Method Article

W pełni przetworzony rekombinowany KRAS4b: izoluje i charakteryzuje białko farnezylowane i metylowane

DOI:

10.3791/60703

⸱

January 16th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NCI RAS Initiative, Cancer Research Technology Program, Frederick National Laboratory for Cancer Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prenylacja jest ważną modyfikacją białek wiążących błony obwodowe. Komórkami owadów można manipulować w celu wytworzenia farnezylowanego i karboksymetylowanego KRAS4b w ilościach umożliwiających biofizyczne pomiary interakcji białko-białko i białko-lipid

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prenylacja białek jest kluczową modyfikacją, która jest odpowiedzialna za kierowanie białek do błon wewnątrzkomórkowych. KRAS4b, który jest zmutowany w 22% nowotworów u ludzi, jest przetwarzany przez farnezylację i karboksymetylację ze względu na obecność motywu pudełka "CAAX" na C-końcu. Zmodyfikowany system bakulowirusa został wykorzystany do ekspresji farnezylowanego i karboksymetylowanego KRAS4b w komórkach owadów i został opisany wcześniej. W tym miejscu opisujemy szczegółowe, praktyczne oczyszczanie i charakterystykę biochemiczną białka. W szczególności zastosowano chromatografię powinowactwa i wymiany jonowej, aby oczyścić białko do jednorodności. Nienaruszona i natywna spektrometria mas została wykorzystana do walidacji poprawności modyfikacji KRAS4b i weryfikacji wiązania nukleotydów. Na koniec zmierzono asocjację błonową farnezylowanego i karboksymetylowanego KRAS4b z liposomami za pomocą spektroskopii powierzchniowego rezonansu plazmonowego.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modyfikacje potranslacyjne odgrywają kluczową rolę w definiowaniu funkcjonalnej aktywności białek. Modyfikacje, takie jak fosforylacja i glikozylacja, są dobrze znane. Modyfikacje lipidów są jednak gorzej scharakteryzowane. Szacuje się, że aż 0,5% wszystkich białek komórkowych może być prenylowanych1. Prenylacja to przeniesienie 15-węglowego farnezylu lub 20-węglowego łańcucha lipidowego geranylgeranylu do białka akceptorowego zawierającego motyw CAAX2. Prenylowane białka są zaangażowane w progresję wielu chorób ludzkich, w tym przedwczesnego starzenia się3, Alzheimer's4, d....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Oczyszczanie białka

  1. Przygotować A–H, jak pokazano w Tabeli 1.
szt.
Roztwór buforowyŚrodek buforujący (wszystkie 20 mM)pHNaCl (mM)imidazol (mM)MgCl2TCEP
ZAHEPESY7,3300-51

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jedną z największych zmiennych w protokole jest ilość wyrażonego białka docelowego (His6-MBP-tev-KRAS4b). Protokół ten został opracowany przy użyciu izolatu z linii komórkowej Trichoplusia ni, Tni-FNL17, przystosowanego do wzrostu zawiesiny i odstawionego od surowicy. Biorąc pod uwagę szeroki zakres wyników zgłaszanych w różnych liniach komórkowych owadów z systemem ekspresji bakulowirusa, zaleca się stosowanie Tni-FNL, przynajmniej początkowo, do produkcji KRAS4b-FMe.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak zauważono w sekcji Reprezentatywne wyniki, najbardziej krytycznym etapem podczas oczyszczania jest obchodzenie się z próbką w czasie, gdy znajduje się ona w niższej zawartości soli. Ograniczenie czasu, w którym próbka jest wystawiona na działanie mniej niż 200 mM NaCl, pomoże zmniejszyć opady i zwiększyć wydajność próbki. Interpretacja wyników CEX może być trudna, jeśli profil nie spełnia oczekiwań (zob. rys. 2). Dopóki protokół nie stanie się rutyną, zaleca się, aby frakcje elucyjne CEX.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doceniamy wsparcie w klonowaniu i ekspresji od Carissy Grose, Jen Melhalko i Matta Drew z Laboratorium Ekspresji Białek, Frederick National Laboratory for Cancer Research. Projekt ten został sfinansowany w całości lub w części ze środków federalnych z National Cancer Institute, National Institutes of Health, na podstawie umowy nr 1. HHSN261200800001E. Treść tej publikacji niekoniecznie odzwierciedla poglądy lub politykę Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej, a wzmianka o nazwach handlowych, produktach komercyjnych lub organizacjach nie oznacza poparcia ze strony rządu Stanów Zjednoczonych

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,8 ml probówki Safe-Lock, naturalneEppendorf22363204
11 mm Cl SS z blokowaną wkładką Fiolki z automatycznym sampleremThermo Scientific30211SS-1232
1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfocholina (POPC)AVANTI POLARNE LIPIDYkupić jako płynne zapasy w chloroformie
1-palmitoilo-2-oleoilo-glicero-3-fosfo-L-seryna (POPS)AVANTI POLAR LIPIDS840034zakupu jako płynne zapasy w chloroformie
5427R WirówkaEppendorf
Acetonitryl, klasa HPLCFisher ChemicalA998-1 1L
Octan amonuSigma-Aldrich09689-250g
Gazargonowy Gaz powietrznyPłytka testowa ARUP
384CORNING3544
Instrument Biacore T200 GEHealthcare
Niebieskie uszczelki Snap-It, T / SThermo ScientificC4011-54B
Branson Kąpiel ultradźwiękowaThermo Fisher15-336-1000
Kolumna chromatografii kationowymiennej (CEX)GE Healthcare Nauki przyrodnicze29018183HiPrep SP Sepharose
Wysokowydajny CHAPSSigmaC3023
Czytnik płytek Dyna Pro Spektrometrmasowy Wyatt Technologies
Exactive Plus EMRThermo Scientific
Kwas mrówkowySigma-AldrichF0507-500MlUżyj odczynnika klasy lub lepszej
Fiolki Gilson Probówki 7x14 mmGE HealthcareBR-1002-12
Szklane fiolki z gwintem z wkładkamiz pianki PTFESpecjalności naukoweB69302
Wirówka szybkoobrotowa/stołowaThermo Fischer Scientific05-112-114Dzdolna do 4,000 xg
proteazy wirusa wytrawiania tytoniu His6-tytoniu (TEV)Addgene92414Oczyszczona zgodnie z Raran-Kurussi i in. (2017) Usuwanie znaczników powinowactwa z proteazą TEV. W: Burgess-Brown N. (red.) Heterologiczna ekspresja genów w E. coli. Metody w biologii molekularnej, tom 1586. Humana Press, Nowy Jork, NY
Immobilizowana chromatografia powinowactwa metali (IMAC) kolumnaGE Healthcare Life Sciences28-9365-51HisPrep FF 16/10
Własne zaopatrzenie w wodę, Arium AdvanceSartorius StedimRezystywność 18 MΩ 0-cm
Zestaw ekstrudera do lipidów z uchwytemAVANTI POLAR LIPIDS
Ciekły azotAirgasNI-DEWAR
M110-EHMikrofluidyzator
MabPac RP UHPLC, 4 um, 3.0 x 50 mmThermo Scientific088645
Kolumna MabPac SEC-1, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mmThermo Scientific088790
Oprogramowanie MagTranMetanol Thermo Scientific
, klasa HPLCVWR ChemicalsBDH20864.400
System chromatograficzny NGC System chromatograficznyBioRad78880002NGC QuestTM 100
Inhibitor proteazy Koktajl bez EDTA i innych chelatorówMillipore SigmaP8849
Gumowe nasadki typ 3GE HealthcareBR-1005-02
Series S Układ czujnika L1GE Healthcare
Thermo Fischer Scientific13-400-519Absorbace przy 280nm
Ultra-15 Filtry odśrodkowe, 10K NMWLMillipore SigmaUFC901008membrana PES
Ultracel 10K MWCO Ultra 0,5 mL Filtry wirówkoweAmiconUFC501024
UltrawirówkaBeckman CoulterOptima - L80Kzdolna do 100 000 xg
Vanquish UHPLC (pompa, separator kolumnowy i system LC)Thermo Scientific
Vortex Genie 2Fisher12-812
Woda, klasa HPLCSigma-Aldrich270733-1LMoże korzystać z własnego źródła wody (patrz poniżej)
Strzykawka Whatman GD/XP PES 0,45 mm filtrGE Healthcare - Whatman6994-2504
Xcalibur QualBrowserThermo Oprogramowanieproteomiczne
850457 610023 Mikrofluidyzator Spektrofotometr 29104993

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cox, A. D., Der, C. J. Protein prenylation: more than just glue. Current Opinion in Cell Biology. 4 (6), 1008-1016 (1992).
  2. Zhang, F. L., Casey, P. J. Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences. Annual Review of Biochemistry.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

KRAS4b PurificationFarnesylated ProteinCation Exchange ChromatographyIntact Mass SpectrometrySurface Plasmon ResonanceBaculovirus ExpressionLiposome Binding AssayProtein DialysisIMAC ChromatographyNucleotide Binding Analysis

Related Articles