Artykuł metodologiczny

Analiza metylacji LINE-1 w mezenchymalnych komórkach macierzystych leczonych pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi pochodzącymi z kostniakomięsaka

DOI:

10.3791/60705

⸱

1 lutego 2020

 ,  ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Diseases, University of Helsinki, 2Helsinki University Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane tutaj jest użycie metody amplifikacji sondy specyficznej dla metylacji do analizy poziomów metylacji elementów LINE-1 w mezenchymalnych komórkach macierzystych leczonych pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi pochodzącymi z kostniakomięsaka. Wykazano również ultrawirowanie, popularną procedurę oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od płodowej surowicy bydlęcej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amplifikacja sondy specyficzna dla metylacji (MSPA) to prosta i solidna technika, która może być używana do wykrywania względnych różnic w poziomach metylacji próbek DNA. Jest zaradny, wymaga niewielkich ilości DNA i zajmuje około 4-5 godzin pracy praktycznej. W prezentowanej technice próbki DNA są najpierw denaturowane, a następnie hybrydyzowane do sond, które celują w DNA w miejscach metylowanych lub referencyjnych jako kontrolę. Zhybrydyzowane DNA jest rozdzielane na równoległe reakcje, z których jedna przechodzi tylko ligację, a druga ligację, po której następuje trawienie za pośrednictwem HhaI w niemetylowanych sekwencjach GCGC. Powstałe w ten sposób fragmenty DNA są amplifikowane metodą PCR i rozdzielane za pomocą elektroforezy kapilarnej. Metylowane miejsca GCGC nie są trawione przez HhaI i wytwarzają sygnały szczytowe, podczas gdy niemetylowane miejsca GCGC są trawione i nie są generowane żadne sygnały szczytowe. Porównanie znormalizowanych kontrolnie pików strawionych i niestrawionych wersji każdej próbki zapewnia stosunek dawki metylacji próbki DNA. W tym przypadku MSPA służy do wykrywania wpływu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z kostniakomięsaka na stan metylacji długo przeplatanego pierwiastka jądrowego-1 (LINE-1) w mezenchymalnych komórkach macierzystych. LINE-1 to powtarzalne elementy DNA, które zazwyczaj ulegają hipometylacji w raku i w tym charakterze mogą służyć jako biomarker. Ultrawirowanie jest również stosowane jako opłacalna metoda oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od płynów biologicznych (tj. podczas przygotowywania płodowej surowicy bydlęcej o zubożonej w EV [FBS] i izolowania EV z pożywki kondycjonowanej kostniakomięsakiem [wirowanie różnicowe]). Do analizy metylacji niestandardowe sondy LINE-1 są zaprojektowane tak, aby celować w trzy miejsca metylacji w sekwencji promotora LINE-1 i siedem miejsc kontrolnych. Protokół ten demonstruje zastosowanie MSPA do analizy metylacji LINE-1 i opisuje przygotowanie FBS zubożonego w EV przez ultrawirowanie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metylacja DNA to główna modyfikacja epigenetyczna zachodząca w komórkach ludzkich. Metylacja DNA odnosi się do powiązania grup metylowych z resztami cytozyny w dinukleotydach CpG. Takie dinukleotydy zwykle znajdują się w klastrach (wyspach CpG) w regionie 5' genów1. W normalnych komórkach większość tych dinukleotydów występuje w stanie niemetylowanym, co umożliwia transkrypcję DNA. Nawiasem mówiąc, wiele nowotworów jest związanych z hipermetylowanymi wyspami CpG i wyciszaniem transkryptomicznym2, szczególnie w genach supresorowych nowotworów, które z kolei przyczyniają się do różnych cech charakterystycznych raka3.

Z drugiej strony, długo przeplatane elementy jądrowe-1 (LINE-1 lub L1) są powtarzalnymi, transpozycyjnymi elementami DNA, które normalnie mają wysoki poziom metylacji na wyspach CpG. Metylacja LINE-1 zapobiega translokacji i pomaga w utrzymaniu integralności genomu. W kilku typach nowotworów LINE-1 jest hipometylowany, co powoduje aktywację, a następnie niestabilność chromosomalną za pośrednictwem retrotranspozycji4. LINE-1 stanowi prawie 17% ludzkiego genomu5, a jego status metylacji może służyć jako wskaźnik globalnych poziomów metylacji genomu6. Uważa się, że globalna hipometylacja LINE-1 poprzedza przejście komórek do fenotypu nowotworu7; W związku z tym jest obiecujący jako potencjalny marker wczesnego początku raka.

Obecnie istnieje kilka metod analizy metylacji, w tym pirosekwencjonowanie, PCR specyficzny dla metylacji, mikromacierze i immunoprecypitacja chromatyny1. Zastosowanie sekwencjonowania nowej generacji umożliwiło również włączenie podejść do wykrywania metylacji DNA obejmujących cały genom. Wiele z tych metod opiera się na DNA poddanym działaniu wodorosiarczynu, w którym niemetylowane cytozyny są przekształcane w uracyl, a cytozyny metylowane pozostają niezmienione. Jednak praca z DNA poddanym działaniu wodorosiarczynu wiąże się z kilkoma pułapkami, takimi jak niekompletna konwersja niemetylowanych cytozyn do uracylu, tendencyjna amplifikacja sekwencji i błędy sekwencjonowania8.

W amplifikacji sondy specyficznej dla metylacji (MSPA), sondy złożone z dwóch oligonukleotydów celują w sekwencje DNA zawierające miejsce restrykcyjne (GCGC) dla wrażliwego na metylację enzymu restrykcyjnego HhaI9. Po hybrydyzacji sond z DNA, każda próbka jest dzielona na dwa zestawy. Sondy w pierwszym zestawie poddawane są podwiązaniu, podczas gdy sondy w drugim zestawie poddawane są podwiązaniu, a następnie trawieniu za pośrednictwem HhaI w niemetylowanych miejscach CGCG. Oba zestawy próbek są następnie amplifikowane metodą PCR, a produkty są rozdzielane za pomocą elektroforezy kapilarnej. Sondy w miejscach niemetylowanych są trawione przez HhaI i nie są wzmacniane podczas PCR, co skutkuje brakiem sygnałów szczytowych. W przeciwieństwie do tego, sondy w miejscach metylacji są chronione przed trawieniem i dlatego są wzmacniane podczas PCR, a następnie generują sygnały szczytowe10.

MSPA ma kilka zalet w porównaniu z alternatywnymi metodami. Po pierwsze, wymaga niewielkiej ilości DNA (50–100 ng) i dobrze nadaje się do analizy DNA z próbek zatopionych w parafinie utrwalonym w formalinie10. Nie wymaga DNA poddanego działaniu wodorosiarczynu; w rzeczywistości nie nadaje się do DNA, które jest modyfikowane w ten sposób. Wiele próbek może być analizowanych w tym samym czasie, a sondy MSPA mogą być zaprojektowane tak, aby celowały w wiele genów lub sekwencji jednocześnie. Dodatkowo sondy są specyficzne i wrażliwe na metylowane DNA, ponieważ miejsce restrykcyjne HhaI odpowiada sekwencji typowej dla wysp CpG10.

To badanie dotyczyło wpływu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z kostniakomięsaka (OS) na metylację LINE-1 w mezenchymalnych komórkach macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (AT-MSC; Rysunek 1). EV to nanoskalowe, połączone błoną pęcherzyki wydzielane przez większość typów komórek. Przenoszą białka, lipidy, mRNA, mikroRNA i dodatkowe cząsteczki z komórek macierzystych11,12. EV pośredniczą w komunikacji międzykomórkowej i odgrywają ważną rolę w kilku stanach patofizjologicznych13,14. Niedawne badanie wykazało, że EV pochodzące z raka mogą przenosić aktywną LINE-1 do komórek biorcy15. Wcześniej informowano, że EV z linii komórkowej HOS-143B mogą zmieniać status metylacji LINE-1 w MSC, oprócz innych efektów genetycznych16.

Podczas hodowli komórek do izolacji EV, ważne jest, aby używać w pożywce wzrostowej surowicy bydlęcej zubożonej w EV, ponieważ EV pochodzące z FBS mogą zakłócać EV z innych źródeł i utrudniać wyniki17,18. Ultrawirowanie jest jedną z najczęstszych metod wyczerpywania EV z FBS. Jest to stosunkowo prosta i opłacalna procedura w porównaniu z alternatywami, takimi jak ultrafiltracja i komercyjne FBS19. W tym przypadku protokół pokazuje również, jak przygotować FBS zubożony w EV za pomocą ultrawirowania.

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół dla wyżej wymienionych technik, od izolacji EV z linii komórkowej OS do analizy metylacji LINE-1 w MSC traktowanych OS-EV (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki Okręgu Szpitalnego w Helsinkach i Uusimaa (zatwierdzenie etyczne D. No. 217/13/03/02/2015).

1. Przygotowanie FBS zubożonego w EV przez ultrawirowanie

  1. Weź FBS do probówek (ultra)wirówek i umieść je w wiadrach do ultrawirówek. Aby zapewnić płynny i bezpieczny przebieg ultrawirowania, należy zrównoważyć wiadra w odległości 10 mg od siebie.
  2. Załadować łyżki na wirnik wahliwy (typ SW28, współczynnik k 246). Umieścić rotor w ultrawirówce i pracować z prędkością 100 000 x g przez 19 godzin w temperaturze 4 °C.
  3. Ostrożnie zebrać jasną górną warstwę supernatantu (około dziewięciu dziesiątych) i przenieść do probówki o pojemności 50 ml. Nie przeszkadzaj ani nie pipetuj ciemnobrązowej granulki, ponieważ zawiera ona EV z FBS.
  4. Przepuścić supernatant przez filtr 0,22 μm do nowej probówki o pojemności 50 ml.
  5. Dodaj wysterylizowany filtrem, zubożony w EV FBS do pożywki do hodowli komórkowych podczas hodowli komórek w celu izolacji EV.

2. Izolacja EV pochodzących z kostniakomięsaka

  1. Płytki OS (linia komórkowa HOS-143B) w kolbie T-175 z pożywką RPMI 1640, uzupełnioną 10% normalnym FBS i 1% antybiotykami (100 U/ml penicyliny, 0,1 mg/ml streptomycyny). Umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Gdy kolba jest w 70%-80% zlewana, przemyj komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), a następnie hoduj je w pożywkach zawierających FBS o zawartości 10% EV (zwanych dalej pożywkami zubożonymi w EV).
    UWAGA: 1 x 106 komórek HOS-143B posianych w kolbie T175 osiąga 70% konfluencji po około 60 godzinach.
  3. W ciągu następnych 48 godzin co 24 godziny zbieraj kondycjonowane podłoże z komórek kostniakomięsaka i dodawaj świeże podłoże o zubożonej EV.
  4. Odwirować kondycjonowane podłoże o sile 2500 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia komórek i resztek komórek. Przenieść supernatant do nowej probówki, pozostawiając na dnie około 2 ml pożywki.
    UWAGA: Jeżeli na tym etapie nie następuje bezpośrednie izolowanie EV, supernatant może być przechowywany w temperaturze -80 oC.
  5. Wlej supernatant do probówek ultrawirówek i zrównoważ je jak wcześniej. Odwirować probówki o stężeniu 100 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
  6. Ostrożnie wyrzucić supernatant, pozostawiając około 1 ml na dnie. Dodaj około 20 ml PBS (0,1 μm przefiltrowanego) do probówki i delikatnie odpipetować, aby umyć i ponownie zawiesić granulat EV.
  7. Zrównoważyć probówki i wykonać kolejną rundę ultrawirowania z tymi samymi ustawieniami.
  8. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad EV w 200 μl PBS za pomocą delikatnego pipetowania. Przechowuj EV w rurkach o niskim wiązaniu.
    UWAGA: Pojazdy elektryczne mogą być używane od razu lub przechowywane w temperaturze -80 °C do czasu, gdy będą potrzebne.

3. Charakterystyka OS-EV

UWAGA: Oczyszczone EV mogą być charakteryzowane za pomocą western blotting (WB), analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)16.

  1. Wykonaj WB zgodnie ze standardowym protokołem16 ze znacznikami EV CD63, TSG101 i Hsp70 oraz z kalneksyną jako kontrolą ujemną, aby wskazać czystość próbki EV20.
  2. W przypadku NTA najpierw rozcieńczyć próbkę EV w PBS Dulbecco przefiltrowanym przez 0,1 μm, aby uzyskać (idealnie) 30–100 cząstek na klatkę.
    1. Pobrać około 500 μl próbki do strzykawki o pojemności 1 ml i załadować ją do portu wlotowego przyrządu NTA. Sprawdź, czy w klatce jest wystarczająca ilość cząstek, aby uzyskać dokładne pomiary.
    2. Otwórz oprogramowanie NTA i nagraj pięć filmów o czasie trwającym 60 sekund, korzystając z poziomu kamery 13 w temperaturze otoczenia. Podczas analizy należy użyć progu detekcji = 5 i wzmocnienia = 10.
  3. Analizuj próbki EV za pomocą TEM zgodnie z wcześniejszym opisem21.

4. Kultura AT-MSC

UWAGA: Ludzka tkanka tłuszczowa do izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych została dostarczona jako aspirat do liposukcji (Oddział Chirurgii Plastycznej, Laser Tilkka Ltd., Finlandia). Pisemną świadomą zgodę uzyskano od dawców lipoaspiratów, którzy przechodzili zabiegi liposukcji planowej.

  1. Wyizoluj AT-MSC z aspiratów liposukcji przy użyciu standardowych metod izolacji mechanicznej i enzymatycznej22.
    UWAGA: Można również stosować MSC z innych źródeł (w tym komercyjnych linii komórkowych).
  2. Hodowla komórek w pożywce DMEM/F-12 uzupełniona 10% FBS i 1% antybiotykami.

5. Leczenie MSC za pomocą OS-EV

  1. Płytka 15 000 AT-MSC na studzienkę w płytce 24-dołkowej.
  2. Po 24 godzinach usuń stare media, umyj ogniwa PBS i zmień na pożywkę ze zubożonym EV.
  3. Traktuj komórki OS-EV (przy stężeniu cząstek 1 x 106 EV na komórkę) w dniu 1 (24 godziny po adhezji komórek), w dniu 3 (48 godzin po dniu 1) i w dniu 5 (96 godzin po dniu 1).
    1. Przerwać obróbkę OS-EV dla próbek z punktu czasowego (TP) 0 w dniu 1, próbek TP 3 w dniu 3 i próbek TP 7 w dniu 7 (48 godzin po dniu 5).
      UWAGA: Można również przestrzegać innych harmonogramów punktów czasowych zgodnie z planami eksperymentalnymi.
  4. Ekstrahować DNA z MSCs przy użyciu odpowiedniej metody. Do analizy danych należy dołączyć dodatnie i ujemne próbki kontrolne.

6. Test metylacji LINE-1

  1. Zaprojektuj niestandardowe startery sondy LINE-1, tak jak to zrobili wcześniej Pavicic et al.23. W przypadku sond metylacyjnych wybierz trzy sekwencje zawierające miejsce restrykcyjne HhaI w regionie promotorowym LINE-1. W przypadku sond kontrolnych wybierz siedem sekwencji pozbawionych miejsca restrykcji HhaI z reszty sekwencji LINE-1.
    UWAGA: Sekwencja LINE-1 jest dostępna w bazie danych GenBank24 (L1.2, nr dostępu. AH005269.2). Skorzystaj z instrukcji producenta MSPA do projektowania sond25.
  2. Rozcieńczyć 70 ng próbki DNA w buforze TE do objętości 5 μl.
  3. Przeprowadzić kolejne etapy termocyklingu i PCR, jak podano w tabeli 1. Podgrzewać próbki przez 10 minut w temperaturze 98 °C, a następnie schłodzić do temperatury 25 °C.
  4. Dodaj 3 μl mieszanki hybrydyzacyjnej sondy do każdej próbki i uruchom termocykler, aby umożliwić sondom hybrydyzację z DNA.
  5. W temperaturze pokojowej (RT) dodać 13 μl mieszanki po hybrydyzacji do każdej próbki. Przenieść 10 μl do drugiej probówki.
  6. Umieścić oba zestawy probówek w termocyklerze i inkubować w temperaturze 48 °C przez co najmniej 1 minutę.
    1. Gdy próbki mają temperaturę 48 °C, dodać 10 μl mieszaniny do ligacji do pierwszego zestawu probówek (seria niestrawiona) i 10 μl mieszaniny ligacyjno-mineralizacyjnej do drugiego zestawu probówek (seria strawiona). Uruchom następny program termocyklera.
  7. Zakręć probówki i jednocześnie ustaw termocykler na 72 °C.
  8. Do każdej probówki dodać 5 μl mieszanki polimerazy i umieścić probówki w termocyklerze. Uruchom program PCR.
  9. Podczas wykonywania programu PCR należy przygotować roztwór 1 ml formamidu zawierający 2,5 μl wzorca wielkości. Odpipetować 10 μl tego roztworu do każdego dołka na optycznej płytce 96-dołkowej (z kodem kreskowym).
  10. Po PCR rozcieńczyć niestrawione i strawione próbki odpowiednio do 1:100 i 1:200 w ultraczystej wodzie. Dodać 2 μl rozcieńczonego produktu PCR do płytki 96-dołkowej. Odwirować płytkę o masie 200 x g przez 15–20 sekund w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
  11. Przeprowadzić analizę fragmentów próbek metodą elektroforezy kapilarnej.
    UWAGA: Płytkę należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu analizy.

7. Analiza danych fragmentarycznych

  1. Otwórz wyniki elektroforezy kapilarnej w oprogramowaniu do analizy elektroferogramu.
    1. W kolumnie Panel dla jednego z przykładów wybierz z menu pozycję MLPA. Kliknij nagłówek panelu i naciśnij Ctrl+D, aby zastosować MLPA do wszystkich próbek.
    2. W ten sam sposób ustaw Metodę analizy na Domyślna mikrosatelitarna dla wszystkich próbek.
    3. Wybierz wszystkie próbki i kliknij przycisk Zielony przycisk odtwarzania, aby przeanalizować próbki zgodnie z wybranymi ustawieniami.
    4. Wybierz wszystkie próbki i kliknij przycisk Wykres, aby wyświetlić piki sondy.
    5. Powiększ obszar piku, aby uzyskać wyższą rozdzielczość poszczególnych pików sondy. Upewnij się, że wszystkie 10 pików odpowiadających sondom z mieszanki sond LINE-1 jest oznaczonych. Odrzuć dodatkowe piki (<95 pz i >160 pz).
    6. Na karcie Genotypy wyeksportuj wyniki w formacie wartości rozdzielanych przecinkami (CSV).
  2. Otwórz plik CSV w oprogramowaniu do analizy danych i posortuj dane w kolumnach.
    1. Oznacz trzy piki miejsca metylacji na podstawie ich przybliżonych rozmiarów (L1-1m przy 153 pz, L1-2m przy 119 pz, L1-3m przy 133 pz). Pozostałe siedem pików odpowiada sondom kontrolnym.
      UWAGA: W tym przypadku używane są wartości pików sondy L1-2m, które mają rozmiar 117 pz, ponieważ ten obszar był używany w większości testów metylacji LINE-123.
    2. Dla każdej próbki (niestrawionej i strawionej) należy obliczyć powierzchnię pików sumy wszystkich siedmiu pików kontrolnych. Podziel powierzchnię piku każdej sondy LINE-1 przez tę sumę.
    3. Dla każdej próbki DNA należy podzielić wartość strawionej próbki przez wartość próbki niestrawionej, aby uzyskać stosunek dawki metylacji (DM), stosując następujące równanie:
      figure-protocol-1
      gdzie: DM to stosunek dawki metylacji, Ax to obszar pod pikiem x (np. pik L1-2m), a Actrl to suma powierzchni piku wszystkich siedmiu sond kontrolnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym celem tego badania była ocena epigenetycznego wpływu OS-EV na MSC. OS-EV zostały wyizolowane z komórek HOS-143B przy użyciu standardowej metody wirowania różnicowego. Ekspresja typowych markerów EV CD63, Hsp70 i TSG101 za pomocą western blot potwierdziła obecność OS-EV. (Rysunek 2A). Brak sygnału kalneksyny wskazywał na czystość izolatu OS-EV. Dodatkowe wskazanie czystości zaobserwowano w przypadku TEM, z obecnymi nienaruszonymi pęcherzykami o różnych rozmiarach (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to ilustruje, w jaki sposób MSPA może być wykorzystany do wykrywania i ilościowego określania stanu metylacji określonego elementu genetycznego. Skupiono się tutaj na LINE-1, ale sondy można zaprojektować tak, aby celowały w szereg genów i sekwencji. Co więcej, istnieje coraz dłuższa lista dostępnych mieszanek sond do różnych zastosowań. MSPA to prosta i solidna technika analizy metylacji DNA, która nie wymaga konwersji wodorosiarczynu10. Cała procedura, od przygotowania próbki do analizy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Uniwersytet Helsiński (WBS490302, WBS73714112), Szpital Uniwersytecki w Helsinkach, państwowe fundusze na badania nad zdrowiem na poziomie uniwersyteckim (Y1014SUL05, TYH2016130), Fińsko-Norweską Fundację Medyczną oraz Fundusz Selmy i Maja-Lisy Selander (Fundacja Minerva). Dziękujemy firmie Walter Pavicic za dostarczenie zmodyfikowanego protokołu MSPA i związane z nim wsparcie techniczne. Jesteśmy wdzięczni Teemu Masalin (Uniwersytet w Helsinkach) za pomoc w produkcji wideo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 1 mlTerumoSS+01T1do płytki 24-dołkowej NTA
Corning3524MSC Hodowla
komórkowa Analizator DNA 3730xlApplied Biosystems, ThermoFisher Scientific3730XL
50 mL Probówka wirówkowaCorning430829
Beckman Optima LE-80K UltrawirówkaBeckman
BlueStar Prestained Protein MarkerNippon GeneticsMWP03WB: marker białkowy
Calnexin (klon C5C9)Cell Signaling Technology2679WB, rozcieńczenie 1:800
CD63 (klon H5C6)BD Biosciences556019WB, rozcieńczenie 1:1000
Wirówka 5702 REppendorf5703000010Do kondycjonowanych pożywek i komórek
Wirówka 5810Eppendorf5810000010Do wirowania 96-dołkowej płytki
Probówka wirówkowa (poliallomer, 14x95 mm)Beckman331374Ultrawirowanie
DMEM/F-12 + pożywka GlutaMAXGibco, Life Technologies31331-028Do hodowli AT-MSC
Surowica bydlęcapłodu Gibco, Life Technologies10270-106
GeneScan 500 LIZ rozmiar standardowyZastosowany Biosystems, Life Technologies4322682do elektroforezy kapilarnej
Zestaw do kompletnej amplifikacji całego genomu (WGA) GenomePlexSigmaWGA2-10RXNdo kontroli negatywnej MSPA
Formamid Hi-DiApplied Biosystems, Life Technologies4311320do elektroforezy kapilarnej
Linia komórkowa HOS-143BATCCCRL-8303
Hsp70 (klon 5G10)BD Biosciences554243WB, rozcieńczenie 1:1000
IRDye 800CW Kozia anty-mysiaLi-Cor926-32210WB: wtórny
IRDye 800CW Koza anty-królikLi-Cor926-32211WB: wtórne
startery sondy i mieszanki LINE-1IDTw tabeli 1
MicroAmp Optykalna 96-dołkowa płytka reakcyjna z kodem kreskowymBiosystemy stosowane, Technologie życia4306737wymaga również folii uszczelniającej
Zestaw do oznaczania białek Micro BCAThermoFisher Scientific23235mierzy stężenie białka
MiniProtean TGX 10% żeleBio-Rad456-1034WB: elektroforeza żelowa
NanoSight LM14CMalvern Instrumentsdo membrany
nitrocelulozowej NTA 0,2 i mikro; mBio-Rad1620112WB: transfer białek
NucleoSpin Tissue XSMacherey-Nagel740901.50do ekstrakcji DNA
Odyssey Blocking BufferLi-Cor927-40000WB: blokowanie, przeciwciała
PBS, 1XCorning21-040-CVR
Penicylina-streptomycynaGibco, Life TechnologiesDE17-602EAntybiotyki do pożywka
hodowlana Probówka białkowa LoBind, 0,5 mlEppendorf22431064Do przechowywania Evs
REVERT Total Protein Stain and Wash Solution KitLi-Cor926-11015WB: całkowita linia
komórkowa RKOATCCCRL-2577do kontroli pozytywnej MSPA
Pożywka RPMI 1640 + GlutaMAXGibco, Life Technologies61870-010Do hodowli komórkowych HOS-143B
SALSA MLPA HhaI enzymMRC-HollandSMR50
Zestaw odczynników SALSA MLPAMRC-HollandEK1-FAM
SALSA MLPA P300 probe-mixMRC-HollandP300-100R
Rotor wahadłowy SW-28Beckman Coulter342207Ultrawirówka
Filtr strzykawkowy, 0,22 i mikro; mJet BiofilFPE-204-030sterylna filtracja FBS
Tecnai 12FEI Firmawyposażona w kamerę CCD Gatan Orius SC
1000B
(Gatan Inc., USA); dla TEM
TBS, 1X tabletkiMedicago09-7500-100WB: bufor
Trans-Blot TurboBio-RadWB: transfer
TermocyklerThermoFisher Scientific
TrypLE ExpressGibco12604-021do trypsynizacji komórek
TSG101 (klon 4A10)SigmaSAB2702167WB, rozcieńczenie 1:500
Sekwencje do barwienia białek TCA0096

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Esteller, M. Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps. Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).
  2. Herman, J. G., Baylin, S. B. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).
  3. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  4. Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice. Oncogene. 27, 404-408 (2008).
  5. Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409, 860-921 (2001).
  6. Rodriguez, J., et al. Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers. Cancer Research. 66, 8462(2006).
  7. Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. The epigenetic progenitor origin of human cancer. Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).
  8. Bock, C., et al. BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing. Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).
  9. Schouten, J. P., et al. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Research. 30, 57(2013).
  10. Nygren, A. O. H., et al. Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences. Nucleic Acids Research. 33 (14), 128(2005).
  11. El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).
  12. Vallabhaneni, K. C., et al. Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites. Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).
  13. Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication. Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).
  14. Lee, T. H., et al. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular "debris". Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).
  15. Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214(2019).
  16. Mannerström, B., et al. Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles. Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).
  17. Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783(2014).
  18. Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA. Scientific Reports. 6, 31175(2016).
  19. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674(2018).
  20. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).
  21. Puhka, M., et al. Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes. Theranostics. 7 (16), 3824(2017).
  22. Peltoniemi, H. H., et al. Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).
  23. Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltomäki, P. LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer. Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).
  24. L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2). , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269 (2000).
  25. Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland. , Available from: https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes (2018).
  26. Takara Bio Inc. , Available from: https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview (2018).
  27. Pisanic, R., et al. Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions. The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Technika MSPAEV z osteosarcomaultrawirowanieFBS pozbawione EVelektroforeza kapilarnaWestern blottingledzenie nanocz steczektransmisyjna mikroskopia elektronowa

Powiązane artykuły