpowiedź funkcjonalną o najwyższym znaczeniu fizjologicznym. Wadą takich eksperymentów jest to, że nie są one kompatybilne z wysokoprzepustowymi badaniami przesiewowymi zarówno ze względów technicznych, jak i etycznych i zostały w dużej mierze zastąpione badaniami opartymi na hodowli komórkowych in vitro4.

Metody ilościowego oznaczania aktywacji GPCR w hodowlach komórkowych obejmują różne testy chemiczne oparte na znacznikach, które w szczególności wykrywają drugie przekaźniki, stan fosforylacji białek sygnałowych w dalszej części strumienia, aktywację transkrypcji za pomocą pewnych czynników transkrypcyjnych lub indukowany przez ligand transport receptorów wewnątrzkomórkowych4,5. Wadą takich testów opartych na znakowaniu jest konieczność znakowania komórek potencjalnie szkodliwymi barwnikami lub markerami radioaktywnymi. Często wymaga to przeprowadzenia testu jako określenia punktu końcowego dla czasu ekspozycji, który musi być określony a priori. Stosowanie testów punktów końcowych opartych na znacznikach cierpi z powodu bardzo ograniczonego i stronniczego czasu eksperymentu oraz ryzyka, że znaczniki chemiczne i sondy mogą zakłócać normalną fizjologię komórki – potencjalnie niezauważone przez eksperymentatora.

W ostatnich latach pojawiły się bezznacznikowe testy do monitorowania aktywacji GPCR, takie jak techniki oparte na impedancji lub metody optyczne wykorzystujące rezonansowe siatki falowodowe5,6. Znakowanie komórek nie jest eksperymentalnie wymagane w przypadku tych podejść. Ponieważ te fizyczne odczyty działają na sygnałach o niskiej amplitudzie, takie metody są uważane za nieinwazyjne, pozwalają na ciągłe monitorowanie komórek potencjalnie w czasie rzeczywistym, a czas obserwacji jest ograniczony tylko przez hodowlę komórkową, a nie przez odczyt. Podobnie jak w przypadku odczytów z całych narządów, podejścia bezznacznikowe zwykle informują o całościowych reakcjach komórek, daleko po aktywacji receptora, gdy integracja wzdłuż całej sieci sygnalizacyjnej prowadzi do zależnych od czasu, ale raczej niespecyficznych zmian w morfologii komórki lub redystrybucji masy. Podczas gdy testy oparte na impedancji mierzą sygnaturę dielektryczną zmian kształtu komórki7,8, pomiary przy użyciu rezonansowych siatek falowodowych są wrażliwe na zmiany indeksu refrakcji na granicy komórka-podłoże wynikające z dynamicznej redystrybucji masy (DMR)9. Integracyjny charakter sprawia, że metody bezznacznikowe są niezwykle wrażliwe na zdarzenia za pośrednictwem receptora, niezależnie od typu (typów) białka G (Gq, Gi / 0, Gs, G12/13) lub β-aresztyny zaangażowanej w kaskadę sygnalizacyjną < sup class="xref">6 i dobrze nadaje się do endogennych poziomów ekspresji receptora.

W standardowym teście opartym na impedancji, bez znaczników, komórki są hodowane na płytkach wielodołkowych ze współpłaszczyznowymi elektrodami o złotej folii umieszczonymi na dnie każdej studni10. Te układy elektrod są podłączone do analizatora impedancji, a reakcje komórek na bodziec eksperymentalny są rejestrowane z poszczególnych studni za pomocą odczytów impedancji z rozdzielczością czasową. W typowym teście GPCR ligand jest dodawany w indywidualnie różnych stężeniach do każdego indywidualnego dołka. Wywołane przez ligand zmiany w przebiegu impedancji w czasie są następnie analizowane w odniesieniu do cech charakterystycznych krzywej, takich jak maksymalna zmiana sygnału, obszar pod krzywą, zmiana sygnału w danym przedziale czasu lub nachylenie krzywej w określonym punkcie czasowym, w celu ilościowego określenia siły i skuteczności liganda11.

Koszt matryc elektrod może ograniczać zastosowanie tej techniki w kampaniach wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS). Ponadto, wraz ze wzrostem liczby próbek, które mają być śledzone równolegle, liczba indywidualnych pomiarów wzrasta, a tym samym stopniowo zmniejsza dostępną rozdzielczość czasową dla każdego dołka - nawet w przypadku najnowocześniejszych nagrań wielokanałowych. W takich warunkach szybkie i przejściowe odpowiedzi komórek mogą wymknąć się pomiarowi. Ponadto konwencjonalne podejście oparte na jednym odwiercie – jednym stężeniu nakłada znaczny czynnik czasu i kosztów na rozwój perfuzji narządów na chipie lub ciała na chipie w odniesieniu do ich przydatności w analizie interakcji ligand-GPCR.

Z tego powodu opracowaliśmy protokół stopniowego dozowania, który umożliwia rejestrację pełnych krzywych dawka-odpowiedź indukowanej ligandem aktywacji GPCR w monowarstwach hodowanych komórek poprzez ciągłe monitorowanie impedancji pojedynczego dołka, podczas gdy stężenie agonisty jest stopniowo zwiększane. Protokół addycji szeregowego agonisty znacznie zwiększa przepustowość na studzienkę z jednego stężenia do 10 lub więcej stężeń, jak pokazano na aktualnym przykładzie ludzkich komórek MG U-373, które endogennie eksprymują receptor histaminy 1 (H1R). W związku z tym metoda ta może znacznie poprawić przepustowość w badaniach dawka-odpowiedź bez znakowania, przy jednoczesnym zachowaniu rozdzielczości czasowej na poziomie instrumentalnym maksimum.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wysiew komórek na matryce elektrod

UWAGA: Wybór układu elektrod jest kompromisem między czułością a liczbą badanych komórek. Im mniejsza elektroda, tym czulszy jest pomiar, ale mniejsza jest liczba badanych komórek. W przypadku komórek wykazujących silne fluktuacje impedancji w czasie w warunkach bazowych, preferowane są elektrody większe lub typu interdigitated.

  1. Podgrzej w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C wszystkie roztwory niezbędne do standardowego pasażowania i wysiewania komórek. W przypadku analiz z wykorzystaniem ludzkich komórek U-373 MG są to: fosforan buforowany sól fizjologiczna (PBS) bez jonów wapnia i magnezu, trypsyna 0,05% (w/v), pożywka do hodowli komórkowych (Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) uzupełniona o 5% (v/v) płodowej surowicy cielęcej (FCS), 2 mM L-glutaminy oraz 100 µg/mL penicyliny/streptomycyny).
  2. Przepłucz dwukrotnie PBS-em warstwę komórek hodowli stokowej, hodowanej na dnie konwencjonalnych kolb lub naczyń do hodowli komórkowej.
  3. Usuń PBS, dodaj roztwór trypsyny (1 mL na 25 cm2) i inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 5 min (dotyczy komórek U-373 MG).
  4. Za pomocą mikroskopu sprawdź, czy komórki całkowicie oddzieliły się od dna podłoża wzrostowego.
  5. Zatrzymaj reakcję trypsynizacji natychmiast po całkowitym oddzieleniu się komórek, dodając do zawiesiny komórkowej 9 mL pożywki do hodowli komórkowych na każdy 1 mL trypsyny. Ostrożnie wypłucz pozostałe komórki z dna podłoża do hodowli, pipetując zawiesinę po powierzchni podłoża.
  6. Zbierz zawiesinę komórkową pipetą i przenieś ją do probówki wirówkowej (15 mL lub 50 mL).
  7. Odwiruj komórki przy 110 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej.
  8. Ostrożnie usuń nadsącz i dokładnie resuspenduj osad komórkowy w pożywce przed policzeniem komórek (np. przy użyciu komory licznikowej do mikroskopów fazowo-kontrastowych i ręcznym liczeniem).
  9. Dostosuj zawiesinę komórkową do pożądanej gęstości komórek. W eksperymentach z komórkami U-373 MG zastosuj 100 000 cells/cm2, aby uzyskać konfluentną warstwę komórek w ciągu 48 h. Przekłada się to na gęstość 200 000 cells/mL dla macierzy elektrod 8-dołkowych o powierzchni wzrostu ~0,8 cm2 i objętości dołka 400 µL.
    UWAGA: Aby uzyskać powtarzalne wyniki eksperymentów aktywacji GPCR, komórki powinny być hodowane do postaci konfluentnych monowarstw na macierzach elektrod. W celu zapewnienia prawidłowej ekspresji receptorów na powierzchni komórek, należy wysiać komórki co najmniej 36 h przed przeprowadzeniem eksperymentu. Testowanie różnych gęstości wysiewu komórek jest często pomocne w celu zidentyfikowania optymalnych warunków eksperymentalnych.
  10. Dodaj zawiesinę komórkową do dołków macierzy elektrod i pozostaw komórki w temperaturze pokojowej na 10–15 min, aby zapewnić ich jednorodne rozmieszczenie na dnie dołków.
  11. Hoduj komórki przez co najmniej 36 h w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych z 5% CO2 (zależnie od rodzaju pożywki) w temperaturze 37 °C i w warunkach zwiększonej wilgotności. Wymień pożywkę do hodowli komórkowych na 24 h przed eksperymentem.
  12. W dniu eksperymentu sprawdź warstwy komórek na macierzach elektrod za pomocą mikroskopii (fazowo-kontrastowej), aby upewnić się, że elektrody są całkowicie pokryte komórkami.

2. Równoważenie komórek w medium bezsurowiczym

  1. Podgrzej wstępnie pożywkę bezsurowiczą; w niniejszym badaniu: pożywkę Leibovitza L15.
  2. Usuń pożywkę hodowlaną z komórek hodowanych na matrycach elektrod i zastąp ją wstępnie podgrzaną pożywką bezsurowiczą. Użyj 200 µL dla matryc elektrod w formacie 8 dołków oraz 150 µL dla matryc elektrod w formacie 96 dołków.
  3. Pozostaw komórki do wyrównania w pożywce bezsurowiczej w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 h. Czas wyrównania jest silnie zależny od typu komórek. Na przykład komórki U-373 MG wymagają 2 h, komórki CHO wymagają 4 h, a komórki BAEC mogą wymagać wyrównania w pożywce L-15 przez noc.
    UWAGA: Pożywka L-15 jest niezależna od CO2 i wymaga atmosfery wolnej od CO2. W celu wyrównania w pożywce L-15 ustaw inkubator na 0 % CO2. Proces wyrównania można monitorować za pomocą pomiarów impedancji, co zalecamy wykonać podczas pierwszych eksperymentów.

3. Monitorowanie równoważenia komórek za pomocą pomiarów impedancji

  1. Umieść matrycę elektrod w uchwycie łączącym analizatora impedancji.
  2. Upewnij się, że między elektrodami a analizatorem impedancji występuje prawidłowy kontakt o niskiej impedancji. Sposób przeprowadzenia tej kontroli różni się w zależności od urządzenia.
    UWAGA: Jeśli instrument nie nawiąże połączenia z elektrodami, otwórz ponownie zacisk kontaktowy, skoryguj ustawienie matrycy elektrod w uchwycie i spróbuj ponownie.
  3. Wybierz typ elektrod i/lub format wielodołkowy w interfejsie użytkownika oprogramowania.
  4. Ustaw parametry pomiarowe. Dostępne są różne opcje.
    UWAGA: W celu wyboru najczulszej częstotliwości prądu zmiennego (AC) należy odnieść się do literatury i instrukcji obsługi urządzenia, ponieważ zależy ona od układu elektrod oraz badanego typu komórek. Zazwyczaj częstotliwość detekcji mieści się w zakresie 4 kHz – 50 kHz. W tym przypadku komórki U-373 MG hodowano na okrągłych elektrodach roboczych o średnicy 250 µm i monitorowano je przy częstotliwości AC wynoszącej 12 kHz.
    1. Jeśli dostępne są tryby akwizycji danych dla pojedynczej i wielu częstotliwości, wybierz tryb pojedynczej częstotliwości, aby zapewnić maksymalną rozdzielczość czasową. Pomiar zostanie wykonany przy tej jednej częstotliwości. W przypadku najpopularniejszych instrumentów dostępnych jest szereg wstępnie ustawionych częstotliwości w ramach dostępnego okna częstotliwości.
    2. Jeśli liczba badanych dołków jest mała lub rozdzielczość czasowa nie jest krytyczna, wybierz zamiast tego rejestrację wielu częstotliwości. Wartości impedancji dla określonej liczby częstotliwości zostaną zapisane dla każdego dołka do późniejszej szczegółowej analizy.
      UWAGA: Rozdzielczość czasowa zmniejsza się wraz ze wzrostem liczby rejestrowanych częstotliwości na dołek oraz wzrostem liczby dołków. Opcje wyboru częstotliwości i trybu akwizycji danych różnią się w zależności od typu i wersji instrumentu.
  5. Rozpocznij akwizycję danych w funkcji czasu.
  6. Monitoruj impedancję warstwy komórek (przez co najmniej 2 h), aż impedancja się ustabilizuje. W międzyczasie przygotuj roztwory agonistów.
  7. Gdy warstwy komórek osiągną stabilny poziom impedancji, można (i) przejść do seryjnego dodawania agonistów w ramach tego samego eksperymentu lub (ii) zakończyć akwizycję danych i rozpocząć nowy zestaw danych w celu monitorowania aktywacji receptorów indukowanej agonistą.

4. Przygotowanie roztworów agonistów do eksperymentów w trybie agonistycznym

  1. Oblicz stężenia roztworów agonisty wymagane dla każdego etapu seryjnego dawkowania zgodnie z równaniem (1). n przyjmuje wartości od 1 do całkowitej liczby seryjnych dodatków i. x oznacza stężenie i objętość w dołku w kroku n. y oznacza stężenie i objętość „roztworu do dodania” w kroku n.

figure-protocol-1

UWAGA: Należy uwzględnić liczbę powtórzeń i obliczyć całkowitą objętość „roztworu do dodania” dla każdego etapu stężenia. Wyniki typowego obliczenia przedstawiono w Tabelach 1-4. Wymagane jest ogólne określenie zakresu stężeń agonisty podlegających badaniu, ponieważ zakres ten definiuje stężenia i liczbę porcji podawanych podczas seryjnego dodawania. Stosując protokół seryjnego dodawania agonisty, stężenie agonisty zwiększa się stopniowo. W związku z tym należy uwzględnić ilość agonisty znajdującą się już w dołku w momencie dodawania kolejnej dawki. Gdy liczba cząsteczek agonisty obecnych już w dołku wynosi nx = cx ∙Vx (przy aktualnym stężeniu cx i objętości Vx), a liczba cząsteczek w dołku po kolejnym dodaniu to nx+y, liczba cząsteczek do dodania ny jest określona przez stężenie cy i objętość Vy roztworu naniesionego do dołka (ny = cy ∙ Vy). Po dodaniu porcji agonisty nowa ilość cząsteczek agonisty w dołku wynosi: cx+y ∙ Vx+y = cx ∙ Vx + cy ∙ Vy. Obliczenie to stosuje się do każdego kolejnego etapu. Ze względu na współzależność stężenia agonisty w dołku i ilości agonisty w porcjach dodawanych w każdym kroku, ważne jest wcześniejsze zdefiniowanie stężeń końcowych po każdym etapie.

Tryb 1: Objętość w dołku będzie zwiększać się przy każdym kroku w miarę ciągłego dodawania cieczy.
Korzystając z tego trybu oraz formatu 8-dołkowego, należy zastosować Vx1 = 200 µL oraz Vy1 …. Vyi = 30 µL.

Tryb 2: Objętość w dołku pozostaje stała, ponieważ objętość dodana w każdym kroku jest usuwana tuż przed kolejnym dodaniem.
Stosując ten tryb w formacie 96-dołkowym, należy przyjąć Vx1 = 150 µL oraz Vy1 …. Vyi = 75 µL.

  1. Wydrukuj arkusz danych z całkowitą objętością dla każdego stężenia oraz szczegółowymi instrukcjami pipetowania.
  2. Przygotuj wszystkie roztwory w wymaganej ilości. Wszystkie roztwory agonistów należy sporządzić w tym samym medium bez surowicy, którego użyto do ekwilibracji komórek.
    OSTRZEŻENIE: Dihydrochlorowodorek histaminy jest uznawany za substancję niebezpieczną zgodnie ze standardem komunikacji o zagrożeniach OSHA z 2012 r. (29 CFR 1910.1200). Histamina powoduje podrażnienie skóry, poważne podrażnienie oczu, może wywołać reakcję alergiczną skóry, alergię, objawy astmy lub trudności w oddychaniu w przypadku wdychania oraz może powodować podrażnienie dróg oddechowych. Należy zapoznać się z kartą charakterystyki substancji.
    UWAGA: Roztwory agonistów należy przygotowywać bezpośrednio przed użyciem. Stabilność agonistów w roztworze może się znacznie różnić. Roztwory należy przechowywać w temperaturze 4 °C lub niższej do momentu użycia w eksperymencie. W przypadku niektórych cząsteczek, takich jak cząsteczki peptydowe lub lipidowe, można rozważyć dodanie dodatkowych stabilizatorów, np. BSA, aby zapobiec adsorpcji do ścianek studzienek i probówek.
  3. W przypadku przeprowadzania eksperymentu w formacie 96-dołkowym, przenieś roztwory do konwencjonalnej płytki 96-dołkowej (bez elektrod) i użyj pipety 8- (lub 12-) kanałowej do szybkiego przeniesienia cieczy do matrycy elektrod.

5. Przygotowanie roztworów agonistów do eksperymentu w trybie antagonisty

UWAGA: Przygotować roztwór(y) antagonisty w stężeniu, które będzie stosowane przez cały czas. Objętość i stężenie roztworu antagonisty zależą od trybu dodawania agonisty (1 lub 2). Przykłady dla eksperymentów w formacie 8-dołkowym lub 96-dołkowym w trybie dodawania 2: (A) format 8-dołkowy (Vx1 = 200 µL, VAntagonist = 200 µL); (B) format 96-dołkowy (Vx1 = 150 µL, VAntagonist = 75 µL).

  1. Oblicz stężenie każdego roztworu agonisty wymaganego dla każdego etapu seryjnego dawkowania, zgodnie z opisem w punkcie 4.1.
  2. Przygotuj wszystkie roztwory agonistów w tym samym medium bezsurowiczym, którego użyto do równoważenia komórek, i dodaj antagonistę w takim samym stężeniu końcowym, jakie zaplanowano dla odpowiednich dołków w eksperymencie.
    UWAGA: W tym przypadku roztwór zapasowy histaminy (10 mM) jest przygotowany w medium L-15. Gdy agoniści są rozpuszczani w innych rozpuszczalnikach (np. dimetylosulfoksydzie (DMSO), etanolu), należy uwzględnić kontrolę rozpuszczalnika, aby skompensować zwiększającą się ilość rozpuszczalnika z każdym etapem dodawania.

6. Wykonywanie protokołu seryjnego dodawania w trybie agonisty

  1. Rozpocznij akwizycję danych zgodnie z opisem w krokach 3.1–3.5.
  2. Przed użyciem należy wstępnie ogrzać roztwory agonistów, umieszczając je w inkubatorze na około 10–15 min przed dodaniem.
    UWAGA: W przypadku stosowania substancji termolabilnych roztworów nie należy przechowywać w 37 °C przez zbyt długi czas. Jeśli wstępne ogrzewanie przez 10–15 min jest uznawane za krytyczne, należy doprowadzić roztwory do 37 °C tuż przed dodaniem w łaźni wodnej.
  3. Przeprowadź seryjne dawkowanie agonisty zgodnie z wybranym trybem dodawania. Następnie tryb 1 całkowita objętość w dołku zwiększa się z każdym kolejnym dodaniem dawki. W tryb 2 taka sama objętość, jaka jest dodawana w każdym kroku, jest ponownie usuwana bezpośrednio przed dodaniem kolejnej, wyższej dawki.
    UWAGA: Czas potrzebny na equilibrację warstwy komórek pomiędzy dwiema kolejnymi dawkami agonisty zależy od czasu odpowiedzi komórek. Wstępny eksperyment w trybie równoległym (jedna studzienka – jedno stężenie) pozwala określić (i) czasy odpowiedzi komórek dla różnych stężeń agonisty oraz (ii) najczulszy parametr krzywej (np. maksimum impedancji, impedancję po czasie x).

A: Tryb 1 / format 8-dołkowy

  1. Do komórek równoważonych w 200 µL medium bez surowicy dodać 30 µL pierwszego roztworu o najniższym stężeniu agonisty.
  2. Pozostawić komórki w celu uzyskania odpowiedzi i równowagi przez określony wcześniej czas (np. 15 min).
  3. Dodać 30 µL drugiego roztworu o kolejnym, wyższym stężeniu.
  4. Powtórzyć kroki 6.3.1-6.3.3 z trzecim, czwartym i kolejnymi roztworami agonisty.
    UWAGA: Praca z 10 stopniami stężeń spowoduje, że całkowita objętość pod koniec eksperymentu wyniesie 500 µL, co znajduje się tuż poniżej maksymalnej dopuszczalnej objętości tych dołków wynoszącej ~ 550 µL.

B: Tryb 2 / format 96-dołkowy

UWAGA: Podczas przeprowadzania eksperymentów w formacie 96-dołkowym należy wstrzymać akwizycję danych za pomocą oprogramowania urządzenia do pomiaru impedancji podczas każdego etapu manipulacji cieczą (dodawania/usuwania). Bardziej złożona obsługa cieczy może zakłócać akwizycję danych. Należy użyć pipety wielokanałowej.

  1. Wstrzymaj akwizycję danych.
  2. Dodaj 75 µL pierwszego roztworu o najniższym stężeniu agonisty do komórek, które zostały równoważone w 150 µL medium bezsurowiczego.
  3. Wznów akwizycję danych.
  4. Pozostaw komórki do czasu uzyskania odpowiedzi i równowagi przez zdefiniowany wcześniej okres czasu (np. 15 min).
  5. Około 1–2 min przed zakończeniem standardowego czasu równoważenia wstrzymaj pomiar i usuń 75 µL z każdej studzienki.
    UWAGA: Moment usunięcia roztworu zależy od liczby studzienek monitorowanych równolegle oraz prędkości pipetowania. Czas potrzebny na usunięcie roztworów nie powinien przekraczać czasu pomiędzy kolejnymi krokami.
  6. Dodaj 75 µL drugiego roztworu o kolejnym wyższym stężeniu i wznów pomiar.
  7. Powtórz kroki 6.3.8-6.3.10 z trzecim, czwartym i kolejnymi roztworami agonisty.

7. Wykonywanie protokołu seryjnego dodawania w trybie antagonisty

  1. Rozpocząć pomiar zgodnie z opisem w krokach 3.1 – 3.5.
  2. Podczas równoważenia warstw komórkowych przygotować roztwór antagonisty (np. 200 µL 1,5 µM chlorowodorku difenhydraminy w medium L15).
    UWAGA: Chlorowodorek difenhydraminy może wywoływać ostre skutki zdrowotne. Jest szkodliwy w przypadku połknięcia lub wdychania, może powodować podrażnienie oczu i skóry oraz podrażnienie dróg oddechowych i pokarmowych. Należy zapoznać się z kartą charakterystyki substancji.
  3. Podgrzać wstępnie roztwory antagonisty i agonisty, umieszczając je w inkubatorze na około 10 – 15 min przed dodaniem do kultur komórkowych (por. 6.2). Jeśli w analizie uwzględniono również studzienki bez antagonisty, należy wstępnie podgrzać medium bezsurowicze.
  4. Dodać roztwór antagonisty do wyznaczonych studzienek. Pozostawić komórki na 15 – 20 min w celu równoważenia z antagonistą. W przypadku studzienek bez antagonisty dodać do nich taką samą objętość medium bezsurowiczego.
  5. Zgodnie z dodawaniem antagonisty w trybie 2, usunąć roztwór ze studzienek
    (A) format 8-studzienkowy (200 µL)
    (B) format 96-studzienkowy (75 µL)
  6. Uruchomić sekwencję dodawania agonisty zgodnie z opisem w kroku 6.3.

8. Eksport i analiza danych

  1. Wyeksportuj dane za pomocą oprogramowania urządzenia do pomiaru impedancji, aby przekonwertować wszystkie zarejestrowane dane z formatu własnościowego na powszechne formaty danych (np. csv). Krok ten umożliwia reorganizację danych i ich prezentację przy użyciu innych pakietów oprogramowania.
  2. Wczytaj dane w formacie csv do oprogramowania do naukowej analizy danych.
  3. Znormalizuj wartości impedancji poprzez odjęcie impedancji ostatniego punktu danych przed pierwszym dodaniem roztworu agonisty oraz ustawienie czasu dodania na t = 0. Przedstaw przebieg czasowy znormalizowanej impedancji na wykresie.
  4. Przedstaw na wykresach poszczególne przebiegi czasowe i wyznacz wartości maksymalne impedancji po każdym etapie dodawania. Sporządź arkusz danych z tymi wartościami.
  5. Przedstaw na wykresie wartości maksymalnych (lub minimalnych, jeśli dotyczy) zmian impedancji jako funkcję stężenia agonisty. Można to zrobić dla poszczególnych dołków lub dla wartości średnich (średnia ± SD).
  6. Użyj procedury dopasowania danych, aby wyznaczyć połowiczną maksymalną stężenie efektywne (EC50) oraz maksymalną odpowiedź (EMax), stosując czteroparametrowy model logistyczny (równanie 2):

figure-protocol-2

UWAGA: c oznacza stężenie agonisty, A1 to asymptota minimalna, a A2 to asymptota maksymalna sigmoidalnej krzywej zależności odpowiedzi od dawki (A2 = EMax). EC50 to stężenie w punkcie przegięcia krzywej, a n odpowiada współczynnikowi nachylenia Hill (Hill slope).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Typowy schemat przygotowania różnych roztworów agonistów pokazano dla eksperymentu z zastosowaniem 8-ściennej matrycy elektrodowej z histaminą jako agonistą w Tabelach 1–4. Tabela 1 i Tabela 2 przedstawiają objętości i stężenia dla eksperymentu przeprowadzanego z wykorzystaniem trybu dodawania 1 (por. Rysunek 1), natomiast Tabela 3 i Tabela 4 zawierają objętości i stężenia dla eksperymentu p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten opisuje metodę bezznacznikowych pomiarów impedancji w celu określenia zależności dawka-odpowiedź indukowanej przez agonistę aktywacji GPCR przy braku lub obecności specyficznych antagonistów dla tego samego receptora. Dowód słuszności koncepcji tej metody został przedstawiony w niedawnej publikacji12. Według naszej wiedzy jest to pierwsze badanie opisujące ustalenie pełnej krzywej dawka-odpowiedź aktywacji GPCR za pośrednictwem agonistów przy użyciu pojedynczej warstwy komórkowej in v...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Barbarze Goricnick i Nadji Hinterreiter za pomoc w hodowli komórek i przygotowaniu eksperymentalnych rozwiązań. Autorzy dziękują za wsparcie finansowe ze strony Grupy Badawczej 1910 "Chemia medyczna selektywnych ligandów GPCR" ufundowane przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG) w ramach grantu nr 222125149. JAS jest szczególnie wdzięczny za stypendium przyznane przez Bawarski Program Równości Płci.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bü komora licząca rkerMarienfeld (Lauda-Kö nigshofen, Niemcy)640210
kolby do hodowli komórkowych 25 cm2Greiner bio-one (Frickenhausen, Niemcy)690175
Inkubator komórek (linia funkcyjna Heraeus BB15)Thermo Scientific (Darmstadt, Niemcy)\
Wirówka (Heraeus 1S-R)Thermo Scientific (Darmstadt, Niemcy)\
ChlorowodorekdifenhydraminySigma Aldrich (Taufkirchen, Niemcy)D3630
Minimum Essential Medium firmy Eagle z 4,5 g/l D-glukozy i 2,2 g/l NaHCO3Sigma Aldrich (Taufkirchen, Niemcy)D5671
Impedancja (ECIS Zθ)Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)\
8-well electrode Arrays (8W1E PET)Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)\PET base z elektrodą roboczą 0,049 mm2 i przeciwelektrodą ~50 mm2 (złotą)
96-dołkowe matryce elektrod (96W1E+ PET)Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)\Podstawa PET z dwiema elektrodami (złoty) o całkowitej powierzchni elektrody 0,256 mm2
Surowica płodu cielęcego (FCS)Biochrom (Berlin, Niemcy)S0615
Dichlorowodorek histaminyCarl Roth (Karlsruhe, Niemcy)4017.1
Okap z przepływem laminarnym (Herasafe, KS 12)Thermo Scientific (Darmstadt, Niemcy)51022515komora bezpieczeństwa klasy II
Leibovitz' L-15 mediumThermo Scientific (Darmstadt, Niemcy)21083-027
L-glutaminaSigma Aldrich (Taufkirchen, Niemcy)G7513
Mikropipeta duża (100 - 1000 &mikro; L)Brandt (Wertheim, Niemcy)704780
Mikropipeta duża (20 - 200 &mikro; L)Brandt (Wertheim, Niemcy)704778
Mikroskop (kontrast fazowy, Nikon Diaphot)Nikon (Dü sseldorf, Niemcy)
Penicylina/streptomycynaSigma Aldrich (Taufkirchen, Niemcy)P0781
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sigma Aldrich (Taufkirchen, Niemcy)D8537
Pipeta, serologicznaGreiner bio-one (Frickenhausen, Niemcy)607 180
Pipettor (accu-jet pro)Brandt (Wertheim, Niemcy)26300
TrypsynaSigma Aldrich (Taufkirchen, Niemcy)T4174w PBS z 1 mM
probówką EDTA, 15 mlGreiner bio-one (Frickenhausen, Niemcy)188 271
Probówka, 50 mlGreiner bio-one (Frickenhausen, Niemcy)210 261
U-373 MG komórkiATCC (Rockville, MD, USA)ATCC HTB-17
(TW21)Julabo (Seelbach, Niemcy)\
Kąpiel wodna

Bibliografia

  1. Rosenbaum, D. M., Rasmussen, S. G., Kobilka, B. K. The structure and function of G-protein-coupled receptors. Nature. 459, 356-363 (2009).
  2. Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-Coupled Receptors as Targets for Approved Drugs: How Many Targets and How Many Drugs. Molecular Pharmacology. 93, 251-258 (2018).
  3. Kaitin, K. I. Deconstructing the drug development process: The new face of innovation. Clinical Pharmacoly and Therapeutics. 87, 6(2010).
  4. Kenakin, T. P. Cellular assays as portals to seven-transmembrane receptor-based drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 8, 617-626 (2009).
  5. Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta Pharmacologica Sinica. 33, 372-384 (2012).
  6. Scott, C. W., Peters, M. F. Label-free whole-cell assays: expanding the scope of GPCR screening. Drug Discovery Today. 15, 704-716 (2010).
  7. Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81, 3761-3764 (1984).
  8. Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, 591-592 (1993).
  9. Fang, Y., Ferrie, A. M., Fontaine, N. H., Mauro, J., Balakrishnan, J. Resonant waveguide grating biosensor for living cell sensing. Biophysical Journal. 91, 16(2006).
  10. Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. Impedance analysis of GPCR-mediated changes in endothelial barrier function: overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements. Pflugers Archiv : European Journal of Physiology. 467, 2193-2218 (2015).
  11. Lieb, S., et al. Label-free versus conventional cellular assays: Functional investigations on the human histamine H1 receptor. Pharmacological Research. 114, 13-26 (2016).
  12. Stolwijk, J. A., et al. Increasing the throughput of label-free cell assays to study the activation of G-protein-coupled receptors by using a serial agonist exposure protocol. Integrative Biology. 11, 10(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bezznakownikowe analizy impedancyjneseryjne dodawanie agonist wkrzywa dawka odpowiedmonitorowanie impedancjist enie histaminyczteroparametryczny model logistycznyblokowanie receptor wantagoni ci GPCRwysiew kom rek

Powiązane artykuły