Wizualizacja śmierci komórek litycznych makrofagów podczas infekcji prątkami w zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Wykazano, że infekcja prątkowa powoduje śmierć komórek immunologicznych gospodarza¹. Na przykład atenuowany szczep wywoła apoptozę w makrofagach i powstrzyma infekcję. Jednak zjadliwy szczep wywoła śmierć komórek litycznych, powodując rozprzestrzenianie się bakterii^1,2. Biorąc pod uwagę wpływ tych różnych typów śmierci komórek na odpowiedź przeciwprątkową gospodarza, potrzebna jest szczegółowa obserwacja śmierci komórek makrofagów podczas infekcji prątkami in vivo.

Konwencjonalne metody pomiaru śmierci komórek polegają na użyciu barwienia martwych komórek, takich jak Annnexin V, TUNEL lub barwienie pomarańczą akrydynową/jodkiem propidyny^3,4,5. Metody te nie są jednak w stanie rzucić światła na dynamiczny proces śmierci komórki in vivo. Obserwacja śmierci komórek in vitro została już ułatwiona dzięki obrazowaniu na żywo⁶. Jednak to, czy wyniki dokładnie naśladują warunki fizjologiczne, pozostaje niejasne.

Danio pręgowany był doskonałym modelem do badania reakcji antyprątkowych gospodarza. Ma wysoce konserwatywny układ odpornościowy podobny do ludzkiego, łatwy do manipulowania genom, a wczesne zarodki są przezroczyste, co pozwala na obrazowanie na żywo^7,8,9. Po zakażeniu M. marinum dorosłe rybo pręgowany tworzą typowe dojrzałe struktury ziarniniaka, a embrionalny danio pręgowany tworzy wczesne struktury podobne do ziarniniaka^9,10. Dynamiczny proces interakcji między komórkami odpornościowymi a bakteriami został już wcześniej zbadany w modelu zakażenia danio pręgowanego M. marinum^11,12. Jednak ze względu na wysokie wymagania dotyczące rozdzielczości przestrzenno-czasowej, szczegóły dotyczące śmierci wrodzonych komórek odpornościowych pozostają w dużej mierze nieokreślone.

Tutaj opisujemy, jak zobrazować proces śmierci komórek litycznych makrofagów wywołany infekcją mykobakteryjną in vivo. Protokół ten może być również stosowany do wizualizacji zachowania komórek in vivo podczas rozwoju i stanu zapalnego.

Danio pręgowany były hodowane w standardowych warunkach, zgodnie z wytycznymi dla zwierząt laboratoryjnych dotyczących etycznego przeglądu dobrostanu zwierząt (GB/T 35823-2018). Wszystkie eksperymenty z danio pręgowanym w tym badaniu zostały zatwierdzone (2019-A016-01) i przeprowadzone w Centrum Klinicznym Zdrowia Publicznego w Szanghaju, Uniwersytet Fudan.

1. M. marinum Preparat inokulum jednokomórkowego (Rysunek 1)

1. Rozmrozić cykulańsko-fluorescencyjny bulion glicerolu M. marinum w temperaturze -80 °C i zaszczepić płytkę agarową 7H10 10% (v/v) OADC, 0,25% glicerolu i 50 μg/ml higromycyny. Inkubować płytkę w temperaturze 32 °C przez około 10 dni.
2. Wybierz kolonię wykazującą dodatnią fluorescencję i zaszczep 3 ml pożywki 7H9 10% OADC, 0,5% glicerolu i 50 μg/ml higromycyny.
   1. Inkubować inokulację w temperaturze 32 °C i 100 obrotach na minutę (obr./min) przez 4–6 dni, aż kultura osiągnie fazę logarytmiczną (OD₆₀₀ = 0,6–1,0).
   2. Subkultura (1:100) w 30 ml świeżej pożywki 7H9 z 10% OADC, 0,5% glicerolu, 0,05% Tween-80 i 50 μg/ml, aż OD₆₀₀ osiągnie ~1,0,
      UWAGA: Aby uzyskać najwyższą jakość kultury, na tym etapie zalecany jest etap subkultury. Z naszego doświadczenia wynika, że dodanie klonu bezpośrednio do dużej objętości podłoża doprowadzi do powstania grudek bakteryjnych.
3. Zbierz komórki M. marinum zgodnie z poniższym opisem.
   1. Wirować przy 3 000 x g przez 10 minut, aby zebrać M. marinum w postaci granulatu. Wyrzucić wszystko, z wyjątkiem 300 μl supernatantu i użyć go do ponownego wymieszania osadu.
   2. Dodać 3 ml pożywki 7H9 z 10% glicerolem w celu dalszego zawieszenia osadu, a następnie sonikować zawiesinę w łaźni wodnej o mocy 100 W przez 15 s ON, 15 s OFF, w sumie 2 min.
      UWAGA: Celem sonikacji jest uzyskanie jednorodności pojedynczej komórki dla inokulum, co zapobiegnie zablokowaniu igły do mikroiniekcji.
4. Przenieś zawiesinę bakteryjną do strzykawki o pojemności 10 ml, a następnie przepuść przez filtr 5 μm w celu usunięcia wszelkich grudek bakteryjnych.
5. Zmierzyć gęstość optyczną (OD) zawiesiny za pomocą spektrofotometru i rozcieńczyć ją do OD₆₀₀ = 1,0 za pomocą pożywki 7H9 zawierającej 10% glicerolu. Podzielić zawiesinę na 10 μl porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C w zamrażarce do wykorzystania w przyszłości.
6. Potwierdzić stężenie bakteryjne inokulum (jtk/ml) przez seryjne rozcieńczanie i posiewanie materiału bakteryjnego na płytce agarowej 7H10 zawierającej 10% (v/v) OADC, 0,5% glicerolu i 50 μg/ml higromycyny.

2. Przygotowanie zarodków danio pręgowanego

1. Na dzień przed tarłem należy ustawić pary lęgowe danio pręgowanego w komorze hodowlanej.
   UWAGA: Dodaj tylko jedną parę do każdej komory hodowlanej.
2. Zbierz zarodki następnego ranka w ciągu 1 godziny po zapłodnieniu (hpf). Ostrożnie umyć zarodki wodą destylowaną i przenieść do 100 zarodków na 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 30 ml pożywki E3. Inkubować w temperaturze 28,5 °C.
3. Po 12 godzinach obserwuj pod mikroskopem i wyrzuć niezapłodnione lub uszkodzone jaja.
4. Przy 24 hpf zmień pożywkę na świeżą pożywkę E3 z N-fenylotiomocznikiem (PTU, stężenie końcowe 0,2 nM), aby zapobiec rozwojowi pigmentu. Inkubować zarodki w temperaturze 28,5 °C, aż zarodki będą gotowe do mikroiniekcji.

3. Zakażenie za pomocą mikroiniekcji bakteryjnej

1. Przygotować igły do iniekcji mikrokapilarnych ze szkła borokrzemianowego zgodnie z wcześniejszym opisem w reference¹³.
2. Zarodki danio pręgowanego montowane w celu zakażenia
   1. Mikrofale 100 ml 1% (w/v) i 100 ml 0,5% (w/v) niskotopliwej agarozy w autoklawowanym podłożu E3, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Podzielić na 1 ml podwielokrotnych probówek i przechowywać w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości.
   2. Przed użyciem podgrzej agarozę w bloku grzewczym o temperaturze 95 °C, aż całkowicie się rozpuści. Utrzymuj agarozę w postaci płynnej, umieszczając ją w bloku grzewczym o temperaturze 45 °C (Rysunek 2).
   3. Montaż do infekcji śródmięśniowej w okolicy tułowia
      1. Stwórz dolną warstwę agarozy, wylewając równomiernie 0,5 ml 1% (w/v) agarozy na szklane szkiełko. Umieść na pojemniku na lód lub zimnej powierzchni na 3 minuty do zestalenia.
      2. Znieczulenie zarodków danio pręgowanego (48–72 hpf) w wodzie z jajami z trikainą (200 μg/ml) i PTU przez 5 minut przed montażem. Umieść do 60 zarodków danio pręgowanego na dolnej warstwie agarozy i ułóż je ostrożnie w dwóch rzędach (Rysunek 2B).
      3. Usuń pozostałą wodę z dolnej warstwy agarozy bibułką przed dodaniem 0,3 ml 0,5% (w/v) agarozy, aby utworzyć górną warstwę. Upewnij się, że zarodki są całkowicie osadzone w agarozie. Ponownie włóż szklane szkiełko do pojemnika na lód, aby zestalić agarozę i zapobiec odwodnieniu.
      4. Utrzymuj górną warstwę agarozy wilgotną, pokrywając powierzchnię dodatkową wodą jajeczną E3.
   4. Montaż w przypadku infekcji śródmózgowia
      1. Przykryj rowek pojedynczego szkiełka mikroskopowego ze szkła wklęsłego 1% (w/v) agarozy, a następnie przenieś 4-6 znieczulonych trikainą zarodków do agarozy.
      2. Ostrożnie ustaw głowę każdego zarodka do góry za pomocą igły 10 G (Rysunek 2C).
      3. Gdy pozycje wszystkich zarodków zostaną ustalone, przenieś szklane szkiełko do pojemnika na lód lub zimnej powierzchni, aby agaroza zastygła.
         UWAGA: Unikaj rozcieńczania agarozy o niskiej temperaturze topnienia, minimalizując objętość transferu wody jajowej z zarodkami.
3. Preparat bakteryjny na infekcję
   1. Dodać 1 μl sterylnie przefiltrowanej czerwieni fenolowej (10x) do 10 μl podwielokrotności bulionu bakteryjnego (przygotowanego w kroku 1) i wymieszać przez krótkie wirowanie.
      UWAGA: Końcowe stężenie można dostosować za pomocą sterylnego PBS.
   2. Sonikuj preparat za pomocą 100 W przez 10 s ON, 10 s OFF przez 1 min, aby rozbić wszelkie grudki, które mogły się utworzyć¹⁴.
4. Zakażenie za pomocą mikroiniekcji
   1. Ustaw mikrowtryskiwacz i mikromanipulator we właściwej pozycji i ustawieniu do mikroiniekcji, jak wcześniej raportowano¹³.
   2. Przenieść 3 μl preparatu bakteryjnego za pomocą mikroładowarki do przygotowanej igły (patrz krok 3.1). Pipetować powoli i ostrożnie, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza.
   3. W przypadku infekcji okolicy tułowia wstrzyknij 100 jtk w obszar tułowia (Rysunek 3A). Unikaj wstrzykiwania bakterii do struny grzbietowej.
      UWAGA: Jtk do wstrzykiwań szacuje się według wzoru cfu = stężenie podstawowe bakterii x współczynnik rozcieńczenia x objętość kropli iniekcji. Rzeczywisty jtk potwierdza się przez posiew jednej kropli inokulum bakteryjnego na płytce agarowej 7H10 zawierającej 10% (v/v) OADC, 0,5% glicerolu i 50 μg/ml higromycyny.
   4. W przypadku infekcji śródmózgowia wstrzyknij około 500 jtk w obszar śródmózgowia (Ryc. 3B).
   5. Po mikroiniekcji ostrożnie przepłucz zarodki danio pręgowanego do świeżej wody z jaj za pomocą plastikowej pipety.
      UWAGA: Zamontuj zarodki w naczyniu ze szklanym dnem tak szybko, jak to możliwe, aby zakryć obserwację bardzo wczesnej wrodzonej odpowiedzi komórek odpornościowych.

4. Obrazowanie infekcji na żywo

1. Montowanie ryb do obrazowania na żywo
   1. Przenieś do 10 zarodków znieczulonych trikainą na środek naczynia o szklanym dnie 35 mm. Wyrzuć dodatkowe podłoże E3.
   2. Przykryj naczynie 1% agarozą o niskiej temperaturze topnienia i ostrożnie ustaw zarodki danio pręgowanego za pomocą igły 10 G. Inkubować naczynie ze szklanym dnem na lodzie przez 10 sekund, aby zestalić agarozę.
      UWAGA: W przypadku iniekcji śródmózgowia zarodki powinny być osadzone w agarozie z głową skierowaną do góry (Rysunek 4A). W przypadku zakażenia śródmięśniowego okolicy tułowia zarodki powinny być zamontowane bocznie w agarozie (Ryc. 4B).
   3. Po całkowitym zastygnięciu agaroza zalej warstwą wody jajecznej (plus 1 x trikaina i PTU).
2. Trójkolorowa mikroskopia konfokalna poklatkowa o wysokiej rozdzielczości
   UWAGA: Poniższe kroki są wykonywane na mikroskopii konfokalnej wyposażonej w soczewkę obiektywową UV 63.0x 1.40 oil.
   1. Ustaw temperaturę komory środowiskowej na 28,5 °C. Umieść mokrą bibułkę w komorze, aby zapewnić wilgotność i zapobiec parowaniu wody z jaja (rysunek uzupełniający 1).
   2. Umieść naczynie ze szklanym dnem o średnicy 35 mm z danio pręgowanym w komorze środowiskowej.
   3. Otwórz oprogramowanie konfokalne i zainicjuj stolik. Przełącz się na obiektyw UV o wymiarach 63,0 x 1,40 i zlokalizuj danio pręgowanego za pomocą kanału jasnego pola z filtrem kontrastu różnicowego (DIC).
   4. Otwórz diodę 405, argon (20% mocy) i laser DPSS 561 nm. Ustaw odpowiednie ustawienia mocy i widma lasera.
      UWAGA: Poniżej przedstawiono ustawienia widma dla Cerulean (wzbudzenie = 405 nm; emisja = ~456–499 nm), eGFP (wzbudzenie = 488 nm; emisja = ~500–550 nm), DsRed2 (wzbudzenie = 561 nm; emisja = ~575–645 nm) (Rysunek uzupełniający 2B).
   5. Wybierz tryb akwizycji "XYZ" "Skanowanie sekwencyjne" i ustaw format obrazów na "512 x 512 pikseli" (rysunek uzupełniający 2A).
   6. Przełącz na "Tryb danych na żywo". Wyceluj w pozycję pierwszego danio pręgowanego i zaznacz pozycję Z "Początek" i "Koniec". Powtórz ten proces dla każdego z pozostałych zarodków. Na końcu programu można dodać "Pauzę" (rysunek uzupełniający 2C).
   7. Zdefiniuj pętlę i cykl programu.
   8. Zapisz plik.

5. Promieniowanie UV pojedynczych komórek w celu wywołania apoptozy i obrazowania na żywo

1. Zamontuj rybę zgodnie z opisem w kroku 4.1.
2. Obrazowanie obszaru śródmózgowia 3 dni po zapłodnieniu (dpf) transgeniczny transgeniczny Tg(mfap4-eGFP) swoisty dla makrofagów zarodek¹⁵
3. Wybierz obszar zainteresowania jednego pojedynczego fluorescencyjnie znakowanego makrofaga i skanuj z prędkością 400 Hz i mocą lasera UV 6% przez 50 s.
   UWAGA: Szybkość i czas skanowania powinny być zoptymalizowane w zależności od indywidualnego mikroskopu. Czas skanowania powinien być zoptymalizowany, aby spowodować rozległe uszkodzenia DNA, które następnie spowodują apoptozę komórki docelowej, ale nie fotowybielają całej komórki.
4. Powtórz powyższy krok, aby napromieniować więcej komórek docelowych.
5. Wykonać obrazowanie poklatkowe obszaru śródmózgowia zgodnie z opisem w punkcie 4.

6. Przetwarzanie obrazu

1. Wykonaj "Projekcję maksymalną" dla uzyskanych obrazów.
2. Znajdź i zaznacz pozycję XY i czas komórek docelowych w widoku "Projekcja maksymalna".
3. Wróć do widoku standardowego, aby znaleźć i zaznaczyć pozycję Z komórek docelowych.
4. Przytnij jednowarstwowy obraz komórek docelowych.
5. Eksportuj kanał nakładki i jasne pole jako filmy w formacie AVI.
6. Przytnij obszar zainteresowania kanału nakładki i jasnego pola w obrazie ImageJ.
7. Połącz dwa filmy w ostatnim kroku w pionie i zapisz jako jedno wideo w formacie AVI w ImageJ.

Zakażenie prątkami może wywołać różne reakcje gospodarza w zależności od drogi infekcji. W tym protokole zarodki danio pręgowanego są zakażone przez domięśniowe mikrowstrzyknięcie fluorescencyjnie znakowanych bakterii do śródmózgowia lub tułowia (Ryc. 3) i obserwowane za pomocą konfokalnego obrazowania na żywo. Zakażenie tymi dwiema drogami lokalnie ograniczy infekcję, powodując wrodzoną rekrutację komórek odpornościowych, a następnie śmierć komórki.

Wizualizacja szczegółów wrodzonej śmierci komórek odpornościowych jest wyzwaniem. Śmierć komórek litycznych zachodzi w bardzo krótkim czasie i wymaga mikroskopii o wysokiej rozdzielczości do obserwacji. Ponadto wysoka ruchliwość wrodzonych komórek odpornościowych pozwala im na migrację poza obszar obserwacji. W tym protokole rozwiązujemy ten problem, obserwując równolegle wiele zarodków. Szereg zarodków danio pręgowanego można zamontować na pojedynczym szklanym szkiełku mikroskopowym w celu infekcji, a do 10 zarodków można zamontować na tej samej szklanej misce o średnicy 35 mm do obrazowania na żywo (Rysunek 4). Korzystając z modelu danych na żywo w mikroskopii konfokalnej, można obserwować więcej niż jeden zarodek jednocześnie. Zwiększa to wydajność obrazowania na żywo i znacznie zwiększa prawdopodobieństwo uchwycenia całego procesu śmierci komórki litycznej.

Wrodzony układ odpornościowy jest pierwszą linią obrony przed infekcją mykobakteryjną, a dwoma kluczowymi składnikami są makrofagi i neutrofile. Tutaj wykorzystujemy wcześniej zgłoszone Tg(coro1a:eGFP; lyzDsRed2) i Tg(mpeg1:loxP-DsRedx-loxP-eGFP; lyz:eGFP) w celu rozróżnienia makrofagów i neutrofili in vivo16,17,18. Makrofag silnie nabrzmiały bakteryjnie stawał się okrągły i wykazywał zmniejszoną ruchliwość, z ewentualnym obrzękiem cytoplazmatycznym, pęknięciem błony komórkowej i szybkim rozprzestrzenianiem się zawartości cytoplazmatycznej. Zdarzenia te są typowymi zmianami morfologicznymi śmierci komórek litycznych, jak wcześniej opisano (Rysunek 5A)16. Naświetlanie promieniowaniem UV zostało wykorzystane do wywołania apoptozy komórek u danio pręgowanego20,21. Zgodnie z tym pojęciem, makrofagi napromieniowane promieniowaniem UV wykazywały typowe apoptotyczne fenotypy komórek, takie jak kurczenie się komórek, fragmentacja jądrowa i kondensacja chromatyny (Rysunek 5B)22,23. W połączeniu z użyciem cerulean-fluorescencyjnej M. marinum19, uzyskano trzykolorowe obrazowanie na żywo interakcji między makrofagami, neutrofilami i M. marinum in vivo. Zaobserwowaliśmy również, że makrofagi mogą aktywnie fagocytozę i rozprowadzać M. marinum (rysunek uzupełniający 3A). Jednak neutrofile miały ograniczoną zdolność fagocytarną i szybko ulegały śmierci komórek litycznych bez widocznego obrzęku bakteryjnego (rysunek uzupełniający 3B). Neutrofile mogą być wywołane przez fagocytozę tylko kilku martwych M. marinum, które nie wyrażają fluorescencji Cerulean, lub po prostu przez fagocytozę ograniczonych szczątków martwych komórek.

Rysunek 1: Schemat ideowy przygotowania bakterii jednokomórkowych. Jednokomórkowe stada cerulean-fluorescencyjne M. marinum zostały wygenerowane zgodnie z opisanym procesem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Schemat mocowania zarodka danio pręgowanego do mikroiniekcji. (A) Schemat ideowy procesu montażu. (B) Zarodki danio pręgowanego montowano z boku w celu zakażenia okolicy tułowia. (C) Zarodki danio pręgowanego były umieszczane z głowami skierowanymi do góry w celu zakażenia śródmózgowia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Umiejscowienie do mikroiniekcji. (A) Czerwona strzałka wskazuje miejsce wstrzyknięcia w przypadku infekcji okolicy tułowia. (B) Czerwona strzałka wskazuje miejsce wstrzyknięcia w przypadku infekcji śródmózgowia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 4: Montaż zarodków danio pręgowanego do obrazowania na żywo. (A) W przypadku infekcji śródmózgowia embriony danio pręgowanego montowano z głowami skierowanymi w dół. (B) W przypadku zakażenia okolicy tułowia, zarodki danio pręgowanego montowano z boku w miejscu wstrzyknięcia blisko dna naczynia ze szklanym dnem. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Typowe zmiany morfologiczne w zakażeniu M. marinum indukowane śmiercią komórek litycznych makrofagów i apoptozą makrofagów indukowaną promieniowaniem UV. (A) Obrazowanie poklatkowe makrofaga (Mac) przechodzącego śmierć komórki litycznej, gdy jest ona mocno nabrzmiała M. marinum. Śródmózgowie 3 dpf Tg(coro1a:eGFP; lyzDsRed2) zarodek danio pręgowanego jest zakażony przez Cerulean-fluorescencyjny M. marinum (~500 jtk) poprzez mikroiniekcje. Dostępne są obrazy zarówno dla kanału nakładki (górny panel), jak i kanału DIC (dolny panel). T 00:00 to 5 h 20 min po zakażeniu. Białe przerywane linie = kontur błony komórkowej; czarne przerywane linie = pęczniejąca cytoplazma; czarne strzałki = pęknięta błona komórkowa; Czerwone przerywane linie = szybko tracona zawartość cytoplazmatyczna. (B) Obrazowanie poklatkowe makrofagów napromieniowanych promieniowaniem UV. Jedna komórka GFP+ w obszarze śródmózgowia 3 dpf Tg (mfap4: eGFP) jest naświetlana promieniowaniem UV, a następnie następuje obrazowanie poklatkowe. Białe przerywane linie = kontur błony komórkowej; Czarne strzałki = fragmentacja jądrowa i kondensacja chromatyny. Podziałka = 15 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Komora środowiskowa przygotowana do obrazowania na żywo. (A) Ustaw sterownik cyfrowy tak, aby utrzymywał temperaturę na poziomie 28.5 °C. (B) Umieść wilgotne chusteczki w komorze, aby zapewnić wilgotność i zapobiec parowaniu wody jajecznej. (C) Zamknij pokrywę komory i odczekaj co najmniej 30 minut na ustabilizowanie się temperatury przed rozpoczęciem obrazowania na żywo. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 2: Ustawienie panelu konfokalnego do obrazowania na żywo. (A) Przedstawienie ustawień panelu akwizycji. (B) Przedstawienie ustawień mocy i widma lasera. (C) Reprezentacja wielu zadań i ustawień pętli w trybie danych na żywo. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 3: Makrofagi rozprzestrzeniają infekcję, a neutrofile ulegają śmierci komórek litycznych po zakażeniu M. marinum. (A) Makrofagi rozsiewające M. marinum w pniu 2 dpf Tg(coro1a:eGFP; lyz:DsRed2) zarodek danio pręgowanego zakażony przez Cerulean-fluorescencyjny M. marinum (~100 jtk). (B) Neutrofile (Neu) ulegające śmierci komórki litycznej bez widocznego M. marinum obciążonego w obszarze tułowia 3 dpf Tg (mpeg1:LRLG; lyz:eGFP) zarodek danio pręgowanego zakażony przez cerulean-fluorescencyjny M. marinum (~100 jtk) za pomocą mikroiniekcji. Kolor zielony jest przypisany do LRLG, a kolor czerwony jest przypisany do eGFP dla lepszej wizualizacji procesu śmierci komórki litycznej. Strzałki w kolorze niebieskozielonym wskazują komórki docelowe. Strzałki w kolorze czerwonym wskazują komórki, które mają zamiar uwolnić zawartość cytoplazmy w następnej klatce. Strzałki w kolorze zielonym wskazują martwe komórki, które właśnie straciły zawartość cytoplazmy. Podziałka = 25 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wideo 1: Makrofag silnie obciążony M. marinum ulega śmierci komórki litycznej, związanej z Rysunek 5A. Obrazowanie poklatkowe (obiektyw 63x) przez 9 min i 18 s przy 3 klatkach na sekundę (kl./s) obszaru śródmózgowia 3 dpf Tg(coro1a:eGFP; lyzDsRed2) zarodek danio pręgowanego zakażony cerulano-fluorescencyjnym M. marinum. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Wideo 2: Makrofag ulega apoptozie po naświetlaniu promieniami UV, związanymi z Rysunek 5B. Obrazowanie poklatkowe (obiektyw 63x) trwające 74 minuty przy 6 kl./s obszaru śródmózgowia zarodka danio pręgowanego o ciśnieniu 3 dpf Tg(mfap4:eGFP). Jedna komórka GFP+ w obszarze śródmózgowia zarodków jest naświetlana promieniowaniem UV, a następnie wykonywana jest obrazowanie poklatkowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Wideo 3: Makrofag rozprzestrzenia M. marinum, związany z rysunkiem uzupełniającym 3A. Obrazowanie poklatkowe (obiektyw 63x) trwające 24 minuty przy 3 kl./s obszaru tułowia 2 dpf Tg(coro1a:eGFP; lyz:DsRed2) zarodek danio pręgowanego zakażony Cerulean-fluorescencyjnym M. marinum. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Wideo 4: Neutrofile ulega śmierci komórki litycznej bez widocznego obrzęku M. marinum, co jest związane z rysunkiem uzupełniającym 3B. Obrazowanie poklatkowe (obiektyw 63x) 7 min 30 s przy 3 kl./s obszaru tułowia 3 dpf Tg (mpeg1:LRLG; lyz:eGFP) zarodek danio pręgowanego zakażony cerule-fluorescencyjnym M. marinum. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.