Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowe obrazowanie nienaruszonych organoidów w rozdzielczości pojedynczej komórki

19.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60709

⸱

5 czerwca 2020

 ,  ,  ,  , 
1Princess Máxima Center for Pediatric Oncology, 2Department of Cancer Research, Oncode Institute, Hubrecht Institute-KNAW Utrecht, 3Cancer Genomics Center (CGC), 4Hubrecht Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW) and University Medical Center (UMC) Utrecht

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Cała struktura 3D i zawartość komórkowa organoidów, jak również ich fenotypowe podobieństwo do oryginalnej tkanki, mogą być uchwycone za pomocą opisanego tutaj protokołu obrazowania 3D o rozdzielczości pojedynczej komórki. Protokół ten może być stosowany do szerokiej gamy organoidów różniących się pochodzeniem, rozmiarem i kształtem.

Streszczenie

Technologia organoidów, hodowla in vitro 3D miniaturowych tkanek, otworzyła nowe eksperymentalne okno dla procesów komórkowych, które regulują rozwój i funkcję narządów, a także choroby. Mikroskopia fluorescencyjna odegrała ważną rolę w szczegółowym scharakteryzowaniu ich składu komórkowego i wykazaniu ich podobieństwa do tkanki, z której pochodzą. W tym artykule przedstawiamy kompleksowy protokół obrazowania 3D całych organoidów w wysokiej rozdzielczości po znakowaniu immunofluorescencyjnym. Metoda ta ma szerokie zastosowanie do obrazowania organoidów różniących się pochodzeniem, wielkością i kształtem. Do tej pory zastosowaliśmy tę metodę do organoidów dróg oddechowych, okrężnicy, nerek i wątroby pochodzących ze zdrowych tkanek ludzkich, a także organoidów ludzkiego guza piersi i organoidów gruczołów sutkowych myszy. Używamy optycznego środka czyszczącego, FUnGI, który umożliwia pozyskiwanie całych organoidów 3D z możliwością ilościowego oznaczania markerów w pojedynczych komórkach. Ten trzydniowy protokół od pobrania organoidów do analizy obrazu jest zoptymalizowany pod kątem obrazowania 3D przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Wprowadzenie

Postęp nowatorskich metod hodowli, takich jak technologia organoidów, umożliwił hodowlę organów w dish1. Organoidy wyrastają w trójwymiarowe (3D) struktury, które przypominają tkankę, z której pochodzą, zachowując cechy fenotypowe i funkcjonalne. Organoidy odgrywają teraz zasadniczą rolę w rozwiązywaniu podstawowych problemów biologicznych2, modelowaniu chorób, w tym raka3, oraz opracowywaniu spersonalizowanych strategii leczenia4,5,6,7. Od czasu pierwszego protokołu generowania organoidów pochodzących z jelitowych dorosłych komórek macierzystych8, technologia organoidów rozszerzyła się, obejmując szeroki zakres zdrowych i nowotworowych tkanek pochodzących z narządów, w tym prostaty9, brain10, liver11,12, żołądek13, breast14,15, endometrium16, gruczoł ślinowy17, kubek smakowy18, trzustka19, oraz nerka20.

Rozwój organoidów zbiegł się z powstaniem nowych technik mikroskopii wolumetrycznej, które mogą wizualizować architekturę całej tkanki wierzchowca w 3D21,22,23,24. 3D obrazowanie jest lepsze od tradycyjnego obrazowania 2D przekroju tkanki w wizualizacji złożonej organizacji informacji o specimens. 3D biologicznym okazuje się niezbędne dla zrozumienie składu komórkowego, kształtu komórki, decyzji dotyczących losu komórki i interakcji komórka-komórka w nienaruszonych próbkach biologicznych. Nieniszczące techniki cięcia optycznego, takie jak konfokalna lub wielofotonowa laserowa mikroskopia skaningowa (CLSM i MLSM) oraz mikroskopia fluorescencyjna arkuszy świetlnych (LSFM), umożliwiają obecnie połączoną wizualizację zarówno drobnych szczegółów, jak i ogólnej architektury tkankowej w ramach pojedynczej próbki biologicznej. To potężne podejście do obrazowania daje możliwość zbadania złożoności strukturalnej, którą można modelować za pomocą organoids25 i mapowania rozmieszczenia przestrzennego, tożsamości fenotypowej i stanu komórkowego wszystkich pojedynczych komórek tworzących te struktury 3D.

Niedawno opublikowaliśmy szczegółowy protokół obrazowania 3D w wysokiej rozdzielczości stałych i oczyszczonych organoidów26. Protokół ten został specjalnie zaprojektowany i zoptymalizowany do przetwarzania delikatnych struktur organoidowych, w przeciwieństwie do metodologii dla dużych, nienaruszonych tkanek, takich jak DISCO27,28, CUBIC29,30,31 oraz CLARITY32,33. W związku z tym metoda ta ma ogólne zastosowanie do szerokiej gamy organoidów różniących się pochodzeniem, rozmiarem i kształtem oraz zawartością komórkową. Ponadto, w porównaniu z innymi protokołami obrazowania wolumetrycznego, które często wymagają znacznego czasu i wysiłku, nasz protokół jest niewymagający i można go ukończyć w ciągu 3 dni. Zastosowaliśmy nasz protokół obrazowania 3D do wizualizacji architektury i składu komórkowego nowo opracowanych systemów organoidowych pochodzących z różnych tkanek, w tym ludzkich dróg oddechowych34, kidney20, liver11 i organoidy ludzkiego raka piersi15. W połączeniu z wielobarwnym śledzeniem linii fluorescencyjnej, metoda ta została również wykorzystana do ujawnienia biopotencji komórek podstawnych w organoidach sutka myszy14.

Tutaj udoskonalamy protokół, wprowadzając nietoksyczny środek czyszczący FUnGI35. Oczyszczanie FUnGI odbywa się w jednym kroku inkubacji, jest łatwiejsze do zamontowania ze względu na swoją lepkość i lepiej zachowuje fluorescencję podczas przechowywania. Ponadto wprowadzamy dodecylosiarczan sodu (SDS) do buforu płuczącego w celu wzmocnienia barwienia jądrowego, a także metodę montażu na bazie silikonu w celu łatwego przygotowania szkiełek przed mikroskopią. Rysunek 1 przedstawia graficzny przegląd protokołu (Rysunek 1A) oraz przykłady organoidów zobrazowanych w 3D (Rysunek 1B−D). Krótko mówiąc, organoidy są odzyskiwane z matrycy 3D, utrwalane i znakowane immunologicznie, optycznie oczyszczane, obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej, a następnie renderowane w 3D za pomocą oprogramowania do wizualizacji.

Protokół

Użycie organoidów pochodzących od myszy było zgodne ze standardami regulacyjnymi i zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Instytutu Waltera i Elizy Hall (WEHI). Wszystkie próbki ludzkich organoidów zostały pobrane z biobanków za pomocą Hubrecht Organoid Technology (HUB, www.hub4organoids.nl). Komisja Etyki Medycznej UMC w Utrechcie (METC UMCU) uzyskała zezwolenia na wniosek HUB w celu zapewnienia zgodności z holenderską ustawą o badaniach medycznych z udziałem ludzi, a w stosownych przypadkach uzyskano świadomą zgodę od dawców.

1. Przygotowanie odczynników

  1. Aby przygotować 4% (w/v) paraformaldehydu (PFA), należy podgrzać 400 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do temperatury nieco poniżej 60 °C w łaźni wodnej. Dodać 20 g proszku PFA i rozpuścić za pomocą mieszadła.
    1. Następnie dodaj kilka kropli 10 M NaOH. Pozostaw do ostygnięcia na lodzie i dodaj kilka kropli 10 M HCl, aby dostosować pH do 7,4. Uzupełnić PBS do 500 ml i podwielokrotności (przechowywać w temperaturze -20 °C do 2 miesięcy).
      UWAGA: Nie podgrzewaj powyżej 60 °C, aby uniknąć degradacji PFA. Czas przygotowania = 4 h.
  2. Aby przygotować PBS z Tween-20 (PBT) (0,1% v/v), dodaj 1 ml Tween-20 do 1 l PBS (przechowywać w temperaturze 4 °C do 4 tygodni).
    UWAGA: Czas przygotowania = 10 min.
  3. Aby przygotować 100 ml 0,5 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), dodaj 18,6 g EDTA i 2,5 g NaOH do 80 ml dH2O. Dostosuj pH do 8 za pomocą 1 M NaOH i napełnij do 100 ml dH2O.
  4. Aby przygotować 500 ml 1 M Tris, rozpuść 60,55 g Tris w 42 ml stężonego (36−38%) HCl w 300 ml dH2O. Dostosuj pH do 8 i napełnij do 500 ml.
  5. Aby przygotować organoidowy bufor do przemywania (OWB), dodać 1 ml Triton X-100, 2 ml 10% (w/v) SDS i 2 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 1 l PBS (przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni).
    UWAGA: Czas przygotowania = 10 min.
  6. Aby uzyskać 220 ml FUnGI, wymieszaj 110 ml glicerolu z 20 ml dH2O, 2,2 ml buforu Tris (1 M, pH 8,0) i 440 μl EDTA (0,5 M). Dodaj 50 g fruktozy i mieszaj w temperaturze pokojowej (RT) w ciemności, aż się rozpuści. Gdy będzie klarowna, dodaj 49 g fruktozy i mieszaj aż do rozpuszczenia. Następnie dodać 33,1 g mocznika i mieszać aż do rozpuszczenia (przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności).
    UWAGA: Nie podgrzewaj, ponieważ fruktoza karmelizuje się w wyższych temperaturach. FUnGI składa się z 50% (v/v) glicerolu, 9,4% (v/v) dH2O, 10,6 mM zasady tris, 1,1 mM EDTA, 2,5 M fruktozy i 2,5 M mocznika. Czas przygotowania = 1 dzień.
  7. Aby przygotować PBS-BSA (1% w/v), rozpuść 1 g BSA w 100 ml PBS (przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni).
    UWAGA: Czas przygotowania = 10 min.

2. Odzyskiwanie organoidów

UWAGA: Poniższe kroki dotyczą organoidów hodowanych w ekstrakcie z błony podstawnej (BME), które były hodowane na 24-dołkowej płytce o wielkości 100−500 μm.

  1. Odessać pożywkę hodowlaną i przemyć 1x lodowatym PBS. Unikaj zakłócania pracy matrycy 3D.
  2. Umieść płytkę na lodzie i dodaj 1 ml lodowatego roztworu do odzyskiwania komórek (tabela materiałów) do każdej studzienki. Inkubować 30−60 min w temperaturze 4 °C na wytrząsarce poziomej (40 obr./min).
    UWAGA: Kropelki matrycy 3D powinny być całkowicie rozpuszczone.
  3. Pokryj końcówkę pipety o pojemności 1 ml BSA, zanurzając 1% PBS-BSA i pipetując w górę i w dół 2x. Ta powłoka zapobiegnie przywieraniu organoidów do końcówki. Aby pokryć wewnętrzną stronę stożkowej probówki o pojemności 15 ml, napełnij ją 5 ml 1% PBS-BSA, odwróć 2−3x i wyrzuć PBS-BSA.
    UWAGA: Ta powłoka jest niezbędna dla wszystkich materiałów eksploatacyjnych z tworzyw sztucznych do momentu zamocowania (krok 3.3).
  4. Za pomocą powlekanej końcówki delikatnie ponownie zawiesić zawartość studzienki 5−10x i przenieść organoidy do powlekanych probówek o pojemności 15 ml. Organoidy z różnych dołków o tej samej tożsamości można połączyć w tej samej probówce.
  5. Dodaj 1 ml lodowatego 1% PBS-BSA do każdej studzienki, aby wypłukać i zebrać wszystkie organoidy.
  6. Dodać zimny PBS do 10 ml i wirować przez 3 minuty w temperaturze 70 x g i 4 °C, aby uzyskać szczelny osad bez widocznej warstwy matrycy 3D. Ostrożnie usunąć supernatant.

3. Utrwalanie i blokowanie

  1. Ostrożnie zawiesić organoidy w 1 ml lodowatego PFA za pomocą powlekanej końcówki o pojemności 1 ml.
  2. Utrwalić w temperaturze 4 °C przez 45 minut. Delikatnie zawiesić organoidy w połowie czasu utrwalania za pomocą powlekanej końcówki o pojemności 1 ml, aby zapewnić równomierne utrwalenie wszystkich organoidów.
  3. Dodać 10 ml lodowatego PBT do probówki, delikatnie wymieszać odwracając probówkę, inkubować przez 10 minut i odwirować w temperaturze 70 x g, oba w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Od tego etapu powlekanie końcówek na ogół nie jest potrzebne, ponieważ większość typów organoidów nie przykleja się do końcówki po utrwaleniu. Jednak niektóre organoidy mogą wymagać powlekanych tworzyw sztucznych nawet po utrwaleniu.
  4. Zablokuj organoidy poprzez ponowne zawieszenie osadu w lodowatym OWB (co najmniej 200 μl OWB na studzienkę) i przenieś organoidy na 24-dołkową płytkę zawiesinowa.
    UWAGA: Organoidy z jednej dużej osadówki można podzielić na wiele dołków, aby wykonać różne barwienia.
  5. Inkubować w temperaturze 4 °C przez co najmniej 15 minut.

4. Znakowanie immunologiczne

  1. Odpipetować 200 μl OWB do pustej studzienki, aby służyła jako studzienka referencyjna
    UWAGA: Znakowanie immunologiczne można również przeprowadzić na płytkach 48- lub 96-dołkowych w celu zmniejszenia zużycia przeciwciał. Użytkownik powinien jednak mieć świadomość, że zarówno plamienie, jak i wydajność prania mogą być zmniejszone ze względu na mniejszą objętość.
  2. Pozwól, aby organoidy osiadły na dnie płytki.
    UWAGA: Można to sprawdzić za pomocą mikroskopu stereoskopowego i jest to łatwiejsze dzięki zastosowaniu ciemnego tła.
  3. Przechylić płytkę o 45° i usunąć OWB, pozostawiając organoidy w 200 μl OWB (użyć studzienki referencyjnej, aby oszacować 200 μl).
  4. Dodaj 200 μl OWB z pierwszorzędowymi przeciwciałami 2x skoncentrowanymi (np. E-kadheryna [1:400] i Ki67 [1:200] dla wyników w Rysunek 1; keratyna 5 [1:500], keratyna 8/18 [1:200], MRP2 [1:50] i Ki67 [1:200] dla wyników w Rysunek 2) i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc/wstrząsając (40 obr./min na wytrząsarce poziomej).
  5. Następnego dnia dodaj 1 ml OWB.
  6. Pozwól organoidom osiąść na dnie płytki przez 3 minuty. Usuń OWB, pozostawiając 200 μl w płytce. Dodać 1 ml OWB i myć 2 godziny łagodnym kołysaniem/potrząsaniem.
  7. Powtórz krok 4.6 jeszcze dwa razy.
  8. Pozwól organoidom osiąść na dnie płytki przez 3 minuty. Usuń OWB, pozostawiając 200 μl w studzience.
  9. Dodaj 200 μL OWB z przeciwciałami drugorzędowymi, przeciwciałami sprzężonymi i barwnikami 2x skoncentrowanymi (np. DAPI [1:1000], rat-AF488 [1:500], mouse-AF555 [1:500], phalloidin-AF647 [1:100] dla wyników w Rysunek 1; DAPI [1:1000], rat-AF488 [1:500], królik-AF555 [1:500], mysz-AF555 [1:500], falloidyna-AF647 [1:100] dla wyników w Rysunek 2; DAPI [1:1000], falloidyna-AF647 [1:100] dla wyników w Rysunek 3) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc/potrząsając.
  10. Następnego dnia powtórz kroki 4.5−4.7.
  11. Przenieść organoidy do probówki o pojemności 1,5 ml i wirować w tempie 70 x g przez 3 minuty.

5. Optyczne oczyszczanie organoidów

  1. Usunąć jak najwięcej OWB przez pipetowanie bez naruszania organoidów.
  2. Dodać FUnGI (co najmniej 50 μl, RT) za pomocą końcówki o pojemności 200 μl z odciętym końcem i delikatnie zawiesić, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 min.
    UWAGA: Oczyszczanie optyczne przez FUnGI może powodować niewielkie kurczenie się tkanek. Nie wpłynie to na ogólną morfologię organoidów jednowarstwowych i wielowarstwowych; Jednak jednowarstwowe organoidy o kulistym kształcie i dużych prześwitach mogą się zapaść. W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C (przez co najmniej 1 tydzień) lub w temperaturze -20 °C (przez co najmniej 6 miesięcy).

6. Przygotowanie preparatu do obrazowania konfokalnego

  1. Przygotować strzykawkę o pojemności 10 ml z uszczelniaczem silikonowym (tabela materiałów). Załóż końcówkę o pojemności 200 μl i odetnij koniec, aby umożliwić delikatny przepływ lepkiego silikonu po naciśnięciu strzykawki. Za pomocą strzykawki narysuj prostokąt o wymiarach 1 cm x 2 cm na środku szkiełka.
  2. Odetnij koniec końcówki o pojemności 200 μl i przenieś organoidy z FUnGI na środek prostokąta.
  3. Umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu. Aby zminimalizować uwięzione pęcherzyki powietrza, najpierw umieść lewą stronę szkiełka nakrywkowego, a następnie powoli opuść szkiełko nakrywkowe od lewej do prawej, aż nie będzie uwięzionego powietrza, a następnie zwolnij szkiełko nakrywkowe.
    UWAGA: Można użyć przekładek o rozmiarach podobnych do organoidów, aby zapobiec ich uszkodzeniu.
  4. Delikatnie dociśnij wszystkie krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby mocno przymocować je do szczeliwa silikonowego. Slajd jest teraz gotowy do obrazowania.
    UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a próbkę można przechowywać w temperaturze 4 °C (przez co najmniej 1 tydzień) lub -20 °C (przez co najmniej 6 miesięcy).

7. Akwizycja i przetwarzanie obrazu

  1. Za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego (tabela materiałów) zobrazuj szkiełko za pomocą obiektywu multi-immersion 25x lub oil immersion 40x do obrazowania konfokalnego.
    1. Użyj następujących ustawień akwizycji dla obiektywu 25x: ramka trybu skanowania, rozmiar klatki 1024 x 1024, rozmiar woksela 332 nm x 332 nm x 1,2 μm, czas przebywania pikseli <2 μs, skanowanie dwukierunkowe, uśrednienie liczby 1, głębia bitowa 8. Aby zmniejszyć fotowybielanie, użyj niskiej mocy lasera (ogólnie <5%, <10% w przypadku słabego barwienia).
    2. Użyj trybu stosu Z, aby zdefiniować dolną i górną granicę oraz ustawić rozmiar kroku Z na optymalny. Podczas obrazowania dużych struktur organoidowych lub wielu organoidów razem, należy użyć trybu kafelkowania z 10% nałożeniem i wskazać obszar zainteresowania.
      UWAGA: Przy tych ustawieniach rozmiar danych dla typowego organoidu o średnicy <300 μm wynosi <1 GB.
  2. W przypadku zestawów danych skanowania kafelków zszyj pliki obrazowania w oprogramowaniu dołączonym do mikroskopu (tabela materiałów). W sekcji przetwarzania wybierz Łączenie jako metodę, wybierz Nowe wyjście w obszarze parametry i wybierz plik do zszycia. Naciśnij Zastosuj, aby rozpocząć szycie.
  3. Uzyskaj renderowaną w 3D reprezentację obrazowania na karcie Widok 3D w oprogramowaniu do obrazowania (Tabela materiałów), a następnie zoptymalizuj jasność, kontrast i właściwości renderowania 3D. Eksportuj migawki RGB wyników jako pliki TIFF.

Wyniki

Obrazowanie organoidów w 3D umożliwia szczegółową wizualizację architektury, składu komórkowego, a także procesów wewnątrzkomórkowych. Przedstawiona technika jest mało wymagająca i prawdopodobnie może zostać zastosowana w szerokim zakresie systemów organoidów pochodzących z różnych organów lub gatunków gospodarzy.

Przewaga obrazowania 3D nad obrazowaniem 2D została zilustrowana obrazami organoidów gruczołu mlekowego myszy, które zostały wygenerowane zgodnie z niedawno opublikowanymi metodami14. Centralna warstwa tych organoidów składa się z kolumnowych komórek luminalnych wykazujących pozytywność na K8/K18, natomiast warstwa zewnętrzna zawiera wydłużone komórki basalne wykazujące pozytywność na K5 (Rysunek 2A), co odwzorowuje morfologię gruczołu mlekowego in vivo. Taka polaryzacja organizacji jest trudna do dostrzeżenia na 2D przekroju optycznym tego samego organoidu (Rysunek 2B, środkowy panel). Innym przykładem złożonej struktury, której nie da się zinterpretować bez informacji 3D, jest sieć kanalików wykazujących pozytywność na MRP2, które ułatwiają gromadzenie żółci w organoidach wątroby człowieka11 (Rysunek 2B). Przykładowo pokazuje to, w jaki sposób nasza metoda umożliwia wizualizację kluczowych cech strukturalnych organoidów. Co więcej, uzyskana jakość i rozdzielczość pozwalają na półautomatyczną segmentację i analizę obrazu. Dzięki temu można ilościowo określić całkowitą liczbę komórek oraz obecność markerów w konkretnych podtypach komórkowych w całych organoidach. Ilustrujemy to poprzez segmentację jąder całego organoidu zawierającego 140 komórek, z których 3 komórki wykazują wysoką pozytywność na marker cyklu komórkowego Ki67 (Rysunek 2C). Jako kanał źródłowy wybrano kanał DAPI, a segmenty wygenerowano w oparciu o krok progowania intensywności oraz średnicę sfery wynoszącą 10 µm. Stykające się obiekty zostały rozdzielone metodą region growing z punktów ziarnowania. Na koniec zastosowano filtr wielkości 10 voxels, aby usunąć niewielkie segmenty wywołane szumem. Dla każdego segmentu reprezentującego jądro wyeksportowano średnią intensywność kanału Ki67 w celu sporządzenia wykresu.

Opracowaliśmy niedawno środek do optycznego wyjaśniania FUnGI35, który w niniejszym protokole zintegrowano w celu poprawy przejrzystości organoidów. FUnGI jest łatwy w użyciu, ponieważ wyjaśnienie tkanek uzyskuje się poprzez pojedynczy etap inkubacji po barwieniu immunofluorescencyjnym. Dodatkową zaletą tego środka jest jego lepkość, która ułatwia manipulację próbkami podczas montowania preparatów na szkiełkach. Próbki fluorescencyjne w FUnGI zachowują swoją fluorescencję nawet podczas przechowywania przez wiele miesięcy w temperaturze -20 °C. Wykazaliśmy, że FUnGI przewyższa próbki niewyjaśnione oraz traktowane fruktozo-glicerolem pod względem jakości sygnału fluorescencyjnego w głębokich warstwach organoidu (Rysunek 3A,B), a organoidy wyjaśnione za pomocą FUnGI wykazują ogólnie zwiększoną intensywność fluorescencji w porównaniu z organoidami niewyjaśnionymi (Rysunek 3C).

Podsumowując, opisaliśmy niewymagającą i powtarzalną technikę obrazowania 3D służącą do pozyskiwania danych wolumetrycznych z immunoznakowanych organoidów. Protokół ten może być łatwo zastosowany do obrazowania różnych rodzajów organoidów, w tym pochodzących zarówno od myszy, jak i ludzi, obejmując modele zdrowotne oraz chorobowe. Prosta metoda przygotowania próbek może zostać dostosowana do pracy z konfokalnymi, wielofotonowymi i arkuszowymi mikroskopami fluorescencyjnymi w celu uzyskania rozdzielczości od poziomu komórkowego do subkomórkowego dla całych organoidów.

Schemat procesu obrazowania organoidów; mikroskopia konfokalna z immunoznakowaniem F-aktyny/E-kaderyny/Ki67.
Rysunek 1: Schematyczny przegląd protokołu wysokorozdzielczego obrazowania 3D. Organoidy są odzyskiwane z matrycy 3D. Przed immunoznakowaniem przeciwciałami i barwnikami przeprowadza się fiksację i blokowanie. Przejaśnianie optyczne uzyskuje się w jednym kroku przy użyciu czynnika przejaśniającego FUnGI. Renderowanie obrazów 3D można wykonać za pomocą oprogramowania do obrazowania. (A) Schematyczny przegląd procedury. (B) Przejaśnione trójwymiarowe obraz konfokalne całego preparatu organoidu jelita grubego człowieka, immunoznakowanego pod kątem F-aktyny i E-kaderyny (E-cad) (obiektyw olejowy 25x). Pasek skali = 40 μm. (C) Przejaśnione trójwymiarowe obraz konfokalne całego preparatu. Pasek skali = 20 μm. (D) Powiększony przekrój optyczny organoidu jelita grubego człowieka, immunoznakowanego pod kątem F-aktyny, E-kaderyny (E-cad) i Ki67 (obiektyw olejowy 25x). Pasek skali = 5 μm. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Dekkers i wsp.26. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Obrazowanie komórek 3D; ekspresja F-aktyny; schemat z mikroskopii fluorescencyjnej; segmentacja jąder; kwantyfikacja Ki67.
Rycina 2: Obrazowanie wolumetryczne wizualizuje złożoną architekturę 3D. Obrazy konfokalne reprezentujące zestawy danych 3D całych preparatów (panel lewy), 2D przekroje optyczne (panel środkowy) oraz obszary 3D powiększonego regionu (panel prawy). (A) Organoid pochodzący z pojedynczej komórki podstawnej gruczołu mlekowego myszy, ilustrujący organizację 3D wydłużonych komórek podstawnych gruczołu mlekowego, które otaczają komórki luminalne, znakowane pod kątem K8/18, K5 oraz F-aktyny (przejaśnianie fruktozo-glicerolowe; obiektyw olejowy 25x). Paski skali reprezentują 55 μm (panel lewy) oraz 40 μm (panele środkowy i prawy). (B) Organoid ludzkiej wątroby płodowej ze złożoną siecią 3D kanalików MRP2-dodatnich, znakowany pod kątem DAPI, MRP2 oraz F-aktyny (przejaśnianie fruktozo-glicerolowe; obiektyw olejowy 40x). Paski skali reprezentują 25 μm (panel lewy) oraz 8 μm (panele środkowy i prawy). (C) Konfokalny obraz 3D całego preparatu organoidu ludzkiej wątroby płodowej znakowanego DAPI i Ki67 (panel lewy) oraz obraz segmentowany w kanale DAPI przy użyciu oprogramowania do obrazowania (panel środkowy). Pasek skali = 15 μm. Wykres przedstawiający średnią intensywność Ki67 we wszystkich komórkach (segmentowanych przez DAPI) całego organoidu (140 komórek) (panel prawy). Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie pracy Dekkers et al.26. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Mikroskopia 3D F-aktyny/DAPI w tkance: efekt metod klarowania, wykres intensywności, wykres analizy.
Rysunek 3: Klarowanie optyczne organoidów przy użyciu FUnGI. (A) Reprezentatywne obrazy ludzkich organoidów jelita grubego znakowanych F-aktyną (zielony) i DAPI (szary), obrazowane bez klarowania, po klarowaniu fruktozą-glicerolem lub po klarowaniu FUnGI (obiektyw olejowy 25x). Panel lewy: rendering 3D organoidu. Panel prawy: przekrój optyczny organoidu na głębokości 150 μm. Dla warunku „bez klarowania” jasność obrazu musiała zostać zwiększona w porównaniu do warunków „fruktoza-glicerol” i „FUnGI”, aby zwizualizować organoid. Pasek skali = 50 μm. (B) Dopasowanie nieliniową regresją pokazujące spadek intensywności DAPI wraz ze wzrostem głębokości Z dla różnych metod klarowania optycznego. Wartości reprezentują intensywności poszczególnych komórek wykrytych za pomocą segmentacji DAPI i są znormalizowane do średniej intensywności DAPI pierwszych 50 μm organoidu. Aby uniknąć niedoszacowania tłumienia spowodowanego jaśniejszymi komórkami na głębszych krawędziach i strukturach pączkujących, analizowano tylko regiony centralne organoidów. (C) Trzy organoidy na warunek o podobnej wielkości i głębokości względem szkiełka podstawowego zostały obrazowane przy użyciu identycznych ustawień mikroskopu. Pełne zestawy danych 3D poddano segmentacji pojedynczych komórek na podstawie sygnału DAPI w celu porównania. Wykres słupkowy przedstawiający średnią intensywność DAPI przy różnych metodach klarowania na pełnych segmentowanych zestawach danych. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. Wartości stanowią intensywności >3800 poszczególnych komórek wykrytych za pomocą segmentacji DAPI. **** = p < 0.0001, test Kruskala-Wallisa z dwustronnym testem post-hoc wielokrotnych porównań Dunna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiliśmy szczegółowy protokół obrazowania 3D nienaruszonych organoidów z rozdzielczością pojedynczej komórki. Aby pomyślnie wykonać ten protokół, należy podjąć kilka krytycznych kroków. W tej sekcji przedstawiamy te kroki i zapewniamy rozwiązywanie problemów.

Pierwszym krytycznym krokiem jest usunięcie matrycy 3D. Większość organoidów rozmnaża się in vitro przy użyciu matryc, które naśladują środowisko zewnątrzkomórkowe in vivo, aby wzmocnić tworzenie dobrze spolaryzowanych struktur 3D. Utrwalanie, a następnie barwienie w matrycy 3D jest możliwe, ale może być niekorzystne dla penetracji przeciwciał lub może generować wysoki sygnał tła (dane nie pokazane). Na skuteczne usuwanie matryc może mieć wpływ rodzaj matrycy, ilość i wielkość organoidów oraz długotrwała hodowla. W związku z tym może być wymagana optymalizacja dla różnych warunków hodowli. W przypadku organoidów hodowanych w Matrigel lub BME, 30-60-minutowy krok w lodowatym roztworze do odzyskiwania komórek jest wystarczający do rozpuszczenia matrycy bez uszkodzenia organoidów. Ponadto usunięcie nośnej matrycy 3D może spowodować utratę natywnych struktur i zakłócenie kontaktów organoidów z innymi typami komórek, na przykład gdy organoidy są hodowane wspólnie z fibroblastami lub komórkami odpornościowymi. Co więcej, optymalne utrwalanie organoidów ma kluczowe znaczenie dla zachowania architektury tkanki 3D, antygenowości białek i zminimalizowania autofluorescencji. Utrwalanie przez 45 minut z 4% PFA w temperaturze 4 °C jest zwykle wystarczające do znakowania szerokiej gamy organoidów i antygenów. Jednak dłuższy etap utrwalania, do 4 godzin, jest zazwyczaj bardziej odpowiedni dla organoidów wyrażających fluorescencyjne białka reporterowe, ale będzie wymagał optymalizacji dla różnych fluoroforów. Czasy utrwalania krótsze niż 20 minut są niewystarczające do prawidłowego znakowania F-aktyny za pomocą sond falloidyny. Innym częstym problemem jest utrata organoidów podczas protokołu. Dlatego ważne jest, aby (i) ostrożnie pokryć końcówki i probówki pipet 1% BSA-PBS, zgodnie z opisem podczas obchodzenia się z nieutrwalonymi organoidami, aby zapobiec ich przywieraniu do tworzyw sztucznych, (ii) używać płytek o niskiej przyczepności lub zawiesiny, aby zapobiec przywieraniu próbki do płytki, oraz (iii) pozostawić wystarczająco dużo czasu, aby organoidy osiadły na dnie płytki przed ostrożnym usunięciem. Pipetowanie lepkiej FUnGI może powodować powstawanie pęcherzyków. Obchodzenie się z oczyszczoną próbką w temperaturze pokojowej zmniejsza lepkość i poprawia łatwość użycia, minimalizując w ten sposób straty organoidów. Podczas gdy większość organoidów jest łatwa w obsłudze, organoidy torbielowate o powiększonym świetle mają dużą tendencję do zapadania się podczas wiązania za pomocą 4% PFA lub po oczyszczeniu za pomocą FUnGI. Efekt ten można zmniejszyć, ale nie całkowicie mu zapobiec, stosując inny utrwalacz (np. formalinę lub aldehyd glutarowy PFA). Może to jednak potencjalnie wpływać na autofluorescencję, penetrację przeciwciał i dostępność epitopów. Gdy organoidy torbielowate wydają się pofałdowane po oczyszczeniu, zaleca się pominięcie etapu usuwania i zobrazowanie za pomocą mikroskopii wielofotonowej, która jest mniej utrudniona przez rozpraszanie światła. Wreszcie, uzyskanie całej struktury 3D organoidów może być trudne i wymaga minimalnej odległości między szkiełkiem nakrywkowym a organoidem. Ponadto, gdy organoidy mają miejsce na przemieszczanie się środka montażowego, może to powodować przesunięcia X i Y podczas rejestrowania danych w głębokości Z. Użycie mniejszej ilości szczeliwa silikonowego podczas przygotowywania szkiełek może rozwiązać problem nieoptymalnego montażu między szkiełkiem nakrywkowym a szkiełkiem mikroskopowym. Jednak zbyt mała ilość silikonu może prowadzić do kompresji organoidów i utraty ich naturalnej struktury 3D. FUnGI poprawia obsługę przy montażu szkiełek i stabilność organoidów podczas obrazowania, dzięki wyższej lepkości.

Chociaż protokół ten może być używany w szerokim zakresie zastosowań do dogłębnego badania zawartości komórkowej i architektury 3D nienaruszonych organoidów, należy wziąć pod uwagę pewne ograniczenia. Ta metodologia jest raczej mało przepustowa i czasochłonna. Rzeczywiście, użytkownicy powinni pamiętać, że obrazowanie dużych, nienaruszonych organoidów w 3D wymaga zarówno kafelkowania, jak i pobierania próbek w Z, co prowadzi do wydłużenia czasu akwizycji. Szybsze obrazowanie można osiągnąć dzięki wykorzystaniu zasobów mikroskopowych, w tym skanera rezonansowego lub wirującego dysku, lub technologii mikroskopu arkuszowegoświatła 26. Inną kwestią jest to, że markery mogą ulegać niejednorodnej ekspresji między różnymi organoidami z tej samej próbki. Dlatego należy pozyskać wiele organoidów, aby lepiej uchwycić tę niejednorodność organoidów w kulturze. Wreszcie, podczas gdy cała procedura mokrego laboratorium jest prosta, przetwarzanie końcowe danych wymaga umiejętności w zakresie oprogramowania do analizy obrazu w celu wizualizacji 3D i kwantyfikacji, a także statystyk w celu wydobycia wszystkich informacji zawartych w zbiorze danych.

W ciągu ostatniej dekady dziedzina obrazowania objętościowego znacznie się rozwinęła, zarówno ze względu na rozwój szerokiej gamy optycznych środków czyszczących, jak i ulepszenia w mikroskopii i technologiach obliczeniowych 27,30,31. Podczas gdy w przeszłości większość badań koncentrowała się na obrazowaniu dużej objętości narządów lub związanych z nimi nowotworów, ostatnio opracowano metody dla mniejszych i bardziej delikatnych tkanek, w tym struktur organoidowych, 36,37,38. Niedawno opublikowaliśmy prostą i szybką metodę obrazowania organoidów w całości o różnym pochodzeniu, rozmiarze i kształcie na poziomie pojedynczej komórki w celu późniejszego renderowania 3D i analizy obrazu26, którą przedstawiliśmy tutaj z pewnymi ulepszeniami (np. FUnGI, mocowanie silikonowe) i której towarzyszy protokół wideo. Metoda ta jest lepsza od konwencjonalnego obrazowania 2D opartego na przekrojach w rozszyfrowywaniu złożonej morfologii komórek i architektury tkanek (ryc. 2) i łatwa do wdrożenia w laboratoriach z mikroskopem konfokalnym. Dzięki niewielkim dostosowaniom do protokołu, próbki mogą być kompatybilne z obrazowaniem konfokalnym o superrozdzielczości, wielofotonowym oraz lekkim arkuszem, co sprawia, że protokół ten ma szerokie zastosowanie i zapewnia użytkownikom potężne narzędzie do lepszego zrozumienia wielowymiarowej złożoności, którą można modelować za pomocą organoidów.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy bardzo wdzięczni za wsparcie techniczne od Centrum Onkologii Dziecięcej Princess Máxima oraz dla Instytutu Hubrechta i Zeissa za wsparcie i współpracę w zakresie obrazowania. Wszystkie obrazowania zostały wykonane w centrum obrazowania Princess Máxima. Prace te były wspierane finansowo przez Centrum Onkologii Dziecięcej im. Księżniczki Máximy. Projekt JFD był wspierany przez stypendium Marie Curie Global Fellowship oraz grant VENI z Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO). ACR otrzymało wsparcie w postaci grantu dla początkujących członków Rady Europejskiej (ERBN).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki wirówkowe 1,5 ml z blokadą safe-lockEppendorfEP0030 120.094
ml probówki wirówkowe z blokadą safe-lockEppendorfEP0030 120.094
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma AldrichA3059
Roztwór do odzyskiwania komórekCorning354253
Mikroskop konfokalnyZeissLSM880
Oprogramowanie do mikroskopu konfokalnego ZENZeissZEN/niebieski
Probówki stożkowe 15 mlGreiner Bio-One5618-8271
Szkło nakrywkowe #1,5 24x60mmMenzel-GlazerG418-15
Szkło nakrywkowe #1,5 48x60mmProSciTechG425-4860
DAPIThermoFisherD3571rozcieńczenie 1:1000
Rozwarstwienie Mikroskop stereoskopowyLeicaM205 FA
Dwustronna taśma klejąca 12,7 mm 6,35 mScotch 3M
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS)Gibco141901441x
EDTAInvitrogen15576-028
Focus ClearCelExplorerFC-101
FruktozaSigma AldrichF0127
Wysięgnikglicerolowy76050771.0500
Pipety z podziałkąSamco222-15
Wytrząsarka poziomaVWR444-2900
Kwas solny (HCl)Ajax Firechem.265.2.5L-PL10M roztwór podstawowy,
Oprogramowanie ImarisSzkiełka mikroskopowe Bitplane
SuperfrostThermoFisher10143352krawędź szlifowana, 90 stopni 26 mm ~ 76 mm
ParaformaldehydSigma AldrichP6148-500gNiebezpieczna
falloidyna Alexa Fluor 647ThermoFisherA22287rozcieńczenie 1:100-200
E-kadherynaThermoFisher13-1900rozcieńczenie 1:400
Ki-67BD BiosciencesB56rozcieńczenie 1:200
Keratyna 5BioLegend905501rozcieńczenie 1:500
Keratyna 8/18DSHB (University of Iowa)rozcieńczenie 1:200
MRP2Abcamab3373rozcieńczenie 1:50
Wtórne IgG szczura (H+L) Alexa Fluor 488ThermoFisherA-21208rozcieńczenie 1:500
Wtórna mysia IgG (H+L) Alexa Fluor 555ThermoFisherA-31570rozcieńczenie 1:500
Wtórna IgG królika (H+L) Alexa Fluor 555ThermoFisherA-31572rozcieńczenie 1:500
Uszczelniacz silikonowyGriffonS-200
Dodecylosiarczan soduThermoFisher28312
Granulki wodorotlenku sodu (NaOH)Merck Millipore56753010 M roztwór podstawowy,
Zawiesinowe płytki do hodowli komórkowychGreiner Bio-One66210224-dołkowe
TrisFisher Scientific11486631
Triton X-100Sigma AldrichT8532Niebezpieczne
Tween-20Sigma AldrichP1379
UltraPure o niskiej temperaturze topnienia (LMP) AgarozaThermoFisher16520050
MocznikSigma Aldrich51456
Stacja roboczaDell
2

Bibliografia

  1. Sato, T., Clevers, H. Snapshot: Growing Organoids from Stem Cells. Cell. 161 (7), 1700(2015).
  2. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  3. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  4. Bartfeld, S., Stem Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
  5. Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
  6. Dekkers, J. F., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Science Translational Medicine. 8 (344), 84(2016).
  7. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
  8. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  9. Karthaus, W. R., et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  10. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  11. Hu, H., et al. Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
  12. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  13. Nanki, K., et al. Divergent Routes toward Wnt and R-spondin Niche Independency during Human Gastric Carcinogenesis. Cell. 174 (4), 856-869 (2018).
  14. Jamieson, P. R., et al. Derivation of a robust mouse mammary organoid system for studying tissue dynamics. Development. 144 (6), 1065-1071 (2017).
  15. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  16. Turco, M. Y., et al. hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).
  17. Maimets, M., et al. Long-Term In vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
  18. Ren, W., et al. Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).
  19. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  20. Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
  21. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  22. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. SnapShot: Tissue Clearing. Cell. 171 (2), 496(2017).
  23. Rios, A. C., et al. Essential role for a novel population of binucleated mammary epithelial cells in lactation. Nature Communications. 7, 11400(2016).
  24. Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
  25. Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
  26. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  27. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  28. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  29. Kubota, S. I., et al. Whole-Body Profiling of Cancer Metastasis with Single-Cell Resolution. Cell Reports. 20, 236-250 (2017).
  30. Murakami, T. C., et al. A three-dimensional single-cell-resolution whole-brain atlas using CUBIC-X expansion microscopy and tissue clearing. Nature Neuroscience. 21 (4), 625-637 (2018).
  31. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  32. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  33. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  34. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300(2019).
  35. Rios, A. C., et al. Intraclonal Plasticity in Mammary Tumors Revealed through Large-Scale Single-Cell Resolution 3D Imaging. Cancer Cell. 35 (4), 618-632 (2019).
  36. Chen, Y., et al. Application of three-dimensional imaging to the intestinal crypt organoids and biopsied intestinal tissues. The Scientific World Journal. 2013, 624342(2013).
  37. Costa, E. C., Silva, D. N., Moreira, A. F., Correia, I. J. Optical clearing methods: An overview of the techniques used for the imaging of 3D spheroids. Biotechnology and Bioengineering. 116 (10), 2742-2763 (2019).
  38. Masselink, W., et al. Broad applicability of a streamlined ethyl cinnamate-based clearing procedure. Development. 146, 166884(2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie organoid wmikroskopia konfokalnautrwalanie optyczneodczynnik FUnGIznakowanie immunofluorescencyjnerekonstrukcja 3Dakwizycja stos w Ztryb mozaikiprzygotowanie preparatu
Trójwymiarowe obrazowanie nienaruszonych organoidów w rozdzielczości pojedynczej komórki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.