Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja, hodowla i indukcja adipogenna grzebienia nerwowego Oryginalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej okołoorciowej

5.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60691

⸱

2 marca 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Shanghai Chest Hospital, Shanghai Jiao Tong University, 2Shanghai Institute of Nutrition and Health, Shanghai Institute for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences, 3Shanghai Key Laboratory of Hypertension, Shanghai Institute of Hypertension, Ruijin Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 4Department of Cardiology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 5Department of Cardiology, Shanghai Key Laboratory of Clinical Geriatric Medicine, Huadong Hospital Affiliated to Fudan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół izolacji, hodowli i indukcji adipogennej komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej pochodzącej z grzebienia nerwowego (NCADSC) z okołoaortalnej tkanki tłuszczowej Wnt-1 Cre+/-; Myszy Rosa26RFP/+. NCADSC mogą być łatwo dostępnym źródłem ADSC do modelowania adipogenezy lub lipogenezy in vitro.

Streszczenie

Nadmierna ilość tkanki tłuszczowej otaczającej naczynia krwionośne (okołonaczyniowa tkanka tłuszczowa, znana również jako PVAT) wiąże się z wysokim ryzykiem chorób sercowo-naczyniowych. ADSC pochodzące z różnych tkanek tłuszczowych wykazują odmienne cechy, a te z PVAT nie zostały dobrze scharakteryzowane. W niedawnym badaniu informowaliśmy, że niektóre ADSC w tkance tłuszczowej łuku okołoaortalnego (PAAT) pochodzą z komórek grzebienia nerwowego (NCC), przejściowej populacji komórek migrujących pochodzących z ektodermy.

W tym artykule opisujemy protokół izolacji NCC znakowanych czerwonym białkiem fluorescencyjnym (RFP) z PAAT Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ myszy i indukowanie ich różnicowania adipogennego in vitro. Krótko mówiąc, frakcja naczyniowa zrębu (SVF) jest enzymatycznie dysocjowana od PAAT, a ADSC pochodzące z grzebienia nerwowego RFP+ (NCADSC) są izolowane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). NCADSC różnicują się zarówno w brązowe, jak i białe adipocyty, mogą być kriokonserwowane i zachowują swój potencjał adipogenny przez ~3–5 pasaży. Nasz protokół może generować obfite ADSC z PVAT do modelowania adipogenezy PVAT lub lipogenezy in vitro. W związku z tym NCADSC mogą stanowić cenny system do badania przełączników molekularnych zaangażowanych w różnicowanie PVAT.

Wprowadzenie

Rozpowszechnienie otyłości wzrasta na całym świecie, co zwiększa ryzyko powiązanych chorób przewlekłych, w tym chorób układu krążenia i cukrzycy1. PVAT otacza naczynia krwionośne i jest głównym źródłem czynników endokrynnych i parakrynnych zaangażowanych w funkcjonowanie naczyń krwionośnych. Badania kliniczne pokazują, że wysoka zawartość PVAT jest niezależnym czynnikiem ryzyka chorób sercowo-naczyniowych2,3, a jego funkcja patologiczna zależy od fenotypu składowych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC)4.

Chociaż linie komórkowe ADSC, takie jak mysia 3T3-L1, 3T3-F442A i OP9, są użytecznymi modelami komórkowymi do badania adipogenezy lub lipogenezy5, mechanizmy regulacji adipogenezy różnią się między liniami komórkowymi a komórkami pierwotnymi. ADSC we frakcji komórek naczyniowych zrębu (SVF) wyizolowane bezpośrednio z tkanki tłuszczowej i indukowane do różnicowania się w adipocyty najprawdopodobniej rekapitulują in vivo adipogenezę i lipogenezę6. Jednak kruchość, wyporność oraz różnice w wielkości i immunofenotypach ADSC sprawiają, że ich bezpośrednia izolacja jest wyzwaniem. Ponadto różne procedury izolacji mogą również znacząco wpływać na fenotyp i potencjał adipogenny tych komórek7, podkreślając w ten sposób potrzebę protokołu, który zachowuje integralność ADSC.

Tkanka tłuszczowa jest zazwyczaj klasyfikowana jako morfologicznie i funkcjonalnie odrębna biała tkanka tłuszczowa (WAT), albo brązowa tkanka tłuszczowa (BAT)8, która zawiera odrębne ADSC9. Podczas gdy ADSC wyizolowane z okołoskórnych i pachwinowych podskórnych WAT zostały scharakteryzowane w poprzednich badaniach9,10,11,12, mniej wiadomo o ADSC z PVAT, który składa się głównie z BAT13.

W niedawnym badaniu stwierdziliśmy, że część ADSC rezydentnych w tkance tłuszczowej łuku okołoaortalnego (PAAT) pochodzi z komórek grzebienia nerwowego (NCC), przejściowej populacji migrujących komórek progenitorowych, które pochodzą z ektodermy14,15. Transgeniczne myszy Wnt1-Cre wykorzystano do śledzenia rozwoju komórek grzebienia nerwowego16,17. Skrzyżowaliśmy myszy Wnt1-Cre + z myszami Rosa26RFP / +, aby wygenerować Wnt-1 Cre +/-; Myszy Rosa26RFP/+, w których NCC i ich potomkowie są znakowani czerwonym białkiem fluorescencyjnym (RFP) i są łatwo śledzeni in vivo i in vitro15. W tym miejscu opisujemy metodę izolowania ADSC pochodzących z grzebienia nerwowego (ADSC pochodzących z NC lub NCADSC) z mysiego PAAT i indukowania NCADSC do różnicowania się w adipocyty białe lub adipocyty brązowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół dla zwierząt został sprawdzony i zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Jiao Tong w Szanghaju.

1. Generacja Wnt-1 Cre+/-; Myszy Rosa26RFP/+

  1. Krzyżuj Wnt-1 Cre+/- mice16 z Rosa26RFP/+ mice18, aby wygenerować Wnt-1 Cre+/-; Myszy Rosa26RFP/+. Myszy trzymane w domu w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność w obiekcie wolnym od patogenów w temperaturze 25 °C i wilgotności 45% do 4–8 tygodnia życia.

2. Sekcja PAAT

UWAGA: Zobacz Rysunek 1.

  1. Sterylizować wszystkie narzędzia chirurgiczne (np. nożyczki chirurgiczne, standardowe kleszcze oraz nożyczki i kleszcze mikrochirurgiczne) przez autoklawowanie w temperaturze 121 °C przez 30 minut.
  2. Przygotuj pożywkę do wytrawiania (Dulbecco's Modified Eagle Medium [HDMEM] o wysokiej zawartości glukozy zawierające 2 mg/ml kolagenazy typu I). Przygotować pożywkę hodowlaną (HDMEM zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej [FBS] i 1% v/v penicyliny-streptomycyny [PS]). Przed użyciem wysterylizuj za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm.
  3. Wysterylizuj odczynniki do hodowli komórkowych za pomocą promieniowania UV, etanolu, filtracji lub pary, w zależności od potrzeb.
  4. Przygotować szalkę Petriego ze zrównoważonym roztworem soli fizjologicznej Hanksa (HBSS) i stożkową probówką o pojemności 15 ml z 10 ml HBSS uzupełnionymi 1% v/v roztworu PS. Trzymaj oba na lodzie.
  5. Znieczulenie myszy 15 izofluranem i uśmiercenie przez zwichnięcie szyjki macicy. Zanurz ciała w zlewce wypełnionej 75% alkoholem (200 ml) na 5 minut, aby wysterylizować powierzchnię skóry.
  6. Odetnij i oddziel skórę na brzuchu i przetnij wzdłuż brzusznej linii środkowej od miednicy do szyi. Otwórz jamę brzuszną i przesuń wątrobę, aby odsłonić przeponę19.
  7. Przetnij przeponę i żebra po obu stronach linii środkowej i odsłoń serce i płuca, odrywając żebra.
  8. Usuń płuco i grasicę i usuń PAAT wraz z aortą i sercem.
  9. Odetnij aortę u nasady aortalnej, aby usunąć serce. Wykonaj przecięcie między łukiem aorty a aortą zstępującą i ostrożnie oddziel tkankę tłuszczową otaczającą obie struktury oraz lewą i prawą tętnicę szyjną wspólną od tylnej ściany klatki piersiowej. Przenieść tkankę do lodowatego buforu HBSS na szalce Petriego.
  10. Za pomocą sterylnych kleszczy usuń jak najwięcej układu naczyniowego (np. aorty, tętnic szyjnych wspólnych i innych małych naczyń krwionośnych) i powięzi, a następnie przenieś tkankę tłuszczową do probówek Eppendorfa o pojemności 2 ml zawierających 0,5 ml lodowatego buforu HBSS na lodzie.

3. Izolacja SVF

Zbierz PAAT 5-6 myszy do jednej probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml świeżo przygotowanej pożywki trawiącej i zmiel tkankę za pomocą nożyczek chirurgicznych w probówce Eppendorfa w temperaturze pokojowej (RT).

  1. Przenieść mieszaninę do probówek o pojemności 50 ml zawierających 9 ml pożywki wytrawiającej. Homogenizować tkanki, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety 1 ml 10x.
  2. Inkubować probówki w temperaturze 37 °C, stale wstrząsając przy 100 obr./min przez 30–45 minut i sprawdzać co 5–10 minut, aby zapobiec nadmiernemu trawieniu. Ma to kluczowe znaczenie dla poprawy żywotności i wydajności komórek.
    UWAGA: Dobre trawienie tkanek spowoduje powstanie jednorodnej, jasnożółtej tkanki tłuszczowej, która jest widoczna gołym okiem po delikatnym zawirowaniu rurki.
  3. Zatrzymać trawienie, dodając 5 ml HDMEM zawierającego 10% FBS i 1% v/v PS w temperaturze pokojowej i dobrze wymieszać pipetując.
  4. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. SVF będzie widoczny jako brązowawa granulka. Ostrożnie odessać pływające adipocyty i zdekantować pozostały supernatant bez naruszania SVF. Rozpuścić osad SVF w 10 ml pożywki hodowlanej i przefiltrować przez sitko o wielkości 70 μm.
  5. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 500 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i delikatnie zawiesić osad w 5 ml buforu do lizy erytrocytów w stożkowej probówce o pojemności 15 ml na 10 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Zatrzymaj reakcję, dodając 10 ml 1x PBS zawierającego 1% FBS. Odwirować zawiesinę komórek o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml 1 x PBS zawierającego 1% FBS.
  7. Ponownie odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml pożywki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml w temperaturze 4 °C.
  8. Po ostatniej rundzie wirowania (500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C), ponownie zawiesić granulowane komórki w 5 ml buforu FACS (PBS zawierający 10% FBS, 100 jednostek/mL DNA I 1% v/v PS) na lodzie i policzyć komórki za pomocą hemocytometru.

4. Izolacja NCADSC przez FACS

  1. Skonfiguruj i zoptymalizuj sortownik komórek zgodnie z instrukcją obsługi. Wybierz dyszę 100 μm, wysterylizuj probówki zbiorcze, zainstaluj wymagane urządzenie zbierające i ustaw strumienie boczne20.
  2. Do sortowania komórek RFP+ zalecany jest żółto-zielony laser o długości fali 561 nm i filtr optyczny 579/16. Przeprowadzić kompensację przy użyciu kontroli ujemnej i jednobarwnych kontroli dodatnich. Zobacz Rysunek 2A dla schematu bramkowania.
  3. Przefiltrować komórki przez sitko o wielkości 40 μm, odwirować przy 500 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić komórki w 2 ml buforu FACS o gęstości 0,5–1 x 107/ml. Przenieś komórki do wyraźnie oznaczonych probówek z polistyrenu o okrągłym dnie o pojemności 5 ml i załaduj do sortera.
  4. Uruchomić probówkę z próbką eksperymentalną w temperaturze 4 °C, włączyć płytki odchylające i posortować do stożkowej probówki o pojemności 15 ml wstępnie pokrytej RPMI zawierającej 1% FBS i 1% v/v PS.
    UWAGA: Chroń próbki przed silnym światłem, aby zminimalizować wygaszanie RFP.

5. Kultura NCADSC

  1. Posortowane komórki należy rozłożyć na płytkach o gęstości 5 000 komórek/cm2 na 12-dołkowej płytce hodowlanej w kompletnej pożywce i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 przez 20–24 godziny.
  2. Usunąć pożywkę hodowlaną, umyć komórki wstępnie podgrzanym (37 °C) PBS w celu usunięcia resztek komórek i dodać świeżą pożywkę hodowlaną.
  3. Gdy komórki zlewają się w 80–90%, należy wytrawić monowarstwę za pomocą 0,25% roztworu trypsyny EDTA w temperaturze 37 °C w inkubatorze przez 3–5 minut i zneutralizować 2 ml pożywki hodowlanej.
  4. Odwirować zebrane komórki przez 15 minut przy 250 x g w temperaturze pokojowej, usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki hodowlanej. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
  5. Zasiaj komórki na 12-dołkowej płytce hodowlanej o gęstości 5,000 komórek/cm2.
  6. Zawiesić pozostałe komórki w pożywce hodowlanej zawierającej 10% DMSO, zamrozić i przechowywać w ciekłym azocie.

6. Indukcja adipogeniczna NCADSC

  1. Indukuj dyferencjalność adipogeniczną NCADSC przy 80–90% zbiegu i standardowych warunkach hodowli21.
  2. W przypadku brązowej indukcji adipogennej najpierw potraktuj hodowane komórki brązowym pożywką do indukcji adipogennej (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0,5 mM/L IBMX, 0,1 μM/L deksametazonu, 1 μM/L rozyglitazonu, 10 nmol/L trójjodotyroniny i 1 μg/ml insuliny) przez 2 dni. Umyj komórki PBS 2x i zastąp świeżą pożywką (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 1 μM/L rozyglitazonu, 10 nmol/L trójjodotyroniny i 1 μg/ml insuliny). Zmieniaj to podłoże co 2 dni, w sumie 3–5 razy.
  3. W przypadku białej indukcji adipogennej najpierw potraktuj komórki białym pożywką do indukcji adipogennej (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS, 0,5 mM/L IBMX, 0,1 μM/L deksametazonu i 1 μg/ml insuliny) przez 2 dni. Umyj komórki PBS 2x i zastąp świeżą pożywką (HDMEM, 10% FBS, 1% v/v PS i 1 μg/ml insuliny). Zmieniaj to podłoże co 2 dni, w sumie 3-5 razy.
  4. W razie potrzeby przeanalizować komórki adipogenne.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas mycia komórek PBS. Zróżnicowane adipocyty mogą łatwo się zmyć.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując opisany powyżej protokół, uzyskaliśmy ~0,5–1,0 x 106 ADSCs z 5–6 myszy Wnt-1 Cre+/-;Rosa26RFP/+ (w wieku 48 tygodni, samców lub samic).

Schemat blokowy pobierania PAAT od myszy przedstawiono na Ryc. 1. Morfologia NCADSC była podobna do ADSC z innych tkanek tłuszczowych myszy. Hodowane NCADSC osiągnęły 80–90% konfluencji po 7–8 dniach hodowli, a NCADSC wykazywały rozszerzoną morfologię fibroblastopodobną (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu przedstawiamy wiarygodną metodę izolacji, hodowli i indukcji adipogennej NCADSC wyekstrahowanych z PVAT Wnt-1 Cre +/-; Transgeniczne myszy Rosa26RFP/+ zaprojektowane do produkcji RFP+ ADSC. Poprzednie doniesienia pokazują, że nie ma znaczącej różnicy w ekspresji ogólnych markerów multipotencjalnych mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) w NCADSC i nieNCADSC22 oraz że NCADSC mają duży potencjał do różnicowania się w adipocyty in vitro

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Narodowy Kluczowy Program Badawczo-Rozwojowy Chin (2018YFC1312504), Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (81970378, 81670360, 81870293) oraz Komisja Nauki i Technologii Gminy Szanghaj (17411971000, 17140902402) zapewniły fundusze na to badanie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4% PFABBI nauki przyrodniczeE672002-0500Część #: EC11FA0001
AgarozaABCONE (Chiny)A479021% stężenie robocze
Anty-cebp/&alfa;ABklonalA09041:1000 stężenie robocze
Anty-mysie IgG, CST sprzężone z HRP70761:5000 stężenie robocze
Anti-perilipinaAbcamAB616821 μ g/ml stężenia roboczego; część #: GR66486-54
Anty-PPARySANTA CRUZsc-72730.2 μ g/ml stężenie robocze
Anty-królicze IgG, sprzężone z HRPCST70741:5000 stężenie robocze
Anty-β-tubulinaCST21461:1000 stężenie robocze
BSAVWR nauki przyrodnicze0332-100G50 mg/ml stężenie robocze; partia #: 0536C008
Kolagenaza, typ IGibco17018029
deksametazonSigma-AldrichD49020,1 i mikro; M stężenie robocze
Bufor do lizy erytrocytówInvitrogen00-4333
FBSCorningR35-076-CV50 mg/ml stężenie robocze; partia #: R2040212FBS
HBSSGibco14025092
HDMEMGelifesciencesSH30243.01Część #: AD20813268
IBMXSigma-AldrichI70180,5 mM działa stężenie
InsulinaSigma-AldrichI35361 μ g / ml stężenie robocze
Kleszcze mikrochirurgiczneSuzhou Mingren Medical Equipment Co., Ltd. (Chiny)MR-F201A-1
Nożyczki mikrochirurgiczneSuzhou Mingren Medical Equipment Co., Ltd. (Chiny)MR-H121A
Roztwór czerwieniO Sigma-AldrichO15160,3% stężenie robocze
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem)ABCONE (Chiny)P41970
Zestaw odczynników Penicylina-StreptomycynaGibco15140122
PrimeScript RTTAKARARR047APartia #: AK4802
RNeasy zestawTAKARA9767Część #: AHF1991D
Myszy Rosa26RFP/+JAXNo.007909C57BL/6 backgroud; męski i żeński
RosiglitazoneSigma-AldrichR24081 μ Stężenie robocze M
Standardowe kleszczeSuzhou Mingren Medical Equipment Co., Ltd. (Chiny)MR-F424
Nożyczki chirurgiczneSuzhou Mingren Medical Equipment Co., Ltd. (Chiny)MR-S231
SYBR Premix Ex TaqTAKARARR420ADużo #: AK9003
TrijodotyroninaSigma-AldrichT287710 nM stężenie robocze
Wnt1-Cre+; PPARγ Myszy flox/floxJAXNo.009107C57BL/6 backgroud; męskie i żeńskie
olejowej

Bibliografia

  1. Afshin, A., et al. Health Effects of Overweight and Obesity in 195 Countries over 25 Years. New England Journal of Medicine. 377 (1), 13-27 (2017).
  2. Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
  3. Britton, K. A., et al. Prevalence, distribution, and risk factor correlates of high thoracic periaortic fat in the Framingham Heart Study. Journal of the American Heart Association. 1 (6), 004200(2012).
  4. Police, S. B., Thatcher, S. E., Charnigo, R., Daugherty, A., Cassis, L. A. Obesity promotes inflammation in periaortic adipose tissue and angiotensin II-induced abdominal aortic aneurysm formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (10), 1458-1464 (2009).
  5. Farmer, S. R. Transcriptional control of adipocyte formation. Cell Metabolism. 4 (4), 263-273 (2006).
  6. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).
  7. Ruan, H., Zarnowski, M. J., Cushman, S. W., Lodish, H. F. Standard isolation of primary adipose cells from mouse epididymal fat pads induces inflammatory mediators and down-regulates adipocyte genes. Journal of Biological Chemistry. 278 (48), 47585-47593 (2003).
  8. Cinti, S. Between brown and white: novel aspects of adipocyte differentiation. Annals of Medicine. 43 (2), 104-115 (2011).
  9. Van Harmelen, V., Rohrig, K., Hauner, H. Comparison of proliferation and differentiation capacity of human adipocyte precursor cells from the omental and subcutaneous adipose tissue depot of obese subjects. Metabolism. 53 (5), 632-637 (2004).
  10. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  11. Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).
  12. Chen, Y., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. Journal of Visualized Experiments. (109), e53886(2016).
  13. Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
  14. Medeiros, D. M. The evolution of the neural crest: new perspectives from lamprey and invertebrate neural crest-like cells. Wiley Interdisciplinary Reviews. Developmental Biology. 2 (1), 1-15 (2013).
  15. Fu, M., et al. Neural Crest Cells Differentiate Into Brown Adipocytes and Contribute to Periaortic Arch Adipose Tissue Formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. , (2019).
  16. Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
  17. Tamura, Y., et al. Neural crest-derived stem cells migrate and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (3), 582-589 (2011).
  18. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  19. Tan, P., Pepin, É, Lavoie, J. L. Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis. Journal of Visualized Experiments. (131), e57026(2018).
  20. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments. (41), e1546(2010).
  21. Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
  22. Sowa, Y., et al. Adipose stromal cells contain phenotypically distinct adipogenic progenitors derived from neural crest. PLoS One. 8 (12), 84206(2013).
  23. Billo, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
  24. Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), e55818(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mesenchymalne komórki macierzyste tkanki tłuszczowej grzebienia neuronalnegoizolacja okołorticznej tkanki tłuszczowejfrakcja naczyniowo-stromalnasortowanie komórek metodą fluorescencyjnej aktywacjiróżnicowanie adypogeniczneindukcja adipocytów brunatnychindukcja adipocytów białychznakowanie białkami fluorescencyjnymiprotokół hodowli komórkowejprzechowywanie w krio konserwacji
Izolacja, hodowla i indukcja adipogenna grzebienia nerwowego Oryginalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej okołoorciowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.