Protokół stopniowego dozowania w celu zwiększenia przepustowości w bezznacznikowych testach GPCR opartych na impedancji

Summary

Ten protokół demonstruje rejestrowanie w czasie rzeczywistym pełnych zależności dawka-odpowiedź dla indukowanej przez agonistę aktywacji GPCR z pojedynczej warstwy komórki hodowanej na pojedynczej mikroelektrodzie przy użyciu pomiarów impedancji bez znaczników. Nowy schemat dozowania znacznie zwiększa przepustowość bez utraty rozdzielczości czasowej.

Abstract

Testy oparte na impedancji bez znaczników są coraz częściej używane do nieinwazyjnego badania indukowanej przez ligandy aktywacji GPCR w eksperymentach z hodowlami komórkowymi. Podejście to zapewnia monitorowanie komórek w czasie rzeczywistym z zależną od urządzenia rozdzielczością czasową do kilkudziesięciu milisekund i jest wysoce zautomatyzowane. Jednakże, gdy liczba próbek staje się wysoka (np. badania dawka-odpowiedź dla różnych ligandów), koszt jednorazowych matryc elektrod, jak również dostępna rozdzielczość czasowa dla sekwencyjnych zapisów well-by-well, mogą stać się ograniczające. Dlatego przedstawiamy tutaj protokół addycji szeregowego agonisty, który może znacznie zwiększyć wydajność testów GPCR bez znaczników. Korzystając z protokołu dodawania szeregowego agonisty, agonista GPCR jest dodawany sekwencyjnie w zwiększających się stężeniach do pojedynczej warstwy komórki, jednocześnie stale monitorując impedancję próbki (tryb agonisty). Dzięki temu seryjnemu podejściu możliwe jest teraz ustalenie pełnej krzywej dawka-odpowiedź dla agonisty GPCR z tylko jednej warstwy komórek. Protokół addycji szeregowego agonisty ma zastosowanie do różnych typów sprzężeń GPCR, G_{q G i / 0} lub G_s i jest zgodny z rekombinowanymi i endogennymi poziomami ekspresji badanego receptora. Blokowanie receptorów przez antagonistów GPCR jest również możliwe do oceny (tryb antagonisty).

Introduction

Ten raport przedstawia szczegółowy opis protokołu szeregowego dodawania, opracowanego do ilościowego oznaczania indukowanej przez ligand aktywacji receptora sprzężonego z białkiem G (GPCR) w przylegających do siebie komórkach za pomocą pomiarów impedancji bez znaczników. Receptory sprzężone z białkiem G (GPCR) są zaangażowane w wiele funkcji fizjologicznych i chorób człowieka¹. Ze względu na to, a także ich dobrą dostępność na powierzchni komórki, GPCR są jednym z najważniejszych celów leków. Ocena ta znajduje odzwierciedlenie w szacunkowej liczbie ~700 zatwierdzonych leków ukierunkowanych na GPCR, co odpowiada ~35% udziałowi we wszystkich dostępnych na rynku lekach².

Rozwój nowych leków składa się z dwóch głównych procesów: (i) identyfikacji i funkcjonalnej charakterystyki biologicznych cząsteczek docelowych, oraz (ii) odkrywania nowych substancji wiodących i przekształcania ich w leki możliwe do podawania. W obu procesach potrzebne są skuteczne metody ilościowej oceny interakcji lek-cel i późniejszej odpowiedzi biologicznej. Na różnych etapach przedklinicznego procesu opracowywania leku wykorzystuje się różne metody analizy, począwszy od badań interakcji biomolekularnych między lekiem a celem, poprzez badania funkcjonalne na komórkach w hodowli, aż po eksperymenty na wyciętym materiale narządowym lub całych zwierzętach. Zarówno znaczenie fizjologiczne, jak i złożoność biologiczna wzrastają od pierwszego do drugiego³. Chociaż ogólnym celem jest zminimalizowanie liczby eksperymentów na zwierzętach, badania farmakologiczne z wykorzystaniem wyizolowanych narządów od zwierząt laboratoryjnych lub nawet całych zwierząt są uważane za nieuniknione w celu kompleksowego scharakteryzowania nowych kandydatów na leki. Jeśli chodzi o odczyt analityczny, badania farmakologiczne narządów zapewniają dystalną, integracyjną "holistyczną" odpowiedź funkcjonalną o najwyższym znaczeniu fizjologicznym. Wadą takich eksperymentów jest to, że nie są one kompatybilne z wysokoprzepustowymi badaniami przesiewowymi zarówno ze względów technicznych, jak i etycznych i zostały w dużej mierze zastąpione badaniami opartymi na hodowli komórkowych in vitro⁴.

Metody ilościowego oznaczania aktywacji GPCR w hodowlach komórkowych obejmują różne testy chemiczne oparte na znacznikach, które w szczególności wykrywają drugie przekaźniki, stan fosforylacji białek sygnałowych w dalszej części strumienia, aktywację transkrypcji za pomocą pewnych czynników transkrypcyjnych lub indukowany przez ligand transport receptorów wewnątrzkomórkowych^4,5. Wadą takich testów opartych na znakowaniu jest konieczność znakowania komórek potencjalnie szkodliwymi barwnikami lub markerami radioaktywnymi. Często wymaga to przeprowadzenia testu jako określenia punktu końcowego dla czasu ekspozycji, który musi być określony a priori. Stosowanie testów punktów końcowych opartych na znacznikach cierpi z powodu bardzo ograniczonego i stronniczego czasu eksperymentu oraz ryzyka, że znaczniki chemiczne i sondy mogą zakłócać normalną fizjologię komórki – potencjalnie niezauważone przez eksperymentatora.

W ostatnich latach pojawiły się bezznacznikowe testy do monitorowania aktywacji GPCR, takie jak techniki oparte na impedancji lub metody optyczne wykorzystujące rezonansowe siatki falowodowe^5,6. Znakowanie komórek nie jest eksperymentalnie wymagane w przypadku tych podejść. Ponieważ te fizyczne odczyty działają na sygnałach o niskiej amplitudzie, takie metody są uważane za nieinwazyjne, pozwalają na ciągłe monitorowanie komórek potencjalnie w czasie rzeczywistym, a czas obserwacji jest ograniczony tylko przez hodowlę komórkową, a nie przez odczyt. Podobnie jak w przypadku odczytów z całych narządów, podejścia bezznacznikowe zwykle informują o całościowych reakcjach komórek, daleko po aktywacji receptora, gdy integracja wzdłuż całej sieci sygnalizacyjnej prowadzi do zależnych od czasu, ale raczej niespecyficznych zmian w morfologii komórki lub redystrybucji masy. Podczas gdy testy oparte na impedancji mierzą sygnaturę dielektryczną zmian kształtu komórki^7,8, pomiary przy użyciu rezonansowych siatek falowodowych są wrażliwe na zmiany indeksu refrakcji na granicy komórka-podłoże wynikające z dynamicznej redystrybucji masy (DMR)⁹. Integracyjny charakter sprawia, że metody bezznacznikowe są niezwykle wrażliwe na zdarzenia za pośrednictwem receptora, niezależnie od typu (typów) białka G (G_q, G_{i / 0}, G_s, G_12/13) lub β-aresztyny zaangażowanej w kaskadę sygnalizacyjną < sup class="xref">6 i dobrze nadaje się do endogennych poziomów ekspresji receptora.

W standardowym teście opartym na impedancji, bez znaczników, komórki są hodowane na płytkach wielodołkowych ze współpłaszczyznowymi elektrodami o złotej folii umieszczonymi na dnie każdej studni¹⁰. Te układy elektrod są podłączone do analizatora impedancji, a reakcje komórek na bodziec eksperymentalny są rejestrowane z poszczególnych studni za pomocą odczytów impedancji z rozdzielczością czasową. W typowym teście GPCR ligand jest dodawany w indywidualnie różnych stężeniach do każdego indywidualnego dołka. Wywołane przez ligand zmiany w przebiegu impedancji w czasie są następnie analizowane w odniesieniu do cech charakterystycznych krzywej, takich jak maksymalna zmiana sygnału, obszar pod krzywą, zmiana sygnału w danym przedziale czasu lub nachylenie krzywej w określonym punkcie czasowym, w celu ilościowego określenia siły i skuteczności liganda¹¹.

Koszt matryc elektrod może ograniczać zastosowanie tej techniki w kampaniach wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS). Ponadto, wraz ze wzrostem liczby próbek, które mają być śledzone równolegle, liczba indywidualnych pomiarów wzrasta, a tym samym stopniowo zmniejsza dostępną rozdzielczość czasową dla każdego dołka - nawet w przypadku najnowocześniejszych nagrań wielokanałowych. W takich warunkach szybkie i przejściowe odpowiedzi komórek mogą wymknąć się pomiarowi. Ponadto konwencjonalne podejście oparte na jednym odwiercie – jednym stężeniu nakłada znaczny czynnik czasu i kosztów na rozwój perfuzji narządów na chipie lub ciała na chipie w odniesieniu do ich przydatności w analizie interakcji ligand-GPCR.

Z tego powodu opracowaliśmy protokół stopniowego dozowania, który umożliwia rejestrację pełnych krzywych dawka-odpowiedź indukowanej ligandem aktywacji GPCR w monowarstwach hodowanych komórek poprzez ciągłe monitorowanie impedancji pojedynczego dołka, podczas gdy stężenie agonisty jest stopniowo zwiększane. Protokół addycji szeregowego agonisty znacznie zwiększa przepustowość na studzienkę z jednego stężenia do 10 lub więcej stężeń, jak pokazano na aktualnym przykładzie ludzkich komórek MG U-373, które endogennie eksprymują receptor histaminy 1 (H1R). W związku z tym metoda ta może znacznie poprawić przepustowość w badaniach dawka-odpowiedź bez znakowania, przy jednoczesnym zachowaniu rozdzielczości czasowej na poziomie instrumentalnym maksimum.

Protocol

1. Zasiewanie komórek na układach elektrod

UWAGA: Wybór układu elektrod to kompromis między czułością a liczbą badanych komórek. Im mniejsza elektroda, tym bardziej czuły jest pomiar, ale tym mniejsza jest liczba badanych komórek. W przypadku ogniw wykazujących silne wahania impedancji w czasie w warunkach wyjściowych preferowane są większe lub międzypalcowe elektrody.

1. Wszystkie roztwory potrzebne do standardowego pasażowania i wysiewu komórek należy wstępnie podgrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Do testów z ludzkimi komórkami U-373 MG wymaga: soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) bez wapnia i magnezu, 0,05% (w/v) trypsyny, pożywki do hodowli komórkowych (Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) uzupełnionej 5% (v/v) płodowej surowicy cielęcej (FCS), 2 mM L-glutaminy i 100 μg/ml penicyliny/streptomycyny).
2. Dwukrotnie przepłukać warstwę komórkową kultury podstawowej wyhodowanej na dnie konwencjonalnych kolb lub szalek do hodowli komórkowych PBS.
3. Usunąć PBS, dodać roztwór trypsyny (1 ml na 25^cm2) i pozostawić komórki do inkubacji w temperaturze 37 °C przez 5 minut (dotyczy komórek U-373 MG).
4. Kontrola całkowitego oderwania komórek od dna podłoża wzrostu za pomocą mikroskopii.
5. Reakcję trypsyny należy zatrzymać, gdy tylko komórki zostaną całkowicie oderwane, dodając do zawiesiny komórkowej 9 ml pożywki do hodowli komórkowych na 1 ml trypsyny. Ostrożnie wypłukać pozostałe komórki z dna substratu do hodowli komórkowej, pipetując zawiesinę na substrat.
6. Zebrać zawiesinę komórek za pomocą pipety i przenieść ją do probówki wirówkowej (probówka 15 ml lub 50 ml).
7. Odwirować komórki przez odwirowanie przy 110 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
8. Ostrożnie usunąć supernatant i dokładnie zawiesić osad komórkowy w pożywce hodowlanej przed zliczeniem komórek (np. za pomocą hemacytometru do mikroskopów z kontrastem fazowym i ręcznego liczenia).
9. Dostosuj zawiesinę komórek do żądanej gęstości komórek. W eksperymentach z komórkami U-373 MG należy użyć 100 000 komórek/^cm2, aby wyhodować zlewającą się warstwę komórkową w ciągu 48 godzin. Przekłada się to na gęstość komórek 200 000 komórek/ml dla 8-dołkowych układów elektrod o powierzchni wzrostu ~0,8^cm2 i objętości studzienki 400 μL.
   UWAGA: W celu uzyskania powtarzalnych eksperymentów aktywacji GPCR, komórki powinny być hodowane do zlewających się monowarstw na matrycach elektrod. Aby zapewnić prawidłową ekspresję receptora na powierzchni komórki, komórki powinny być wysiane co najmniej 36 godzin przed wykonaniem eksperymentu. Testowanie różnych gęstości komórek w celu wysiewu komórek jest często znaczące dla określenia najlepszych warunków eksperymentalnych.
10. Dodaj zawiesinę ogniw do dołków układu elektrod i pozwól im osiąść w temperaturze pokojowej przez 10 – 15 minut, aby zapewnić jednorodne rozmieszczenie komórek na dnie studzienek.
11. Hodować komórki przez co najmniej 36 godzin w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych z 5% CO₂ (w zależności od rodzaju podłoża) w temperaturze 37 °C i wilgotnej atmosferze. Zmień pożywkę do hodowli komórkowych na 24 godziny przed eksperymentem.
12. W dniu eksperymentu należy sprawdzić warstwy ogniw na matrycach elektrod za pomocą mikroskopii (kontrast fazowy), aby zapewnić pełne pokrycie elektrod ogniwami.

2. Równowaga komórek w pożywce wolnej od surowicy

1. Wstępnie rozgrzane podłoże bez surowicy, w tym badaniu: Pożywka L15 firmy Leibovitz.
2. Usuń pożywkę do hodowli komórkowych z komórek hodowanych na matrycach elektrod i zastąp ją wstępnie podgrzaną pożywką bez surowicy. Użyj 200 μl dla 8-dołkowych matryc elektrod i 150 μl dla 96-dołkowych matryc elektrod.
3. Pozostawić komórki w pożywce wolnej od surowicy w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 godziny. Czas równowagi silnie zależy od typu ogniwa. Na przykład komórki U-373 MG potrzebują 2 godzin, komórki CHO potrzebują 4 godzin, BAEC może wymagać nocnej równowagi w pożywce L-15.
   UWAGA: Podłoże L-15 jest niezależne od CO₂ i wymaga atmosfery wolnej od CO₂ . W celu zrównoważenia w L-15 ustawić inkubator na 0 % CO₂ . Równowaga może być monitorowana za pomocą odczytów impedancji, co zalecamy wykonać w przypadku pierwszych eksperymentów.

3. Monitorowanie równoważności komórek za pomocą odczytów impedancji

1. Umieść matrycę elektrod w uchwycie matrycy połączeniowej analizatora impedancji.
2. Zapewnij prawidłowy kontakt o niskiej impedancji między elektrodami a analizatorem impedancji. Ta kontrola jest indywidualna dla różnych instrumentów.
   UWAGA: Jeśli przyrząd nie nawiąże połączenia z elektrodami, otwórz zacisk stykowy ponownie, ponownie wyreguluj układ elektrod w celu prawidłowego umieszczenia wewnątrz uchwytu i spróbuj ponownie.
3. Wybierz typ elektrody i/lub format wielodołkowy z interfejsu użytkownika oprogramowania.
4. Skonfiguruj parametry pomiaru. Dostępne są różne opcje.
   UWAGA: Aby wybrać najbardziej wrażliwą częstotliwość prądu przemiennego, zapoznajemy się z literaturą i instrukcjami obsługi przyrządów, ponieważ zależy to od układu elektrod i badanego typu ogniwa. Zazwyczaj częstotliwość wykrywania mieści się w zakresie 4 kHz – 50 kHz. W tym przypadku ogniwa U-373 MG hodowano na okrągłych elektrodach roboczych o średnicy 250 μm i monitorowano je przy częstotliwości prądu przemiennego 12 kHz.
   1. Jeśli dostępne są tryby akwizycji danych o jednej i wielu częstotliwościach, wybierz tryb pojedynczej częstotliwości, aby zapewnić maksymalną rozdzielczość czasową. Pomiar zostanie wykonany z tą pojedynczą częstotliwością. W przypadku najbardziej rozpowszechnionych instrumentów istnieje pewna liczba wstępnie ustawionych częstotliwości wzdłuż dostępnego okna częstotliwości.
   2. Jeśli liczba badanych odwiertów jest niska lub rozdzielczość czasowa nie jest krytyczna, wybierz zamiast tego nagrania o wielu częstotliwościach. Odczyty impedancji przy określonej liczbie częstotliwości będą rejestrowane dla każdego odwiertu w celu późniejszej dogłębnej analizy.
      UWAGA: Rozdzielczość czasowa zmniejsza się wraz ze wzrostem liczby częstotliwości rejestrowanych na odwiert i wzrostem liczby dołków. Opcje wyboru częstotliwości i trybu akwizycji danych różnią się w zależności od typu i wersji urządzenia.
5. Rozpocznij pozyskiwanie danych o przebiegu czasu.
6. Postępuj zgodnie z impedancją warstwy ogniw (co najmniej 2 godziny), aż impedancja się ustabilizuje. W międzyczasie przygotuj roztwory agonistyczne.
7. Gdy warstwy komórkowe osiągną stabilny poziom impedancji, należy (i) przejść do szeregowego dodawania agonisty w ramach tego samego eksperymentu lub (ii) zakończyć akwizycję danych i rozpocząć nowy zestaw danych do monitorowania aktywacji receptora indukowanego przez agonistę.

4. Przygotowanie roztworów agonistycznych do eksperymentów w trybie agonistycznym

1. Obliczyć stężenie roztworów agonistów zgodnie z potrzebami dla każdego etapu dawkowania seryjnego zgodnie z równaniem (1). N waha się od 1 do całkowitej liczby szeregowych dodatków I. x oznacza stężenie i objętość w studzience na etapie N. Y oznacza stężenie i objętość "roztworu, który ma być dodany" w kroku N.

UWAGA: Rozważ liczbę powtórzeń i oblicz całkowitą objętość "roztworu, który ma być dodany" dla każdego etapu koncentracji. Wyniki typowych obliczeń przedstawiono w tabelach 1-4. Wymaga to ogólnego wyobrażenia o zakresie stężeń agonistów, które należy zbadać, ponieważ zakres określa stężenia i liczbę porcji, które mają być podawane podczas szeregowego dodawania. Korzystając z protokołu addycji szeregowego agonisty, stężenie agonisty jest zwiększane stopniowo. W związku z tym należy wziąć pod uwagę ilość agonisty znajdującą się już w studzience w momencie dodania kolejnej dawki. Gdy liczba cząsteczek agonistów już obecnych w studzience wynosi n_x = c_x ∙V_x (przy obecnym stężeniu c_x i objętości V_x), a liczba cząsteczek w studzience po następnym dodaniu wynosi n_x+y, liczbę cząsteczek do dodania n_y określa się na podstawie stężenia c_y i objętości V_y roztworu, który ma być zastosowany do studzienki (n_y = c_y ∙ V_y). Po dodaniu porcji agonisty, nowa ilość cząsteczek agonistów w studzience wynosi: c_x+y ∙ V_x+y = c_x ∙ V_x + c_y ∙ V_y. Kalkulacja ta ma zastosowanie do każdego kolejnego kroku. Ze względu na współzależność stężenia agonisty w studzience i ilości agonisty w porcjach, które należy dodać na każdym etapie, ważne jest, aby z góry określić końcowe stężenia po każdym etapie.

Tryb 1: Objętość w studni będzie się zwiększać z każdym krokiem, ponieważ ciecz jest stale dodawana.
Korzystając z tego trybu i formatu 8-dołkowego, użyj V_x1 = 200 μL i V_{y1 ....} V_yi = 30 μL.

Tryb 2: Objętość w studni jest stała, ponieważ objętość dodawana z każdym krokiem jest usuwana tuż przed kolejnym dodawaniem.
Korzystając z tego trybu i formatu 96-dołkowego, użyj V_x1 = 150 μL i V_{y1 ....} V_yi = 75 μL.

2. Wydrukuj arkusz danych z całkowitą objętością na stężenie i szczegółowymi instrukcjami dotyczącymi pipetowania.
3. Przygotuj wszystkie roztwory w wymaganej ilości. Przygotować wszystkie roztwory agonistów w tym samym podłożu bez surowicy, które jest używane do równoważenia komórek.
   UWAGA: Dichlorowodorek histaminy jest uważany za niebezpieczny przez normę OSHA 2012 dotyczącą informowania o zagrożeniach (29 CFR 1910.1200). Histamina powoduje podrażnienie skóry, poważne podrażnienie oczu, może powodować reakcję alergiczną skóry, alergię, objawy astmy lub trudności w oddychaniu w przypadku wdychania i może powodować podrażnienie dróg oddechowych. Proszę zapoznać się z kartą charakterystyki.
   UWAGA: Roztwory agonistów powinny być tak świeże, jak to możliwe. Stabilność agonistów w roztworze może się znacznie różnić. Roztwory należy przechowywać w temperaturze 4 °C lub niższej do czasu wykorzystania w eksperymencie. W przypadku niektórych cząsteczek można rozważyć dodatkowe dodatki stabilizujące, takie jak BSA w przypadku stosowania cząsteczek na bazie peptydów lub lipidów, aby zapobiec adsorpcji na ściankach studni i rur.
4. Jeśli przeprowadzasz eksperyment w formacie 96-dołkowym, przenieś roztwory na konwencjonalną płytkę 96-dołkową (bez elektrod) i użyj 8- (lub 12-kanałowej) pipety do szybkiego transferu cieczy do układu elektrod.

5. Przygotowanie roztworów agonistycznych do eksperymentu w trybie antagonistycznym

UWAGA: Przygotuj roztwór (roztwory) antagonisty o stężeniu, które ma być stosowane przez cały czas. Objętość i stężenie roztworu antagonisty zależą od sposobu dodawania agonisty (1 lub 2). Przykłady eksperymentów w formacie 8-dołkowym lub 96-dołkowym w trybie addycyjnym 2: (A) format 8-dołkowy (V_x1 = 200 μL, V_Antagonista = 200 μL); (B) Format 96-dołkowy (V_x1 = 150 μL, V_Antagonista = 75 μL).

1. Obliczyć stężenie każdego roztworu agonisty potrzebne dla każdego etapu dawkowania seryjnego, jak opisano w kroku 4.1.
2. Sporządzić wszystkie roztwory agonistów w tym samym pożywce wolnej od surowicy, jaka jest używana do równoważenia komórek i dodać antagonistę w tym samym stężeniu końcowym, jakie zaplanowano dla odpowiednich studzienek w eksperymencie.
   UWAGA: W tym przypadku roztwór podstawowy histaminy (10 mM) przygotowuje się w pożywce L-15. Gdy agoniści są rozpuszczeni w innych rozpuszczalnikach (np. dimetylosulfotlenek (DMSO), etanol), należy włączyć kontrolę rozpuszczalnika w celu uwzględnienia zwiększającego się ładunku rozpuszczalnika z każdym etapem dodawania.

6. Wykonywanie protokołu dodawania szeregowego w trybie agonisty

1. Rozpocznij pobieranie danych zgodnie z opisem w krokach 3.1 – 3.5.
2. Przed użyciem roztwory agonistów należy wstępnie podgrzać, umieszczając je w inkubatorze na około 10 – 15 minut przed dodaniem.
   UWAGA: W przypadku stosowania substancji termolabilnych roztwory nie powinny być zbyt długo przechowywane w temperaturze 37 °C. Jeśli wstępne podgrzewanie przez 10 – 15 minut jest uważane za krytyczne, doprowadzić roztwory do temperatury 37 °C na krótko przed dodaniem do łaźni wodnej.
3. Uruchom dawkowanie seryjne agonisty w zależności od wybranego trybu dodawania. Po zastosowaniu trybu 1 całkowita objętość w studzience zwiększa się z każdym dodaniem kolejnej dawki. W trybie 2 ten sam objętość, która jest dodawana z każdym krokiem, jest również ponownie usuwana tuż przed dodaniem następnej większej dawki.
   UWAGA: Czas potrzebny do zrównoważenia warstwy komórkowej pomiędzy dwiema kolejnymi dawkami agonistów zależy od czasu odpowiedzi komórek. Wstępny eksperyment w trybie równoległym (jedna studzienka – jedno stężenie) ujawnia (i) czasy odpowiedzi komórek dla różnych stężeń agonistów oraz (ii) najbardziej czuły parametr krzywej (np. maksimum impedancji, impedancja po czasie x).

A: Format trybu 1 / 8-dołkowego

1. Dodać 30 μl pierwszego roztworu o najniższym stężeniu agonisty do komórek, które były zrównoważone w 200 μl pożywki wolnej od surowicy.
2. Pozwól komórkom reagować i równoważyć się przez określony czas (np. 15 minut).
3. Dodać 30 μl drugiego roztworu o następnym wyższym stężeniu.
4. Powtórz kroki 6.3.1-6.3.3 z trzecim, czwartym i tak dalej roztworem agonisty.
   UWAGA: Praca z 10 krokami koncentracji spowoduje, że całkowita objętość wyniesie 500 μL na końcu eksperymentu, co jest nieco poniżej maksymalnej obowiązującej objętości tych studzienek wynoszącej ~ 550 μL.

B: Format trybu 2 / 96 dołków

UWAGA: Wstrzymaj zbieranie danych podczas każdego kroku obsługi cieczy (dodawania/usuwania) za pomocą oprogramowania urządzenia impedancji podczas przeprowadzania eksperymentów w formacie 96-dołkowym. Bardziej wyszukana obsługa cieczy może zakłócać akwizycję danych. Użyj pipety wielokanałowej.

1. Wstrzymaj pobieranie danych.
2. Dodać 75 μl pierwszego roztworu o najniższym stężeniu agonisty do komórek, które były zrównoważone w 150 μl pożywki wolnej od surowicy.
3. Wznawianie pobierania danych.
4. Pozwól komórkom reagować i równoważyć się przez określony czas (np. 15 minut).
5. Na około 1 – 2 minuty przed końcem regularnego czasu równowagi należy wstrzymać pomiar i usunąć 75 μl z każdej studzienki.
   UWAGA: Punkt czasowy, w którym należy usunąć roztwór, zależy od liczby studzienek monitorowanych równolegle i prędkości pipetowania. Czas potrzebny na usunięcie roztworów nie powinien przekraczać czasu pomiędzy kolejnymi krokami.
6. Dodać 75 μl drugiego roztworu o następnym wyższym stężeniu i wznowić pomiar.
7. Powtórz kroki 6.3.8-6.3.10 z trzecim, czwartym i tak dalej roztworem agonisty.

7. Wykonywanie protokołu szeregowego dodawania w trybie antagonisty

1. Rozpocznij pomiar zgodnie z opisem w krokach 3.1 – 3.5.
2. Podczas równoważenia warstw komórkowych należy przygotować roztwór antagonistyczny (np. 200 μL 1,5 μM chlorowodorku difenhydraminy w pożywce L15).
   UWAGA: Chlorowodorek difenhydraminy ma potencjalne ostre skutki zdrowotne. Jest szkodliwy po połknięciu lub wdychaniu może powodować podrażnienie oczu i skóry. Może powodować podrażnienie dróg oddechowych i pokarmowych. Prosimy o zapoznanie się z kartą charakterystyki.
3. Roztwory antagonistów i agonistów należy wstępnie ogrzać, umieszczając je w inkubatorze na około 10 – 15 minut przed dodaniem do kultur komórkowych (patrz 6.2). Jeśli w teście uwzględniono również studzienki wolne od antagonistów, należy również wstępnie podgrzać pożywkę wolną od surowicy.
4. Dodaj roztwór antagonisty do wyznaczonych studni. Pozwól komórkom zrównoważyć się z antagonistą przez 15 – 20 minut. Jeśli uwzględnione są studzienki wolne od antagonistów, dodaj do nich taką samą objętość pożywki bez surowicy.
5. Zgodnie z dodawaniem antagonisty w trybie 2, usuń roztwór ze studzienek
   (A) Format 8-dołkowy (200 μl)
   (B) Format 96-dołkowy (75 μl)
6. Uruchom sekwencję dodawania agonisty zgodnie z opisem w kroku 6.3.

8. Eksport i analiza danych

1. Eksport danych za pomocą oprogramowania przyrządu impedancji w celu przekształcenia wszystkich zarejestrowanych danych z zastrzeżonych formatów danych na popularne formaty danych (np. csv). Ten krok pozwala na reorganizację danych i prezentację z innymi pakietami oprogramowania.
2. Załaduj dane w formacie csv do oprogramowania do analizy danych naukowych.
3. Normalizuj wartości impedancji, odejmując impedancję ostatniego punktu danych przed pierwszym dodaniem roztworu agonisty i ustawiając czas dodawania na t = 0. Wykreśl przebieg czasowy znormalizowanej impedancji.
4. Wykreśl poszczególne przebiegi czasowe i określ maksima impedancji po każdym kroku dodawania. Utwórz arkusz danych z tymi wartościami.
5. Wykreślić wartości maksymalnych (lub minimalnych, jeśli ma to zastosowanie) zmian impedancji w funkcji stężenia agonisty. Można to zrobić dla poszczególnych dołków lub dla średnich (średnia ± SD).
6. Zastosować procedurę dopasowywania danych w celu określenia połowy maksymalnych stężeń skutecznych (EC₅₀) i maksymalnej odpowiedzi (E_Max) przy użyciu czteroparametrowego modelu logistycznego (równanie 2):

UWAGA: c oznacza stężenie agonisty, A₁ to minimum, a A₂ to maksymalna asymptota sigmoidalnej krzywej dawka-odpowiedź (A₂ = E_Max). EC₅₀ to stężenie w punkcie przegięcia krzywej, a n odpowiada nachyleniu wzgórza.

Results

Typowy schemat przygotowania różnych roztworów agonistów jest pokazany w eksperymencie z użyciem 8-dołkowych układów elektrod z histaminą jako agonistą w tabelach 1-4. Tabela 1 i Tabela 2 przedstawiają objętości i stężenia dla eksperymentu z użyciem trybu dodawania 1 (por. Rysunek 1), podczas gdy Tabela 3 i Tabela 4 prezentują objętości i stężenia dla eksperymentu następującego po trybie

Discussion

Protokół ten opisuje metodę bezznacznikowych pomiarów impedancji w celu określenia zależności dawka-odpowiedź indukowanej przez agonistę aktywacji GPCR przy braku lub obecności specyficznych antagonistów dla tego samego receptora. Dowód słuszności koncepcji tej metody został przedstawiony w niedawnej publikacji¹². Według naszej wiedzy jest to pierwsze badanie opisujące ustalenie pełnej krzywej dawka-odpowiedź aktywacji GPCR za pośrednictwem agonistów przy użyciu pojedynczej warstwy komórkowej in v...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bü komora licząca rker	Marienfeld (Lauda-Kö nigshofen, Niemcy)	640210
kolby do hodowli komórkowych 25 cm2	Greiner bio-one (Frickenhausen, Niemcy)	690175
Inkubator komórek (linia funkcyjna Heraeus BB15)	Thermo Scientific (Darmstadt, Niemcy)	\
Wirówka (Heraeus 1S-R)	Thermo Scientific (Darmstadt, Niemcy)	\
Chlorowodorek	difenhydraminySigma Aldrich (Taufkirchen, Niemcy)	D3630
Minimum Essential Medium firmy Eagle z 4,5 g/l D-glukozy i 2,2 g/l NaHCO3	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Niemcy)	D5671
Impedancja (ECIS Zθ)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)	\
8-well electrode Arrays (8W1E PET)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)	\	PET base z elektrodą roboczą 0,049 mm2 i przeciwelektrodą ~50 mm2 (złotą)
96-dołkowe matryce elektrod (96W1E+ PET)	Applied BioPhysics Inc. (Troy, NY, USA)	\	Podstawa PET z dwiema elektrodami (złoty) o całkowitej powierzchni elektrody 0,256 mm2
Surowica płodu cielęcego (FCS)	Biochrom (Berlin, Niemcy)	S0615
Dichlorowodorek histaminy	Carl Roth (Karlsruhe, Niemcy)	4017.1
Okap z przepływem laminarnym (Herasafe, KS 12)	Thermo Scientific (Darmstadt, Niemcy)	51022515	komora bezpieczeństwa klasy II
Leibovitz' L-15 medium	Thermo Scientific (Darmstadt, Niemcy)	21083-027
L-glutamina	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Niemcy)	G7513
Mikropipeta duża (100 - 1000 &mikro; L)	Brandt (Wertheim, Niemcy)	704780
Mikropipeta duża (20 - 200 &mikro; L)	Brandt (Wertheim, Niemcy)	704778
Mikroskop (kontrast fazowy, Nikon Diaphot)	Nikon (Dü sseldorf, Niemcy)
Penicylina/streptomycyna	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Niemcy)	P0781
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Niemcy)	D8537
Pipeta, serologiczna	Greiner bio-one (Frickenhausen, Niemcy)	607 180
Pipettor (accu-jet pro)	Brandt (Wertheim, Niemcy)	26300
Trypsyna	Sigma Aldrich (Taufkirchen, Niemcy)	T4174	w PBS z 1 mM
probówką EDTA, 15 ml	Greiner bio-one (Frickenhausen, Niemcy)	188 271
Probówka, 50 ml	Greiner bio-one (Frickenhausen, Niemcy)	210 261
U-373 MG komórki	ATCC (Rockville, MD, USA)	ATCC HTB-17
(TW21)	Julabo (Seelbach, Niemcy)	\