Artykuł metodologiczny

Wizualizacja śmierci komórek litycznych makrofagów podczas infekcji prątkami w zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii przyżyciowej

DOI:

10.3791/60698

⸱

9 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University, 2School of Life Sciences, Bengbu Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje technikę wizualizacji zachowania i śmierci makrofagów u embrionalnego danio pręgowanego podczas infekcji Mycobacterium marinum. Uwzględniono etapy przygotowania bakterii, zakażenia zarodków i mikroskopii przyżyciowej. Technika ta może być stosowana do obserwacji zachowania komórek i śmierci w podobnych scenariuszach obejmujących infekcję lub sterylny stan zapalny.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany jest doskonałym organizmem modelowym do badania zachowania wrodzonych komórek odpornościowych, ze względu na swoją przezroczystość i poleganie wyłącznie na wrodzonym układzie odpornościowym we wczesnym okresie rozwoju. Model zakażenia Mycobacterium marinum (M. marinum) został dobrze ugruntowany w badaniu odpowiedzi immunologicznej gospodarza na zakażenie prątkami. Sugeruje się, że różne typy śmierci komórek makrofagów prowadzą do różnych wyników infekcji prątkami. W tym miejscu opisujemy protokół wykorzystujący mikroskopię przyżyteczną do obserwacji śmierci komórek makrofagów w zarodkach danio pręgowanego po zakażeniu M. marinum. Linie transgeniczne danio pręgowanego, które specyficznie znakują makrofagi i neutrofile, są zakażone poprzez domięśniowe mikrowstrzyknięcie fluorescencyjnie znakowanego M. marinum w śródmózgowie lub tułów. Zakażone zarodki danio pręgowanego są następnie umieszczane na niskotopliwej agarozie i obserwowane za pomocą mikroskopii konfokalnej w wymiarach X-Y-Z-T. Ponieważ długoterminowe obrazowanie na żywo wymaga użycia niskiej mocy lasera, aby uniknąć fotowybielania i fototoksyczności, zdecydowanie zaleca się stosowanie transgenicznego produktu o silnej ekspresji. Protokół ten ułatwia wizualizację dynamicznych procesów in vivo, w tym migracji komórek odpornościowych, interakcji z patogenem gospodarza i śmierci komórki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykazano, że infekcja prątkowa powoduje śmierć komórek immunologicznych gospodarza1. Na przykład atenuowany szczep wywoła apoptozę w makrofagach i powstrzyma infekcję. Jednak zjadliwy szczep wywoła śmierć komórek litycznych, powodując rozprzestrzenianie się bakterii1,2. Biorąc pod uwagę wpływ tych różnych typów śmierci komórek na odpowiedź przeciwprątkową gospodarza, potrzebna jest szczegółowa obserwacja śmierci komórek makrofagów podczas infekcji prątkami in vivo.

Konwencjonalne metody pomiaru śmierci komórek polegają na użyciu barwienia martwych komórek, takich jak Annnexin V, TUNEL lub barwienie pomarańczą akrydynową/jodkiem propidyny3,4,5. Metody te nie są jednak w stanie rzucić światła na dynamiczny proces śmierci komórki in vivo. Obserwacja śmierci komórek in vitro została już ułatwiona dzięki obrazowaniu na żywo6. Jednak to, czy wyniki dokładnie naśladują warunki fizjologiczne, pozostaje niejasne.

Danio pręgowany był doskonałym modelem do badania reakcji antyprątkowych gospodarza. Ma wysoce konserwatywny układ odpornościowy podobny do ludzkiego, łatwy do manipulowania genom, a wczesne zarodki są przezroczyste, co pozwala na obrazowanie na żywo7,8,9. Po zakażeniu M. marinum dorosłe rybo pręgowany tworzą typowe dojrzałe struktury ziarniniaka, a embrionalny danio pręgowany tworzy wczesne struktury podobne do ziarniniaka9,10. Dynamiczny proces interakcji między komórkami odpornościowymi a bakteriami został już wcześniej zbadany w modelu zakażenia danio pręgowanego M. marinum11,12. Jednak ze względu na wysokie wymagania dotyczące rozdzielczości przestrzenno-czasowej, szczegóły dotyczące śmierci wrodzonych komórek odpornościowych pozostają w dużej mierze nieokreślone.

Tutaj opisujemy, jak zobrazować proces śmierci komórek litycznych makrofagów wywołany infekcją mykobakteryjną in vivo. Protokół ten może być również stosowany do wizualizacji zachowania komórek in vivo podczas rozwoju i stanu zapalnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany były hodowane w standardowych warunkach, zgodnie z wytycznymi dla zwierząt laboratoryjnych dotyczących etycznego przeglądu dobrostanu zwierząt (GB/T 35823-2018). Wszystkie eksperymenty z danio pręgowanym w tym badaniu zostały zatwierdzone (2019-A016-01) i przeprowadzone w Centrum Klinicznym Zdrowia Publicznego w Szanghaju, Uniwersytet Fudan.

1. M. marinum Preparat inokulum jednokomórkowego (Rysunek 1)

  1. Rozmrozić cykulańsko-fluorescencyjny bulion glicerolu M. marinum w temperaturze -80 °C i zaszczepić płytkę agarową 7H10 10% (v/v) OADC, 0,25% glicerolu i 50 μg/ml higromycyny. Inkubować płytkę w temperaturze 32 °C przez około 10 dni.
  2. Wybierz kolonię wykazującą dodatnią fluorescencję i zaszczep 3 ml pożywki 7H9 10% OADC, 0,5% glicerolu i 50 μg/ml higromycyny.
    1. Inkubować inokulację w temperaturze 32 °C i 100 obrotach na minutę (obr./min) przez 4–6 dni, aż kultura osiągnie fazę logarytmiczną (OD600 = 0,6–1,0).
    2. Subkultura (1:100) w 30 ml świeżej pożywki 7H9 z 10% OADC, 0,5% glicerolu, 0,05% Tween-80 i 50 μg/ml, aż OD600 osiągnie ~1,0,
      UWAGA: Aby uzyskać najwyższą jakość kultury, na tym etapie zalecany jest etap subkultury. Z naszego doświadczenia wynika, że dodanie klonu bezpośrednio do dużej objętości podłoża doprowadzi do powstania grudek bakteryjnych.
  3. Zbierz komórki M. marinum zgodnie z poniższym opisem.
    1. Wirować przy 3 000 x g przez 10 minut, aby zebrać M. marinum w postaci granulatu. Wyrzucić wszystko, z wyjątkiem 300 μl supernatantu i użyć go do ponownego wymieszania osadu.
    2. Dodać 3 ml pożywki 7H9 z 10% glicerolem w celu dalszego zawieszenia osadu, a następnie sonikować zawiesinę w łaźni wodnej o mocy 100 W przez 15 s ON, 15 s OFF, w sumie 2 min.
      UWAGA: Celem sonikacji jest uzyskanie jednorodności pojedynczej komórki dla inokulum, co zapobiegnie zablokowaniu igły do mikroiniekcji.
  4. Przenieś zawiesinę bakteryjną do strzykawki o pojemności 10 ml, a następnie przepuść przez filtr 5 μm w celu usunięcia wszelkich grudek bakteryjnych.
  5. Zmierzyć gęstość optyczną (OD) zawiesiny za pomocą spektrofotometru i rozcieńczyć ją do OD600 = 1,0 za pomocą pożywki 7H9 zawierającej 10% glicerolu. Podzielić zawiesinę na 10 μl porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C w zamrażarce do wykorzystania w przyszłości.
  6. Potwierdzić stężenie bakteryjne inokulum (jtk/ml) przez seryjne rozcieńczanie i posiewanie materiału bakteryjnego na płytce agarowej 7H10 zawierającej 10% (v/v) OADC, 0,5% glicerolu i 50 μg/ml higromycyny.

2. Przygotowanie zarodków danio pręgowanego

  1. Na dzień przed tarłem należy ustawić pary lęgowe danio pręgowanego w komorze hodowlanej.
    UWAGA: Dodaj tylko jedną parę do każdej komory hodowlanej.
  2. Zbierz zarodki następnego ranka w ciągu 1 godziny po zapłodnieniu (hpf). Ostrożnie umyć zarodki wodą destylowaną i przenieść do 100 zarodków na 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 30 ml pożywki E3. Inkubować w temperaturze 28,5 °C.
  3. Po 12 godzinach obserwuj pod mikroskopem i wyrzuć niezapłodnione lub uszkodzone jaja.
  4. Przy 24 hpf zmień pożywkę na świeżą pożywkę E3 z N-fenylotiomocznikiem (PTU, stężenie końcowe 0,2 nM), aby zapobiec rozwojowi pigmentu. Inkubować zarodki w temperaturze 28,5 °C, aż zarodki będą gotowe do mikroiniekcji.

3. Zakażenie za pomocą mikroiniekcji bakteryjnej

  1. Przygotować igły do iniekcji mikrokapilarnych ze szkła borokrzemianowego zgodnie z wcześniejszym opisem w reference13.
  2. Zarodki danio pręgowanego montowane w celu zakażenia
    1. Mikrofale 100 ml 1% (w/v) i 100 ml 0,5% (w/v) niskotopliwej agarozy w autoklawowanym podłożu E3, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Podzielić na 1 ml podwielokrotnych probówek i przechowywać w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości.
    2. Przed użyciem podgrzej agarozę w bloku grzewczym o temperaturze 95 °C, aż całkowicie się rozpuści. Utrzymuj agarozę w postaci płynnej, umieszczając ją w bloku grzewczym o temperaturze 45 °C (Rysunek 2).
    3. Montaż do infekcji śródmięśniowej w okolicy tułowia
      1. Stwórz dolną warstwę agarozy, wylewając równomiernie 0,5 ml 1% (w/v) agarozy na szklane szkiełko. Umieść na pojemniku na lód lub zimnej powierzchni na 3 minuty do zestalenia.
      2. Znieczulenie zarodków danio pręgowanego (48–72 hpf) w wodzie z jajami z trikainą (200 μg/ml) i PTU przez 5 minut przed montażem. Umieść do 60 zarodków danio pręgowanego na dolnej warstwie agarozy i ułóż je ostrożnie w dwóch rzędach (Rysunek 2B).
      3. Usuń pozostałą wodę z dolnej warstwy agarozy bibułką przed dodaniem 0,3 ml 0,5% (w/v) agarozy, aby utworzyć górną warstwę. Upewnij się, że zarodki są całkowicie osadzone w agarozie. Ponownie włóż szklane szkiełko do pojemnika na lód, aby zestalić agarozę i zapobiec odwodnieniu.
      4. Utrzymuj górną warstwę agarozy wilgotną, pokrywając powierzchnię dodatkową wodą jajeczną E3.
    4. Montaż w przypadku infekcji śródmózgowia
      1. Przykryj rowek pojedynczego szkiełka mikroskopowego ze szkła wklęsłego 1% (w/v) agarozy, a następnie przenieś 4-6 znieczulonych trikainą zarodków do agarozy.
      2. Ostrożnie ustaw głowę każdego zarodka do góry za pomocą igły 10 G (Rysunek 2C).
      3. Gdy pozycje wszystkich zarodków zostaną ustalone, przenieś szklane szkiełko do pojemnika na lód lub zimnej powierzchni, aby agaroza zastygła.
        UWAGA: Unikaj rozcieńczania agarozy o niskiej temperaturze topnienia, minimalizując objętość transferu wody jajowej z zarodkami.
  3. Preparat bakteryjny na infekcję
    1. Dodać 1 μl sterylnie przefiltrowanej czerwieni fenolowej (10x) do 10 μl podwielokrotności bulionu bakteryjnego (przygotowanego w kroku 1) i wymieszać przez krótkie wirowanie.
      UWAGA: Końcowe stężenie można dostosować za pomocą sterylnego PBS.
    2. Sonikuj preparat za pomocą 100 W przez 10 s ON, 10 s OFF przez 1 min, aby rozbić wszelkie grudki, które mogły się utworzyć14.
  4. Zakażenie za pomocą mikroiniekcji
    1. Ustaw mikrowtryskiwacz i mikromanipulator we właściwej pozycji i ustawieniu do mikroiniekcji, jak wcześniej raportowano13.
    2. Przenieść 3 μl preparatu bakteryjnego za pomocą mikroładowarki do przygotowanej igły (patrz krok 3.1). Pipetować powoli i ostrożnie, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza.
    3. W przypadku infekcji okolicy tułowia wstrzyknij 100 jtk w obszar tułowia (Rysunek 3A). Unikaj wstrzykiwania bakterii do struny grzbietowej.
      UWAGA: Jtk do wstrzykiwań szacuje się według wzoru cfu = stężenie podstawowe bakterii x współczynnik rozcieńczenia x objętość kropli iniekcji. Rzeczywisty jtk potwierdza się przez posiew jednej kropli inokulum bakteryjnego na płytce agarowej 7H10 zawierającej 10% (v/v) OADC, 0,5% glicerolu i 50 μg/ml higromycyny.
    4. W przypadku infekcji śródmózgowia wstrzyknij około 500 jtk w obszar śródmózgowia (Ryc. 3B).
    5. Po mikroiniekcji ostrożnie przepłucz zarodki danio pręgowanego do świeżej wody z jaj za pomocą plastikowej pipety.
      UWAGA: Zamontuj zarodki w naczyniu ze szklanym dnem tak szybko, jak to możliwe, aby zakryć obserwację bardzo wczesnej wrodzonej odpowiedzi komórek odpornościowych.

4. Obrazowanie infekcji na żywo

  1. Montowanie ryb do obrazowania na żywo
    1. Przenieś do 10 zarodków znieczulonych trikainą na środek naczynia o szklanym dnie 35 mm. Wyrzuć dodatkowe podłoże E3.
    2. Przykryj naczynie 1% agarozą o niskiej temperaturze topnienia i ostrożnie ustaw zarodki danio pręgowanego za pomocą igły 10 G. Inkubować naczynie ze szklanym dnem na lodzie przez 10 sekund, aby zestalić agarozę.
      UWAGA: W przypadku iniekcji śródmózgowia zarodki powinny być osadzone w agarozie z głową skierowaną do góry (Rysunek 4A). W przypadku zakażenia śródmięśniowego okolicy tułowia zarodki powinny być zamontowane bocznie w agarozie (Ryc. 4B).
    3. Po całkowitym zastygnięciu agaroza zalej warstwą wody jajecznej (plus 1 x trikaina i PTU).
  2. Trójkolorowa mikroskopia konfokalna poklatkowa o wysokiej rozdzielczości
    UWAGA: Poniższe kroki są wykonywane na mikroskopii konfokalnej wyposażonej w soczewkę obiektywową UV 63.0x 1.40 oil.
    1. Ustaw temperaturę komory środowiskowej na 28,5 °C. Umieść mokrą bibułkę w komorze, aby zapewnić wilgotność i zapobiec parowaniu wody z jaja (rysunek uzupełniający 1).
    2. Umieść naczynie ze szklanym dnem o średnicy 35 mm z danio pręgowanym w komorze środowiskowej.
    3. Otwórz oprogramowanie konfokalne i zainicjuj stolik. Przełącz się na obiektyw UV o wymiarach 63,0 x 1,40 i zlokalizuj danio pręgowanego za pomocą kanału jasnego pola z filtrem kontrastu różnicowego (DIC).
    4. Otwórz diodę 405, argon (20% mocy) i laser DPSS 561 nm. Ustaw odpowiednie ustawienia mocy i widma lasera.
      UWAGA: Poniżej przedstawiono ustawienia widma dla Cerulean (wzbudzenie = 405 nm; emisja = ~456–499 nm), eGFP (wzbudzenie = 488 nm; emisja = ~500–550 nm), DsRed2 (wzbudzenie = 561 nm; emisja = ~575–645 nm) (Rysunek uzupełniający 2B).
    5. Wybierz tryb akwizycji "XYZ" "Skanowanie sekwencyjne" i ustaw format obrazów na "512 x 512 pikseli" (rysunek uzupełniający 2A).
    6. Przełącz na "Tryb danych na żywo". Wyceluj w pozycję pierwszego danio pręgowanego i zaznacz pozycję Z "Początek" i "Koniec". Powtórz ten proces dla każdego z pozostałych zarodków. Na końcu programu można dodać "Pauzę" (rysunek uzupełniający 2C).
    7. Zdefiniuj pętlę i cykl programu.
    8. Zapisz plik.

5. Promieniowanie UV pojedynczych komórek w celu wywołania apoptozy i obrazowania na żywo

  1. Zamontuj rybę zgodnie z opisem w kroku 4.1.
  2. Obrazowanie obszaru śródmózgowia 3 dni po zapłodnieniu (dpf) transgeniczny transgeniczny Tg(mfap4-eGFP) swoisty dla makrofagów zarodek15
  3. Wybierz obszar zainteresowania jednego pojedynczego fluorescencyjnie znakowanego makrofaga i skanuj z prędkością 400 Hz i mocą lasera UV 6% przez 50 s.
    UWAGA: Szybkość i czas skanowania powinny być zoptymalizowane w zależności od indywidualnego mikroskopu. Czas skanowania powinien być zoptymalizowany, aby spowodować rozległe uszkodzenia DNA, które następnie spowodują apoptozę komórki docelowej, ale nie fotowybielają całej komórki.
  4. Powtórz powyższy krok, aby napromieniować więcej komórek docelowych.
  5. Wykonać obrazowanie poklatkowe obszaru śródmózgowia zgodnie z opisem w punkcie 4.

6. Przetwarzanie obrazu

  1. Wykonaj "Projekcję maksymalną" dla uzyskanych obrazów.
  2. Znajdź i zaznacz pozycję XY i czas komórek docelowych w widoku "Projekcja maksymalna".
  3. Wróć do widoku standardowego, aby znaleźć i zaznaczyć pozycję Z komórek docelowych.
  4. Przytnij jednowarstwowy obraz komórek docelowych.
  5. Eksportuj kanał nakładki i jasne pole jako filmy w formacie AVI.
  6. Przytnij obszar zainteresowania kanału nakładki i jasnego pola w obrazie ImageJ.
  7. Połącz dwa filmy w ostatnim kroku w pionie i zapisz jako jedno wideo w formacie AVI w ImageJ.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakażenie prątkami może wywołać różne reakcje gospodarza w zależności od drogi infekcji. W tym protokole zarodki danio pręgowanego są zakażone przez domięśniowe mikrowstrzyknięcie fluorescencyjnie znakowanych bakterii do śródmózgowia lub tułowia (Ryc. 3) i obserwowane za pomocą konfokalnego obrazowania na żywo. Zakażenie tymi dwiema drogami lokalnie ograniczy infekcję, powodując wrodzoną rekrutację komórek odpornościowych, a następnie śmierć komórki.

Wizualizacja sz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje wizualizację śmierci makrofagów podczas infekcji prątkami. W oparciu o takie czynniki, jak integralność błony komórkowej, śmierć komórki spowodowaną infekcją można podzielić na apoptozę i śmierć komórki lityczną24,25. Śmierć komórek litycznych jest bardziej stresująca dla organizmu niż apoptoza, ponieważ wywołuje silną reakcję zapalną 24,25. Obserwacja śmierci komórek litycznych in vi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Zilong Wen za podzielenie się szczepami danio pręgowanego, Dr. Stefanowi Oehlersowi i Dr. Davidowi Tobinowi za podzielenie się zasobami związanymi z M. marinum, Yuepeng He za pomoc w przygotowaniu figury. Praca ta była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81801977) (B.Y.), Wybitny Program Szkolenia Młodzieży Miejskiej Komisji Zdrowia w Szanghaju (2018YQ54) (B.Y.), Shanghai Sailing Program (18YF1420400) (B.Y.) oraz Open Fund of Shanghai Key Laboratory of Tuberculosis (2018KF02) (B.Y.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% Stostrzykawka Tween-80SigmaP1379
10 mlSolarbioYA0552
10% OADCBD211886
kwas 3-aminobenzoesowySigmaE10521
5 μ m filtrMille XSLSV025LS
50 μ l/ml higromycynySangon BiotechA600230
7H10BD262710
7H9BD262310
Szklana dna 35 mm miskaIn Vitro ScientificD35-10-0-N
AgarozaSangon BiotechA60015
Mikroskop konfokalnyLeicaTCS SP5 II
Komora środowiskowaPecontemp control 37-2 cyfrowy
mikroładowarkaEppendorf EppendorfNo.5242956003
Szkiełko mikroskopoweBioland Scientific LLC7105P
A100854glicerolSangon Biotech
KeelreinPH-140(A)
M.marinumATCC BAA-535
Igła do mikroiniekcjiWorld Precision InstrumentsIB100F-4
MikrowtryskiwaczEppendorfFemtojet
MikromanipulatorNARISHIGEMN-151
msp12: ceruleanRef.: PMID 25470057; 27760340
Czerwień fenolowaSigmaP3532
PTUSigmaP7629
Szkiełko mikroskopowe z pojedynczą wklęsłościąMarkażagla 7103
SonicatorSCICNTZJY92-IIDN
Spektrofotometr (OD600)Eppendorf AG22331 Hamburski
mikroskop stereoskopowyOLYMPUSSZX10
Tg(mfap4:eGFP)Ref.: PMID 30742890
Tg(coro1a:eGFP; lyzDsRed2)Ref.: PMID 31278008
Tg(mpeg1:LRLG; lyz:eGFP)Ref.: PMID 27424497; 17477879
Inkubator

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).
  2. Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Manipulation of host cell death pathways during microbial infections. Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).
  3. Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).
  4. Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).
  5. Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).
  6. Rathkey, J. K., et al. Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death. Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).
  7. Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).
  8. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).
  9. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
  10. Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).
  11. Clay, H., et al. Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish. Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).
  12. Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  13. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781(2012).
  14. Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis. Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).
  15. Wang, Z., et al. Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae. Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).
  16. Wang, T., et al. Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish. Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).
  17. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42(2007).
  18. Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine. Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).
  19. Oehlers, S. H., et al. Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth. Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).
  20. Kulms, D., Schwarz, T. Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis. Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).
  21. van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).
  22. Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
  23. Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z. Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (8), 2778-2783 (2005).
  24. Ashida, H., et al. Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival. Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).
  25. Traven, A., Naderer, T. Microbial egress: a hitchhiker's guide to freedom. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

mier kom rek makrofag wmikroskopia konfokalnalinie transgenicznebakterie fluorescencyjneiniekcja domi niowaustawienia mocy laserasekwencyjne skanowanie XYZ

Powiązane artykuły