Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza metylacji LINE-1 w mezenchymalnych komórkach macierzystych leczonych pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi pochodzącymi z kostniakomięsaka

5.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60705

⸱

1 lutego 2020

 ,  ,  , 
1Department of Oral and Maxillofacial Diseases, University of Helsinki, 2Helsinki University Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisane tutaj jest użycie metody amplifikacji sondy specyficznej dla metylacji do analizy poziomów metylacji elementów LINE-1 w mezenchymalnych komórkach macierzystych leczonych pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi pochodzącymi z kostniakomięsaka. Wykazano również ultrawirowanie, popularną procedurę oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od płodowej surowicy bydlęcej.

Streszczenie

Amplifikacja sondy specyficzna dla metylacji (MSPA) to prosta i solidna technika, która może być używana do wykrywania względnych różnic w poziomach metylacji próbek DNA. Jest zaradny, wymaga niewielkich ilości DNA i zajmuje około 4-5 godzin pracy praktycznej. W prezentowanej technice próbki DNA są najpierw denaturowane, a następnie hybrydyzowane do sond, które celują w DNA w miejscach metylowanych lub referencyjnych jako kontrolę. Zhybrydyzowane DNA jest rozdzielane na równoległe reakcje, z których jedna przechodzi tylko ligację, a druga ligację, po której następuje trawienie za pośrednictwem HhaI w niemetylowanych sekwencjach GCGC. Powstałe w ten sposób fragmenty DNA są amplifikowane metodą PCR i rozdzielane za pomocą elektroforezy kapilarnej. Metylowane miejsca GCGC nie są trawione przez HhaI i wytwarzają sygnały szczytowe, podczas gdy niemetylowane miejsca GCGC są trawione i nie są generowane żadne sygnały szczytowe. Porównanie znormalizowanych kontrolnie pików strawionych i niestrawionych wersji każdej próbki zapewnia stosunek dawki metylacji próbki DNA. W tym przypadku MSPA służy do wykrywania wpływu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z kostniakomięsaka na stan metylacji długo przeplatanego pierwiastka jądrowego-1 (LINE-1) w mezenchymalnych komórkach macierzystych. LINE-1 to powtarzalne elementy DNA, które zazwyczaj ulegają hipometylacji w raku i w tym charakterze mogą służyć jako biomarker. Ultrawirowanie jest również stosowane jako opłacalna metoda oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od płynów biologicznych (tj. podczas przygotowywania płodowej surowicy bydlęcej o zubożonej w EV [FBS] i izolowania EV z pożywki kondycjonowanej kostniakomięsakiem [wirowanie różnicowe]). Do analizy metylacji niestandardowe sondy LINE-1 są zaprojektowane tak, aby celować w trzy miejsca metylacji w sekwencji promotora LINE-1 i siedem miejsc kontrolnych. Protokół ten demonstruje zastosowanie MSPA do analizy metylacji LINE-1 i opisuje przygotowanie FBS zubożonego w EV przez ultrawirowanie.

Wprowadzenie

Metylacja DNA to główna modyfikacja epigenetyczna zachodząca w komórkach ludzkich. Metylacja DNA odnosi się do powiązania grup metylowych z resztami cytozyny w dinukleotydach CpG. Takie dinukleotydy zwykle znajdują się w klastrach (wyspach CpG) w regionie 5' genów1. W normalnych komórkach większość tych dinukleotydów występuje w stanie niemetylowanym, co umożliwia transkrypcję DNA. Nawiasem mówiąc, wiele nowotworów jest związanych z hipermetylowanymi wyspami CpG i wyciszaniem transkryptomicznym2, szczególnie w genach supresorowych nowotworów, które z kolei przyczyniają się do różnych cech charakterystycznych raka3.

Z drugiej strony, długo przeplatane elementy jądrowe-1 (LINE-1 lub L1) są powtarzalnymi, transpozycyjnymi elementami DNA, które normalnie mają wysoki poziom metylacji na wyspach CpG. Metylacja LINE-1 zapobiega translokacji i pomaga w utrzymaniu integralności genomu. W kilku typach nowotworów LINE-1 jest hipometylowany, co powoduje aktywację, a następnie niestabilność chromosomalną za pośrednictwem retrotranspozycji4. LINE-1 stanowi prawie 17% ludzkiego genomu5, a jego status metylacji może służyć jako wskaźnik globalnych poziomów metylacji genomu6. Uważa się, że globalna hipometylacja LINE-1 poprzedza przejście komórek do fenotypu nowotworu7; W związku z tym jest obiecujący jako potencjalny marker wczesnego początku raka.

Obecnie istnieje kilka metod analizy metylacji, w tym pirosekwencjonowanie, PCR specyficzny dla metylacji, mikromacierze i immunoprecypitacja chromatyny1. Zastosowanie sekwencjonowania nowej generacji umożliwiło również włączenie podejść do wykrywania metylacji DNA obejmujących cały genom. Wiele z tych metod opiera się na DNA poddanym działaniu wodorosiarczynu, w którym niemetylowane cytozyny są przekształcane w uracyl, a cytozyny metylowane pozostają niezmienione. Jednak praca z DNA poddanym działaniu wodorosiarczynu wiąże się z kilkoma pułapkami, takimi jak niekompletna konwersja niemetylowanych cytozyn do uracylu, tendencyjna amplifikacja sekwencji i błędy sekwencjonowania8.

W amplifikacji sondy specyficznej dla metylacji (MSPA), sondy złożone z dwóch oligonukleotydów celują w sekwencje DNA zawierające miejsce restrykcyjne (GCGC) dla wrażliwego na metylację enzymu restrykcyjnego HhaI9. Po hybrydyzacji sond z DNA, każda próbka jest dzielona na dwa zestawy. Sondy w pierwszym zestawie poddawane są podwiązaniu, podczas gdy sondy w drugim zestawie poddawane są podwiązaniu, a następnie trawieniu za pośrednictwem HhaI w niemetylowanych miejscach CGCG. Oba zestawy próbek są następnie amplifikowane metodą PCR, a produkty są rozdzielane za pomocą elektroforezy kapilarnej. Sondy w miejscach niemetylowanych są trawione przez HhaI i nie są wzmacniane podczas PCR, co skutkuje brakiem sygnałów szczytowych. W przeciwieństwie do tego, sondy w miejscach metylacji są chronione przed trawieniem i dlatego są wzmacniane podczas PCR, a następnie generują sygnały szczytowe10.

MSPA ma kilka zalet w porównaniu z alternatywnymi metodami. Po pierwsze, wymaga niewielkiej ilości DNA (50–100 ng) i dobrze nadaje się do analizy DNA z próbek zatopionych w parafinie utrwalonym w formalinie10. Nie wymaga DNA poddanego działaniu wodorosiarczynu; w rzeczywistości nie nadaje się do DNA, które jest modyfikowane w ten sposób. Wiele próbek może być analizowanych w tym samym czasie, a sondy MSPA mogą być zaprojektowane tak, aby celowały w wiele genów lub sekwencji jednocześnie. Dodatkowo sondy są specyficzne i wrażliwe na metylowane DNA, ponieważ miejsce restrykcyjne HhaI odpowiada sekwencji typowej dla wysp CpG10.

To badanie dotyczyło wpływu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z kostniakomięsaka (OS) na metylację LINE-1 w mezenchymalnych komórkach macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (AT-MSC; Rysunek 1). EV to nanoskalowe, połączone błoną pęcherzyki wydzielane przez większość typów komórek. Przenoszą białka, lipidy, mRNA, mikroRNA i dodatkowe cząsteczki z komórek macierzystych11,12. EV pośredniczą w komunikacji międzykomórkowej i odgrywają ważną rolę w kilku stanach patofizjologicznych13,14. Niedawne badanie wykazało, że EV pochodzące z raka mogą przenosić aktywną LINE-1 do komórek biorcy15. Wcześniej informowano, że EV z linii komórkowej HOS-143B mogą zmieniać status metylacji LINE-1 w MSC, oprócz innych efektów genetycznych16.

Podczas hodowli komórek do izolacji EV, ważne jest, aby używać w pożywce wzrostowej surowicy bydlęcej zubożonej w EV, ponieważ EV pochodzące z FBS mogą zakłócać EV z innych źródeł i utrudniać wyniki17,18. Ultrawirowanie jest jedną z najczęstszych metod wyczerpywania EV z FBS. Jest to stosunkowo prosta i opłacalna procedura w porównaniu z alternatywami, takimi jak ultrafiltracja i komercyjne FBS19. W tym przypadku protokół pokazuje również, jak przygotować FBS zubożony w EV za pomocą ultrawirowania.

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół dla wyżej wymienionych technik, od izolacji EV z linii komórkowej OS do analizy metylacji LINE-1 w MSC traktowanych OS-EV (Rysunek 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Okręgu Szpitalnego Helsinki i Uusimaa (zatwierdzenie etyczne nr D. 217/13/03/02/2015).

1. Przygotowanie FBS pozbawionego EV metodą ultrawirowania

  1. Przenieść FBS do probówek do (ultra)wirowania i umieścić je w koszyczkach ultrawirowarki. Aby zapewnić płynny i bezpieczny przebieg ultrawirowania, należy zrównoważyć masę koszyczków z dokładnością do 10 mg.
  2. Załaduj wiadra do rotora z kątem (typ SW28, k-factor 246). Umieść rotor w ultrawirówce i wiruj przy 10 0 x g przez 19 h w temperaturze 4 °C.
  3. Kolejno i ostrożnie pobierz jasną górną warstwę supernatantu (około dziewięć dziesiątych objętości) i przenieś ją do probówki o pojemności 50 ml. Nie naruszaj i nie pipetuj ciemnobrązowego osadu, ponieważ zawiera on pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) z FBS.
  4. Przenieś nadnadkład przez 0.22 µm przefiltrować do nowej probówki o pojemności 50 ml.
  5. Podczas hodowli komórek do izolacji EV, do pożywek hodowlanych należy dodać filtrowaną sterylnie, pozbawioną EV płodową surowicę bydlęcą (FBS).

2. Izolacja EV pochodzących z osteosarkoma

  1. Wysiać komórki OS (linia komórkowa HOS-143B) do kolby T-175 z pożywką RPMI 1640, uzupełnioną o 10% normalnej FBS i 1% antybiotyków (10 U/mL penicyliny, 0,1 mg/mL streptomycyny). Umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.
  2. Gdy komórki w kolbie osiągną 70%–80% konfluencji, przemyć je solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), a następnie hodować w pożywce zawierającej 10% FBS pozbawionej EV (dalej nazywanej pożywką pozbawioną EV).
    UWAGA: 1 x 106 komórek HOS-143B wysianych do kolby T175 osiąga 70% konfluencji po około 60 h.
  3. W ciągu kolejnych 48 h zbierać pożywkę warunkową z komórek osteosarcoma co 24 h i dodawać świeżą pożywkę pozbawioną EV.
  4. Wiruwać pożywkę warunkową przy 250 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C w celu usunięcia komórek i szczątków komórkowych. Przenieść supernatant do nowej probówki, pozostawiając około 2 mL pożywki na dnie.
    UWAGA: Jeśli izolacja EV nie jest przeprowadzana bezpośrednio na tym etapie, supernatant można przechowywać w temperaturze -80 ᵒC.
  5. Przelać supernatant do probówek do ultrawirówki i zrównoważyć je jak wcześniej. Wirować probówki przy 10 0 x g przez 2 h w temperaturze 4 °C.
  6. Ostrożnie usunąć supernatant, pozostawiając około 1 mL na dnie. Dodać do probówki około 20 mL PBS (filtrowanego przez 0,1 µm) i delikatnie pipetować, aby przemyć i resuspender osad EV.
  7. Zrównoważyć probówki i przeprowadzić kolejną rundę ultrawirowania przy tych samych ustawieniach.
  8. Ostrożnie usunąć supernatant i resuspender osad EV w 20 µL PBS poprzez delikatne pipetowanie. Przechowywać EV w probówkach o niskim stopniu wiązania (low binding).
    UWAGA: EV można wykorzystać natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

3. Charakterystyka OS-EV

UWAGA: Oczyszczone EV można scharakteryzować za pomocą western blottingu (WB), analizy śledzenia nanocząstek (NTA) oraz transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM)16.

  1. Przeprowadź analizę WB zgodnie ze standardowym protokołem16, wykorzystując markery EV CD63, TSG101 i Hsp70 oraz kalneksynę jako kontrolę negatywną w celu oceny czystości próbki EV20.
  2. W przypadku NTA najpierw rozcieńcz próbkę EV w filtrowanym przez filtr 0,1 µm PBS-ie Dulbecco, aby uzyskać (idealnie) 30–10 cząsteczek na klatkę.
    1. Pobierz około 50 µL próbki do strzykawki 1 mL i wprowadź ją do portu wlotowego urządzenia NTA. Sprawdź, czy liczba cząsteczek na klatkę jest wystarczająca do uzyskania dokładnych pomiarów.
    2. Uruchom oprogramowanie NTA i nagraj pięć filmów o czasie trwania 60 s, używając poziomu kamery 13 w temperaturze otoczenia. Podczas analizy zastosuj próg detekcji (detection threshold) = 5 oraz wzmocnienie (gain) = 10.
  3. Próbki EV przeanalizuj metodą TEM zgodnie z wcześniejszym opisem21.

4. Hodowla AT-MSC

UWAGA: Ludzka tkanka tłuszczowa do izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych została dostarczona w formie aspiratu z liposukcji (Department of Plastic Surgery, Laser Tilkka Ltd., Finlandia). Od dawców lipoaspiratu, którzy poddawali się planowym zabiegom liposukcji, uzyskano pisemną zgodę na udział w badaniu.

  1. Wyizolować AT-MSCs z aspiratów liposukcyjnych, stosując standardowe metody izolacji mechanicznej i enzymatycznej2.
    UWAGA: Można również stosować MSCs z innych źródeł (w tym komercyjne linie komórkowe).
  2. Hodować komórki w pożywce DMEM/F-12 uzupełnionej o 10% FBS i 1% antybiotyków.

5. Traktowanie MSCs za pomocą OS-EVs

  1. Wysiać 15 0 AT-MSCs na każdą studzienkę płytki 24-dołkowej.
  2. Po 24 h usunąć stare medium, przemyć komórki PBS i zmienić medium na pozbawione EV.
  3. Traktować komórki OS-EVs (przy stężeniu cząstek 1 x 106 EVs na komórkę) w dniu 1. (24 h po adhezji komórek), dniu 3. (48 h po dniu 1.) oraz w dniu 5. (96 h po dniu 1.).
    1. Przerwać traktowanie OS-EV dla próbek z punktu czasowego (TP) 0 w dniu 1., próbek TP 3 w dniu 3. i próbek TP 7 w dniu 7. (48 h po dniu 5.).
      UWAGA: Można również stosować inne harmonogramy punktów czasowych zgodnie z planami eksperymentalnymi.
  4. Wyekstrahować DNA z MSCs przy użyciu odpowiedniej metody. Do analizy danych dołączyć próbki kontrolne pozytywne i negatywne.

6. Analiza metylacji LINE-1

  1. Zaprojektuj spersonalizowane primery do sond LINE-1, zgodnie z metodą opisaną wcześniej przez Pavic i wsp.23. W przypadku sond metylacji wybierz trzy sekwencje zawierające miejsce restrykcyjne HhaI w regionie promotora LINE-1. W przypadku sond kontrolnych wybierz siedem sekwencji pozbawionych miejsca restrykcyjnego HhaI z pozostałej części sekwencji LINE-1.
    UWAGA: Sekwencja LINE-1 jest dostępna w bazie danych GenBank24 (L1.2, numer dostępu AH005269.2). Do projektowania sond należy użyć instrukcji producenta MSPA25.
  2. Rozcieńcz 70 ng próbki DNA w buforze TE do objętości 5 µL.
  3. Przeprowadź kolejne etapy termocyklingu i PCR zgodnie z Tabelą 1. Próbki podgrzewaj przez 10 min w 98 °C, a następnie schłodź do 25 °C.
  4. Dodaj 3 µL mieszaniny do hybrydyzacji sond do każdej próbki i uruchom termocykler, aby umożliwić hybrydyzację sond z DNA.
  5. W temperaturze pokojowej (RT) dodaj 13 µL mieszaniny pohybrydyzacyjnej do każdej próbki. Przenieś 10 µL do drugiej probówki.
  6. Umieść oba zestawy probówek w termocyklerze i inkubuj w 48 °C przez co najmniej 1 min.
    1. Gdy próbki znajdują się w 48 °C, dodaj 10 µL mieszaniny ligacyjnej do pierwszego zestawu probówek (seria niepoddana trawieniu) oraz 10 µL mieszaniny ligacyjno-trawiennej do drugiego zestawu probówek (seria poddana trawieniu). Uruchom kolejny program termocyklera.
  7. Odwiruj probówki i jednocześnie ustaw termocykler na 72 °C.
  8. Dodaj 5 µL mieszaniny polimerazy do każdej probówki i umieść probówki w termocyklerze. Uruchom program PCR.
  9. Podczas trwania programu PCR przygotuj roztwór 1 mL formamidu zawierający 2,5 µL standardu wielkości. Pipetuj 10 µL tego roztworu do każdej studzienki optycznej płytki 96-dołkowej (z kodem kreskowym).
  10. Po PCR rozcieńcz próbki nietrawione i trawione odpowiednio w stosunku 1:10 i 1:20 w wodzie ultrapure. Dodaj 2 µL rozcieńczonego produktu PCR do płytki 96-dołkowej. Odwiruj płytkę przy 20 x g przez 15–20 s, aby usunąć pęcherzyki powietrza.
  11. Przeprowadź analizę fragmentów próbek metodą elektroforezy kapilarnej.
    UWAGA: Płytkę należy przechowywać w 4 °C w ciemności do czasu analizy.

7. Analiza danych fragmentów

  1. Otwórz wyniki elektroforezy kapilarnej w oprogramowaniu do analizy elektroferogramów.
    1. Pod Panel kolumna, dla jednej z próbek, wybrać MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) z menu. Kliknij w Panel nagłówek i prasa Ctrl+D zastosować MLPA (wielokrotna analiza ligacji zależna od ligacji) do wszystkich próbek.
    2. W ten sam sposób ustaw Metoda analizy Proszę podać tekst do tłumaczenia. Domyślne ustawienia mikrosatelitów dla wszystkich próbek.
    3. Zaznacz wszystkie próbki i kliknij w Zielone odtworzenie przycisk do analizy próbek zgodnie z wybranymi ustawieniami.
    4. Zaznacz wszystkie próbki i kliknij w Wykres przycisk do wizualizacji pików sondy.
    5. Powiększ obszar piku, aby uzyskać wyższą rozdzielczość poszczególnych pików sond. Upewnij się, że wszystkie 10 pików odpowiadających sondom z mieszaniny sond LINE-1 zostało oznakowanych. Odrzuć dodatkowe piki (<95 pz i >160 bp).
    6. W Genotypy zakładka, wyeksportuj wyniki w formacie wartości rozdzielanych przecinkami (CSV).
  2. Otwórz plik CSV w oprogramowaniu do analizy danych i podziel dane na kolumny.
    1. Oznacz trzy piki miejsc metylacji na podstawie ich przybliżonych rozmiarów (L1-1m przy 153 bp, L1-2m przy 19 bp, L1-3m przy 133 bp). Pozostałe siedem pików odpowiada sondom kontrolnym.
      UWAGA: W tym przypadku wykorzystano wartości pików sondy L1-2m o wielkości 17 bp, ponieważ region ten był stosowany w większości testów metylacji LINE-123.
    2. Dla każdej próbki (nientrawionej i trawionej) oblicz sumę pól wszystkich siedmiu pików kontrolnych. Pole piku każdej sondy LINE-1 podziel przez uzyskaną sumę.
    3. Dla każdej próbki DNA podziel wartość próbki poddanej trawieniu przez wartość próbki nietrawionej, aby otrzymać stosunek dawki metylacji (DM) przy użyciu następującego równania:
      Równanie analizy trawienia DNA, stosunek absorbancji, wzór do porównywania danych eksperymentalnych.
      Gdzie: DM stosunek dawki metylowania, Ax czy jest to pole pod pikiem Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. (np. szczyt L1-2m) oraz Agrupa kontrolna jest sumą pól powierzchni piku wszystkich siedmiu sond kontrolnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Głównym celem niniejszego badania była ocena efektów epigenetycznych OS-EVs w odniesieniu do MSCs. OS-EVs wyizolowano z komórek HOS-143B, stosując standardową metodę wirowania różnicowego. Ekspresja typowych markerów EV, takich jak CD63, Hsp70 i TSG101, potwierdzona za pomocą western blottingu, dowiodła obecności OS-EVs (Rycina 2A). Brak sygnału kalneksyny wskazywał na czystość izolatu OS-EV. Dodatkowym potwierdzeniem czystości była analiza TEM, w której zaobserwowano nienar...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badanie to ilustruje, w jaki sposób MSPA może być wykorzystany do wykrywania i ilościowego określania stanu metylacji określonego elementu genetycznego. Skupiono się tutaj na LINE-1, ale sondy można zaprojektować tak, aby celowały w szereg genów i sekwencji. Co więcej, istnieje coraz dłuższa lista dostępnych mieszanek sond do różnych zastosowań. MSPA to prosta i solidna technika analizy metylacji DNA, która nie wymaga konwersji wodorosiarczynu10. Cała procedura, od przygotowania próbki do analizy ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Uniwersytet Helsiński (WBS490302, WBS73714112), Szpital Uniwersytecki w Helsinkach, państwowe fundusze na badania nad zdrowiem na poziomie uniwersyteckim (Y1014SUL05, TYH2016130), Fińsko-Norweską Fundację Medyczną oraz Fundusz Selmy i Maja-Lisy Selander (Fundacja Minerva). Dziękujemy firmie Walter Pavicic za dostarczenie zmodyfikowanego protokołu MSPA i związane z nim wsparcie techniczne. Jesteśmy wdzięczni Teemu Masalin (Uniwersytet w Helsinkach) za pomoc w produkcji wideo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 1 mlTerumoSS+01T1do płytki 24-dołkowej NTA
Corning3524MSC Hodowla
komórkowa Analizator DNA 3730xlApplied Biosystems, ThermoFisher Scientific3730XL
50 mL Probówka wirówkowaCorning430829
Beckman Optima LE-80K UltrawirówkaBeckman
BlueStar Prestained Protein MarkerNippon GeneticsMWP03WB: marker białkowy
Calnexin (klon C5C9)Cell Signaling Technology2679WB, rozcieńczenie 1:800
CD63 (klon H5C6)BD Biosciences556019WB, rozcieńczenie 1:1000
Wirówka 5702 REppendorf5703000010Do kondycjonowanych pożywek i komórek
Wirówka 5810Eppendorf5810000010Do wirowania 96-dołkowej płytki
Probówka wirówkowa (poliallomer, 14x95 mm)Beckman331374Ultrawirowanie
DMEM/F-12 + pożywka GlutaMAXGibco, Life Technologies31331-028Do hodowli AT-MSC
Surowica bydlęcapłodu Gibco, Life Technologies10270-106
GeneScan 500 LIZ rozmiar standardowyZastosowany Biosystems, Life Technologies4322682do elektroforezy kapilarnej
Zestaw do kompletnej amplifikacji całego genomu (WGA) GenomePlexSigmaWGA2-10RXNdo kontroli negatywnej MSPA
Formamid Hi-DiApplied Biosystems, Life Technologies4311320do elektroforezy kapilarnej
Linia komórkowa HOS-143BATCCCRL-8303
Hsp70 (klon 5G10)BD Biosciences554243WB, rozcieńczenie 1:1000
IRDye 800CW Kozia anty-mysiaLi-Cor926-32210WB: wtórny
IRDye 800CW Koza anty-królikLi-Cor926-32211WB: wtórne
startery sondy i mieszanki LINE-1IDTw tabeli 1
MicroAmp Optykalna 96-dołkowa płytka reakcyjna z kodem kreskowymBiosystemy stosowane, Technologie życia4306737wymaga również folii uszczelniającej
Zestaw do oznaczania białek Micro BCAThermoFisher Scientific23235mierzy stężenie białka
MiniProtean TGX 10% żeleBio-Rad456-1034WB: elektroforeza żelowa
NanoSight LM14CMalvern Instrumentsdo membrany
nitrocelulozowej NTA 0,2 i mikro; mBio-Rad1620112WB: transfer białek
NucleoSpin Tissue XSMacherey-Nagel740901.50do ekstrakcji DNA
Odyssey Blocking BufferLi-Cor927-40000WB: blokowanie, przeciwciała
PBS, 1XCorning21-040-CVR
Penicylina-streptomycynaGibco, Life TechnologiesDE17-602EAntybiotyki do pożywka
hodowlana Probówka białkowa LoBind, 0,5 mlEppendorf22431064Do przechowywania Evs
REVERT Total Protein Stain and Wash Solution KitLi-Cor926-11015WB: całkowita linia
komórkowa RKOATCCCRL-2577do kontroli pozytywnej MSPA
Pożywka RPMI 1640 + GlutaMAXGibco, Life Technologies61870-010Do hodowli komórkowych HOS-143B
SALSA MLPA HhaI enzymMRC-HollandSMR50
Zestaw odczynników SALSA MLPAMRC-HollandEK1-FAM
SALSA MLPA P300 probe-mixMRC-HollandP300-100R
Rotor wahadłowy SW-28Beckman Coulter342207Ultrawirówka
Filtr strzykawkowy, 0,22 i mikro; mJet BiofilFPE-204-030sterylna filtracja FBS
Tecnai 12FEI Firmawyposażona w kamerę CCD Gatan Orius SC
1000B
(Gatan Inc., USA); dla TEM
TBS, 1X tabletkiMedicago09-7500-100WB: bufor
Trans-Blot TurboBio-RadWB: transfer
TermocyklerThermoFisher Scientific
TrypLE ExpressGibco12604-021do trypsynizacji komórek
TSG101 (klon 4A10)SigmaSAB2702167WB, rozcieńczenie 1:500
Sekwencje do barwienia białek TCA0096

Bibliografia

  1. Esteller, M. Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps. Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).
  2. Herman, J. G., Baylin, S. B. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).
  3. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  4. Howard, G., Eiges, R., Gaudet, F., Jaenisch, R., Eden, A. Activation and transposition of endogenous retroviral elements in hypomethylation induced tumors in mice. Oncogene. 27, 404-408 (2008).
  5. Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409, 860-921 (2001).
  6. Rodriguez, J., et al. Chromosomal instability correlates with genome-wide DNA demethylation in human primary colorectal cancers. Cancer Research. 66, 8462(2006).
  7. Feinberg, A. P., Ohlsson, R., Henikoff, S. The epigenetic progenitor origin of human cancer. Nature Reviews Genetics. 7, 21-33 (2006).
  8. Bock, C., et al. BiQ Analyzer: visualization and quality control for DNA methylation data from bisulfite sequencing. Bioinformatics. 21 (11), 4067-4068 (2005).
  9. Schouten, J. P., et al. Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent probe amplification. Nucleic Acids Research. 30, 57(2013).
  10. Nygren, A. O. H., et al. Methylation-Specific MLPA (MS-MLPA): simultaneous detection of CpG methylation and copy number changes of up to 40 sequences. Nucleic Acids Research. 33 (14), 128(2005).
  11. El Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 347-357 (2013).
  12. Vallabhaneni, K. C., et al. Extracellular vesicles from bone marrow mesenchymal stem/stromal cells transport tumor regulatory microRNA, proteins, and metabolites. Oncotarget. 6 (7), 4953-4967 (2015).
  13. Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, A., Ratajczak, M. Z. Membrane- derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication. Leukemia. 20, 1487-1495 (2006).
  14. Lee, T. H., et al. Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer- the emerging science of cellular "debris". Seminars in Immunopathology. 33, 455-467 (2011).
  15. Kawamura, Y., Calle, A. S., Yamamoto, Y., Sato, T., Ochiya, T. Extracellular vesicles mediate the horizontal transfer of an active LINE-1 retrotransposon. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1643214(2019).
  16. Mannerström, B., et al. Epigenetic alterations in mesenchymal stem cells by osteosarcoma-derived extracellular vesicles. Epigenetics. 14 (4), 352-364 (2019).
  17. Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24783(2014).
  18. Wei, Z., Batagov, A. O., Carter, D. R., Krichevsky, A. M. Fetal bovine serum RNA interferes with the cell culture derived extracellular RNA. Scientific Reports. 6, 31175(2016).
  19. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7, 1422674(2018).
  20. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 1-29 (2006).
  21. Puhka, M., et al. Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes. Theranostics. 7 (16), 3824(2017).
  22. Peltoniemi, H. H., et al. Stem cell enrichment does not warrant a higher graft survival in lipofilling of the breast: A prospective comparative study. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66 (11), 1494-1503 (2013).
  23. Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltomäki, P. LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer. Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).
  24. L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2). , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269 (2000).
  25. Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland. , Available from: https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes (2018).
  26. Takara Bio Inc. , Available from: https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview (2018).
  27. Pisanic, R., et al. Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions. The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Technika MSPAEV z osteosarcomaultrawirowanieFBS pozbawione EVelektroforeza kapilarnaWestern blottingśledzenie nanocząsteczektransmisyjna mikroskopia elektronowa
Analiza metylacji LINE-1 w mezenchymalnych komórkach macierzystych leczonych pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi pochodzącymi z kostniakomięsaka
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.