Method Article

W pełni przetworzony rekombinowany KRAS4b: izoluje i charakteryzuje białko farnezylowane i metylowane

DOI:

10.3791/60703

⸱

January 16th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NCI RAS Initiative, Cancer Research Technology Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prenylacja jest ważną modyfikacją białek wiążących błony obwodowe. Komórkami owadów można manipulować w celu wytworzenia farnezylowanego i karboksymetylowanego KRAS4b w ilościach umożliwiających biofizyczne pomiary interakcji białko-białko i białko-lipid

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prenylacja białek jest kluczową modyfikacją, która jest odpowiedzialna za kierowanie białek do błon wewnątrzkomórkowych. KRAS4b, który jest zmutowany w 22% nowotworów u ludzi, jest przetwarzany przez farnezylację i karboksymetylację ze względu na obecność motywu pudełka "CAAX" na C-końcu. Zmodyfikowany system bakulowirusa został wykorzystany do ekspresji farnezylowanego i karboksymetylowanego KRAS4b w komórkach owadów i został opisany wcześniej. W tym miejscu opisujemy szczegółowe, praktyczne oczyszczanie i charakterystykę biochemiczną białka. W szczególności zastosowano chromatografię powinowactwa i wymiany jonowej, aby oczyścić białko do jednorodności. Nienaruszona i natywna spektrometria mas została wykorzystana do walidacji poprawności modyfikacji KRAS4b i weryfikacji wiązania nukleotydów. Na koniec zmierzono asocjację błonową farnezylowanego i karboksymetylowanego KRAS4b z liposomami za pomocą spektroskopii powierzchniowego rezonansu plazmonowego.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modyfikacje potranslacyjne odgrywają kluczową rolę w definiowaniu funkcjonalnej aktywności białek. Modyfikacje, takie jak fosforylacja i glikozylacja, są dobrze znane. Modyfikacje lipidów są jednak gorzej scharakteryzowane. Szacuje się, że aż 0,5% wszystkich białek komórkowych może być prenylowanych1. Prenylacja to przeniesienie 15-węglowego farnezylu lub 20-węglowego łańcucha lipidowego geranylgeranylu do białka akceptorowego zawierającego motyw CAAX2. Prenylowane białka są zaangażowane w progresję wielu chorób ludzkich, w tym przedwczesnego starzenia się3, Alzheimer's4, dysfunkcja serca5, choroideremia6, oraz cancer7. Małe GTPazy, HRAS, NRAS i KRAS1, laminy jądrowe i kinetochory CENP-E i F są białkami farnezylowanymi w stanie podstawowym. Inne małe GTPazy, a mianowicie RhoA, RhoC, Rac1, cdc-42 i RRAS to geranylgeranylated8, podczas gdy RhoB może być farnezylowany lub geranylgeranylated9.

Mała GTPaza KRAS4b działa jak przełącznik molekularny, zasadniczo przekazując sygnał zewnątrzkomórkowy czynnikowi wzrostu do wewnątrzkomórkowych szlaków transdukcji sygnału, które stymulują wzrost i proliferację komórek, poprzez wiele interakcji białko-białko. Istnieją dwa kluczowe aspekty biochemii KRAS4b, które są niezbędne dla jego aktywności. Po pierwsze, białko przechodzi cyklicznie między nieaktywnym GDP a aktywnym stanem związanym z GTP, w którym aktywnie angażuje się w efektory. Po drugie, C-końcowy region polilizyny oraz farnezylowana i karboksymetylowana cysteina kierują białko do błony plazmatycznej, umożliwiając rekrutację i aktywację dalszych efektorów. Zmutowany KRAS4b jest onkogennym czynnikiem powodującym raka trzustki, jelita grubego i płuc10, a zatem interwencja terapeutyczna przyniosłaby ogromne korzyści kliniczne. Produkcja autentycznie zmodyfikowanego białka rekombinowanego, które jest farnezylowane i karboksymetylowane, umożliwiłoby biochemiczne badania przesiewowe przy użyciu KRAS4b w połączeniu z substytutami błony, takimi jak liposomy lub nanodyski lipidowe11,12.

Transferaza farnezylowa (FNT) katalizuje dodanie pirofosforanu farnezylu do C-końcowej cysteiny w motywie CAAX w KRAS4b. Po prenylacji białko jest transportowane do retikulum endoplazmatycznego (ER), gdzie enzym konwertujący Ras (RCE1) rozszczepia trzy reszty C-końcowe. Ostatnim etapem przetwarzania jest metylacja nowej C-końcowej reszty farnezylocysteiny przez białko błonowe ER, metylotransferazę karboksylową izoprenylocysteiny (ICMT). Ekspresja rekombinowanego KRAS4b w E. coli powoduje produkcję niemodyfikowanego białka. Wcześniejsze próby wytworzenia przetworzonego KRAS4b były ograniczone ze względu na niewystarczającą wydajność dla strukturalnych lub przesiewowych badań przesiewowych leków lub nie udało się podsumować natywnego dojrzałego białka o pełnej długości13,14. Przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje zmodyfikowany system ekspresji komórek owadów oparty na bakulowirusie i metodę oczyszczania, która generuje wysoce oczyszczony, w pełni przetworzony KRAS4b przy wydajności 5 mg / L hodowli komórkowej.

Staranna charakterystyka białek jest niezbędna do sprawdzenia jakości rekombinowanych białek przed rozpoczęciem badań z zakresu biologii strukturalnej lub badań przesiewowych leków. Dwa kluczowe parametry w pełni przetworzonego KRAS4b to walidacja prawidłowej modyfikacji prenylu oraz dostępność farnezylowanego i karboksymetylowanego C-końca (FMe) do interakcji z substytutami błonowymi lub lipidami. Spektrometria mas z jonizacją elektronrozpylającą (ESI-MS) KRAS4b-FMe została wykorzystana do pomiaru masy cząsteczkowej i potwierdzenia obecności modyfikacji farnezylu i karboksymetylu. Natywna spektrometria mas, w której próbki są spryskiwane rozpuszczalnikami niedenaturującymi, została wykorzystana do wykazania, że KRAS4b-FMe był również związany ze swoim kofaktorem GDP. Na koniec wykorzystano spektroskopię powierzchniowego rezonansu plazmonowego do pomiaru bezpośredniego wiązania KRAS4b-FMe z unieruchomionymi liposomami.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Oczyszczanie białka

  1. Przygotować A–H, jak pokazano w Tabeli 1.
szt. szt. Rozdział szt. szt. szt. szt. szt. szt.
Roztwór buforowyŚrodek buforujący (wszystkie 20 mM)pHNaCl (mM)imidazol (mM)MgCl2TCEP
ZAHEPESY7,3300-51
WHEPESY7,33003551
ZHEPESY7,330050051
DMes6,0200-51
EMes6,0--51
ZMes6,0100-51
ZMes6,01000-51
HHEPESY7,3300-11
  1. Przygotować materiały oczyszczające (patrz tabela materiałów): koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA i innych chelatorów; kolumna do chromatografii z immobilizowanym powinowactwem do metali (IMAC); kolumna do chromatografii kationowymiennej (CEX); filtr strzykawkowy 0,45 μm; 2 M imidazol (pH = 7,5); ultrawirówka o wydajności 100 000 x g; wirówka stołowa o dużej prędkości 4 000 x g; odśrodkowe jednostki filtracyjne (10 KDa NMWL); spektrofotometr zdolny do odczytu przy długości fali 280 nm; Proteaza wirusa wytrawiania tytoniu (TEV) his6-tobacco etch virus; oraz oprzyrządowanie chromatograficzne zdolne do mieszania dwóch roztworów buforowych, nakładania roztworów na kolumny, tworzenia elucji gradientowych z kolumny i zbierania frakcji z kolumn.
  2. Rozmrozić komórki z ~2 litrów hodowli komórek owadów przechowywanej wcześniej w temperaturze -80 °C lub użyć świeżo zebranych komórek. Zobacz Gillette et al. 201915, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat linii komórkowej owadów Tni.FNL i protokołów ekspresji. Ostrożnie ponownie zawiesić komórki za pomocą 200 ml buforu A z dodatkiem inhibitora proteazy 1:200 v/v bez wprowadzania powietrza lub tworzenia piany.
    UWAGA: Krok 1.3 i kolejne kroki (z wyjątkiem zaznaczonych) należy wykonywać w temperaturze pokojowej (~22 °C). Ważne jest, aby próbka była jednorodna, aby umożliwić całkowitą lizę w następnym etapie.
  3. Lizuj osady komórkowe w mikrofluidyzatorze przy ciśnieniu 7,000 psi przez dwa przejścia lub w równoważnym systemie lizy. Alternatywne metody lizy nie zostały zbadane.
  4. Klarowanie lizatów komórek owadów jest problematyczne ze względu na obecność związków, które zatykają filtry. Dlatego bardzo ważne jest ultrawirowanie (100 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C). Należy unikać tworzenia się białych pozostałości lipidowych na powierzchni supernatantu i można je usunąć lub zredukować za pomocą wacików. Przefiltrować zdekantowany supernatant przez filtr PES 0,45 μm. Oczyszczoną próbkę należy zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Pozostałości szybko blokują filtry i może być potrzebnych wiele filtrów. Brak zmniejszenia ilości tego materiału doprowadzi do wysokiego ciśnienia wstecznego kolumny w kolejnych krokach.
  5. Oznaczyć objętość oczyszczonego lizatu i dostosować próbkę do 35 mM imidazolu przez dodanie 2 M imidazolu podstawowego. Załadować próbkę z prędkością 3 ml/min do kolumny IMAC o pojemności 20 ml (kolumna HisPrep FF 16/10) wstępnie zrównoważonej w buforze B dla objętości trzech kolumn (CV).
  6. Chociaż białko docelowe jest zazwyczaj ilościowo adsorbowane w kolumnie, najlepiej jest zebrać przepływ w kolumnie do późniejszej analizy. Przemyć kolumnę, aż Abs280 osiągnie stałą linię podstawową (<100 jednostek miliabsorbancji [mAU]) buforem B o stężeniu 3 ml / min przez 20 ml (1 CV), a następnie przez ~ 3 CV przy 4 ml / min przez pozostałą część etapu płukania. Zazwyczaj do osiągnięcia absorbancji wyjściowej potrzeba 60–80 ml buforu B.
  7. Eluować białko o gradiencie 400 ml (20 CV) od buforu B do buforu C, zbierając frakcje 8 ml. Zazwyczaj białko docelowe eluuje w pierwszej połowie gradientu (Rysunek 1A; nie wszystkie późniejsze frakcje są pokazane).
  8. Analizuj frakcje białkowe za pomocą barwienia SDS-PAGE/Coomassie. Puluj frakcje szczytowe i dializa basenu przez noc w stosunku do 2 l buforu D w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Niskie pH ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia wiązania białek w następnym kroku. Jednak zmiana pH podczas tej dializy zachodzi powoli i jest to wygodny etap inkubacji przez noc. Nie badano alternatywnych strategii wymiany buforu (np. wyższe stężenie buforu w celu przyspieszenia zmiany pH). Białko zacznie powoli wytrącać się z czasem przy niższym pH i niższych stężeniach soli, a niewielka ilość wytrącania jest normalna na tym etapie. Z tego powodu unikamy wymiany buforu na 100 mM NaCl niezbędny do wiązania się z następną kolumną podczas dializy. Do dializy stosuje się stężenie NaCl wynoszące 200 mM, a białko rozcieńcza się do 100 mM (patrz poniżej) bezpośrednio przed nałożeniem na kolumnę. Nie badaliśmy, czy to wytrącanie jest specyficzne dla KRAS4b, ale białko, które się wytrąca, zostało potwierdzone jako KRAS4b-FMe. Z tego powodu sugerujemy stosowanie wyższego stężenia NaCl w buforze dializacyjnym dla każdego białka będącego przedmiotem zainteresowania jako środek ostrożności do czasu określenia stabilności białka docelowego w buforze wiążącym.
  9. Usunąć próbkę z dializy i odwirować przy 4 000 x g przez 10 minut w celu usunięcia osadu. Końcowa dializowana, oczyszczona próbka w tym momencie jest nadal często mętna, ale może być naniesiona bez dalszej obróbki na kolejną kolumnę CEX.
  10. Przygotować kolumnę kationitową o pojemności 20 ml (patrz tabela materiałów), przemłukując trzema CV buforu G, a następnie trzema CV buforu F.
    UWAGA: Chociaż nie oceniliśmy skrupulatnie innych żywic, kilku kolegów stwierdziło słabą rozdzielczość żywic innych niż żywica SP Sepharose High Performance.
  11. Rozcieńczyć 20 ml dializowanej próbki do końcowego stężenia NaCl wynoszącego 100 mM przez dodanie 20 ml buforu E i nanieść rozcieńczoną próbkę do kolumny kationitowej.
  12. Kontynuować ładowanie kolumny, dodając świeżo rozcieńczone próbki przygotowane w sposób opisany powyżej do rurki obciążeniowej, ponieważ poprzednie rozcieńczenie zbliża się do końca wsadu.
    UWAGA: Rozcieńczenie całej próbki jednorazowo do 100 mM NaCl spowodowało znaczną utratę białka docelowego w wyniku wytrącania się.
  13. Przemyć kolumnę do wartości podstawowej Abs280 za pomocą buforu F. Zazwyczaj wymaga to 3 CV. Białko jest eluowane z kolumny podczas gradientu 400 ml (20 CV) od buforu F do 65% buforu G, zebranego we frakcjach 6 ml (Rysunek 1B).
  14. Kontynuuj mycie kolumny przez dodatkowe 1,5 CV (65% buforu G) po zakończeniu gradientu. Frakcje dodatnie należy wybierać zarówno na podstawie analizy niebieskiego barwnika SDS-PAGE/Coomassie, jak i kontroli śladu UV chromatogramu.
    UWAGA: Ślad UV zazwyczaj zawiera pięć pików. Zaczynając od niższych stężeń soli, początkowy pik to zwykle nieprzetworzone i/lub proteolizowane białko. Drugi i trzeci pik są mieszaniną dwóch form przetworzonego białka: drugi pik jest przede wszystkim farnezylowanym półproduktem (FARN), podczas gdy trzeci to przede wszystkim w pełni przetworzone białko FMe, które jest przedmiotem zainteresowania. Piki czwarty i piąty reprezentują białka fuzyjne His6-MBP-KRAS4b (całe białko jest w tym momencie w tym formacie, ponieważ nie zaszło trawienie TEV). Nie są one N-acetylowane na N-końcu i są farnezylowane (pik czwarty) oraz farnezylowane i karboksymetylowane (pik piąty) na C-końcu. Ponieważ pik drugi i pik czwarty będą wytwarzać identyczne białka po usunięciu znacznika (tj. KRAS4b-FARN), w razie potrzeby można je połączyć na tym etapie. Podobnie, pik trzeci i pik piąty można połączyć, aby uzyskać pojedynczą partię KRAS4b-FMe (Rysunek 1B, Rysunek 2). Zaleca się jednak, aby to łączenie odbywało się tylko wtedy, gdy potwierdzono charakter białka w oddzielnych pikach.
  15. Trawić białko zebrane w kroku 1.15 z proteazą His6-TEV (~200 μg proteazy/ml próbki.
    UWAGA: Proteazę His6-TEV tworzymy przy użyciu plazmidu i protokołów dostępnych w Addgene (https://www.addgene.org/92414). Metabolizowanie TEV w stosunku do buforu A (rurka dializująca MWCO o masie 10 kDa z co najmniej 40 ml buforu A na ml próbki) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie przez noc w temperaturze 4 °C.
  16. Po trawieniu i dializie załadować białko bezpośrednio do kolumny IMAC o pojemności 20 ml zrównoważonej buforem A w ilości 3 ml/min.
    UWAGA: Zbierz 7 ml frakcji podczas całej tej chromatografii, ponieważ białko docelowe ma niskie powinowactwo do kolumny, ale może nie być całkowicie związane z żywicą. Przemywać kolumnę z prędkością 3 ml/min buforem A, w sumie 3 CV lub do momentu osiągnięcia absorbancji wyjściowej.
  17. Białko docelowe jest eluowane za pomocą gradientu 5 CV buforu C od 0% do 10%, zbierając frakcje 7 ml. Na wszelki wypadek, dodatkowe związane białka można eluować za pomocą 100% buforu C. Frakcje dodatnie są identyfikowane po analizie za pomocą SDS-PAGE (Rysunek 1C). Zazwyczaj białko docelowe eluuje przy niskim stężeniu imidazolu (tj. w gradiencie buforu C 0%–10%), ale czasami eluuje w przepływie lub płukaniu kolumnowym.
  18. Przeprowadzić dializę końcowej puli w stosunku do buforu H. Oznaczyć stężenie białka za pomocą spektrofotometrii przy 280 nm.
    UWAGA: Pamiętaj, aby uwzględnić obecność nukleotydu przy określaniu współczynnika ekstynkcji, który ma być użyty do tego obliczenia.
  19. Białko można zagęścić do ~2–5 mg/ml za pomocą filtra odśrodkowego (10 K NMWL) bez znacznej utraty białka. Filtr z filtrem strzykawkowym 0,22 μM. Zmierz absorbancję roztworu w A280, aby obliczyć końcowe stężenie białka (Rysunek 1D). Szybkie zamrażanie podwielokrotności w ciekłym azocie i przechowywanie zamrożonych próbek w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Oczyszczone białko jest związane z GDP. KRAS4b-FMe może być zamieniony na GppNHp przy użyciu wcześniej opublikowanych protokołów16.

2. Przygotowanie próbki do analizy masy w stanie nienaruszonym i analizy masy natywnej

  1. Przygotowanie próbki do analizy masy nienaruszonej
    1. Rozmrozić próbkę białka na lodzie przed analizą. W celu analizy masy w stanie nienaruszonym rozcieńczyć białko do 0,1 mg/ml w 20 mM wodorowęglanie amonu (pH = ~8,4). W celu analizy masy natywnej rozcieńczyć białko do stężenia 0,1 mg/ml w 50 mM octanie amonu (pH = ~7,5). Wirować każdą próbkę przez 5–10 s, a następnie odwirować przy 12 500 x g przez 1 minutę, aby osadzać dowolny materiał stały w roztworze. Usunąć 10–20 μl każdego supernatantu i przenieść do szklanej fiolki z automatycznym podajnikiem próbek. Każdą fiolkę szczelnie zakryć, aby zapobiec zanieczyszczeniu lub parowaniu.
      UWAGA: W przypadku analizy masy nienaruszonej lub analizy masy natywnej, próbka może być odsalona przed analizą przy użyciu filtra membranowego z celulozy MWCO o mocy 10 kDa w celu wymiany buforowej do końcowego buforu rozcieńczającego.
  2. Przygotowanie spektroskopii mas w rozszerzonym zakresie mas (EMR) do analizy mas
    UWAGA: Przed przeprowadzeniem jakiejkolwiek analizy na spektrometrze mas upewnij się, że został on niedawno skalibrowany. Ponadto w razie potrzeby należy zawsze nosić rękawice i inne środki ochrony osobistej, aby uniknąć szkodliwych chemikaliów i uniknąć zanieczyszczenia próbek i rozpuszczalników. Kalibrację przeprowadza się przy użyciu roztworu kalibracyjnego uzyskanego komercyjnie i roztworu jodku cezu o stężeniu 2 mg/ml przygotowanego we własnym zakresie.
    1. Otwórz oprogramowanie analityczne i załaduj odpowiedni plik metody przyrządowej. Dla nienaruszonej analizy masy białek KRAS4b odpowiednie parametry wyjściowe są następujące: dodatni tryb wykrywania; trzy mikroskany, rozdzielczość = 70 000; Cel AGC = 3e6; maksymalny czas integracji = 200 ms; i zakres skanowania = 70–1 800 stosunek masy do ładunku (m/z). Dla natywnej analizy masy białek KRAS4b odpowiednie parametry wyjściowe są następujące: dodatni tryb detekcji; 10 mikroskanów, rozdzielczość = 17 500; dysocjacja wywołana zderzeniem w źródle (CID) = 20 eV; Cel AGC = 3e6; energia zderzenia (CE) = 20; maksymalny czas integracji = 200 ms; i zakres skanowania = 500–10 000 m/z.
  3. Przygotowanie rozpuszczalników chromatograficznych i kolumny
    1. Przygotować rozpuszczalniki niezbędne do analizy masy w stanie nienaruszonym. Rozpuszczalnik A to woda z 0,1% kwasem mrówkowym. Rozpuszczalnik B składa się w 80% z acetonitrylu i 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie.
    2. Przygotować rozpuszczalniki niezbędne do analizy masy natywnej. Rozpuszczalnik A to 0,1 M octan amonu w wodzie, a rozpuszczalnik B to woda.
    3. Po przygotowaniu odpowiednich rozpuszczalników należy oczyścić system tak, aby rurki zostały wypełnione odpowiednimi rozpuszczalnikami, a wszystkie pęcherzyki powietrza zostały usunięte z przewodów.
    4. Zainstaluj odpowiednią kolumnę (kolumnę z odwróconą fazą do analizy masy w stanie nienaruszonym i kolumnę wykluczającą rozmiar do natywnej analizy masy). W przypadku analizy masy w stanie nienaruszonym natężenie przepływu wynosi 0,5 ml/min, a temperatura kolumny (przy użyciu grzałki kolumnowej) wynosi 50 °C. Równoważ kolumnę przez 15–20 minut. W przypadku natywnej analizy masy natężenie przepływu wynosi 0,25 ml/min.
      UWAGA: Zawsze monitoruj ciśnienie wsteczne kolumny, aby upewnić się, że nie przekracza górnej granicy, co może wskazywać na zatkaną linię lub naruszenie matrycy kolumny. W razie potrzeby wymień kolumnę.
  4. Analiza próbki
    1. Umieścić przygotowaną próbkę białka w szklanej fiolce z automatycznym samplerem do odpowiedniego stojaka na fiolki w automatycznym podajniku próbek LC. Utwórz listę próbek w oprogramowaniu z odpowiednią metodą przyrządu do żądanej analizy. Po utworzeniu przykładowej listy kliknij przycisk Odtwórz, aby rozpocząć analizę.
    2. Wstrzyknąć 1–2 μl próbki na analizę, z ślepą próbą wodną przed i po każdej próbce, aby upewnić się, że nie ma przeniesienia.
      UWAGA: Analiza masy w stanie nienaruszonym bardzo różni się od natywnej analizy masy i wymaga bardzo różnych ustawień metody przyrządu. Dzieje się tak, ponieważ przy nienaruszonej analizie masy białko jest "zrelaksowane" w obecności rozpuszczalnika organicznego, a zatem jest w stanie przyjąć więcej ładunków. Łatwiej jest zdekonwolucjonizować i rozwiązać rozkład izotopowy stanów ładunku. Natywna analiza masy zapewnia wąski rozkład ładunku jonów białkowych i w oparciu o białko wymaga różnych ustawień napięcia i energii zderzenia.
  5. Analiza danych i dekonwolucja białek
    1. Eksportuj widmo próbki do oprogramowania, gdzie można je przekształcić w widmo bez zawiłości, które wyświetli nienaruszoną masę (lub masę natywną) białka. Nienaruszona masa będzie miała izotopowy rozkład pików ze względu na dużą obfitość naładowanych pików widmowych. Masa natywna zazwyczaj będzie miała bardzo mało pików ze względu na niską obfitość naładowanych pików widmowych (Rysunek 3D).
    2. Rozszerz zakres stosunku masy do ładunku (m/z) piku d, aby potwierdzić, że zmierzona masa jest zgodna z przewidywaną masą. Czasami, ze względu na dodanie ładunków do białka, może wystąpić niewielka różnica między oczekiwaną masą cząsteczkową (MW) a obserwowaną MW. Ponadto, podobnie jak w przypadku wielu analiz spektrometrii mas, addukty, takie jak sód, mogą przyczyniać się do pojawienia się dodatkowych pików w danych, nawet w przypadku starannie odsolonych próbek. Czasami obserwuje się niższe obfite piki z m/z niższym niż oczekiwano. Jest to najprawdopodobniej spowodowane utratą neutralną, czyli utratą grupy funkcyjnej w wyniku procesu jonizacji.
      UWAGA: Zgodnie z oczekiwaniami, wystąpią różnice między nienaruszoną masą a natywnymi pikami masy. Nienaruszony wyświetlacz masy pokaże oczekiwaną wartość MW białka. Nie będzie miał dodatkowego MW dołączonego nukleotydu ani innych modyfikacji. Jednak natywny pik masy pokaże białko z dowolnym dodanym nukleotydem.

3. Walidacja wiązania KRAS4b-FMe z liposomami

  1. Przygotowanie liposomów błonowych
    1. Przygotuj bufor składający się z 20 mM HEPES (pH = 7,3), 150 mM NaCl i 1 mM TCEP.
    2. Materiały do przygotowania liposomów obejmują 25 mM zapasów 1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfocholiny (POPC) i 10 mM 1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfo-L-seryny (POPS) w chloroformie; zestaw wytłaczarki lipidowej z uchwytem i blokiem grzewczym; argon gazowy i ciekły azot; kąpiel ultradźwiękowa; szklane fiolki z gwintem śrubowym z wkładkami z pianki PTFE; oraz czytnik płytek zdolny do dynamicznego wykrywania rozpraszania światła.
    3. Rozmrażać zapasy lipidów w chloroformie w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przygotować 1 ml 5 mM 70:30 POPC: POPS liposomów, podając 106 μl 25 mM POPC (zapas) i 118 μL 10 mM POPS (bulion) do szklanej fiolki.
      UWAGA: Nie rozdzielaj lipidów plastikową końcówką, ponieważ chloroform może rozpuścić niektóre plastikowe końcówki.
    4. Wysuszyć lipidy pod stałym strumieniem argonu. Powoli obracaj szklaną fiolkę podczas nakładania argonu, aby utworzyć cienką warstwę suchego filmu.
    5. Umieść próbki pod liofilizatorem próżniowym na noc, aby usunąć nadmiar chloroformu.
    6. Rozpuść lipidy, dodając 1 ml buforu do wysuszonej warstwy i wiruj mieszaniny przez 5 minut. Uwodnić mieszaniny lipidów, kołysząc przez 1 godzinę w temperaturze 25 °C.
      UWAGA: Próbka będzie bardzo mętna po dodaniu buforu do warstwy wysuszonej warstwy lipidów.
    7. Wykonać pięć cykli zamrażania/rozmrażania, naprzemiennie umieszczając fiolkę z próbką w lodowatej wodzie (4 °C lub niżej) i w ciepłej łaźni wodnej (25 °C lub wyższej).
    8. Umieścić fiolkę z próbką w łaźni ultradźwiękowej i sonikować próbkę przez około 0,5 godziny lub do momentu, gdy próbka stanie się półprzezroczysta.
    9. Wytłaczaj próbki za pomocą zestawu wytłaczarki lipidowej. Zmontuj zestaw do wytłaczania zgodnie z instrukcjami producenta. Wytłaczać próbki za pomocą bibuły filtracyjnej 0,1 μm. Załaduj próbki do jednej szklanej strzykawki i przymocuj ją do jednego końca aparatu do wytłaczania. Dodać pustą strzykawkę na drugim końcu aparatu do wytłaczania. Przesuwaj w przód i w tył 10–20 razy, aż próbki staną się w pełni przezroczyste.
    10. Próbki końcowe należy obracać przez 30 minut w temperaturze 20 000 x g, aby usunąć wszelkie duże kruszywa.
    11. Użyj dynamicznego rozpraszania światła (DLS), aby określić rozmiar i jednorodność liposomów (opcjonalnie). Umieścić 30 μl liposomów w 384-dołkowym czytniku płytek. Obracać płytkę o wymiarach 1 000 x g przez 30 minut. Umieść płytkę w czytniku płytek i zbierz 10 pomiarów rozpraszania światła.
  2. Charakterystyka wiązania KRAS4b-FMe z liposomami za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)
    1. Zbierz wymagane materiały: przyrząd SPR, chip czujnika L1, probówki z fiolkami 7 x 14 mm i CHAPS.
    2. Przygotować bufor zawierający 20 mM HEPES (pH = 7,3), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP. Przygotować serię rozcieńczeń 2:1 KRAS4b-FMe od 60 μM–0,06 μM w całkowitej objętości 200 μL (łącznie 10 miareczkowań). Końcowe rozcieńczone próbki przenieść do probówek z fiolkami (patrz tabela materiałów), umieścić probówki z fiolkami w stojaku i włożyć próbki do przyrządu SPR.
    3. Włóż chip czujnika L1 do przyrządu SPR. Podłączyć bufor i zalać system buforem na 7 minut.
    4. Skonfiguruj metodę automatyczną w następujący sposób:
      1. Ustaw temperaturę przyrządu na 25 °C.
      2. Aktywuj chip czujnika L1, przepłukując go dwoma 1-minutowymi wstrzyknięciami 20 mM CHAPS rozpuszczonych w wodzie przy natężeniu przepływu 30 μl/min.
      3. Wykonaj cykle rozruchowe składające się z dziesięciu 1-minutowych wstrzyknięć bufora roboczego w celu nawodnienia powierzchni chipa.
        1. Umieść liposomy na chipie czujnika L1, wstrzykując liposomy do komórki przepływowej (FC)-2 chipa L1 z 2-minutowymi wstrzyknięciami przy 5 μl/min. Celuj w poziom wychwytywania co najmniej ~3,000 jednostek odpowiedzi (RU).
          UWAGA: Należy wydłużać czas wstrzykiwania aż do osiągnięcia odpowiedniego poziomu wychwytywania.
      4. Wstrzyknąć trzy cykle buforu zarówno na FC-1, jak i FC-2 z 1-minutowymi wstrzyknięciami w tempie 30 μl/min.
        1. Wstrzykiwać różne miareczkowania KRAS4b-FMe od serii od najniższego do najwyższego stężenia. Wstrzyknąć białka, stosując 1-minutowe wstrzyknięcia w fazie asocjacji i 2-minutowe wstrzyknięcia w fazie dysocjacji przy natężeniu przepływu 30 μl/min przez oba FC.
        2. Zregeneruj chip czujnika L1, przepłukując go dwoma 1-minutowymi wstrzyknięciami 20 mM CHAPS z prędkością 30 μl/min.
    5. Dopasuj dane za pomocą oprogramowania do oceny SPR przy użyciu modelu powiązania pojedynczej witryny, aby uzyskać pozorne powinowactwo powiązań (zobacz sekcję Dyskusja, aby uzyskać wyjaśnienie dopasowywania danych).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jedną z największych zmiennych w protokole jest ilość wyrażonego białka docelowego (His6-MBP-tev-KRAS4b). Protokół ten został opracowany przy użyciu izolatu z linii komórkowej Trichoplusia ni, Tni-FNL17, przystosowanego do wzrostu zawiesiny i odstawionego od surowicy. Biorąc pod uwagę szeroki zakres wyników zgłaszanych w różnych liniach komórkowych owadów z systemem ekspresji bakulowirusa, zaleca się stosowanie Tni-FNL, przynajmniej początkowo, do produkcji KRAS4b-FMe.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak zauważono w sekcji Reprezentatywne wyniki, najbardziej krytycznym etapem podczas oczyszczania jest obchodzenie się z próbką w czasie, gdy znajduje się ona w niższej zawartości soli. Ograniczenie czasu, w którym próbka jest wystawiona na działanie mniej niż 200 mM NaCl, pomoże zmniejszyć opady i zwiększyć wydajność próbki. Interpretacja wyników CEX może być trudna, jeśli profil nie spełnia oczekiwań (zob. rys. 2). Dopóki protokół nie stanie się rutyną, zaleca się, aby frakcje elucyjne CEX...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doceniamy wsparcie w klonowaniu i ekspresji od Carissy Grose, Jen Melhalko i Matta Drew z Laboratorium Ekspresji Białek, Frederick National Laboratory for Cancer Research. Projekt ten został sfinansowany w całości lub w części ze środków federalnych z National Cancer Institute, National Institutes of Health, na podstawie umowy nr 1. HHSN261200800001E. Treść tej publikacji niekoniecznie odzwierciedla poglądy lub politykę Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej, a wzmianka o nazwach handlowych, produktach komercyjnych lub organizacjach nie oznacza poparcia ze strony rządu Stanów Zjednoczonych

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,8 ml probówki Safe-Lock, naturalneEppendorf22363204
11 mm Cl SS z blokowaną wkładką Fiolki z automatycznym sampleremThermo Scientific30211SS-1232
1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfocholina (POPC)AVANTI POLARNE LIPIDYkupić jako płynne zapasy w chloroformie
1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfo-L-seryna (POPS)AVANTI POLAR LIPIDS840034zakupu jako płynne zapasy w chloroformie
5427R WirówkaEppendorf
Acetonitryl, klasa HPLCFisher ChemicalA998-1 1L
Octan amonuSigma-Aldrich09689-250g
Gazargonowy Gaz powietrznyPłytka testowa ARUP
384CORNING3544
Instrument Biacore T200 GEHealthcare
Niebieskie uszczelki Snap-It, T / SThermo ScientificC4011-54B
Branson Kąpiel ultradźwiękowaThermo Fisher15-336-1000
Kolumna chromatografii kationowymiennej (CEX)GE Healthcare Nauki przyrodnicze29018183HiPrep SP Sepharose
Wysokowydajny CHAPSSigmaC3023
Czytnik płytek Dyna Pro Spektrometrmasowy Wyatt Technologies
Exactive Plus EMRThermo Scientific
Kwas mrówkowySigma-AldrichF0507-500MlUżyj odczynnika klasy lub lepszej
Fiolki Gilson Probówki 7x14 mmGE HealthcareBR-1002-12
Szklane fiolki z gwintem z wkładkamiz pianki PTFESpecjalności naukoweB69302
Wirówka szybkoobrotowa/stołowaThermo Fischer Scientific05-112-114Dzdolna do 4,000 xg
proteazy wirusa wytrawiania tytoniu His6-tytoniu (TEV)Addgene92414Oczyszczona zgodnie z Raran-Kurussi i in. (2017) Usuwanie znaczników powinowactwa z proteazą TEV. W: Burgess-Brown N. (red.) Heterologiczna ekspresja genów w E. coli. Metody w biologii molekularnej, tom 1586. Humana Press, Nowy Jork, NY
Immobilizowana chromatografia powinowactwa metali (IMAC) kolumnaGE Healthcare Life Sciences28-9365-51HisPrep FF 16/10
Własne zaopatrzenie w wodę, Arium AdvanceSartorius StedimRezystywność 18 MΩ 0-cm
Zestaw ekstrudera do lipidów z uchwytemAVANTI POLAR LIPIDS
Ciekły azotAirgasNI-DEWAR
M110-EHMikrofluidyzator
MabPac RP UHPLC, 4 um, 3.0 x 50 mmThermo Scientific088645
Kolumna MabPac SEC-1, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mmThermo Scientific088790
Oprogramowanie MagTranMetanol Thermo Scientific
, klasa HPLCVWR ChemicalsBDH20864.400
System chromatograficzny NGC System chromatograficznyBioRad78880002NGC QuestTM 100
Inhibitor proteazy Koktajl bez EDTA i innych chelatorówMillipore SigmaP8849
Gumowe nasadki typ 3GE HealthcareBR-1005-02
Series S Układ czujnika L1GE Healthcare
Thermo Fischer Scientific13-400-519Absorbace przy 280nm
Ultra-15 Filtry odśrodkowe, 10K NMWLMillipore SigmaUFC901008membrana PES
Ultracel 10K MWCO Ultra 0,5 mL Filtry wirówkoweAmiconUFC501024
UltrawirówkaBeckman CoulterOptima - L80Kzdolna do 100 000 xg
Vanquish UHPLC (pompa, separator kolumnowy i system LC)Thermo Scientific
Vortex Genie 2Fisher12-812
Woda, klasa HPLCSigma-Aldrich270733-1LMoże korzystać z własnego źródła wody (patrz poniżej)
Strzykawka Whatman GD/XP PES 0,45 mm filtrGE Healthcare - Whatman6994-2504
Xcalibur QualBrowserThermo Oprogramowanieproteomiczne
850457 610023 Mikrofluidyzator Spektrofotometr 29104993

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
  2. Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry. 65, 241-269 (1996).
  3. Hottman, D. A., Li, L. Protein prenylation and synaptic plasticity: implications for Alzheimer's disease. Molecular Neurobiology. 50 (1), 177-185 (2014).
  4. Hottman, D. A., Chernick, D., Cheng, S., Wang, Z., Li, L. HDL and cognition in neurodegenerative disorders. Neurobiology of Disease. 72, Pt A 22-36 (2014).
  5. Nakagami, H., Jensen, K. S., Liao, J. K. A novel pleiotropic effect of statins: prevention of cardiac hypertrophy by cholesterol-independent mechanisms. Annals of Medicine. 35 (6), 398-403 (2003).
  6. Kohnke, M., et al. Rab GTPase prenylation hierarchy and its potential role in choroideremia disease. PLoS One. 8 (12), 81758(2013).
  7. Berndt, N., Hamilton, A. D., Sebti, S. M. Targeting protein prenylation for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (11), 775-791 (2011).
  8. Kho, Y., et al. A tagging-via-substrate technology for detection and proteomics of farnesylated proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12479-12484 (2004).
  9. Armstrong, S. A., Hannah, V. C., Goldstein, J. L., Brown, M. S. CAAX geranylgeranyl transferase transfers farnesyl as efficiently as geranylgeranyl to RhoB. Journal of Biological Chemistry. 270 (14), 7864-7868 (1995).
  10. Stephen, A. G., Esposito, D., Bagni, R. K., McCormick, F. Dragging ras back in the ring. Cancer Cell. 25 (3), 272-281 (2014).
  11. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs in Membrane Biochemistry and Biophysics. Chemical Reviews. 117 (6), 4669-4713 (2017).
  12. Bao, H., Duong, F., Chan, C. S. A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles. Journal of Visualized Experiments. (66), e3910(2012).
  13. Dementiev, A. K-Ras4B lipoprotein synthesis: biochemical characterization, functional properties, and dimer formation. Protein Expression and Purification. 84 (1), 86-93 (2012).
  14. Lowe, P. N., et al. Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems. Journal of Biological Chemistry. 266 (3), 1672-1678 (1991).
  15. Gillette, W., et al. Production of Farnesylated and Methylated Proteins in an Engineered Insect Cell System. Methods in Molecular Biology. 2009, 259-277 (2019).
  16. Agamasu, C., et al. KRAS Prenylation Is Required for Bivalent Binding with Calmodulin in a Nucleotide-Independent Manner. Biophysical Journal. 116 (6), 1049-1063 (2019).
  17. Talsania, K., et al. Genome Assembly and Annotation of the Trichoplusia ni Tni-FNL Insect Cell Line Enabled by Long-Read Technologies. Genes. 10 (2), 79(2019).
  18. Spencer-Smith, R., et al. Inhibition of RAS function through targeting an allosteric regulatory site. Nature Chemical Biology. 13 (1), 62-68 (2016).
  19. Lowe, P. N., et al. Expression of polyisoprenylated Ras proteins in the insect/baculovirus system. Biochemical Society Transactions. 20 (2), 484-487 (1992).
  20. Dharmaiaha, S., et al. Structural basis of recognition of farnesylated and methylated KRAS4b by PDEδ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 6766-6775 (2016).
  21. Abdiche, Y. N., Myszka, D. G. Probing the mechanism of drug/Lipid membrane interactions using Biacore. Analytical Biochemistry. 328 (2), 233-243 (2004).
  22. Fisher, R. J., et al. Complex interactions of HIV-1 nucleocapsid protein with oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 34 (2), 472-484 (2006).
  23. Lakshman, B., et al. Quantitative biophysical analysis defines key components modulating recruitment of the GTPase KRAS to the plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 294, 2193-2207 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

KRAS4b PurificationFarnesylated ProteinCation Exchange ChromatographyIntact Mass SpectrometrySurface Plasmon ResonanceBaculovirus ExpressionLiposome Binding AssayProtein DialysisIMAC ChromatographyNucleotide Binding Analysis

Related Articles