Artykuł metodologiczny

Pomiar cytotoksyczności i migracji komórek NK w kontekście komórek nowotworowych wątroby

21.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60714

⸱

22 lutego 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Alabama at Birmingham

W tym artykule

Podsumowanie

Unikanie eliminacji za pośrednictwem komórek NK przez komórki rakowe jest ważne dla inicjacji i progresji raka. Tutaj przedstawiamy dwa protokoły nieoparte na radioaktywności do oceny cytotoksyczności komórek NK w stosunku do komórek nowotworowych wątroby. Dodatkowo przedstawiono trzeci protokół do analizy migracji komórek NK.

Streszczenie

Komórki NK są podzbiorem populacji limfocytów cytotoksycznych wrodzonego układu odpornościowego i stanowią pierwszą linię obrony poprzez usuwanie komórek zakażonych patogenami, złośliwych i zestresowanych. Zdolność komórek NK do eliminowania komórek nowotworowych sprawia, że są one ważnym narzędziem w walce z rakiem. Obecnie badanych jest kilka nowych terapii immunologicznych w leczeniu raka, które polegają albo na zwiększeniu aktywności komórek NK, albo na zwiększeniu wrażliwości komórek nowotworowych na eradykację za pośrednictwem komórek NK. Jednak, aby skutecznie opracować te podejścia terapeutyczne, potrzebne są również opłacalne testy in vitro do monitorowania cytotoksyczności i migracji komórek NK. W tym miejscu przedstawiamy dwa protokoły in vitro, które mogą niezawodnie i powtarzalnie monitorować wpływ cytotoksyczności komórek NK na komórki nowotworowe (lub inne komórki docelowe). Protokoły te nie są oparte na radioaktywności, są proste w konfiguracji i mogą być skalowane w celu przeprowadzenia badań przesiewowych o wysokiej przepustowości. Przedstawiamy również protokół oparty na cytometrii przepływowej do ilościowego monitorowania migracji komórek NK, który można również rozszerzyć do wysokoprzepustowych badań przesiewowych. Łącznie te trzy protokoły mogą być wykorzystywane do monitorowania kluczowych aspektów aktywności komórek NK, które są niezbędne dla zdolności komórek do eliminowania dysfunkcyjnych komórek docelowych.

Wprowadzenie

Zdolność ludzkiego ciała do identyfikowania obcych obiektów jest kluczem do przetrwania człowieka przed patogenami i nowotworami złośliwymi1. Najważniejszą rolę w tym procesie odgrywa ludzka odpowiedź immunologiczna2,3,4. Na podstawie kluczowych cech i funkcji ludzki układ odpornościowy można ogólnie podzielić na dwie główne grupy funkcjonalne: adaptacyjny układ odpornościowy i wrodzony układ odpornościowy. Adaptacyjny układ odpornościowy jest zazwyczaj specyficzny dla danego patogenu i posiada pamięć immunologiczną, a zatem jest długotrwały i reaguje na przyszłe ponowne zakażenie tym samym patogenem5,6,7,8,9. W przeciwieństwie do tego, odporność wrodzona jest znacznie szersza w docelowym zwalczaniu i stosunkowo niespecyficzna. Dlatego zazwyczaj wrodzona odpowiedź immunologiczna służy jako pierwsza linia obrony immunologicznej10. Komórki NK należą do wrodzonego układu odpornościowego i stanowią 10−15% wszystkich krążących limfocytów11. Komórki NK eliminują komórki docelowe za pomocą dwóch głównych mechanizmów. Po pierwsze, po związaniu się z komórkami docelowymi eksprymującymi aktywujące ligandy, komórki NK uwalniają zaburzające błonę białko perforynę i proteazę serynową granzymy poprzez egzocytozę, które wspólnie indukują apoptozę w komórkach docelowych12,13,14,15. Dodatkowo, komórki NK eksprymujące FasL i ligand indukujący apoptozę związany z czynnikiem martwicy nowotworu (TRAIL) oddziałują z komórkami docelowymi wyrażającymi receptory śmierci (Fas / CD95), prowadząc do apoptozy zależnej od kaspazy16. Co najważniejsze, komórki NK nie wymagają wstępnej stymulacji, takiej jak prezentacja antygenu, w celu wyeliminowania komórek zakażonych patogenami lub złośliwych; W związku z tym są one zwykle w stanie gotowym do zabicia17,18. Aby zahamować rozwój i progresję guza oraz wyeliminować komórki rakowe, komórki NK muszą migrować do miejsca guza, a po znalezieniu się w mikrośrodowisku guza zidentyfikować i zaatakować komórki docelowe.

W przeszłości funkcje efektorów komórek NK były głównie monitorowane za pomocą testów degranulacji i cytotoksyczności19,20,21. Cytotoksyczność komórek NK można również zmierzyć za pomocą testu uwalniania chromu 5122,23,24,25. Jednak test ten ma pewne specyficzne wymagania, w tym potrzebę licznika promieniowania gamma, i jest oparty na radioaktywności, co wymaga szkolenia w zakresie obchodzenia się z materiałami promieniotwórczymi i ich usuwania oraz stanowi poziom ryzyka dla użytkownika. W związku z tym opracowano i zastosowano kilka nowych testów nieopartych na radioaktywności, które zastosowano do badania aktywności komórek NK.

Tutaj opisujemy dwa takie protokoły, kolorymetryczną dehydrogenazę mlekową (LDH) opartą na pomiarze cytotoksyczności za pośrednictwem komórek NK oraz mikroskopową metodę barwienia opartą na acetoksymetylu kalceiny (AM) do pomiaru eradykacji komórek rakowych za pośrednictwem komórek NK. Testy te nie wymagają stosowania izotopów promieniotwórczych, są proste, czułe i w powtarzalny sposób identyfikują czynniki, które modulują funkcję komórek NK. Dodatkowo, ponieważ funkcja komórek NK nie może być w pełni oceniona bez monitorowania zmian w migracji komórek NK, przedstawiamy również metodę ilościową opartą na cytometrii przepływowej do monitorowania migracji komórek NK.

Protokół

1. Przygotowanie pożywki hodowlanej dla komórek NK i komórek guza wątroby

  1. Wykorzystać ludzkie komórki natural killer (np. NK92MI) oraz ludzką linię komórkową raka wątroby (np. SK-HEP-1).
  2. Przygotować pożywkę do hodowli komórek NK dla ludzkich komórek NK92MI, dodając do 50 mL minimalnej pożywki podstawowej Eagle alpha (MEM alpha) bez rybonukleozydów i deoksyrybonukleozydów następujące składniki do wskazanych stężeń końcowych: 0,02 mM kwasu foliowego (10 µL kwasu foliowego 100 mM), 0,2 mM mioinozytolu (50 µL mioinozytolu 200 mM), 0,1 mM β-merkaptoetanolu (3,5 µL β-merkaptoetanolu 14,3 M), 2 mM L-glutaminy (5 mL L-glutaminy 20 mM), 1% penicyliny/streptomycyny (5 mL penicyliny/streptomycyny 10x), 12,5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 12,5% surowicy koni. Wymieszać i wysterylizować poprzez filtrację przy użyciu sterylnej jednostki filtrującej 0,2 µm, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotować pożywkę do hodowli linii komórkowej guza wątroby SK-HEP-1, dodając 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny do pożywki Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) z wysoką zawartością glukozy, zawierającej 2 mM L-glutaminy.

2. Test cytotoksyczności pośredniej komórek NK oparty na kolorymetrycznym pomiarze aktywności LDH

  1. Hodować komórki SK-HEP-1 do 70−80% konfluencji w 10 mm szalce Petri do hodowli komórkowej w 5% CO22 w 37 °C w CO2 inkubator. Przygotować zawiesinę pojedynczych komórek, najpierw płukąc komórki 5 ml 1x soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), a następnie inkubując je z 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA w 5% CO22 w 37 °C w CO2 w inkubatorze aż do momentu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.
    UWAGA: Aktywność komórek NK może zostać indukowana przez obciążone komórki nowotworowe w wyniku zmian w ekspresji ligandów aktywujących komórki NK w tych komórkach. Aby uzyskać dokładne wyniki, należy stosować zdrowe i subkonfluentne komórki nowotworowe. Należy również zauważyć, że receptory komórek NK oraz ich ligandy mogą być wrażliwe na trypsynizację.26,27W związku z tym protokół trypsynizacji należy starannie zoptymalizować i należy unikać nadmiernej trypsynizacji.
  2. Po trypsynizacji dodać 10 ml pożywki do hodowli komórek SK-HEP-1 i odwirować przy 160 x g przez 3 min w sterylnym stożkowym probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Osad komórkowy przemyć 5 ml 1x PBS i resuspendować w 5 ml pożywki hodowlanej.
  3. Równolegle odwiruj komórki NK92MI przy 160 x g przez 3 min w sterylnej probówce do wirowania o pojemności 15 ml. Osad komórkowy przemyć 5 ml 1x PBS i resuspender w 5 ml pożywki do hodowli komórek NK92MI.
    UWAGA: Komórki NK92MI są hodowane w pożywce do hodowli komórek NK i otrzymywane w sposób analogiczny do opisanego w punkcie 2.1.
  4. Należy policzyć komórki SK-HEP-1 i NK92MI za pomocą komory licznikowej (hemocytometru) lub dowolnego dostępnego automatycznego licznika komórek.
  5. Dodaj komórki SK-HEP-1 (komórki docelowe) (1 x 104/100 µL/well) oraz komórki NK92MI (komórki efektorowe) (1 x 105/100 µL/well) w stosunku 1:10 (komórki docelowe:efektory) i wysiać w trzech powtórzeniach w płytce 96-dołkowej.
  6. Inkubować płytkę 96-dołkową w temperaturze 37 °C w atmosferze składającej się z 95% powietrza i 5% CO22 przez 3 h. Po inkubacji odwiruj płytkę przy 450 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
  7. Niezaburzając osadu komórkowego, zebrać 100 µL supernatantu z każdej studzienki i przenieść do studzienki w nowej płytce 96-dołkowej.
  8. Dodaj 50 µL substratu LDH, wymieszać dokładnie i inkubować płytkę przez 20 min w temperaturze pokojowej w ciemności.
  9. Zatrzymać reakcję poprzez dodanie 50 µL roztworu zatrzymującego (50% dimetylformamidu i 20% dodecylosiarczanu sodu o pH 4,7). Następnie bezzwłocznie zmierz absorbancję płytki przy 490 nm i 680 nm przy użyciu czytnika płytek.
  10. Odejmij absorbancję przy 680 nm od absorbancji przy 490 nm. Oblicz procent (%) cytotoksyczności komórek NK, korzystając z poniższego wzoru.
    Równanie cytotoksyczności komórek NK, wzór na procent cytotoksyczności z wykorzystaniem testu LDH, schemat równania.
    gdzie LDH experimentalne (komórki efektorowe + docelowe) to absorbancja komórek NK92MI i komórek SK-HEP-1, LDH komórek efektorowych to absorbancja samych komórek NK92MI, LDH spontaniczne to absorbancja samych komórek SK-HEP-1, a LDH maksymalne to absorbancja komórek SK-HEP-1 z buforem lizującym.
    UWAGA: Aby zminimalizować interferencję surowicy, należy zawsze stosować następujące kontrole: same komórki docelowe (SK-HEP-1), same komórki efektorowe (NK92MI), komórki docelowe z buforem lizującym jako kontrolę pełnej lizy, podłoże dla komórek docelowych, podłoże dla NK92MI, a także mieszaninę podłoża dla komórek docelowych i podłoża dla NK92MI w stosunku 1:1.

3. Mikroskopowa metoda pomiaru cytotoksyczności zależnej od komórek NK oparta na barwieniu calceiną AM

  1. Hodować komórki SK-HEP-1 do uzyskania 70-80% konfluencji. Przygotować zawiesinę pojedynczych komórek, najpierw przemywając komórki 5 ml 1x PBS, a następnie inkubując je w 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA.
  2. Odwiruj komórki SK-HEP-1 w sterylnej probówce do wirowania o pojemności 1 ml przy 160 x g przez 3 min. Przesuspender osad w 3 ml medium DMEM bez surowicy.
  3. Dodaj 1.5 µL roztworu kalceiny AM (10 mM) do komórek SK-HEP-1 i inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej. Odwiruj oznakowane kalceiną AM komórki SK-HEP-1 przy 160 x g przez 3 min w sterylnej probówce wirówkowej o objętości 15 ml.
  4. Przemyć komórki dwukrotnie 5 ml 1x PBS, aby usunąć nadmiar barwnika calcein AM.
  5. Równocześnie odwiruj komórki NK92MI z prędkością 160 x g przez 3 min w sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Osad komórkowy przemyć raz 5 ml 1x PBS, a następnie resuspender w 5 ml pożywki dla komórek NK92MI.
  6. Policzyć komórki SK-HEP-1 oraz komórki NK92MI znakowane kalceiną AM, używając hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
  7. Resuspender komórki SK-HEP-1 w pożywce hodowlanej w stężeniu 1 x 105 komórek/ml oraz komórki NK92MI w stężeniu 1 x 106 komórek/ml w medium dla komórek NK.
  8. Wysiać na płytkę komórki SK-HEP-1 (komórki docelowe) znakowane kalceiną AM (1 x 104/100 µL/well) z komórkami NK92MI (komórki efektorowe) (1 x 105/100 µL/well) (stosunek docelowy:efektor 1:10) na studzienkę, w trzech powtórzeniach w płytce 96-dołkowej.
  9. Inkubować płytkę 96-dołkową w temperaturze 37 °C w atmosferze składającej się z 95% powietrza i 5% CO22 przez 4 h. Po inkubacji należy wykonać obrazy fluorescencyjne komórek znakowanych calceiną AM przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego z powiększeniem 10x. Należy zarejestrować co najmniej 10 różnych pól widzenia dla każdego powtórzenia w każdym wariancie traktowania.
  10. Losowo wybierz 10 obrazów dla każdej powtórki i policz komórki docelowe znakowane calceiną AM dodatnie w grupach inkubowanych z komórkami NK92MI lub bez nich. Oblicz % cytotoksyczności, korzystając z poniższego wzoru.
    Wzór cytotoksyczności komórek NK; schemat; równanie służące do oceny cytotoksyczności komórek odpornościowych in vitro.
    UWAGA: Jako kontrole należy zastosować komórki docelowe bez komórek NK92MI oraz całkowicie lizowane komórki docelowe jako kontrolę całkowitej lizy. W celu przeprowadzenia całkowitej lizy należy inkubować komórki w 0,5% Triton X-10 przez 1 h (20 µL 5% Triton X-10 w 200 µL pożywek hodowlanych).

4. Test migracji komórek NK

  1. Hodować komórki NK92MI i wirować komórki z prędkością 160 x g przez 3 min w sterylnym probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
  2. Osad komórkowy przemyć dwukrotnie 5 ml 1x PBS, a następnie zawiesić komórki w 3 ml bezsurowiczego pożywki dla komórek NK92MI. Liczbę komórek NK92MI oznaczyć za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
  3. Wysiać komórki NK92MI (2,5 x 105 komórki/100 µL/well) w górnej komorze przepuszczalnej wkładki Transwell (wkładka o średnicy 6,5 mm i 5 µm wielkość porów).
  4. Do dolnej komory należy dodać 0,6 ml medium bezsurowiczego zawierającego materiał badany pod kątem właściwości chemoatraktacyjnych dla komórek NK (np. medium kondycjonowane, chemokiny, cytokiny).
    UWAGA: Podczas przygotowywania medium warunkującego należy użyć medium o obniżonej zawartości surowicy bez dodatku surowicy, aby wyeliminować interferencję białek surowicy w teście migracji.
  5. Inkubować przepuszczalne komory 24-dołkowe w temperaturze 37 °C przez 4 h. Po 4 h należy zebrać nieprzyległe i zmigrowane komórki NK92MI z dolnej komory i przenieść je do probówek do sortera komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) w celu dalszej analizy.
    UWAGA: Czas hodowli może się różnić w zależności od rodzaju komórek docelowych, a także od ilości i kinetyki chemokin produkowanych przez te komórki. W związku z tym czas ten należy ustalić empirycznie dla każdego typu komórek, chemokiny i eksperymentu.
  6. Dodaj określoną liczbę kulek liczących do cytometrii przepływowej w objętości 50 µL do każdej probówki zawierającej migrujące komórki NK. Oceń objętość 300 µL/well zawiesinę komórkową przy użyciu dowolnego cytometru przepływowego umożliwiającego zautomatyzowane liczenie komórek metodą FACS.
    UWAGA: Przed każdym użyciem należy dokładnie wymieszać lub wymieszać w wirówce laboratoryjnej (vortex) kulek do liczenia w cytometrii przepływowej, aby zapewnić wykorzystanie stałej liczby kulek i zminimalizować zmienność eksperymentalną. W celu zachowania dokładności przy pracy z kulkami do liczenia zaleca się stosowanie pipetowania odwrotnego. Jako kontrole analizy FACS należy używać wyłącznie komórek NK oraz kulek do liczenia w cytometrii przepływowej. Autorzy zalecają odczyt co najmniej 10 0 łącznie kulek i komórek NK, co w ich doświadczeniu przyniosło dobre rezultaty. Liczba ta może się jednak różnić w zależności od warunków eksperymentalnych. W związku z tym łączna liczba kulek i komórek NK powinna zostać określona empirycznie dla każdego rodzaju eksperymentu. Ponadto ważne jest przeprowadzanie doświadczeń w trzech powtórzeniach biologicznych, aby uzyskać statystycznie istotne wyniki i uwzględnić zmienność między różnymi liczbami komórek.
  7. Oblicz bezwzględną liczbę migrowanych komórek NK92MI, korzystając z następującego wzoru:
    Wzór na migrację komórek NK92MI: A/B × C/D. Równanie, metoda obliczania migracji komórek.
    gdzie A = liczba komórek, B = liczba kulek, C = przypisana liczba kulek w partii (liczba kulek liczących do cytometrii przepływowej/50 µL; w tym przykładzie 49 50), a D = objętość próbki (µL).
    UWAGA: Jeśli 300 µL objętości próbki (migrowane komórki) wykorzystuje się do analizy FACS przy użyciu 50 µL liczby kulek do cytometrii przepływowej, absolutna liczba migrowanych komórek = 1 70 komórek / 3 30 zdarzeń kulek x 49 50 kulek/300 µL = 84,975 komórek/µLObliczenia należy skorygować w przypadku rozcieńczenia próbki lub zastosowania innej objętości kulek liczących do FACS.

Wyniki

Testy cytotoksyczności komórek NK oraz test migracji komórek NK przeprowadzono z wykorzystaniem linii komórek guza wątroby SK-HEP-1 jako systemu modelowego. Aby zmierzyć cytotoksyczność komórek NK za pomocą testu LDH, komórki SK-HEP-1 wykazujące ekspresję niespecyficznego (NS) shRNA lub shRNA skierowanego przeciwko aktywującemu czynnikowi transkrypcyjnemu 4 (ATF4) inkubowano z komórkami NK92MI na płytce 96-dołkowej przez 3 h (Rysunek 1A). Wcześniej wykazano, że ATF4 reguluje cytotoksyczność komórek NK poprzez upregulację aktywującego ligandu ULBP128. Aktywność LDH związaną z zabijaniem komórek docelowych przez komórki NK mierzono kolorymetrycznie, a procent cytotoksyczności obliczono zgodnie z formułą opisaną w protokole 1. Nokdown ATF4 znacząco zredukował cytotoksyczność indukowaną przez komórki NK w porównaniu z komórkami NK wykazującymi ekspresję NS shRNA (Rysunek 1B-D). Zmierzyliśmy również cytotoksyczność komórek NK za pomocą testu opartego na barwieniu kalceiną AM. W tym celu komórki SK-HEP-1 wykazujące ekspresję NS shRNA lub shRNA skierowanego przeciwko ATF4 znakowano kalceiną AM i inkubowano z komórkami NK92MI na płytkach 96-dołkowych przez 4 h, jak pokazano na Rysunku 2A. Po inkubacji obrazowane komórki pozytywne pod kątem kalceiny AM przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z filtrem FITC/GFP. Komórek zabitych przez komórki NK nie wykrywa się tą metodą, ponieważ nie zatrzymują one już barwnika kalceiny AM. Jak pokazano na Rysunku 2B,C, liczba komórek SK-HEP-1 pozytywnych pod kątem kalceiny AM zmniejsza się po kokulturze z komórkami NK92MI w porównaniu z komórkami SK-HEP-1 hodowanymi bez komórek NK92MI. Jednakże, zgodnie z oczekiwaniami, nokdown ATF4 za pomocą shRNA zredukował zabijanie komórek SK-HEP-1 przez komórki NK, co objawiło się większą liczbą komórek pozytywnych pod kątem kalceiny AM (Rysunek 2B,C). Zatem zarówno testy oparte na LDH, jak i kalceinie AM wykazały spójne wyniki i potwierdziły, że nokdown ATF4 redukuje indukowaną przez NK cytotoksyczność komórek nowotworowych. Każdy z tych testów jest wystarczający do oceny cytotoksyczności indukowanej przez komórki NK; zalecamy jednak stosowanie obu metod w celu zwiększenia rygoru oraz pewności uzyskanych wyników.

Przedstawiamy również wyniki testu migracji komórek NK w 24-dołkowej płytce. Komórki NK92MI zawieszono ponownie w bezsurowiczym medium NK92MI w górnej komorze, a do dolnej komory przepuszczalnej dodano ligand 2 chemokiny o motywie CC (CCL2). Migrację komórek NK oceniano zgodnie z opisem w sekcji 3 (Rysunek 3A). Liczbę migrujących komórek NK92MI określono poprzez dodanie kulek liczonych do cytometrii przepływowej, a następnie przeprowadzono analizę FACS. Jak pokazano na Rysunku 3B-C, odnotowano istotny wzrost liczby komórek NK92MI, które migrowały w kierunku medium zawierającego CCL2, w porównaniu do medium kontrolnego.

Schemat testu cytotoksyczności LDH z udziałem komórek NK i komórek nowotworowych, pomiar absorbancji przy 490/680 nm.
Rysunek 1: Kolorymetryczny test cytotoksyczności pośredniczonej przez komórki NK oparty na aktywności LDH. (A) Schemat przedstawiający kluczowe etapy kolorymetrycznego testu cytotoksyczności komórek NK opartego na aktywności LDH. (B,C) Analizowano ekspresję ATF4 w komórkach SK-HEP-1 wykazujących ekspresję nieswoistego (NS) shRNA lub shRNA skierowanych przeciwko ATF4 za pomocą ilościowej RT-PCR i western blottingu. (B) Względny ATF4 poziom mRNA przedstawiono po normalizacji do ACTINB poziom w komórkach SK-HEP-1 wykazujących ekspresję shRNA przeciwko NS lub shRNA przeciwko ATF4. (C) poziom białek ATF4 i ACTINB w komórkach SK-HEP-1 wykazujących ekspresję NS shRNA lub ATF4 shRNA (małe cząsteczki interferencyjne RNA). (D) cytotoksyczność zależną od komórek NK analizowano w komórkach SK-HEP-1 wykazujących ekspresję albo NS shRNA, albo ATF4 shRNA metodą LDH. Przedstawiono procent (%) cytotoksyczności zależnej od komórek NK. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM; ns – brak istotności statystycznej; **p < 0,01, ***p < 0.001. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury, kliknij tutaj.

Równowaga statyczna w cytolizie; schemat testu komórek NK z mikroskopią, przedstawiający wyniki lizy komórek.
Rysunek 2: Mikroskopowa metoda pomiaru cytotoksyczności pośredniczonej przez komórki NK oparta na barwieniu Calcein AM. (A) Schemat przedstawiający kluczowe etapy mikroskopowej metody pomiaru cytotoksyczności zależnej od komórek NK, opartej na barwieniu kalceiną AM. (B) Cytotoksyczność zależna od komórek NK analizowano w komórkach SK-HEP-1 wykazujących ekspresję shRNA dla NS lub ATF4 shRNA z zastosowaniem metody z calceiną AM. Przedstawiono reprezentatywne obrazy. Pasek skali = 200 μm. (C) Procent komórek pozytywnych pod względem calceiny AM dla eksperymentu przedstawionego na panelu B. **p < 0.01. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Test Transwell migracji komórek NK, analiza cytometryczna; stymulator CCL2; wynik przedstawiony na wykresie słupkowym.
Rycina 3: Ilościowy test migracji komórek NK oparty na metodzie FACS. (A) Schemat przedstawiający kluczowe etapy testu migracji komórek NK w oparciu o metodę FACS. (B,CAnalizę migracji komórek NK przeprowadzono po dodaniu 50 ng CCL2 do dolnej komory płytki 24-dołkowej.B) Przedstawiono reprezentatywne wykresy kropkowe migracii komórek NK dla grupy kontrolnej oraz dla pożywki hodowlanej z dodatkiem CCL2. (C) Dane dotyczące migracji komórek NK (średnia ± SEM) przedstawiono dla eksperymentu pokazanego na panelu B. ***p < 0.001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Dyskusja

Opisane tutaj metody cytotoksyczności i migracji mogą być wykorzystane do oceny cytotoksyczności komórek NK dla komórek nowotworowych i mechanizmów unikania odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem komórek NK w nowotworach złośliwych, a także do identyfikacji środków terapeutycznych, które zwiększą aktywność/funkcję komórek NK. Protokoły są proste, czułe, powtarzalne i stanowią preferowaną alternatywę dla klasycznego testu uwalniania chromu 51opartego na radioaktywności. Protokoły zostały specjalnie zaprojektowane tak, aby można je było łatwo dostosować do użytku w większości laboratoriów, z prostymi odczytami kolorymetrycznymi, mikroskopowymi lub opartymi na FACS, które są łatwe do interpretacji, co pozwala badaczom na wyciągnięcie wiarygodnych wniosków. Wszystkie są skalowalne pod kątem wysokoprzepustowych podejść opartych na badaniach przesiewowych. Chociaż protokoły są przedstawione w kontekście pojedynczej linii komórkowej guza wątroby, można je łatwo dostosować do innych typów komórek rakowych i/lub innych nienowotworowych komórek docelowych.

Podczas gdy wszystkie przedstawione metody są solidne i powtarzalne, różnice międzyeksperymentalne mogą wystąpić w przypadku różnych partii komórek nowotworowych i komórek NK. Aby upewnić się, że wyniki dokładnie wspierają wnioski z eksperymentów, zaleca się powtórzenie eksperymentu co najmniej dwa razy przy użyciu biologicznych trzech prób.

Ograniczeniem tej metody jest to, że tempo wzrostu komórek NK92MI może być powolne. Dlatego w przypadku eksperymentów z 50 lub więcej próbkami należy wcześniej wyhodować wystarczającą liczbę NK92MI, aby zapobiec opóźnieniom. Ponadto wszystkie kontrole opisane w protokołach muszą zostać wdrożone, aby uniknąć fałszywych i niepowtarzalnych wyników. Innym ograniczeniem testu cytotoksyczności NK jest to, że stosunek NK do komórek rakowych, a także czas inkubacji, muszą być zoptymalizowane dla każdej komórki docelowej. Na przykład przetestowaliśmy różne proporcje komórek rakowych do komórek NK (1:5, 1:10, 1:20, 1:40 i 1:80) dla linii komórkowych raka wątroby, a także wielokrotne czasy inkubacji (2, 3, 4, 5 i 6 godzin). Na podstawie naszych wyników zaobserwowaliśmy najbardziej spójne wyniki ze stosunkami 1:10 i 1:20 komórek nowotworowych do komórek NK i inkubacją przez 3 godziny.

Ponadto komórki rakowe pochodzące z guzów litych przyczepiają się i rosną na powierzchni płytki hodowlanej, podczas gdy komórki NK rosną w zawiesinie. Jeśli czas inkubacji jest dłuższy niż 3 godziny, zaleca się stosowanie 96-dołkowych płytek o ultraniskim przyłączu, co poprawi spójność i odtwarzalność między eksperymentami i kontrpróbami biologicznymi. Ważne jest również, aby pamiętać, że testy cytotoksyczności indukowanej komórkami NK można również przeprowadzić przy użyciu pierwotnych komórek NK wyizolowanych z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Istnieją jednak pewne ograniczenia związane z takimi eksperymentami. Po pierwsze, eksperymenty te nie mogą być tak łatwo skalowane, jak w przypadku ogniw NK92MI. Po drugie, zmienność aktywności cytotoksycznej komórek NK wyizolowanych z PMBC z partii na partię może być problematyczna pod względem odtwarzalności i interpretacji wyników. Podobnie, inne ludzkie linie komórkowe NK są opisane w literaturze i mogą być wykorzystane w tego typu eksperymentach, w tym komórki NKL29; jednak w przeciwieństwie do komórek NK-92MI, komórki NKL są zależne od IL-2 i nie są dostępne na rynku.

Biorąc pod uwagę opisane eksperymenty z kalceiną AM, ważne jest, aby zauważyć, że kalceina AM pozostaje w ciałach apoptotycznych po śmierci komórki30. Z tego względu należy dokładnie przeprowadzić ilościowe oznaczanie kalceiną AM, ponieważ może to prowadzić do niedoszacowania cytotoksyczności NK.

Podobnie jak w przypadku cytotoksyczności za pośrednictwem komórek NK, modulacja migracji komórek NK przez cytokiny i inne chemoatraktanty odgrywa ważną rolę w regulacji funkcji komórek NK. Opisany tutaj test migracji komórek NK stanowi prostą platformę do oceny migracji komórek NK w kontekście bodźca, takiego jak chemokina lub chemoatraktant. Test ten może być wykorzystany do oceny czynników, które mogą promować lub zakłócać migrację komórek NK - identyfikując w ten sposób wzmacniacze i represory migracji komórek NK. Metoda ta może być również przydatna do badania zdolności regulacyjnej migracji komórek NK w wyniku zmian genetycznych/epigenetycznych (regulacja w górę lub w dół) lub w wyniku leczenia farmakologicznego.

Aby dokładnie zmierzyć migrację komórek NK, należy wykonać kilka krytycznych kroków. W przypadku wszystkich eksperymentów z użyciem kondycjonowanej pożywki ważne jest, aby w celu uzyskania dokładnych pomiarów stosować równoważne kondycjonowane podłoże zarówno w warunkach kontrolnych, jak i leczniczych. Czas inkubacji będzie urozmaicony oczyszczonymi chemoatraktantami i kondycjonowaną pożywką. Wreszcie, testy migracji transwell są dobrze ugruntowane i uważane za doskonałą metodę oceny migracji komórek NK; jednak jednorodne monokultury zastosowane w testach nie mają złożonej fizjologii tkanek, a nawet kultur 3D, które mogłyby dokładniej naśladować mikrośrodowisko guza.

Tak więc, chociaż istnieją pewne ograniczenia dotyczące testów cytotoksyczności komórek NK i testów migracji NK przedstawionych w tym artykule, testy te mają zastosowanie w szerokim zakresie badań immunologicznych, a tym samym zapewniają ważne i wiarygodne metody oceny funkcji komórek NK i modulujących immunoterapii komórek NK.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Z wdzięcznością dziękujemy za granty od National Institutes of Health: R01CA195077-01A1 (NW), R01CA200919-01 (NW) i 1R01 CA218008-01A1 (NW). Potwierdzamy również finansowanie Departamentu Obrony W81XWH1910480 i W81XWH-18-1-0069 dla NW.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Koraliki do liczenia bezwzględnegoThermo Fisher ScientificC36950
Alpha-MEMSigma-AldrichM4256
Amicon ultra Filtry odśrodkoweMilliporeUFC900324
Calcein AM dyeSigma-Aldrich17783
DMEMGibco11965-092
Surowica bydlęca płoduGibco
Kwas foliowySigma-AldrichF8758
Surowica koniaGibco16050114
L-glutamina (200 mM)Gibco2530081
cytotoksyczny LDH ZestawThermo Fisher Scientific88953
mio-inozytolSigma-AldrichI5125
NK92MI komórkiATCCCRL-2408
Opti-MEMGibco31985070
Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS)Sigma-AldrichP4417
SKHEP-1 KomórkiATCCHTB-52
Komory przepuszczalne TranswellCostar3241
Roztwór trypsyny EDTAGibco25200056
26140079 Test

Bibliografia

  1. Chiossone, L., Dumas, P. Y., Vienne, M., Vivier, E. Natural killer cells and other innate lymphoid cells in cancer. Nature Reviews Immunology. 18 (11), 671-688 (2018).
  2. Borghaei, H., Smith, M. R., Campbell, K. S. Immunotherapy of cancer. European Journal of Pharmacology. 625 (1-3), 41-54 (2009).
  3. Kalbasi, A., Ribas, A. Tumour-intrinsic resistance to immune checkpoint blockade. Nature Reviews Immunology. , (2019).
  4. Zhang, Q., Cao, X. Epigenetic regulation of the innate immune response to infection. Nature Reviews Immunology. 19 (7), 417-432 (2019).
  5. Janeway, C. A. Jr The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunol Today. 13 (1), 11-16 (1992).
  6. Natoli, G., Ostuni, R. Adaptation and memory in immune responses. Nature Immunology. 20 (7), 783-792 (2019).
  7. Cooper, M. D., Alder, M. N. The evolution of adaptive immune systems. Cell. 124 (4), 815-822 (2006).
  8. Riera Romo, M., Perez-Martinez, D., Castillo Ferrer, C. Innate immunity in vertebrates: an overview. Immunology. 148 (2), 125-139 (2016).
  9. Sonnenberg, G. F., Hepworth, M. R. Functional interactions between innate lymphoid cells and adaptive immunity. Nature Reviews Immunology. 19 (10), 599-613 (2019).
  10. Vivier, E., et al. Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells. Science. 331 (6013), 44-49 (2011).
  11. Shi, F. D., Ljunggren, H. G., La Cava, A., Van Kaer, L. Organ-specific features of natural killer cells. Nature Reviews Immunology. 11 (10), 658-671 (2011).
  12. Trapani, J. A., Davis, J., Sutton, V. R., Smyth, M. J. Proapoptotic functions of cytotoxic lymphocyte granule constituents in vitro and in vivo. Current Opinion in Immunology. 12 (3), 323-329 (2000).
  13. Krzewski, K., Strominger, J. L. The killer's kiss: the many functions of NK cell immunological synapses. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 597-605 (2008).
  14. Berke, G. The binding and lysis of target cells by cytotoxic lymphocytes: molecular and cellular aspects. Annual Review of Immunology. 12, 735-773 (1994).
  15. Abel, A. M., Yang, C., Thakar, M. S., Malarkannan, S. Natural Killer Cells: Development, Maturation, and Clinical Utilization. Frontiers in Immunology. 9, 1869(2018).
  16. Zamai, L., et al. Natural killer (NK) cell-mediated cytotoxicity: differential use of TRAIL and Fas ligand by immature and mature primary human NK cells. Journal of Experimental Medicine. 188 (12), 2375-2380 (1998).
  17. Marcus, A., et al. Recognition of tumors by the innate immune system and natural killer cells. Advances in Immunology. 122, 91-128 (2014).
  18. Vesely, M. D., Kershaw, M. H., Schreiber, R. D., Smyth, M. J. Natural innate and adaptive immunity to cancer. Annual Review of Immunology. 29, 235-271 (2011).
  19. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. Journal of Immunological Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
  20. Bryceson, Y. T., et al. A prospective evaluation of degranulation assays in the rapid diagnosis of familial hemophagocytic syndromes. Blood. 119 (12), 2754-2763 (2012).
  21. Shabrish, S., Gupta, M., Madkaikar, M. A Modified NK Cell Degranulation Assay Applicable for Routine Evaluation of NK Cell Function. Journal of Immunology Research. 2016, 3769590(2016).
  22. Pietra, G., et al. Melanoma cells inhibit natural killer cell function by modulating the expression of activating receptors and cytolytic activity. Cancer Research. 72 (6), 1407-1415 (2012).
  23. Fehniger, T. A., et al. Potential mechanisms of human natural killer cell expansion in vivo during low-dose IL-2 therapy. Journal of Clinical Investigation. 106 (1), 117-124 (2000).
  24. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
  25. Roder, J. C., et al. A new immunodeficiency disorder in humans involving NK cells. Nature. 284 (5756), 553-555 (1980).
  26. Byrd, A., Hoffmann, S. C., Jarahian, M., Momburg, F., Watzl, C. Expression analysis of the ligands for the Natural Killer cell receptors NKp30 and NKp44. PLoS One. 2 (12), e1339(2007).
  27. Nitahara, A., et al. NKG2D ligation without T cell receptor engagement triggers both cytotoxicity and cytokine production in dendritic epidermal T cells. Journal of Investigative Dermatology. 126 (5), 1052-1058 (2006).
  28. Gowen, B. G., et al. A forward genetic screen reveals novel independent regulators of ULBP1, an activating ligand for natural killer cells. Elife. 4, e08474(2015).
  29. Robertson, M. J., et al. Characterization of a cell line, NKL, derived from an aggressive human natural killer cell leukemia. Experimental Hematology. 24 (3), 406-415 (1996).
  30. Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), e0141074(2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

kom rki Natural Killertest cytotoksyczno cimigracja kom rekcytometria przep ywowatest LDHcalceina AMrak hepatokom rkowychemotaksjahodowla kom rkowamikroskopia fluorescencyjna
Pomiar cytotoksyczności i migracji komórek NK w kontekście komórek nowotworowych wątroby
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.