Fluorescencyjne obrazowanie wapnia i późniejsza hybrydyzacja in situ w celu charakterystyki prekursorów neuronalnych u Xenopus laevis

Podsumowanie

Prezentujemy dwuczęściowy protokół, który łączy fluorescencyjne obrazowanie wapnia z hybrydyzacją in situ, pozwalając eksperymentatorowi skorelować wzorce aktywności wapnia z profilami ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki.

Streszczenie

Spontaniczną wewnątrzkomórkową aktywność wapnia można zaobserwować w różnych typach komórek i proponuje się odgrywanie kluczowych ról w różnych procesach fizjologicznych. W szczególności odpowiednia regulacja wzorców aktywności wapnia podczas embriogenezy jest niezbędna dla wielu aspektów rozwoju neuronalnego kręgowców, w tym prawidłowego zamykania cewy nerwowej, synaptogenezy i specyfikacji fenotypu neuroprzekaźników. Podczas gdy obserwacja, że wzorce aktywności wapnia mogą różnić się zarówno częstotliwością, jak i amplitudą, sugeruje przekonujący mechanizm, za pomocą którego strumienie te mogą przekazywać zakodowane sygnały do dalszych efektorów i regulować ekspresję genów, istniejące podejścia na poziomie populacji nie były wystarczająco precyzyjne, aby dalej badać tę możliwość. Co więcej, podejścia te ograniczają badania nad rolą interakcji komórka-komórka, wykluczając możliwość oznaczenia stanu determinacji neuronalnej przy braku kontaktu komórka-komórka. Dlatego ustaliliśmy eksperymentalny przepływ pracy, który łączy poklatkowe obrazowanie wapnia zdysocjowanych eksplantatów neuronalnych z fluorescencyjnym testem hybrydyzacji in situ, umożliwiając jednoznaczną korelację wzorca aktywności wapnia z fenotypem molekularnym na poziomie pojedynczej komórki. Udało nam się wykorzystać to podejście do rozróżnienia i scharakteryzowania określonych wzorców aktywności wapnia związanych odpowiednio z różnicowaniem komórek nerwowych i nerwowych komórek progenitorowych; Poza tym jednak ramy eksperymentalne opisane w tym artykule można łatwo dostosować do badania korelacji między dowolnym profilem aktywności szeregów czasowych a ekspresją genu lub genów będących przedmiotem zainteresowania.

Wprowadzenie

Wolny cytozolowy wapń ma kluczowe znaczenie dla różnych procesów biologicznych, począwszy od proliferacji i migracji komórek, a skończywszy na apoptozie i autofagii^1,2,3. W ramach tych szlaków wapń może wywierać dalszy wpływ na ekspresję genów poprzez interakcję z domenami wiążącymi wapń w celu wywołania zmian konformacyjnych, które modulują aktywność i interakcje białek. Na przykład neuronalny czujnik wapnia znany jako Modulator Antagonisty Elementu Regulatorowego (DREAM) jest utrzymywany w rozwiniętej konformacji pośredniej, gdy jest związany przez wapń, co uniemożliwia mu interakcję z jego białkami i celami DNA⁴. Poza tym, że służy jako prosta cząsteczka sygnałowa, dynamiczna natura wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych wapnia pozwala tym wzorcom aktywności kodować bardziej złożone sygnały oparte na amplitudzie lub częstotliwości5^,6. Translokacja jądrowa czynnika transkrypcyjnego czynnika jądrowego aktywowanych limfocytów T (NFAT) jest wzmacniana przez oscylacje wapnia o wysokiej częstotliwości, ale hamowana przez oscylacje o niskiej częstotliwości⁷. Co ciekawe, ostatnie prace sugerują, że NFAT może faktycznie reagować na skumulowaną ekspozycję na wapń⁸. Zarówno kalcyneuryna, jak i kinaza białkowa zależna od Ca^{2 +} / kalmoduliny II (CaMKII) wykazują również wyraźne odpowiedzi na stany przejściowe wapnia o określonej częstotliwości, czasie trwania lub amplitudzie⁹. Aby dodać dodatkowy poziom złożoności regulacyjnej, modele obliczeniowe sugerują, że wiele białek wiążących wapń staje się mniej lub bardziej zależnych od częstotliwości w odpowiedzi na obecność lub brak wiążących konkurentów^10,11.

W rozwijającym się układzie nerwowym zdefiniowano dwie główne klasy zachowań związanych z aktywnością wapnia i są one związane z określonymi procesami biologicznymi. Napływy wapnia są klasyfikowane jako "skoki", jeśli występują w pojedynczych komórkach, osiągają szczytową intensywność ~400% wartości podstawowej w ciągu pięciu sekund i wykazują podwójną wykładniczą degradację¹². Ten typ sygnału jest związany przede wszystkim ze specyfikacją fenotypu neuroprzekaźnika¹³. W przeciwieństwie do tego, "fale" są definiowane jako wolniejsze, mniej ekstremalne stany przejściowe wapnia, w których wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia w komórce wzrasta do ~200% wartości wyjściowej w ciągu trzydziestu sekund lub dłużej, a następnie zanika w ciągu kilku minut¹². Sygnały te często rozchodzą się po wielu sąsiednich komórkach, a ich obecność wiąże się z rozrostem neurytów i proliferacją komórek^14,15. Jednakże, chociaż te dwie klasy zostały zdefiniowane na podstawie charakterystycznych profili kinetycznych, nie jest jasne, które dokładnie cechy tych wzorców są faktycznie wykrywane przez komórki i translowane przez dalsze efektory.

Zrozumienie związku między wewnątrzkomórkowymi oscylacjami wapnia a ekspresją genów dostarczyłoby kluczowego wglądu w jeden z mechanizmów regulacyjnych, które zapewniają prawidłowy rozwój i wzorcowanie układu nerwowego. W tym celu badania embrionalnego rdzenia kręgowego wykazały, że zwiększona aktywność skoków wapnia podczas rozwoju wiąże się z wyższymi poziomami neuronów hamujących, podczas gdy zmniejszona aktywność skoków wapnia wiąże się z wyższymi poziomami neuronów pobudzających¹³. Jednak te testy na poziomie populacji nie zostały wykorzystane do powiązania aktywności wapnia z ekspresją genów na poziomie pojedynczej komórki.

Podejście do tych pytań na poziomie pojedynczej komórki daje kilka wyraźnych zalet w porównaniu z poprzednimi pracami. Po pierwsze, możliwość oceny aktywności wapnia i ekspresji genów w wielu komórkach z osobna pozwala na obserwację pełnego repertuaru różnych wzorców aktywności bez zaciemniania przez pomiar na poziomie masowym. Ponadto badanie tych zależności w hodowli pierwotnej pojedynczej komórki oznacza, że autonomiczne powiązania między aktywnością wapnia a ekspresją genów zostaną utrzymane, podczas gdy interakcje wymagające komunikacji komórka-komórka zostaną zniesione. Dlatego takie podejście pozwala na badanie tych autonomicznych mechanizmów komórkowych w izolacji. Pozwala jednak również na wyjaśnienie i zbadanie roli nieautonomicznej dla komórek aktywności wapnia. Na przykład, komórki mogą być wypreparowane z zarodka na etapie płytki nerwowej, hodowane do momentu, gdy rodzeństwo kontrolne osiągnie stadium cewy nerwowej, a następnie porównane z komórkami, które zostały świeżo wypreparowane z zarodka w stadium cewy nerwowej. Pozwala to na bezpośrednie porównanie komórek, które zachowały komunikację komórka-komórka w kluczowym okresie rozwoju, z tymi, w których komunikacja komórka-komórka została zniesiona.

Szukając rozwiązania problemów poprzednich metod eksperymentalnych, opracowaliśmy protokół, który umożliwiłby ocenę zarówno aktywności wapnia, jak i ekspresji genów w poszczególnych neuronalnych komórkach progenitorowych, ułatwiając korelację określonych wzorców aktywności z późniejszymi programami różnicowania. Tkankę nerwową wypreparowano z Xenopus laevis na różnych etapach rozwoju neuronalnego, zdysocjowano na pojedyncze komórki i zobrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej w obecności fluorescencyjnego wskaźnika wapnia. Po obrazowaniu żywych komórek próbki utrwalono i oznaczono za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu wykrycia ekspresji genu lub izoformy będącej przedmiotem zainteresowania. Co ważne, poszczególne komórki mogą być śledzone w obu eksperymentach obrazowania, co oznacza, że profil aktywności wapnia w komórce i poziom ekspresji genów mogą być ze sobą powiązane (Rysunek 1). Opisany tutaj protokół ma na celu zbadanie związków między wzorcami aktywności wapnia a ekspresją genów w rozwoju neurologicznym embrionalnym u Xenopus laevis. Jednak szersze ramy eksperymentalne (obrazowanie przebiegu czasowego pojedynczej komórki, a następnie FISH i korejestracja obrazu) mogą być modyfikowane i stosowane do praktycznie każdego typu komórki, reportera fluorescencyjnego i genu będącego przedmiotem zainteresowania.

Protokół

Wszystkie prace z udziałem zwierząt zostały wykonane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w College of William and Mary.

1. Opieka nad zwierzętami i obchodzenie się z zarodkami

1. Wywołać naturalne krycie poprzez podanie podskórnego wstrzyknięcia ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (HCG) do grzbietowego worka limfatycznego dorosłego Xenopus laevis w dawce 600 U dla samic i 400 U dla samców.
2. Po wstrzyknięciu należy umieścić na noc co najmniej jednego samca i jedną samicę żaby w zbiorniku o temperaturze pokojowej. Składanie jaj zwykle rozpoczyna się 9-12 godzin po podaniu HCG.
3. Zbieraj zarodki. Dejelli delikatnie przemywając 2% cysteiną (pH 8,0) przez 2-4 min.
4. Opłucz zarodki 3x w 0,1x zmodyfikowanym roztworze Ringera Marka (MMR) (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM_MgSO4, 2 mM CaCl₂, 5 mM HEPES, pH dostosowane do 7,4–7,6).
5. Przenieść zarodki na szklane szalki Petriego o średnicy 100 mm zawierające 0,1x MMR i 50 μg/ml gentamycyny. Odpowiednia jest gęstość 50-100 zarodków na płytkę.
6. Inkubować szalki w temperaturze 14–22°C i pozwolić zarodkom rozwijać się aż do osiągnięcia pożądanego etapu (etapów) rozwojowego. Okresowo usuwaj niezapłodnione komórki i martwicze lub nieprawidłowo rozwijające się zarodki za pomocą plastikowej pipety transferowej.
   UWAGA: Aby zapewnić spójność, stopień zaawansowania rozwoju jest przeprowadzany zgodnie z kryteriami morfologicznymi zdefiniowanymi przez Nieuwkoop i Faber¹⁶. Etapy zainteresowania będą się różnić w zależności od ukierunkowania eksperymentu. Na przykład kluczowe punkty orientacyjne rozwoju układu nerwowego są związane z etapem 14 (początek neurulacji), etapem 18 (początek zamknięcia cewy nerwowej) i etapem 22 (początek wydłużania pąka ogonowego).

2. Sekcja zarodków i przygotowanie próbki

1. Przygotowanie roztworu
   1. Przygotować 2 mM Ca²⁺ roztwór zawierający 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 2 mM CaCl₂·2H₂O, 1,31 mM_MgSO4 i 4,6 mM Tris. Na każde 100 ml roztworu dodać 1 ml penicyliny/streptomycyny (10 000 j./ml penicyliny; 10 000 μg/ml streptomycyny). Dostosuj pH do 7,8 i sterylizuj filtrem.
   2. Przygotuj roztwór wolny od wapnia i magnezu (CMF), łącząc 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 4,6 mM Tris i 0,4 mM EDTA. Dostosuj pH do 7,8 i autoklaw do sterylizacji. Na każde 100 ml roztworu dodać 1 ml penicyliny/streptomycyny (10 000 j./ml penicyliny; 10 000 μg/ml streptomycyny). Dostosuj pH do 7,8 i sterylizuj filtrem.
2. Przygotowanie płytek do rozwarstwienia i obrazowania
   1. Wysterylizuj UV dwie plastikowe szalki Petriego o średnicy 35 mm i jedną naczynie do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm (patrz tabela materiałów).
   2. Podczas pracy w okapie z przepływem laminarnym przygotuj dwie plastikowe stożkowe probówki o pojemności 50 ml zawierające 10 ml roztworu 2 mM Ca²⁺ każda.
   3. Kontynuować pracę w okapie z przepływem laminarnym i dodać 2 ml roztworu 2 mM Ca²⁺ do jednej plastikowej szalki Petriego o średnicy 35 mm, 2 ml roztworu 2 mM Ca²⁺ do jednej szalki do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm i 2 ml roztworu CMF do jednej plastikowej szalki Petriego o średnicy 35 mm.
   4. Na zewnątrz okapu z przepływem laminarnym napełnić dwie plastikowe szalki Petriego o średnicy 100 mm i jedną plastikową szalkę Petriego o średnicy 35 mm roztworem 0,1 MMR z gentamycyną (50 μg/ml). Napełnij plastikową szalkę Petriego o średnicy 60 mm 70% etanolem.
   5. Bezpośrednio przed rosekcją dodać 0,01 g kolagenazy B do jednej z 50 ml probówek zawierających roztwór Ca²⁺. Dobrze wymieszaj i przenieś roztwór na świeżą plastikową szalkę Petriego o średnicy 60 mm.
3. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego zidentyfikuj zarodki o pożądanym etapie rozwoju. Za pomocą sterylnej pipety transferowej przenieść co najmniej sześć odpowiednich zarodków na jedną z płytek o średnicy 100 mm zawierających 0,1x MMR + gentamycyna przygotowanych w kroku 2.2.4. Będzie to służyć jako płyta mocująca.
4. Za pomocą sterylnej pipety transferowej przenieść jeden zarodek na drugą płytkę o średnicy 100 mm zawierającą 0,1x MMR + gentamycyna. Będzie to służyć jako płyta preparacyjna.
   1. W przypadku preparowania zarodków wystarczająco dużych, aby się poruszać (w wieku około 23 lat lub starszych), znieczulenie każdego zarodka przed sekcją poprzez przeniesienie go do naczynia zawierającego 0,1% ester etylowy kwasu 3-aminobenzoesowego rozcieńczony w 0,1 MMR gentamycyną (50 μg / ml). Po unieruchomieniu zarodka przenieś go z powrotem do naczynia zawierającego 0,1x MMR z gentamycyną (50 μg/ml) i kontynuuj sekcję.
5. Ostrożnie usuń błonę witeliny otaczającą zarodek. Najłatwiej można to zrobić, używając pary kleszczy do stabilizacji zarodka, jednocześnie używając pary cienkich kleszczy do chwytania błony. Ostrożnie pociągnij cienkimi kleszkami, aby oderwać membranę witelinową.
6. Użyj cienkich kleszczy, aby oddzielić grzbietową i brzuszną część zarodka. Można to zrobić, używając kleszczy do "uszczypnięcia" zarodka wzdłuż osi przednio-tylnej, przecinając go na pół. Za pomocą sterylnej pipety transferowej przenieść część grzbietową na płytkę o średnicy 60 mm z roztworem kolagenazy przygotowanym w kroku 2.2.5. Wyrzuć część brzuszną.
7. Pozostaw eksplantat grzbietowy do inkubacji w roztworze kolagenazy przez 1-2 minuty w temperaturze pokojowej. Delikatnie przenieś go z powrotem na płytkę preparacyjną.
8. Zakończ sekcję, ostrożnie usuwając wszystkie pozostałości zanieczyszczenia endodermalnego i mezodermalnego z przypuszczalnej tkanki nerwowej ektodermy. W przypadku zarodków w stadium 22 lub starszych cewę nerwową należy również usunąć i wyrzucić.
   UWAGA: Jeśli to konieczne podczas sekcji, naczynie z 70% etanolu przygotowane w kroku 2.2.4 może być użyte do oczyszczenia lub ponownej sterylizacji kleszczy.
9. Po zakończeniu preparacji delikatnie przenieść eksplant na 35-milimetrową płytkę roztworu Ca²⁺ przygotowanego w kroku 2.2.3.
10. Powtarzać kroki 2.4-2.9, aż zostaną zebrane cztery eksplantaty.
11. Za pomocą mikropipety P1000 przenieś wszystkie cztery eksplantaty na płytkę 35 mm zawierającą roztwór CMF, uważając, aby uniknąć kontaktu między eksplantatami a powierzchnią międzypowietrzno-wodną. Delikatnie zakręć naczyniem, aby wszystkie eksplantaty skupiły się na środku talerza.
12. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić eksplantatom dysocjację.
    UWAGA: Aby wspomóc dysocjację, do roztworu CMF można dodać 0,025%–0,01% trypsyny. Może to być konieczne do skutecznej dysocjacji starszych zarodków (stadium 22 i starsze).
13. W tym momencie na płytce trzymającej powinny pozostać co najmniej dwa odpowiednio zaawansowane zarodki. Przenieś te zarodki do świeżego naczynia wypełnionego 0,1x MMR z gentamycyną przygotowanego w kroku 2.2.4 i pozwól im rozwijać się bez zakłóceń, przykrywając naczynie tak, aby pasowało do naczynia z eksplantatu. Te zarodki będą służyć jako kontrola rodzeństwa.
14. Za pomocą kleju superglue przymocuj szkiełko nakrywkowe w mikroliniaturę (patrz tabela materiałów) do dna naczynia do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm przygotowanego w kroku 2.2.3.
    UWAGA: Umieść małe krople superglue wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego, a następnie mocno dociśnij go do spodu naczynia do hodowli komórkowych. Oznaczenia pozycyjne będą zasłonięte w każdym miejscu, w którym klej styka się z siatką, dlatego ważne jest, aby środkowa część szkiełka nakrywkowego z siatką była wolna od kleju.
15. Po dysocjacji eksplantatów przez 1 godzinę użyj mikropipety P100, aby przenieść je do naczynia do hodowli komórkowych. Aby umieścić jak najwięcej komórek na siatkowej części naczynia, należy trzymać pipetę pod płytkim kątem blisko powierzchni naczynia, umieścić końcówkę pipety w rogu kratki skierowanej do wewnątrz i mocno wypchnąć zawiesinę komórek w poprzek siatkowanego obszaru. Idealnie byłoby, gdyby komórki osiedliły się w ciasnym, gęstym klastrze.
16. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby komórki przylgnęły do płytki. Określ i zapisz etap rozwojowy zarodków kontrolnych rodzeństwa, gdy rozpoczyna się ta inkubacja.
17. Połączyć 5 μl 1 mM Fluo-4 AM (patrz tabela materiałów) z 2 μl 10% kwasu pluronowego F-127.
    UWAGA: Fluo-4 AM jest wrażliwy na światło i powinien być przez cały czas przechowywany w bezpiecznej dla światła lub pokrytej folią tubie.
18. Po zakończeniu inkubacji przenieś naczynie na próbkę do ciemni lub innego miejsca chronionego przed światłem. Za pomocą mikropipety usuń 100 μl roztworu z krawędzi naczynia. Dodać ten roztwór do podwielokrotności kwasu Fluo-4 AM/Pluronic F-127, pipetować w górę i w dół, aby wymieszać, i zwrócić pełną objętość do naczynia na próbkę. Delikatnie zamieszaj, aby wymieszać.
19. Przykryj płytkę folią aluminiową i pozostaw do inkubacji na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Określ i zapisz etap rozwojowy zarodków kontrolnych rodzeństwa, gdy rozpoczyna się ta inkubacja.
20. Pod koniec inkubacji użyć pozostałej stożkowej probówki o pojemności 2 mM Ca²⁺, aby wykonać trzy płukania pożywką w następujący sposób: 1) usunąć 1 ml roztworu z naczynia, dodać 3 ml świeżego roztworu, 2) usunąć 3 ml roztworu z naczynia, dodać 3 ml świeżego roztworu, 3) usunąć 3 ml roztworu z naczynia, dodać 3 ml świeżego roztworu.

3. Obrazowanie wapnia

UWAGA: Obrazowanie wapnia zostało wykonane przy użyciu odwróconego mikroskopu konfokalnego (Tabela materiałów).

1. Umieść płytkę z próbką na stoliku mikroskopu, uważając, aby chronić ją przed światłem otoczenia. Po zabezpieczeniu płytki użyj markera, aby oznaczyć przedni punkt płytki, aby można było znaleźć to samo pole widzenia w kolejnych obrazowaniach.
2. Zlokalizuj próbkę pod mikroskopem - najpierw przy powiększeniu 10X, a następnie 20X - i wybierz odpowiednie pole widzenia do obrazowania. Idealne pole widzenia jest gęste od komórek, ale nie na tyle gęste, aby komórki były zbite lub trudne do rozróżnienia pojedynczo.
3. Dostosuj ostrość mikroskopu tak, aby szkiełko nakrywkowe w kształcie siatki było widoczne. Numery zaznaczone na szkiełku nakrywkowym służą jako niepowtarzalne identyfikatory dla poszczególnych miejsc siatki i mogą być wykorzystane do zlokalizowania tego samego pola widzenia w celu dodatkowego obrazowania. Jeśli pierwotnie wybrane pole widzenia nie nakłada się na żadne liczby, dostosuj ponownie, aż w kadrze znajdzie się możliwa do zidentyfikowania liczba.
4. Zrób zdjęcie w jasnym polu wybranego pola widzenia z ostrym szkiełkiem nakrywkowym w siatce.
5. Dostosuj ustawienia ostrości i zrób zdjęcie w jasnym polu wybranego pola view z ostrymi komórkami.
6. Gdy warstwa komórkowa jest w centrum uwagi, oświetl próbki laserem o długości fali 488 nm. Wartości HV i Offset mogą być optymalizowane dla każdego eksperymentu, aby zapewnić wykrycie dynamicznego zakresu fluorescencji na kanale FITC.
7. W przypadku obrazu dwugodzinnego zmodyfikuj konfigurację obrazowania, aby zarejestrować 901 klatek z czasem skanowania 3,93 s i interwałem 8 s. Uruchom konfigurację, aby uzyskać obraz.
8. Po zakończeniu obrazowania wyjmij płytkę ze stolika mikroskopu. Usunąć 1 ml roztworu z płytki i zastąpić go 1 ml 2x MEMFA (200 mM MOPS, 2 mM EGTA i 2 mM_MgSO4 w 7,4% formaldehydzie).
9. Inkubować płytkę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Określić i zapisać stadium rozwojowe zarodków kontrolnych rodzeństwa w momencie rozpoczęcia inkubacji.
10. Po zakończeniu utrwalania usunąć cały roztwór z płytki i zastąpić go 2 ml 1x PBS. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C do dalszej obróbki.

4. Analiza ekspresji genów: Synteza sondy

1. Jak opisano poniżej, wygeneruj antysensowną sondę RNA do hybrydyzacji in situ. Dodatkowo wygeneruj sondę zmysłową dla tego samego genu do wykorzystania jako kontrola negatywna.
2. W celu oczyszczenia plazmidowego DNA zawierającego sekwencję matrycy sondy, zaszczepić 150 ml bulionu LB bakteryjnymi zapasami glicerolu zawierającymi plazmid matrycowy. Inkubować w temperaturze 37 °C, wytrząsając przez noc lub do momentu, gdy kultura stanie się mętna.
3. Oczyść plazmidowe DNA z kultury bakteryjnej przy użyciu wybranej metody.
   UWAGA: Używamy zestawu McNary-Nagel midi-prep kit, aby uzyskać wysoką wydajność plazmidowego DNA.
4. Aby potwierdzić, że plazmid zawiera oczekiwaną wstawkę, należy przeprowadzić trawienie restrykcyjne i przeanalizować produkty na żelu agarozowym. Nieoszlifowany plazmid można również analizować na żelu agarozowym w celu sprawdzenia zanieczyszczenia genomowego DNA.
5. Aby zlinearyzować matrycowy DNA, należy przeprowadzić reakcję trawienia restrykcyjnego o objętości 100 μl, zawierającą 20 μg plazmidowego DNA, 2 μl odpowiedniego enzymu restrykcyjnego i 1x odpowiedni bufor. Inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 godziny.
6. Wyodrębnij zlinearyzowane DNA, wykonując ekstrakcję fenolem/chloroformem, a następnie ekstrakcję chloroformem.
7. Wytrącić DNA 100% etanolem. Można to zrobić szybko, dodając dwie objętości zimnego etanolu do próbki i inkubując ją w temperaturze -80 °C aż do zestalenia się (15-30 min).
8. Za pomocą wirówki z chłodzeniem należy granulować DNA przez wirowanie przez 20 minut w temperaturze 12 000 x g/4 °C.
9. Usunąć supernatant i przemyć osad 200 μl 70% etanolu. Wirować przez 5 minut w temperaturze 12 000 x g/4 °C.
10. Usunąć supernatant i suchy na powietrzu osad na około 5 minut. Zawiesić ponownie w 20 μl 1x TE i przechowywać w temperaturze 4 °C do dalszego użycia.
11. Aby zsyntetyzować i oczyścić antysensowną sondę RNA, utwórz mieszaninę 2,5 mM rNTP, łącząc 15 μL 10 mM rCTP, 15 μL 10 mM rGTP, 15 μL 10 mM rATP, 9,75 μL 10 mM rUTP i 5,25 μL 10 mM dig-11 UTP (patrz tabela materiałów).
12. Przygotować 50 μl reakcji transkrypcyjnej in vitro zawierającej 4 μg zlinearyzowanego matrycowego DNA z kroku 4.2-4.10, 15 μl 2,5 mM mieszanki rNTP z kroku 4.11, 10 μl 5x buforu transkrypcyjnego, 5 μL 0,1 M DTT, 0,5 μL inhibitora RNAzy (20 U/μL), i 1,5 μl odpowiedniej polimerazy RNA (T3, T7 lub SP6). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
13. Dodać dodatkowe 1,5 μl polimerazy RNA do reakcji i powrócić do 37 °C na dodatkową godzinę.
14. Dodać 1 μl DNA RQ1 do reakcji i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut w celu degradacji matrycy DNA.
15. Do próbki dodać 30 μl 7,5 M roztworu LiCl. Odpipetować do mieszania i inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę.
16. Za pomocą wirówki z chłodzeniem wirować próbkę przez 25 minut w temperaturze 14 000 x g/4 °C.
17. Usunąć supernatant i przepłukać osad 500 μl 70% etanolu. Wirować przez 5 minut w temperaturze 14 000 x g/4 °C.
18. Usunąć supernatant i suchy na powietrzu osad na około 5 minut. Zawiesić w 20 μl wody wolnej od nukleaz.
19. Stwórz 10 razy więcej sondy, rozcieńczając próbkę do stężenia 10 ng / μL w buforze hybrydyzacyjnym (50% formamidu, 5x SSC (cytrynian soli fizjologicznej; 750 mM NaCl, 75 mM cytrynian sodu, pH 7,0), 1 mg / ml torula RNA, 0,1% Tween-20, 1x roztwór Denhardta, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA i 100 μg/ml heparyny). Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.

5. Analiza ekspresji genów: Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ

UWAGA: Wszystkie płukania powinny być wykonywane z około 1 ml roztworu za pomocą sterylnej, indywidualnie zapakowanej pipety transferowej. Podczas wyjmowania lub dodawania roztworu pipetę należy umieszczać na krawędzi płytki, a płukanie należy przeprowadzać tak delikatnie, jak to możliwe, aby upewnić się, że komórki nie zostaną usunięte z powierzchni płytki i nie zostaną utracone.

1. Usuń 1x PBS z płytki (od kroku 3.10). Zastąp świeżym 1x PBS i inkubuj 5 minut w temperaturze pokojowej.
2. Połączyć 25 ml 0,1 M trietanoloaminy (pH 8,0) z 62,5 μl bezwodnika octowego. Dobrze wymieszaj. Myj płytkę tym roztworem przez 10 minut.
3. Myć płytkę 1x SSC przez 5 min.
4. Myć płytkę 0,02 M HCl przez 10 minut, aby przepuszczalność komórek.
5. Myć 2x z 1x PBS przez 5 min każdy.
6. Usuń roztwór i dodaj 1 ml buforu hybrydyzacyjnego (50% formamidu, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM cytrynian sodu, pH 7,0), 1 mg/ml torula RNA, 0,1% Tween-20, 1x roztwór Denhardta, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA i 100 μg/ml heparyny) na płytkę. Inkubować z wytrząsaniem przez co najmniej 6 godzin w temperaturze 60 °C.
7. Usuń bufor hybrydyzacyjny i zastąp go 750 μl 1x roztworu sondy RNA (rozcieńczonego z 10x zapasu wykonanego w kroku 4.19. Sondy Sense RNA mogą być używane jako kontrola negatywna.
8. Inkubować z wytrząsaniem przez 8-14 godzin w temperaturze 60 °C.
9. Wyjmij sondę i przechowuj w temperaturze -20 °C.
   UWAGA: 1x rozcieńczenie sondy może być ponownie użyte do trzech razy przed wyrzuceniem.
10. Przepłukać płytkę 0,2x SSC.
11. Myć świeżym 0,2x SSC przez 1 h w temperaturze 60 °C.
12. Przenieś płytki do temperatury pokojowej i równoważ przez 5 minut.
13. Myć płytkę 0,2x SSC przez 5 min.
14. Myj płytkę 1x PBT przez 15 min.
15. Umyj płytkę 2% H₂O₂ w 1x PBT (0,1% Triton-x-100) przez 1 godz.
    UWAGA: Ten roztwór jest wrażliwy na światło, więc powinien być świeży do każdego eksperymentu i osłonięty przed światłem. Podczas tej inkubacji płytki powinny być również osłonięte przed światłem lub foliowane.
16. Myć płytkę 1x TBST (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1%Tween-20) przez 15 min.
17. Rozcieńczyć odczynnik blokujący do 2% w buforze kwasu maleinowego (100 mM kwas maleinowy, 150 mM NaCl, pH 7,5). Zablokuj komórki w tej mieszaninie na co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
18. Zastąp roztwór blokujący przeciwciałem anty-digoksygeninowo-POD rozcieńczonym 1:1,000 w 2% odczynniku blokującym w buforze kwasu maleinowego. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
19. Opłucz płytkę 3x za pomocą 1x TBST.
20. Umyj 4x z 2 ml 1x TBST przez co najmniej 15 minut na pranie z ciągłym kołysaniem.
21. Prać 2x z 1x PBT przez co najmniej 10 minut na pranie z ciągłym kołysaniem.
22. Rozcieńczyć tyramid sprzężony z Cy3 w stosunku 1:25 w 1x PBT. Umyć płytkę 750 μl tego rozcieńczenia przez 5 min.
    UWAGA: To rozwiązanie jest niezwykle wrażliwe na światło, a płytki powinny być zafoliowane lub osłonięte przed światłem przez pozostałą część eksperymentu, aby uniknąć pogorszenia sygnału.
23. Dodać 2,5 μl 0,3% H₂O₂ do tego roztworu i inkubować z ciągłym kołysaniem przez dodatkowe 40 minut w temperaturze pokojowej.
24. Prać 4x z 1x TBST przez co najmniej 15 minut na pranie z ciągłym kołysaniem.
25. Spłucz 1x PBT.
26. Utrwal komórki przez inkubację przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w 1x MEMFA (100 mM MOPS, 1 mM EGTA i 1 mM_MgSO4 w 3,7% formaldehydzie).
27. Usuń roztwór i zastąp go 1x PBS. Przechowywać płytki w foliowanym pojemniku w temperaturze 4 °C do czasu dalszej obróbki.

6. Komórki obrazowania

UWAGA: Obrazowanie zostało wykonane przy użyciu odwróconego mikroskopu konfokalnego.

1. Umieść płytkę z próbką na stoliku mikroskopu, wyrównując znak wykonany w kroku 3.1 z przodu stolika.
2. Ustawić ostrość obrazu tak, aby szkiełko nakrywkowe wyłożone siatką było widoczne, a następnie korzystając z obrazu siatki wykonanego w kroku 3.4 jako odniesienia, dostosować pole widzenia tak, aby odpowiadało polu widzenia uchwyconemu na obrazie wapniowym (sekcja 3).
3. Uzyskuj obrazy w jasnym polu zarówno siatki, jak i komórek.
4. Oświetlić próbki laserem TRITC o długości fali 595 nm. Dostosuj wartości wzmocnienia, aby odpowiednio odróżnić sygnał od tła za pomocą obrazów z komórek kontroli negatywnej i uzyskać nieruchomy obraz.
   UWAGA: Idealnie, poziomy fluorescencji tła są określane na podstawie płytki kontroli ujemnej przetwarzanej równolegle z sondą RNA non-targeting. Ustawienia wzmocnienia są dostosowywane tak, aby ta płyta wydawała się całkowicie (odpowiadająca poziomom tła), a następnie utrzymywana na stałym poziomie dla innych płyt zobrazowanych z tej eksperymentalnej partii.

7. Przetwarzanie danych

UWAGA: Przetwarzanie danych odbyło się przy użyciu oprogramowania Nikon Elements.

1. Otwórz obraz wapnia z 2 godzin z kroku 3.7. Zidentyfikuj piksele odpowiadające każdej pojedynczej komórce, wybierając opcję Binarne wykrywanie > punktowe > Jasne punkty. Upewnij się, że wybrany jest kanał FITC.
2. Kolorowe kółka pojawią się nad poszczególnymi komórkami po wygenerowaniu tej warstwy. Dostosuj parametry rozmieszczenia i rozmiaru komórek tak, aby jak najwięcej komórek było rozpoznawanych i kojarzonych z unikatowym identyfikatorem.
3. Śledź komórki we wszystkich klatkach obrazu, przechodząc do opcji Widok > Formanty analizy > Opcje śledzenia. Ustaw 5 klatek jako maksymalny odstęp między ścieżkami, usuń obiekty skojarzone z mniej niż 600 klatkami i wybierz opcję Zamknij przerwy. Wybierz opcję Pliki binarne ścieżek, aby zastosować śledzenie komórek do obrazu.
4. Po śledzeniu komórek ręcznie usuń wszystkie obiekty, które nie odpowiadają pojedynczej komórce (na przykład zlepek komórek). Nie należy jednak wykluczać punktów danych z dalszej analizy opartej na morfologii śladu aktywności wapnia.
5. W okienku Obraz wybierz opcję Wyświetl nakładkę, > Pokaż identyfikator obiektu binarnego. Przewiń do końca obrazu (klatka 901) i wybierz opcję Edytuj > Utwórz migawkę widoku (8-bitowe RGB)> Bieżąca klatka > OK. Spowoduje to utworzenie migawki ostatniej klatki obrazu z widocznym identyfikatorem binarnym powiązanym z każdą komórką. Zapisz ten obraz.
6. Eksportuj dane szeregów czasowych, zaznaczając wszystkie obiekty, a następnie eksportuj dane do programu Excel. Zapisz dane wyjściowe jako plik CSV.
7. Otwórz obraz FISH. Zoptymalizuj wykrywanie punktowe, jak w krokach 7.1–7.2, używając kanału TRITC zamiast kanału FITC. Ręcznie usuń wszystkie nieprawidłowo przypisane pliki binarne, a następnie wybierz opcję Automatyczne wyniki pomiarów > Aktualizuj pomiar, aby obliczyć intensywność sygnału każdej komórki. Wyeksportuj migawkę obrazu i tabelę danych, powtarzając kroki 7.5 i 7.6.
8. Utwórz arkusz kalkulacyjny, w którym kolumna A jest oznaczona jako FISH Binary ID, a kolumna B jest oznaczona jako Calcium Binary ID. Otwórz obrazy wyeksportowane w krokach 7.5 i 7.7. Dla każdego obiektu zidentyfikowanego na obrazie FISH (krok 7.7) zapisz identyfikator binarny w kolumnie A. Następnie zlokalizuj odpowiednią komórkę na obrazie wapnia (krok 7.5) i zapisz ten binarny identyfikator w kolumnie B. Komórki, których nie można jednoznacznie zidentyfikować na obu obrazach, nie powinny być dodawane do arkusza kalkulacyjnego.
   UWAGA: Pomocne może być użycie programu do edycji zdjęć, takiego jak Adobe Photoshop lub edytor obrazów GIMP, aby otworzyć oba obrazy, ustawić jeden z nich jako półprzezroczysty i nałożyć go na obraz partnerski, aby łatwiej zidentyfikować i połączyć dwa identyfikatory binarne powiązane z każdą komórką.
9. Dla każdej zidentyfikowanej komórki należy zestawić (ręcznie lub za pomocą skryptu) jej dane dotyczące wapnia w szeregach czasowych (skojarzone z binarnym identyfikatorem wapnia i wyeksportowane w kroku 7.6) oraz dane dotyczące ekspresji genów (skojarzone z identyfikatorem binarnym FISH i wyeksportowane w kroku 7.7).
   UWAGA: Dalsze przetwarzanie i analiza danych może obejmować zestawienie tych danych w jedną tabelę danych i zastosowanie szeregu technik analitycznych, w tym zliczania spajków, analizy fraktalnej i entropii Markowa, które pozwalają badaczowi dostrzec nowe wzorce aktywności wapnia ^17,18.

Wyniki

Udany przykład zdysocjowanych komórek przygotowanych do obrazowania wapnia można zobaczyć w Rysunek 2A. Komórki są gęsto platerowane, co pozwala na zebranie maksymalnej ilości informacji z każdego obrazu, ale nie tak gęsto, aby nie można było pewnie odróżnić poszczególnych komórek od siebie. Fluorescencja jest wykrywana dla każdej zdefiniowanej komórki w ciągu 2-godzinnego okresu obrazowania. Wizualizacja wykresu złożonego zawierającego ślady dla wszystkich komórek zarejestrowanych w eksperymencie ujawnia stopień, w jakim pomiary masowe lub populacyjne mogą przesłonić bardziej zniuansowane wzorce zachowania skokowego (Rysunek 2B). Po wyizolowaniu zarejestrowanych profili poszczególnych komórek można wyraźnie zidentyfikować przykłady nieregularnej aktywności impulsowej charakterystycznej dla nerwowych komórek progenitorowych. W przeciwieństwie do dojrzałych neuronów, embrionalne komórki neuronalne wykazują nieregularną, bardzo zmienną i złożoną naturę aktywności wapnia (Ryc. 2B). Aby określić ilościowo tę złożoność, zastosowano różne metody analizy danych^17,18, w tym różne parametry do zdefiniowania skoku (Rysunek 2C).

Udana fluorescencyjna hybrydyzacja in situ, w tym udany projekt i synteza antysensownej sondy mRNA, może być oceniona przez porównanie płytki eksperymentalnej z kontrolą tła inkubowaną z niewiążącą kontrolą zmysłową RNA (Rysunek 3A,B). Pozytywną kontrolę sondy można również przeprowadzić poprzez przetwarzanie typu komórki, o której wiadomo, że wyraża docelowe mRNA na wykrywalnych poziomach.

Identyfikacja tej samej komórki w obrazowaniu wapnia i FISH wymaga, aby komórki zachowywały mniej więcej tę samą pozycję podczas hybrydyzacji i przetwarzania sondy. Jeśli płytki są traktowane z grubsza lub mycie jest wykonywane zbyt mocno, komórki mogą zostać oderwane od powierzchni płytki i albo utracone, gdy roztwór zostanie odrzucony, albo osadzone w innym miejscu na płytce, co uniemożliwi ich dopasowanie na różnych obrazach (Rysunek 4A). Jeśli to zakłócenie dotyczy tylko niektórych komórek w polu widzenia, nadal może być możliwe wykrycie i przypisanie niektórych komórek na obrazie (Rysunek 4B). Jednak maksymalna ilość danych jest uzyskiwana z eksperymentu, w którym FISH jest wykonywany ostrożnie, a kilka komórek jest traconych lub przenoszonych między obrazami (Rysunek 4C).

Po zebraniu danych opisujących zarówno aktywność wapnia, jak i ekspresję genów w rozsądnej liczbie komórek na interesującym etapie rozwoju, można przeprowadzić dalsze analizy w celu oceny korelacji między tymi dwoma cechami (Rysunek 1). Do ilościowego określenia wzorców aktywności wapnia zastosowano szereg wskaźników, w tym zliczanie/częstotliwość skoków, średnią moc, oszacowanie wykładnika Hursta i pomiar entropii Markowa^17,18. Ekspresję genów można określić ilościowo za pomocą bezwzględnego poziomu fluorescencji lub stopniować w skali binarnej (tak/nie), w zależności od poruszanych pytań eksperymentalnych.

Wyniki eksperymentów zestawiających aktywność wapnia z ekspresją genów markerów progenitorowych neuronów ujawniły liczne powiązania między specyficznymi wzorcami aktywności wapnia a fenotypami neuroprzekaźników. Na etapie płytki nerwowej (etap 14) komórki GABA-ergiczne wyrażające hamujący marker neuronu gad1.1 wykazują aktywność wapnia, która jest bardziej regularna i ma wyższą amplitudę niż w komórkach, które nie mają ekspresji gad1.1 (Figura 5A). Ponadto, podczas gdy te komórki wykazujące ekspresję gad1.1 są związane z wyższymi poziomami impulsów o wysokiej amplitudzie, impulsy o niskiej amplitudzie są częstsze w komórkach glutaminergicznym wykazujących ekspresję markera neuronu pobudzającego slc17a7.

Rysunek 1: Schemat eksperymentalnego przepływu pracy. Podziałka = 100 μm. Obrazy w panelach 3-5 pochodzą z Paudel et al. (2019)¹⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Obrazowanie wapnia i przykładowe profile aktywności. (A) Wewnątrzkomórkowa aktywność wapnia zgłoszona przez Fluo4-AM. Każdy obraz trwający 2 godziny składa się z 901 klatek, z których jedna jest pokazana w tym miejscu. (B) Złożony wykres intensywności fluorescencji w czasie we wszystkich komórkach w obrazowanym polu widzenia. Ślady jednoznacznie wskazują na fotobielenie barwnika wskaźnikowego (Fluo4) w godzinach nadliczbowych. Wykres rastrowy w lewym górnym rogu pokazuje reprezentatywne ślady aktywności wapnia po zastosowaniu algorytmu detrendingu opracowanego przez Eilersa i Boelena¹⁹, gdzie pokazane tutaj komórki wykazują różne wzorce zachowania skokowego. (C) Zastosowanie różnych progów (150 % i 200 % wartości wyjściowej, gdzie punktem odniesienia jest średnia intensywności fluorescencji skorygowanej o trend) w celu zdefiniowania skoku (zielone i niebieskie strzałki). Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Obrazowanie FISH. (A) FISH wykonane z niewiążącą sondą RNA jako kontrola ujemna. Ustawienia obrazowania zostały dostosowane tak, aby żadne komórki nie wyglądały na fluorescencyjne. Niektóre pola widzenia mogą zawierać szczątki niekomórkowe z pewną fluorescencją, takie jak widoczne w prawym górnym i prawym dolnym rogu (A); Można je zignorować w celu ustawienia tła. (B) Te same ustawienia obrazowania są następnie wykorzystywane do obrazowania płytki eksperymentalnej (antysensowna sonda RNA). Fluorescencja w tych warunkach odpowiada ekspresji genów powyżej tła. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Nakładanie obrazu i korejestracja. Schematyczne reprezentacje próbki zobrazowane pod kątem aktywności wapnia (komórki reprezentowane przez wypełnione zielone kółka) i po FISH (komórki reprezentowane przez zacienione czerwone kółka). (A) Komórki, które uległy znacznemu przemieszczeniu podczas obchodzenia się z próbką i przetwarzania, nie mogą być wiarygodnie zidentyfikowane na dwóch obrazach. (B) Przerwanie ciągłości działania może dotyczyć tylko niektórych komórek znajdujących się w polu widzenia. Niektóre komórki można wyraźnie zidentyfikować na obu obrazach, podczas gdy innych nie można jednoznacznie dopasować. (C) Jeśli próbki są traktowane ostrożnie, większość komórek pozostanie nienaruszona i będzie można ją zidentyfikować na obu obrazach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Przykład zastosowania tej metody, wykresy pudełkowe pokazujące powiązania między aktywnością wapnia a ekspresją genów (GABA i Glut dla genów odpowiednio gad1.1 i slc17a7) w stadium płytki nerwowej Xenopus laevis. Na etapie 14 komórki GABA-dodatnie (GABA) wykazują wyższą amplitudę i bardziej regularną aktywność wapnia, zgodnie z definicją (A) entropii Markowa18 i (B) liczby skoków przy użyciu progów 125%, 150%, 200% i 300% średniej intensywności fluorescencji odregulowanej (wartość wyjściowa)¹⁷ niż komórki dodatnie slc17a7 (Glut). Gwiazdki wskazują na statystycznie istotne różnice zarówno według skorygowanego przez Bonferroniego testu Kołmogorowa-Smirnowa dla dwóch prób (p < 0,05), jak i statystyk d Cohena dotyczących wielkości efektu (n = 5 kultur i >100 komórek; * 0,2 ≤ |d| < 0,5). Rysunek został przerysowany i zaadaptowany z zestawu danych uzyskanego od Paudel et al.¹⁷. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W komórkach tworzących rozwijający się układ nerwowy zaobserwowano charakterystyczne wzorce aktywności wapnia, przy czym określone typy aktywności są związane z odrębnymi procesami neurorozwojowymi. Jednak dalsze zrozumienie mechanizmów, za pomocą których te gęste od informacji wzorce aktywności są przekształcane w odpowiedzi transkrypcyjne, wymaga zebrania informacji o aktywności wapnia i ekspresji genów z rozdzielczością pojedynczej komórki. Podczas gdy systemy, które wykazują bardziej stereotypową aktywność wapnia, takie jak dojrzałe neurony, mogą być rozsądnie oceniane na poziomie masowym, nieregularne wzorce, które charakteryzują embrionalny układ nerwowy, można łatwo zamaskować za pomocą mniej precyzyjnych zapisów.

Ramy eksperymentalne ustanowione w tym protokole można łatwo dostosować do szerokiej gamy typów komórek i reporterów fluorescencyjnych. Tkanka zawierająca praktycznie dowolny typ komórki lub kombinację typów komórek może zostać wypreparowana z organizmu modelowego będącego przedmiotem zainteresowania i posiew w celu obrazowania pojedynczych komórek. Oprócz umożliwienia identyfikacji komórek i wyizolowania efektu procesów autonomicznych komórek, podejście oparte na pierwotnej hodowli komórkowej pozwala eksperymentatorowi zdefiniować składniki pożywki zgodnie z życzeniem. Na przykład przeprowadzono eksperymenty porównujące aktywność prekursorów neuronalnych w roztworze 2 mM Ca^{2 +} w celu zbadania, czy relacje między częstotliwością skoków a fenotypem neuroprzekaźnika w embrionalnym rdzeniu kręgowym można podsumować bez wpływu interakcji komórka-komórka^13,20.

Chociaż protokół ten wykorzystuje marker fluorescencyjny Fluo4-AM do wykrywania wewnątrzkomórkowej aktywności wapnia, w zależności od kryteriów wyboru, użytkownicy mogą wybrać inne dostępne na rynku markery²¹, w tym genetycznie kodowane wskaźniki wapnia. Podobnie, alternatywne markery mogą być używane do monitorowania dynamicznych zmian stężenia jonu będącego przedmiotem zainteresowania (w tym K⁺, Na⁺ i Zn^2+), potencjału błonowego lub pH komórkowego. Ustawienia obrazowania i czas trwania obrazu można modyfikować w razie potrzeby.

Chociaż skorelowaliśmy aktywność wapnia i fenotyp neuronów jako konkretne zastosowanie, metoda ta ma również zastosowanie do wielu innych właściwości komórkowych. Na przykład fluorescencyjna hybrydyzacja in situ może być przeprowadzana za pomocą sond przeciwko dowolnemu genowi będącemu przedmiotem zainteresowania, w tym markerowi neuronalnemu ChAT lub czynnikowi transkrypcyjnemu Engrailed, co pozwala na czułe wykrywanie konfigurowalnego panelu gatunków mRNA. Sondy te można zaprojektować tak, aby były specyficzne dla izoformy, w razie potrzeby obsługując dodatkową specyficzność docelową. Double FISH można przeprowadzić za pomocą sond sprzężonych z kilkoma dwoma różnymi fluoroforami, co pozwala na jednoczesną ocenę ekspresji wielu genów. Jednak dodatkowe płukania wymagane w tego typu eksperymencie wiążą się ze zwiększonym ryzykiem utraty lub ruchu komórek i wymagają doświadczenia i delikatności, aby można je było pomyślnie przeprowadzić.

Niezależnie od wszelkich modyfikacji specyficznych dla eksperymentu wprowadzonych do tego protokołu, istnieje kilka kluczowych kroków, które wymagają szczególnej uwagi. Sekcje powinny być wykonywane z ostrożnością, aby usunąć wszystkie zanieczyszczające tkanki lub populacje komórek; Ponieważ wzorzec przestrzenny zostaje utracony, gdy eksplantaty są dysocjowane, wszelkie pozostałe komórki z sąsiednich tkanek będą przeplatać się i nie do odróżnienia od komórek będących przedmiotem zainteresowania. Po poszczepieniu komórek z próbkami należy obchodzić się tak delikatnie, jak to możliwe, aby zapobiec ich przemieszczeniu. Co najważniejsze, oznacza to, że wszystkie zmiany roztworu powinny być wykonywane powoli i ostrożnie, z pipetą umieszczoną na krawędzi płytki podczas wyjmowania i dodawania roztworu. Zapewni to pewność identyfikacji komórek zarówno na obrazach wapnia, jak i FISH. Jeśli komórki zostaną zakłócone podczas przetwarzania, identyfikacja niektórych lub wszystkich odpowiadających im komórek między dwoma obrazami może być niemożliwa. Zalecamy ostrożność przy tych przypisaniach, tak aby do dalszej analizy używane były tylko jednoznacznie odpowiadające komórki.

W zależności od poruszanej kwestii biologicznej odpowiednie mogą być różne podejścia analityczne. Aktywność wapnia w szeregach czasowych może być przetwarzana i określana ilościowo na różne sposoby, przy czym eksperymentator może elastycznie wybierać parametry detrendingu, metryki analizy i parametry analizy (na przykład % progu wyjściowego używany do definiowania skoku wapnia). Korelacje między aktywnością wapnia a poziomem ekspresji genów można wyznaczyć, analizując ekspresję genów jako bezwzględną lub względną wartość fluorescencji wyekstrahowaną z obrazu FISH. Alternatywnie, korelacje między aktywnością wapnia a ekspresją genów (obecność/brak) można wyznaczyć poprzez zdefiniowanie progu fluorescencji dla pozytywnego sygnału ekspresji genów i przypisanie identyfikatorów "tak" lub "nie" poszczególnym komórkom. Ogólnie rzecz biorąc, ten schemat eksperymentalny zapewnia niezwykle elastyczny potok do zbierania i wstępnej analizy danych szeregów czasowych w połączeniu z danymi dotyczącymi ekspresji genów dopasowanymi do komórek. Takie eksperymenty będą miały kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia złożonych relacji między dynamiką komórkową a zmianami transkrypcyjnymi, czego przykładem jest identyfikacja wzorców aktywności wapnia charakterystycznych dla prekursorów neuronów o losie hamującym i pobudzającym u embrionalnego Xenopus laevis.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Do hodowli zwierząt i Hodowla komórkowa
CHORULON (gonodotropina kosmówkowa)	Merck Animal Health
Sól siarczanu gentamycyny	Millipore Sigma	G1264
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Płytki Petriego Pyrex, 100 mm x 20 mm	Millipore Sigma	CLS3160102
Naczynia do hodowli tkankowych Corning Falcon Easy-Grip, 35 mm	Fisher Scientific	08-772A
Naczynia do hodowli tkankowych Corning Falcon Easy-Grip, 60 mm	Fisher Scientific	08-772F
Standardowe naczynia do hodowli tkankowych	Falcon Fisher Scientific	08-772E
Thermo Scientifc Kultura komórkowa Nunc / szalki Petriego, szalka 35x10mm, nunclon Delta	Fisher Scientific	12-565-90
Fisherbrand Standardowe jednorazowe pipety transferowe, bez podziałki; Długość: 5,875 cala; Pojemność: 7,7 ml	Fisher Scientific	13-711-7M
3-aminobenzoesan etylu metanosulfonian	Millipore Sigma	E10521
Kolagenaza B	Milipore Kleszcze Sigma	11088807001
Dumont #55, Dumostar	Fine Science Tools	11295-51
Dumont #5 Kleszcze, Dumostar	Fine Science Tools	11295-00
Powierzchnia hodowli komórkowych Cellattice Micro-Lined	Nexcelom Bioscience	CLS5-25D-050
Do obrazowania wapnia
Fluo-4, AM, permeant komórkowa	Thermo Fisher Scientific	F14201
Pluronic F-127, 0,2 i mikro; m przefiltrowany (10% roztwór w wodzie)	Thermo Fisher Scientific	P6866
Do generowania sondy RNA
PureYield Plasmid Miniprep System	Promega	A1222
rATP	Promega	P1132
rCTP	Promega	P1142
rGTP	Promega	P1152
rUTP	Promega	P1162
Digoxigenin-11-UTP	Millipore Sigma	3359247910
Inhibitor RNAZY	Thermo Fisher Scientific	N8080119
Polimeraza RNA	T3 Promega	P2083
Polimeraza RNA T7	Promega	P2075
SP6 Polimeraza RNA	Promega	P1085
RQ1 Bezrnazowy roztwór	Dnazy Promega	M6101
LiCl (7,5 M)	Thermo Fisher Scientific	AM9480
Do fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ
Acetic Anhydro	Thermo Fisher Scientific	320102
Odczynnik blokujący	Millipore Sigma
Anti-Digoxigenin-POD, fragmenty Fab	Millipore Sigma	11207733910
Cy3 Mono-Reactive NHS Ester	Millipore Sigma	GEPA13105
Solution Składniki
Chlorek wapnia, 96% ekstra czysty, proszek, bezwodny, ACROS Organixs	Fisher Scientific	AC349610
Dwuwodny chlorek wapnia	Milipore Sigma	C3306
CHAPS hydrat	Millipore Sigma	C3023
Roztwór Denhardta (50X)	Thermo Fisher Scientific	750018
DTT, klasa molekularna (DL-Ditiothreitol)	Promega	P1171
Kwas etylenodiaminotetraoctowy, sól disodowa dwuwodzian	Fisher Scientific	S311
Kwas bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-tetraoctowy	Millipore Sigma	E3889
Formamid (dejonizowany)	Thermo Fisher Scientific	AM9342
Sól sodowa herparyny z błony śluzowej jelit świń	Millipore Sigma	H3393
HEPES (Ultra Pure)	Thermo Fisher Scientific	11344041
Roztwór nadtlenku wodoru	Millipore Sigma	H1109
L-Cysteina	Millipore Sigma	168149
Chlorek magnezu, czysty, ACROS Organics	Fisher Scientific	AC223211000
Siarczan magnezu, czystość 97%, ACROS Organixs, bezwodny	Kwas	AC413480050
99%, ACROS Organics	Fisher Scientific	ACS125231000
MOPS (drobne białe kryształy/biologia molekularna), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP308
Chlorek potasu	Millipore Sigma	P9541
Kwas rybonukleinowy z drożdży torula, typ IX	Milipore Sigma	R3629
Chlorek sodu	Millipore Sigma	S7653
Trietanoloamina	Millipore Sigma	90279
Tris	Millipore Sigma	GE17-1321-01
TWEEN 20	Millipore Sigma	P9416
Equipment
Laminar Flow Hood	model do wyboru
		model	mikroskopu preparacyjnego
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny	Nikon	TE200
Oprogramowanie do obrazowania elementów NIS	Nikon
	wyboru
wirówki
różny< / mocny>
System filtrów próżniowych butelkowych Corning, 0,22 μ m porów, pojemność butelki 500 ml	Millipore
Falcon 50 ml	Fisher Scientific	14-432-22