Trójwymiarowe obrazowanie nienaruszonych organoidów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Postęp nowatorskich metod hodowli, takich jak technologia organoidów, umożliwił hodowlę organów w dish¹. Organoidy wyrastają w trójwymiarowe (3D) struktury, które przypominają tkankę, z której pochodzą, zachowując cechy fenotypowe i funkcjonalne. Organoidy odgrywają teraz zasadniczą rolę w rozwiązywaniu podstawowych problemów biologicznych², modelowaniu chorób, w tym raka³, oraz opracowywaniu spersonalizowanych strategii leczenia^4,5,6,7. Od czasu pierwszego protokołu generowania organoidów pochodzących z jelitowych dorosłych komórek macierzystych⁸, technologia organoidów rozszerzyła się, obejmując szeroki zakres zdrowych i nowotworowych tkanek pochodzących z narządów, w tym prostaty⁹, brain¹⁰, liver^11,12, żołądek¹³, breast^14,15, endometrium¹⁶, gruczoł ślinowy¹⁷, kubek smakowy¹⁸, trzustka¹⁹, oraz nerka²⁰.

Rozwój organoidów zbiegł się z powstaniem nowych technik mikroskopii wolumetrycznej, które mogą wizualizować architekturę całej tkanki wierzchowca w 3D^21,22,23,24. 3D obrazowanie jest lepsze od tradycyjnego obrazowania 2D przekroju tkanki w wizualizacji złożonej organizacji informacji o specimens. 3D biologicznym okazuje się niezbędne dla zrozumienie składu komórkowego, kształtu komórki, decyzji dotyczących losu komórki i interakcji komórka-komórka w nienaruszonych próbkach biologicznych. Nieniszczące techniki cięcia optycznego, takie jak konfokalna lub wielofotonowa laserowa mikroskopia skaningowa (CLSM i MLSM) oraz mikroskopia fluorescencyjna arkuszy świetlnych (LSFM), umożliwiają obecnie połączoną wizualizację zarówno drobnych szczegółów, jak i ogólnej architektury tkankowej w ramach pojedynczej próbki biologicznej. To potężne podejście do obrazowania daje możliwość zbadania złożoności strukturalnej, którą można modelować za pomocą organoids²⁵ i mapowania rozmieszczenia przestrzennego, tożsamości fenotypowej i stanu komórkowego wszystkich pojedynczych komórek tworzących te struktury 3D.

Niedawno opublikowaliśmy szczegółowy protokół obrazowania 3D w wysokiej rozdzielczości stałych i oczyszczonych organoidów²⁶. Protokół ten został specjalnie zaprojektowany i zoptymalizowany do przetwarzania delikatnych struktur organoidowych, w przeciwieństwie do metodologii dla dużych, nienaruszonych tkanek, takich jak DISCO^27,28, CUBIC^29,30,31 oraz CLARITY^32,33. W związku z tym metoda ta ma ogólne zastosowanie do szerokiej gamy organoidów różniących się pochodzeniem, rozmiarem i kształtem oraz zawartością komórkową. Ponadto, w porównaniu z innymi protokołami obrazowania wolumetrycznego, które często wymagają znacznego czasu i wysiłku, nasz protokół jest niewymagający i można go ukończyć w ciągu 3 dni. Zastosowaliśmy nasz protokół obrazowania 3D do wizualizacji architektury i składu komórkowego nowo opracowanych systemów organoidowych pochodzących z różnych tkanek, w tym ludzkich dróg oddechowych³⁴, kidney²⁰, liver¹¹ i organoidy ludzkiego raka piersi¹⁵. W połączeniu z wielobarwnym śledzeniem linii fluorescencyjnej, metoda ta została również wykorzystana do ujawnienia biopotencji komórek podstawnych w organoidach sutka myszy¹⁴.

Tutaj udoskonalamy protokół, wprowadzając nietoksyczny środek czyszczący FUnGI³⁵. Oczyszczanie FUnGI odbywa się w jednym kroku inkubacji, jest łatwiejsze do zamontowania ze względu na swoją lepkość i lepiej zachowuje fluorescencję podczas przechowywania. Ponadto wprowadzamy dodecylosiarczan sodu (SDS) do buforu płuczącego w celu wzmocnienia barwienia jądrowego, a także metodę montażu na bazie silikonu w celu łatwego przygotowania szkiełek przed mikroskopią. Rysunek 1 przedstawia graficzny przegląd protokołu (Rysunek 1A) oraz przykłady organoidów zobrazowanych w 3D (Rysunek 1B−D). Krótko mówiąc, organoidy są odzyskiwane z matrycy 3D, utrwalane i znakowane immunologicznie, optycznie oczyszczane, obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej, a następnie renderowane w 3D za pomocą oprogramowania do wizualizacji.

Użycie organoidów pochodzących od myszy było zgodne ze standardami regulacyjnymi i zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Instytutu Waltera i Elizy Hall (WEHI). Wszystkie próbki ludzkich organoidów zostały pobrane z biobanków za pomocą Hubrecht Organoid Technology (HUB, www.hub4organoids.nl). Komisja Etyki Medycznej UMC w Utrechcie (METC UMCU) uzyskała zezwolenia na wniosek HUB w celu zapewnienia zgodności z holenderską ustawą o badaniach medycznych z udziałem ludzi, a w stosownych przypadkach uzyskano świadomą zgodę od dawców.

1. Przygotowanie odczynników

1. Aby przygotować 4% (w/v) paraformaldehydu (PFA), należy podgrzać 400 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do temperatury nieco poniżej 60 °C w łaźni wodnej. Dodać 20 g proszku PFA i rozpuścić za pomocą mieszadła.
   1. Następnie dodaj kilka kropli 10 M NaOH. Pozostaw do ostygnięcia na lodzie i dodaj kilka kropli 10 M HCl, aby dostosować pH do 7,4. Uzupełnić PBS do 500 ml i podwielokrotności (przechowywać w temperaturze -20 °C do 2 miesięcy).
      UWAGA: Nie podgrzewaj powyżej 60 °C, aby uniknąć degradacji PFA. Czas przygotowania = 4 h.
2. Aby przygotować PBS z Tween-20 (PBT) (0,1% v/v), dodaj 1 ml Tween-20 do 1 l PBS (przechowywać w temperaturze 4 °C do 4 tygodni).
   UWAGA: Czas przygotowania = 10 min.
3. Aby przygotować 100 ml 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), dodaj 18,6 g EDTA i 2,5 g NaOH do 80 ml dH₂O. Dostosuj pH do 8 za pomocą 1 M NaOH i napełnij do 100 ml dH₂O.
4. Aby przygotować 500 ml 1 M Tris, rozpuść 60,55 g Tris w 42 ml stężonego (36−38%) HCl w 300 ml dH₂O. Dostosuj pH do 8 i napełnij do 500 ml.
5. Aby przygotować organoidowy bufor do przemywania (OWB), dodać 1 ml Triton X-100, 2 ml 10% (w/v) SDS i 2 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 1 l PBS (przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni).
   UWAGA: Czas przygotowania = 10 min.
6. Aby uzyskać 220 ml FUnGI, wymieszaj 110 ml glicerolu z 20 ml dH₂O, 2,2 ml buforu Tris (1 M, pH 8,0) i 440 μl EDTA (0,5 M). Dodaj 50 g fruktozy i mieszaj w temperaturze pokojowej (RT) w ciemności, aż się rozpuści. Gdy będzie klarowna, dodaj 49 g fruktozy i mieszaj aż do rozpuszczenia. Następnie dodać 33,1 g mocznika i mieszać aż do rozpuszczenia (przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności).
   UWAGA: Nie podgrzewaj, ponieważ fruktoza karmelizuje się w wyższych temperaturach. FUnGI składa się z 50% (v/v) glicerolu, 9,4% (v/v) dH2O, 10,6 mM zasady tris, 1,1 mM EDTA, 2,5 M fruktozy i 2,5 M mocznika. Czas przygotowania = 1 dzień.
7. Aby przygotować PBS-BSA (1% w/v), rozpuść 1 g BSA w 100 ml PBS (przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni).
   UWAGA: Czas przygotowania = 10 min.

2. Odzyskiwanie organoidów

UWAGA: Poniższe kroki dotyczą organoidów hodowanych w ekstrakcie z błony podstawnej (BME), które były hodowane na 24-dołkowej płytce o wielkości 100−500 μm.

1. Odessać pożywkę hodowlaną i przemyć 1x lodowatym PBS. Unikaj zakłócania pracy matrycy 3D.
2. Umieść płytkę na lodzie i dodaj 1 ml lodowatego roztworu do odzyskiwania komórek (tabela materiałów) do każdej studzienki. Inkubować 30−60 min w temperaturze 4 °C na wytrząsarce poziomej (40 obr./min).
   UWAGA: Kropelki matrycy 3D powinny być całkowicie rozpuszczone.
3. Pokryj końcówkę pipety o pojemności 1 ml BSA, zanurzając 1% PBS-BSA i pipetując w górę i w dół 2x. Ta powłoka zapobiegnie przywieraniu organoidów do końcówki. Aby pokryć wewnętrzną stronę stożkowej probówki o pojemności 15 ml, napełnij ją 5 ml 1% PBS-BSA, odwróć 2−3x i wyrzuć PBS-BSA.
   UWAGA: Ta powłoka jest niezbędna dla wszystkich materiałów eksploatacyjnych z tworzyw sztucznych do momentu zamocowania (krok 3.3).
4. Za pomocą powlekanej końcówki delikatnie ponownie zawiesić zawartość studzienki 5−10x i przenieść organoidy do powlekanych probówek o pojemności 15 ml. Organoidy z różnych dołków o tej samej tożsamości można połączyć w tej samej probówce.
5. Dodaj 1 ml lodowatego 1% PBS-BSA do każdej studzienki, aby wypłukać i zebrać wszystkie organoidy.
6. Dodać zimny PBS do 10 ml i wirować przez 3 minuty w temperaturze 70 x g i 4 °C, aby uzyskać szczelny osad bez widocznej warstwy matrycy 3D. Ostrożnie usunąć supernatant.

3. Utrwalanie i blokowanie

1. Ostrożnie zawiesić organoidy w 1 ml lodowatego PFA za pomocą powlekanej końcówki o pojemności 1 ml.
2. Utrwalić w temperaturze 4 °C przez 45 minut. Delikatnie zawiesić organoidy w połowie czasu utrwalania za pomocą powlekanej końcówki o pojemności 1 ml, aby zapewnić równomierne utrwalenie wszystkich organoidów.
3. Dodać 10 ml lodowatego PBT do probówki, delikatnie wymieszać odwracając probówkę, inkubować przez 10 minut i odwirować w temperaturze 70 x g, oba w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Od tego etapu powlekanie końcówek na ogół nie jest potrzebne, ponieważ większość typów organoidów nie przykleja się do końcówki po utrwaleniu. Jednak niektóre organoidy mogą wymagać powlekanych tworzyw sztucznych nawet po utrwaleniu.
4. Zablokuj organoidy poprzez ponowne zawieszenie osadu w lodowatym OWB (co najmniej 200 μl OWB na studzienkę) i przenieś organoidy na 24-dołkową płytkę zawiesinowa.
   UWAGA: Organoidy z jednej dużej osadówki można podzielić na wiele dołków, aby wykonać różne barwienia.
5. Inkubować w temperaturze 4 °C przez co najmniej 15 minut.

4. Znakowanie immunologiczne

1. Odpipetować 200 μl OWB do pustej studzienki, aby służyła jako studzienka referencyjna
   UWAGA: Znakowanie immunologiczne można również przeprowadzić na płytkach 48- lub 96-dołkowych w celu zmniejszenia zużycia przeciwciał. Użytkownik powinien jednak mieć świadomość, że zarówno plamienie, jak i wydajność prania mogą być zmniejszone ze względu na mniejszą objętość.
2. Pozwól, aby organoidy osiadły na dnie płytki.
   UWAGA: Można to sprawdzić za pomocą mikroskopu stereoskopowego i jest to łatwiejsze dzięki zastosowaniu ciemnego tła.
3. Przechylić płytkę o 45° i usunąć OWB, pozostawiając organoidy w 200 μl OWB (użyć studzienki referencyjnej, aby oszacować 200 μl).
4. Dodaj 200 μl OWB z pierwszorzędowymi przeciwciałami 2x skoncentrowanymi (np. E-kadheryna [1:400] i Ki67 [1:200] dla wyników w Rysunek 1; keratyna 5 [1:500], keratyna 8/18 [1:200], MRP2 [1:50] i Ki67 [1:200] dla wyników w Rysunek 2) i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc/wstrząsając (40 obr./min na wytrząsarce poziomej).
5. Następnego dnia dodaj 1 ml OWB.
6. Pozwól organoidom osiąść na dnie płytki przez 3 minuty. Usuń OWB, pozostawiając 200 μl w płytce. Dodać 1 ml OWB i myć 2 godziny łagodnym kołysaniem/potrząsaniem.
7. Powtórz krok 4.6 jeszcze dwa razy.
8. Pozwól organoidom osiąść na dnie płytki przez 3 minuty. Usuń OWB, pozostawiając 200 μl w studzience.
9. Dodaj 200 μL OWB z przeciwciałami drugorzędowymi, przeciwciałami sprzężonymi i barwnikami 2x skoncentrowanymi (np. DAPI [1:1000], rat-AF488 [1:500], mouse-AF555 [1:500], phalloidin-AF647 [1:100] dla wyników w Rysunek 1; DAPI [1:1000], rat-AF488 [1:500], królik-AF555 [1:500], mysz-AF555 [1:500], falloidyna-AF647 [1:100] dla wyników w Rysunek 2; DAPI [1:1000], falloidyna-AF647 [1:100] dla wyników w Rysunek 3) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc/potrząsając.
10. Następnego dnia powtórz kroki 4.5−4.7.
11. Przenieść organoidy do probówki o pojemności 1,5 ml i wirować w tempie 70 x g przez 3 minuty.

5. Optyczne oczyszczanie organoidów

1. Usunąć jak najwięcej OWB przez pipetowanie bez naruszania organoidów.
2. Dodać FUnGI (co najmniej 50 μl, RT) za pomocą końcówki o pojemności 200 μl z odciętym końcem i delikatnie zawiesić, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 min.
   UWAGA: Oczyszczanie optyczne przez FUnGI może powodować niewielkie kurczenie się tkanek. Nie wpłynie to na ogólną morfologię organoidów jednowarstwowych i wielowarstwowych; Jednak jednowarstwowe organoidy o kulistym kształcie i dużych prześwitach mogą się zapaść. W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C (przez co najmniej 1 tydzień) lub w temperaturze -20 °C (przez co najmniej 6 miesięcy).

6. Przygotowanie preparatu do obrazowania konfokalnego

1. Przygotować strzykawkę o pojemności 10 ml z uszczelniaczem silikonowym (tabela materiałów). Załóż końcówkę o pojemności 200 μl i odetnij koniec, aby umożliwić delikatny przepływ lepkiego silikonu po naciśnięciu strzykawki. Za pomocą strzykawki narysuj prostokąt o wymiarach 1 cm x 2 cm na środku szkiełka.
2. Odetnij koniec końcówki o pojemności 200 μl i przenieś organoidy z FUnGI na środek prostokąta.
3. Umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu. Aby zminimalizować uwięzione pęcherzyki powietrza, najpierw umieść lewą stronę szkiełka nakrywkowego, a następnie powoli opuść szkiełko nakrywkowe od lewej do prawej, aż nie będzie uwięzionego powietrza, a następnie zwolnij szkiełko nakrywkowe.
   UWAGA: Można użyć przekładek o rozmiarach podobnych do organoidów, aby zapobiec ich uszkodzeniu.
4. Delikatnie dociśnij wszystkie krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby mocno przymocować je do szczeliwa silikonowego. Slajd jest teraz gotowy do obrazowania.
   UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a próbkę można przechowywać w temperaturze 4 °C (przez co najmniej 1 tydzień) lub -20 °C (przez co najmniej 6 miesięcy).

7. Akwizycja i przetwarzanie obrazu

1. Za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (tabela materiałów) zobrazuj szkiełko za pomocą obiektywu multi-immersion 25x lub oil immersion 40x do obrazowania konfokalnego.
   1. Użyj następujących ustawień akwizycji dla obiektywu 25x: ramka trybu skanowania, rozmiar klatki 1024 x 1024, rozmiar woksela 332 nm x 332 nm x 1,2 μm, czas przebywania pikseli <2 μs, skanowanie dwukierunkowe, uśrednienie liczby 1, głębia bitowa 8. Aby zmniejszyć fotowybielanie, użyj niskiej mocy lasera (ogólnie <5%, <10% w przypadku słabego barwienia).
   2. Użyj trybu stosu Z, aby zdefiniować dolną i górną granicę oraz ustawić rozmiar kroku Z na optymalny. Podczas obrazowania dużych struktur organoidowych lub wielu organoidów razem, należy użyć trybu kafelkowania z 10% nałożeniem i wskazać obszar zainteresowania.
      UWAGA: Przy tych ustawieniach rozmiar danych dla typowego organoidu o średnicy <300 μm wynosi <1 GB.
2. W przypadku zestawów danych skanowania kafelków zszyj pliki obrazowania w oprogramowaniu dołączonym do mikroskopu (tabela materiałów). W sekcji przetwarzania wybierz Łączenie jako metodę, wybierz Nowe wyjście w obszarze parametry i wybierz plik do zszycia. Naciśnij Zastosuj, aby rozpocząć szycie.
3. Uzyskaj renderowaną w 3D reprezentację obrazowania na karcie Widok 3D w oprogramowaniu do obrazowania (Tabela materiałów), a następnie zoptymalizuj jasność, kontrast i właściwości renderowania 3D. Eksportuj migawki RGB wyników jako pliki TIFF.

Obrazowanie organoidów w 3D umożliwia bardzo szczegółową wizualizację architektury, składu komórkowego, a także procesów wewnątrzkomórkowych. Przedstawiona technika jest mało wymagająca i prawdopodobnie może być zastosowana do szerokiej gamy układów organoidowych, które pochodzą z różnych narządów lub gatunków gospodarzy.

Siła obrazowania 3D w porównaniu do obrazowania 2D jest zilustrowana obrazami organoidów gruczołu sutkowego myszy, które zostały wygenerowane przy użyciu ostatnio opublikowanych metod14. Środkowa warstwa tych organoidów składa się z kolumnowych komórek luminalnych K8 / K18-dodatnich, a warstwa zewnętrzna zawiera wydłużone komórki podstawne K5-dodatnie (Ryc. 2A), która podsumowuje morfologię gruczołu sutkowego in vivo. Ta spolaryzowana organizacja jest trudna do oceny z sekcji optycznej 2D tego samego organoidu (Rysunek 2B, środkowy panel). Innym przykładem złożonej struktury, która jest niemożliwa do zinterpretowania bez informacji 3D, jest sieć kanalików MRP2-dodatnich, które ułatwiają zbieranie płynu żółciowego z organoidów ludzkiej wątroby11 (Rysunek 2B). To pokazuje, w jaki sposób nasza metoda pozwala na wizualizację podstawowych cech strukturalnych organoidów. Co więcej, uzyskana jakość i rozdzielczość pozwala na półautomatyczną segmentację i analizę obrazu. W ten sposób całkowitą liczbę komórek i obecność markerów można określić ilościowo w określonych podtypach komórkowych w całych organoidach. Ilustrujemy to, segmentując jądra całego organoidu zawierającego 140 komórek, z których 3 komórki wykazują wysoką dodatniość dla markera cyklu komórkowego Ki67 (Rysunek 2C). Kanał DAPI jest wybierany jako kanał źródłowy, a segmenty są generowane na podstawie kroku progowania intensywności i średnicy kuli 10 μm. Stykające się obiekty są podzielone według regionów rosnących od punktów zarodkowych. Na koniec stosuje się filtr o rozmiarze 10 wokseli w celu usunięcia małych segmentów wywołanych hałasem. Dla każdego segmentu reprezentującego jądro, średnia intensywność kanału Ki67 jest następnie eksportowana do wykreślenia.

Niedawno opracowaliśmy optyczny środek czyszczący FUnGI35, który teraz zintegrowaliśmy z tym protokołem, aby udoskonalić przezroczystość organoidów. FUnGI jest łatwy w użyciu, ponieważ usuwanie można łatwo osiągnąć za pomocą pojedynczego etapu inkubacji po barwieniu immunofluorescencyjnym. Dodatkową zaletą środka jest jego lepkość, która ułatwia obsługę próbki podczas montażu na szkiełku. Próbki fluorescencyjne w FUnGI zachowują swoją fluorescencję nawet po wielomiesięcznym przechowywaniu w temperaturze -20 °C. Wykazujemy, że FUnGI przewyższa nieoczyszczone i fruktozowo-glicerynowe pod względem jakości sygnału fluorescencyjnego głęboko w organoidzie (Rysunek 3A, B) oraz że organoidy zatwierdzone przez FunGI mają ogólnie zwiększoną intensywność fluorescencji w porównaniu z nieoczyszczonymi organoidami (Rysunek 3C).

Podsumowując, opisujemy niewymagającą, powtarzalną technikę obrazowania 3D do pozyskiwania danych wolumetrycznych organoidów znakowanych immunologicznie. Protokół ten może być łatwo wykorzystany do obrazowania różnych organoidów, w tym zarówno pochodzenia mysiego, jak i ludzkiego, z modeli zdrowych i chorobowych. Proste przygotowanie próbki można dostosować w celu ułatwienia mikroskopów fluorescencyjnych konfokalnych, wielofotonowych i arkuszy świetlnych w celu uzyskania rozdzielczości komórkowej do subkomórkowej całych organoidów.

Rysunek 1: Schematyczny przegląd protokołu obrazowania 3D o wysokiej rozdzielczości. Organoidy są odzyskiwane z ich matrycy 3D. Utrwalanie i blokowanie przeprowadza się przed znakowaniem immunologicznym za pomocą przeciwciał i barwników. Czyszczenie optyczne odbywa się w jednym kroku za pomocą środka czyszczącego FUnGi. Renderowanie obrazów 3D można wykonać za pomocą oprogramowania do obrazowania. (A) Schematyczny przegląd procedury. (B) Oczyszczony, całościowy obraz konfokalny 3D ludzkiego organoidu okrężnicy znakowanego immunologicznie dla F-aktyny i E-kadheryny (E-cad) (25-krotny obiektyw olejowy). Podziałka liniowa = 40 μm. (C) Oczyszczony obraz konfokalny 3D z całego montażu. Pasek skali = 20 μm. (D) Powiększony przekrój optyczny ludzkiego organoidu okrężnicy znakowanego immunologicznie dla F-aktyny, E-kadheryny (E-cad) i Ki67 (obiektyw olejowy 25x). Podziałka = 5 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany z Dekkers et al.26. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Obrazowanie wolumetryczne wizualizuje złożoną architekturę 3D. Obrazy konfokalne reprezentujące zestawy danych 3D z pełnym montażem (lewy panel), przekroje optyczne 2D (panel środkowy) i obszary 3D powiększonego obszaru (prawy panel). (A) Organoid pochodzący z pojedynczej komórki podstawnej gruczołu sutkowego myszy, ilustrujący organizację 3D wydłużonych komórek podstawnych sutka, które otaczają komórki luminalne lub znakowane dla K8/18, K5 i F-aktyny (oczyszczanie fruktozy-glicerolu; obiektyw 25x olejowy). Paski skali reprezentują 55 μm (lewy panel) i 40 μm (środkowy i prawy panel). (B) Organoid wątroby ludzkiego płodu ze złożoną siecią 3D kanalików MRP2-dodatnich, znakowany dla DAPI, MRP2 i F-aktyny (oczyszczanie fruktozy-glicerolu; 40-krotny obiektyw olejowy). Paski skali reprezentują 25 μm (lewy panel) i 8 μm (środkowy i prawy panel). (C) Konfokalny obraz 3D całego organoidu wątroby ludzkiego płodu znakowanego DAPI i Ki67 (lewy panel) oraz podzielony na segmenty obraz na kanale DAPI przy użyciu oprogramowania do obrazowania (panel środkowy). Podziałka = 15 μm. Wykreślony wykres przedstawiający średnią intensywność Ki67 we wszystkich komórkach (podzielonych na segmenty DAPI) całego organoidu (140 komórek) (prawy panel). Ten rysunek został zmodyfikowany z Dekkers et al.26. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Optyczne oczyszczanie organoidów za pomocą FUnGI. (A) Reprezentatywne obrazy ludzkich organoidów okrężnicy znakowanych F-aktyną (zielony) i DAPI (szary) i zobrazowanych bez oczyszczania, oczyszczonych fruktozą-glicerolem lub oczyszczonych FUnGI (obiektyw olejowy 25x). Lewy panel: renderowanie 3D organoidu. Prawy panel: przekrój optyczny organoidu na głębokości 150 μm. W przypadku stanu "braku oczyszczenia" jasność obrazu musiała zostać zwiększona w porównaniu z warunkami "fruktozy-glicerolu" i "FUnGI", aby uwidocznić organoid. Podziałka = 50 μm. (B) Dopasowanie regresji nieliniowej pokazujące spadek intensywności DAPI wraz ze wzrostem głębokości Z dla różnych metod oczyszczania optycznego. Wartości reprezentują intensywność poszczególnych komórek wykrytych przez segmentację DAPI i są znormalizowane do średniej intensywności DAPI pierwszych 50 μm organoidu. Aby uniknąć niedoszacowania tłumienia spowodowanego przez jaśniejsze komórki na głębszych krawędziach i pączkujących strukturach, analizowano tylko środkowe regiony organoidów. (C) Trzy organoidy na stan o podobnej wielkości i głębokości w kierunku szkiełka nakrywkowego zostały zobrazowane przy użyciu identycznych ustawień mikroskopu. Pełne zestawy danych 3D zostały podzielone na segmenty pojedynczej komórki na sygnale DAPI w celu porównania. Wykres słupkowy przedstawiający średnią intensywność DAPI z różnymi metodami rozliczania na pełnych segmentowanych zestawach danych. Dane są przedstawiane jako średnia ± SD. Wartości są intensywnościami >3800 pojedynczych komórek wykrytych przez segmentację DAPI. = p < 0,0001, test Kruskala-Wallisa z dwustronnym wielokrotnym porównaniem Dunna metodą post-hoc. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.