Prezentujemy dwuczęściowy protokół, który łączy fluorescencyjne obrazowanie wapnia z hybrydyzacją in situ, pozwalając eksperymentatorowi skorelować wzorce aktywności wapnia z profilami ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki.
Artykuł metodologiczny
Fluorescencyjne obrazowanie wapnia i późniejsza hybrydyzacja in situ w celu charakterystyki prekursorów neuronalnych u Xenopus laevis
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Spontaniczną wewnątrzkomórkową aktywność wapnia można zaobserwować w różnych typach komórek i proponuje się odgrywanie kluczowych ról w różnych procesach fizjologicznych. W szczególności odpowiednia regulacja wzorców aktywności wapnia podczas embriogenezy jest niezbędna dla wielu aspektów rozwoju neuronalnego kręgowców, w tym prawidłowego zamykania cewy nerwowej, synaptogenezy i specyfikacji fenotypu neuroprzekaźników. Podczas gdy obserwacja, że wzorce aktywności wapnia mogą różnić się zarówno częstotliwością, jak i amplitudą, sugeruje przekonujący mechanizm, za pomocą którego strumienie te mogą przekazywać zakodowane sygnały do dalszych efektorów i regulować ekspresję genów, istniejące podejścia na poziomie populacji nie były wystarczająco precyzyjne, aby dalej badać tę możliwość. Co więcej, podejścia te ograniczają badania nad rolą interakcji komórka-komórka, wykluczając możliwość oznaczenia stanu determinacji neuronalnej przy braku kontaktu komórka-komórka. Dlatego ustaliliśmy eksperymentalny przepływ pracy, który łączy poklatkowe obrazowanie wapnia zdysocjowanych eksplantatów neuronalnych z fluorescencyjnym testem hybrydyzacji in situ, umożliwiając jednoznaczną korelację wzorca aktywności wapnia z fenotypem molekularnym na poziomie pojedynczej komórki. Udało nam się wykorzystać to podejście do rozróżnienia i scharakteryzowania określonych wzorców aktywności wapnia związanych odpowiednio z różnicowaniem komórek nerwowych i nerwowych komórek progenitorowych; Poza tym jednak ramy eksperymentalne opisane w tym artykule można łatwo dostosować do badania korelacji między dowolnym profilem aktywności szeregów czasowych a ekspresją genu lub genów będących przedmiotem zainteresowania.
Wprowadzenie
Wolny cytozolowy wapń ma kluczowe znaczenie dla różnych procesów biologicznych, począwszy od proliferacji i migracji komórek, a skończywszy na apoptozie i autofagii1,2,3. W ramach tych szlaków wapń może wywierać dalszy wpływ na ekspresję genów poprzez interakcję z domenami wiążącymi wapń w celu wywołania zmian konformacyjnych, które modulują aktywność i interakcje białek. Na przykład neuronalny czujnik wapnia znany jako Modulator Antagonisty Elementu Regulatorowego (DREAM) jest utrzymywany w rozwiniętej konformacji pośredniej, gdy jest związany przez wapń, co uniemożliwia mu interakcję z jego białkami i celami DNA4. Poza tym, że służy jako prosta cząsteczka sygnałowa, dynamiczna natura wewnątrzkomórkowych stanów przejściowych wapnia pozwala tym wzorcom aktywności kodować bardziej złożone sygnały oparte na amplitudzie lub częstotliwości5,6. Translokacja jądrowa czynnika transkrypcyjnego czynnika jądrowego aktywowanych limfocytów T (NFAT) jest wzmacniana przez oscylacje wapnia o wysokiej częstotliwości, ale hamowana przez oscylacje o niskiej częstotliwości7. Co ciekawe, ostatnie prace sugerują, że NFAT może faktycznie reagować na skumulowaną ekspozycję na wapń8. Zarówno kalcyneuryna, jak i kinaza białkowa zależna od Ca2 + / kalmoduliny II (CaMKII) wykazują również wyraźne odpowiedzi na stany przejściowe wapnia o określonej częstotliwości, czasie trwania lub amplitudzie9. Aby dodać dodatkowy poziom złożoności regulacyjnej, modele obliczeniowe sugerują, że wiele białek wiążących wapń staje się mniej lub bardziej zależnych od częstotliwości w odpowiedzi na obecność lub brak wiążących konkurentów10,11.
W rozwijającym się układzie nerwowym zdefiniowano dwie główne klasy zachowań związanych z aktywnością wapnia i są one związane z określonymi procesami biologicznymi. Napływy wapnia są klasyfikowane jako "skoki", jeśli występują w pojedynczych komórkach, osiągają szczytową intensywność ~400% wartości podstawowej w ciągu pięciu sekund i wykazują podwójną wykładniczą degradację12. Ten typ sygnału jest związany przede wszystkim ze specyfikacją fenotypu neuroprzekaźnika13. W przeciwieństwie do tego, "fale" są definiowane jako wolniejsze, mniej ekstremalne stany przejściowe wapnia, w których wewnątrzkomórkowe stężenie wapnia w komórce wzrasta do ~200% wartości wyjściowej w ciągu trzydziestu sekund lub dłużej, a następnie zanika w ciągu kilku minut12. Sygnały te często rozchodzą się po wielu sąsiednich komórkach, a ich obecność wiąże się z rozrostem neurytów i proliferacją komórek14,15. Jednakże, chociaż te dwie klasy zostały zdefiniowane na podstawie charakterystycznych profili kinetycznych, nie jest jasne, które dokładnie cechy tych wzorców są faktycznie wykrywane przez komórki i translowane przez dalsze efektory.
Zrozumienie związku między wewnątrzkomórkowymi oscylacjami wapnia a ekspresją genów dostarczyłoby kluczowego wglądu w jeden z mechanizmów regulacyjnych, które zapewniają prawidłowy rozwój i wzorcowanie układu nerwowego. W tym celu badania embrionalnego rdzenia kręgowego wykazały, że zwiększona aktywność skoków wapnia podczas rozwoju wiąże się z wyższymi poziomami neuronów hamujących, podczas gdy zmniejszona aktywność skoków wapnia wiąże się z wyższymi poziomami neuronów pobudzających13. Jednak te testy na poziomie populacji nie zostały wykorzystane do powiązania aktywności wapnia z ekspresją genów na poziomie pojedynczej komórki.
Podejście do tych pytań na poziomie pojedynczej komórki daje kilka wyraźnych zalet w porównaniu z poprzednimi pracami. Po pierwsze, możliwość oceny aktywności wapnia i ekspresji genów w wielu komórkach z osobna pozwala na obserwację pełnego repertuaru różnych wzorców aktywności bez zaciemniania przez pomiar na poziomie masowym. Ponadto badanie tych zależności w hodowli pierwotnej pojedynczej komórki oznacza, że autonomiczne powiązania między aktywnością wapnia a ekspresją genów zostaną utrzymane, podczas gdy interakcje wymagające komunikacji komórka-komórka zostaną zniesione. Dlatego takie podejście pozwala na badanie tych autonomicznych mechanizmów komórkowych w izolacji. Pozwala jednak również na wyjaśnienie i zbadanie roli nieautonomicznej dla komórek aktywności wapnia. Na przykład, komórki mogą być wypreparowane z zarodka na etapie płytki nerwowej, hodowane do momentu, gdy rodzeństwo kontrolne osiągnie stadium cewy nerwowej, a następnie porównane z komórkami, które zostały świeżo wypreparowane z zarodka w stadium cewy nerwowej. Pozwala to na bezpośrednie porównanie komórek, które zachowały komunikację komórka-komórka w kluczowym okresie rozwoju, z tymi, w których komunikacja komórka-komórka została zniesiona.
Szukając rozwiązania problemów poprzednich metod eksperymentalnych, opracowaliśmy protokół, który umożliwiłby ocenę zarówno aktywności wapnia, jak i ekspresji genów w poszczególnych neuronalnych komórkach progenitorowych, ułatwiając korelację określonych wzorców aktywności z późniejszymi programami różnicowania. Tkankę nerwową wypreparowano z Xenopus laevis na różnych etapach rozwoju neuronalnego, zdysocjowano na pojedyncze komórki i zobrazowano za pomocą mikroskopii konfokalnej w obecności fluorescencyjnego wskaźnika wapnia. Po obrazowaniu żywych komórek próbki utrwalono i oznaczono za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu wykrycia ekspresji genu lub izoformy będącej przedmiotem zainteresowania. Co ważne, poszczególne komórki mogą być śledzone w obu eksperymentach obrazowania, co oznacza, że profil aktywności wapnia w komórce i poziom ekspresji genów mogą być ze sobą powiązane (Rysunek 1). Opisany tutaj protokół ma na celu zbadanie związków między wzorcami aktywności wapnia a ekspresją genów w rozwoju neurologicznym embrionalnym u Xenopus laevis. Jednak szersze ramy eksperymentalne (obrazowanie przebiegu czasowego pojedynczej komórki, a następnie FISH i korejestracja obrazu) mogą być modyfikowane i stosowane do praktycznie każdego typu komórki, reportera fluorescencyjnego i genu będącego przedmiotem zainteresowania.
Protokół
Wszystkie prace z udziałem zwierząt zostały wykonane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w College of William and Mary.
1. Opieka nad zwierzętami i obchodzenie się z zarodkami
- Wywołać naturalne krycie poprzez podanie podskórnego wstrzyknięcia ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (HCG) do grzbietowego worka limfatycznego dorosłego Xenopus laevis w dawce 600 U dla samic i 400 U dla samców.
- Po wstrzyknięciu należy umieścić na noc co najmniej jednego samca i jedną samicę żaby w zbiorniku o temperaturze pokojowej. Składanie jaj zwykle rozpoczyna się 9-12 godzin po podaniu HCG.
- Zbieraj zarodki. Dejelli delikatnie przemywając 2% cysteiną (pH 8,0) przez 2-4 min.
- Opłucz zarodki 3x w 0,1x zmodyfikowanym roztworze Ringera Marka (MMR) (100 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mMMgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES, pH dostosowane do 7,4–7,6).
- Przenieść zarodki na szklane szalki Petriego o średnicy 100 mm zawierające 0,1x MMR i 50 μg/ml gentamycyny. Odpowiednia jest gęstość 50-100 zarodków na płytkę.
- Inkubować szalki w temperaturze 14–22°C i pozwolić zarodkom rozwijać się aż do osiągnięcia pożądanego etapu (etapów) rozwojowego. Okresowo usuwaj niezapłodnione komórki i martwicze lub nieprawidłowo rozwijające się zarodki za pomocą plastikowej pipety transferowej.
UWAGA: Aby zapewnić spójność, stopień zaawansowania rozwoju jest przeprowadzany zgodnie z kryteriami morfologicznymi zdefiniowanymi przez Nieuwkoop i Faber16. Etapy zainteresowania będą się różnić w zależności od ukierunkowania eksperymentu. Na przykład kluczowe punkty orientacyjne rozwoju układu nerwowego są związane z etapem 14 (początek neurulacji), etapem 18 (początek zamknięcia cewy nerwowej) i etapem 22 (początek wydłużania pąka ogonowego).
2. Sekcja zarodków i przygotowanie próbki
- Przygotowanie roztworu
- Przygotować 2 mM Ca2+ roztwór zawierający 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 2 mM CaCl2·2H2O, 1,31 mMMgSO4 i 4,6 mM Tris. Na każde 100 ml roztworu dodać 1 ml penicyliny/streptomycyny (10 000 j./ml penicyliny; 10 000 μg/ml streptomycyny). Dostosuj pH do 7,8 i sterylizuj filtrem.
- Przygotuj roztwór wolny od wapnia i magnezu (CMF), łącząc 116 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 4,6 mM Tris i 0,4 mM EDTA. Dostosuj pH do 7,8 i autoklaw do sterylizacji. Na każde 100 ml roztworu dodać 1 ml penicyliny/streptomycyny (10 000 j./ml penicyliny; 10 000 μg/ml streptomycyny). Dostosuj pH do 7,8 i sterylizuj filtrem.
- Przygotowanie płytek do rozwarstwienia i obrazowania
- Wysterylizuj UV dwie plastikowe szalki Petriego o średnicy 35 mm i jedną naczynie do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm (patrz tabela materiałów).
- Podczas pracy w okapie z przepływem laminarnym przygotuj dwie plastikowe stożkowe probówki o pojemności 50 ml zawierające 10 ml roztworu 2 mM Ca2+ każda.
- Kontynuować pracę w okapie z przepływem laminarnym i dodać 2 ml roztworu 2 mM Ca2+ do jednej plastikowej szalki Petriego o średnicy 35 mm, 2 ml roztworu 2 mM Ca2+ do jednej szalki do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm i 2 ml roztworu CMF do jednej plastikowej szalki Petriego o średnicy 35 mm.
- Na zewnątrz okapu z przepływem laminarnym napełnić dwie plastikowe szalki Petriego o średnicy 100 mm i jedną plastikową szalkę Petriego o średnicy 35 mm roztworem 0,1 MMR z gentamycyną (50 μg/ml). Napełnij plastikową szalkę Petriego o średnicy 60 mm 70% etanolem.
- Bezpośrednio przed rosekcją dodać 0,01 g kolagenazy B do jednej z 50 ml probówek zawierających roztwór Ca2+. Dobrze wymieszaj i przenieś roztwór na świeżą plastikową szalkę Petriego o średnicy 60 mm.
- Za pomocą mikroskopu preparacyjnego zidentyfikuj zarodki o pożądanym etapie rozwoju. Za pomocą sterylnej pipety transferowej przenieść co najmniej sześć odpowiednich zarodków na jedną z płytek o średnicy 100 mm zawierających 0,1x MMR + gentamycyna przygotowanych w kroku 2.2.4. Będzie to służyć jako płyta mocująca.
- Za pomocą sterylnej pipety transferowej przenieść jeden zarodek na drugą płytkę o średnicy 100 mm zawierającą 0,1x MMR + gentamycyna. Będzie to służyć jako płyta preparacyjna.
- W przypadku preparowania zarodków wystarczająco dużych, aby się poruszać (w wieku około 23 lat lub starszych), znieczulenie każdego zarodka przed sekcją poprzez przeniesienie go do naczynia zawierającego 0,1% ester etylowy kwasu 3-aminobenzoesowego rozcieńczony w 0,1 MMR gentamycyną (50 μg / ml). Po unieruchomieniu zarodka przenieś go z powrotem do naczynia zawierającego 0,1x MMR z gentamycyną (50 μg/ml) i kontynuuj sekcję.
- Ostrożnie usuń błonę witeliny otaczającą zarodek. Najłatwiej można to zrobić, używając pary kleszczy do stabilizacji zarodka, jednocześnie używając pary cienkich kleszczy do chwytania błony. Ostrożnie pociągnij cienkimi kleszkami, aby oderwać membranę witelinową.
- Użyj cienkich kleszczy, aby oddzielić grzbietową i brzuszną część zarodka. Można to zrobić, używając kleszczy do "uszczypnięcia" zarodka wzdłuż osi przednio-tylnej, przecinając go na pół. Za pomocą sterylnej pipety transferowej przenieść część grzbietową na płytkę o średnicy 60 mm z roztworem kolagenazy przygotowanym w kroku 2.2.5. Wyrzuć część brzuszną.
- Pozostaw eksplantat grzbietowy do inkubacji w roztworze kolagenazy przez 1-2 minuty w temperaturze pokojowej. Delikatnie przenieś go z powrotem na płytkę preparacyjną.
- Zakończ sekcję, ostrożnie usuwając wszystkie pozostałości zanieczyszczenia endodermalnego i mezodermalnego z przypuszczalnej tkanki nerwowej ektodermy. W przypadku zarodków w stadium 22 lub starszych cewę nerwową należy również usunąć i wyrzucić.
UWAGA: Jeśli to konieczne podczas sekcji, naczynie z 70% etanolu przygotowane w kroku 2.2.4 może być użyte do oczyszczenia lub ponownej sterylizacji kleszczy. - Po zakończeniu preparacji delikatnie przenieść eksplant na 35-milimetrową płytkę roztworu Ca2+ przygotowanego w kroku 2.2.3.
- Powtarzać kroki 2.4-2.9, aż zostaną zebrane cztery eksplantaty.
- Za pomocą mikropipety P1000 przenieś wszystkie cztery eksplantaty na płytkę 35 mm zawierającą roztwór CMF, uważając, aby uniknąć kontaktu między eksplantatami a powierzchnią międzypowietrzno-wodną. Delikatnie zakręć naczyniem, aby wszystkie eksplantaty skupiły się na środku talerza.
- Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby umożliwić eksplantatom dysocjację.
UWAGA: Aby wspomóc dysocjację, do roztworu CMF można dodać 0,025%–0,01% trypsyny. Może to być konieczne do skutecznej dysocjacji starszych zarodków (stadium 22 i starsze). - W tym momencie na płytce trzymającej powinny pozostać co najmniej dwa odpowiednio zaawansowane zarodki. Przenieś te zarodki do świeżego naczynia wypełnionego 0,1x MMR z gentamycyną przygotowanego w kroku 2.2.4 i pozwól im rozwijać się bez zakłóceń, przykrywając naczynie tak, aby pasowało do naczynia z eksplantatu. Te zarodki będą służyć jako kontrola rodzeństwa.
- Za pomocą kleju superglue przymocuj szkiełko nakrywkowe w mikroliniaturę (patrz tabela materiałów) do dna naczynia do hodowli komórkowych o średnicy 35 mm przygotowanego w kroku 2.2.3.
UWAGA: Umieść małe krople superglue wokół krawędzi szkiełka nakrywkowego, a następnie mocno dociśnij go do spodu naczynia do hodowli komórkowych. Oznaczenia pozycyjne będą zasłonięte w każdym miejscu, w którym klej styka się z siatką, dlatego ważne jest, aby środkowa część szkiełka nakrywkowego z siatką była wolna od kleju. - Po dysocjacji eksplantatów przez 1 godzinę użyj mikropipety P100, aby przenieść je do naczynia do hodowli komórkowych. Aby umieścić jak najwięcej komórek na siatkowej części naczynia, należy trzymać pipetę pod płytkim kątem blisko powierzchni naczynia, umieścić końcówkę pipety w rogu kratki skierowanej do wewnątrz i mocno wypchnąć zawiesinę komórek w poprzek siatkowanego obszaru. Idealnie byłoby, gdyby komórki osiedliły się w ciasnym, gęstym klastrze.
- Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby komórki przylgnęły do płytki. Określ i zapisz etap rozwojowy zarodków kontrolnych rodzeństwa, gdy rozpoczyna się ta inkubacja.
- Połączyć 5 μl 1 mM Fluo-4 AM (patrz tabela materiałów) z 2 μl 10% kwasu pluronowego F-127.
UWAGA: Fluo-4 AM jest wrażliwy na światło i powinien być przez cały czas przechowywany w bezpiecznej dla światła lub pokrytej folią tubie. - Po zakończeniu inkubacji przenieś naczynie na próbkę do ciemni lub innego miejsca chronionego przed światłem. Za pomocą mikropipety usuń 100 μl roztworu z krawędzi naczynia. Dodać ten roztwór do podwielokrotności kwasu Fluo-4 AM/Pluronic F-127, pipetować w górę i w dół, aby wymieszać, i zwrócić pełną objętość do naczynia na próbkę. Delikatnie zamieszaj, aby wymieszać.
- Przykryj płytkę folią aluminiową i pozostaw do inkubacji na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Określ i zapisz etap rozwojowy zarodków kontrolnych rodzeństwa, gdy rozpoczyna się ta inkubacja.
- Pod koniec inkubacji użyć pozostałej stożkowej probówki o pojemności 2 mM Ca2+, aby wykonać trzy płukania pożywką w następujący sposób: 1) usunąć 1 ml roztworu z naczynia, dodać 3 ml świeżego roztworu, 2) usunąć 3 ml roztworu z naczynia, dodać 3 ml świeżego roztworu, 3) usunąć 3 ml roztworu z naczynia, dodać 3 ml świeżego roztworu.
3. Obrazowanie wapnia
UWAGA: Obrazowanie wapnia zostało wykonane przy użyciu odwróconego mikroskopu konfokalnego (Tabela materiałów).
- Umieść płytkę z próbką na stoliku mikroskopu, uważając, aby chronić ją przed światłem otoczenia. Po zabezpieczeniu płytki użyj markera, aby oznaczyć przedni punkt płytki, aby można było znaleźć to samo pole widzenia w kolejnych obrazowaniach.
- Zlokalizuj próbkę pod mikroskopem - najpierw przy powiększeniu 10X, a następnie 20X - i wybierz odpowiednie pole widzenia do obrazowania. Idealne pole widzenia jest gęste od komórek, ale nie na tyle gęste, aby komórki były zbite lub trudne do rozróżnienia pojedynczo.
- Dostosuj ostrość mikroskopu tak, aby szkiełko nakrywkowe w kształcie siatki było widoczne. Numery zaznaczone na szkiełku nakrywkowym służą jako niepowtarzalne identyfikatory dla poszczególnych miejsc siatki i mogą być wykorzystane do zlokalizowania tego samego pola widzenia w celu dodatkowego obrazowania. Jeśli pierwotnie wybrane pole widzenia nie nakłada się na żadne liczby, dostosuj ponownie, aż w kadrze znajdzie się możliwa do zidentyfikowania liczba.
- Zrób zdjęcie w jasnym polu wybranego pola widzenia z ostrym szkiełkiem nakrywkowym w siatce.
- Dostosuj ustawienia ostrości i zrób zdjęcie w jasnym polu wybranego pola view z ostrymi komórkami.
- Gdy warstwa komórkowa jest w centrum uwagi, oświetl próbki laserem o długości fali 488 nm. Wartości HV i Offset mogą być optymalizowane dla każdego eksperymentu, aby zapewnić wykrycie dynamicznego zakresu fluorescencji na kanale FITC.
- W przypadku obrazu dwugodzinnego zmodyfikuj konfigurację obrazowania, aby zarejestrować 901 klatek z czasem skanowania 3,93 s i interwałem 8 s. Uruchom konfigurację, aby uzyskać obraz.
- Po zakończeniu obrazowania wyjmij płytkę ze stolika mikroskopu. Usunąć 1 ml roztworu z płytki i zastąpić go 1 ml 2x MEMFA (200 mM MOPS, 2 mM EGTA i 2 mMMgSO4 w 7,4% formaldehydzie).
- Inkubować płytkę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Określić i zapisać stadium rozwojowe zarodków kontrolnych rodzeństwa w momencie rozpoczęcia inkubacji.
- Po zakończeniu utrwalania usunąć cały roztwór z płytki i zastąpić go 2 ml 1x PBS. Przechowywać płytki w temperaturze 4 °C do dalszej obróbki.
4. Analiza ekspresji genów: Synteza sondy
- Jak opisano poniżej, wygeneruj antysensowną sondę RNA do hybrydyzacji in situ. Dodatkowo wygeneruj sondę zmysłową dla tego samego genu do wykorzystania jako kontrola negatywna.
- W celu oczyszczenia plazmidowego DNA zawierającego sekwencję matrycy sondy, zaszczepić 150 ml bulionu LB bakteryjnymi zapasami glicerolu zawierającymi plazmid matrycowy. Inkubować w temperaturze 37 °C, wytrząsając przez noc lub do momentu, gdy kultura stanie się mętna.
- Oczyść plazmidowe DNA z kultury bakteryjnej przy użyciu wybranej metody.
UWAGA: Używamy zestawu McNary-Nagel midi-prep kit, aby uzyskać wysoką wydajność plazmidowego DNA. - Aby potwierdzić, że plazmid zawiera oczekiwaną wstawkę, należy przeprowadzić trawienie restrykcyjne i przeanalizować produkty na żelu agarozowym. Nieoszlifowany plazmid można również analizować na żelu agarozowym w celu sprawdzenia zanieczyszczenia genomowego DNA.
- Aby zlinearyzować matrycowy DNA, należy przeprowadzić reakcję trawienia restrykcyjnego o objętości 100 μl, zawierającą 20 μg plazmidowego DNA, 2 μl odpowiedniego enzymu restrykcyjnego i 1x odpowiedni bufor. Inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 godziny.
- Wyodrębnij zlinearyzowane DNA, wykonując ekstrakcję fenolem/chloroformem, a następnie ekstrakcję chloroformem.
- Wytrącić DNA 100% etanolem. Można to zrobić szybko, dodając dwie objętości zimnego etanolu do próbki i inkubując ją w temperaturze -80 °C aż do zestalenia się (15-30 min).
- Za pomocą wirówki z chłodzeniem należy granulować DNA przez wirowanie przez 20 minut w temperaturze 12 000 x g/4 °C.
- Usunąć supernatant i przemyć osad 200 μl 70% etanolu. Wirować przez 5 minut w temperaturze 12 000 x g/4 °C.
- Usunąć supernatant i suchy na powietrzu osad na około 5 minut. Zawiesić ponownie w 20 μl 1x TE i przechowywać w temperaturze 4 °C do dalszego użycia.
- Aby zsyntetyzować i oczyścić antysensowną sondę RNA, utwórz mieszaninę 2,5 mM rNTP, łącząc 15 μL 10 mM rCTP, 15 μL 10 mM rGTP, 15 μL 10 mM rATP, 9,75 μL 10 mM rUTP i 5,25 μL 10 mM dig-11 UTP (patrz tabela materiałów).
- Przygotować 50 μl reakcji transkrypcyjnej in vitro zawierającej 4 μg zlinearyzowanego matrycowego DNA z kroku 4.2-4.10, 15 μl 2,5 mM mieszanki rNTP z kroku 4.11, 10 μl 5x buforu transkrypcyjnego, 5 μL 0,1 M DTT, 0,5 μL inhibitora RNAzy (20 U/μL), i 1,5 μl odpowiedniej polimerazy RNA (T3, T7 lub SP6). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
- Dodać dodatkowe 1,5 μl polimerazy RNA do reakcji i powrócić do 37 °C na dodatkową godzinę.
- Dodać 1 μl DNA RQ1 do reakcji i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut w celu degradacji matrycy DNA.
- Do próbki dodać 30 μl 7,5 M roztworu LiCl. Odpipetować do mieszania i inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę.
- Za pomocą wirówki z chłodzeniem wirować próbkę przez 25 minut w temperaturze 14 000 x g/4 °C.
- Usunąć supernatant i przepłukać osad 500 μl 70% etanolu. Wirować przez 5 minut w temperaturze 14 000 x g/4 °C.
- Usunąć supernatant i suchy na powietrzu osad na około 5 minut. Zawiesić w 20 μl wody wolnej od nukleaz.
- Stwórz 10 razy więcej sondy, rozcieńczając próbkę do stężenia 10 ng / μL w buforze hybrydyzacyjnym (50% formamidu, 5x SSC (cytrynian soli fizjologicznej; 750 mM NaCl, 75 mM cytrynian sodu, pH 7,0), 1 mg / ml torula RNA, 0,1% Tween-20, 1x roztwór Denhardta, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA i 100 μg/ml heparyny). Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
5. Analiza ekspresji genów: Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ
UWAGA: Wszystkie płukania powinny być wykonywane z około 1 ml roztworu za pomocą sterylnej, indywidualnie zapakowanej pipety transferowej. Podczas wyjmowania lub dodawania roztworu pipetę należy umieszczać na krawędzi płytki, a płukanie należy przeprowadzać tak delikatnie, jak to możliwe, aby upewnić się, że komórki nie zostaną usunięte z powierzchni płytki i nie zostaną utracone.
- Usuń 1x PBS z płytki (od kroku 3.10). Zastąp świeżym 1x PBS i inkubuj 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Połączyć 25 ml 0,1 M trietanoloaminy (pH 8,0) z 62,5 μl bezwodnika octowego. Dobrze wymieszaj. Myj płytkę tym roztworem przez 10 minut.
- Myć płytkę 1x SSC przez 5 min.
- Myć płytkę 0,02 M HCl przez 10 minut, aby przepuszczalność komórek.
- Myć 2x z 1x PBS przez 5 min każdy.
- Usuń roztwór i dodaj 1 ml buforu hybrydyzacyjnego (50% formamidu, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM cytrynian sodu, pH 7,0), 1 mg/ml torula RNA, 0,1% Tween-20, 1x roztwór Denhardta, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA i 100 μg/ml heparyny) na płytkę. Inkubować z wytrząsaniem przez co najmniej 6 godzin w temperaturze 60 °C.
- Usuń bufor hybrydyzacyjny i zastąp go 750 μl 1x roztworu sondy RNA (rozcieńczonego z 10x zapasu wykonanego w kroku 4.19. Sondy Sense RNA mogą być używane jako kontrola negatywna.
- Inkubować z wytrząsaniem przez 8-14 godzin w temperaturze 60 °C.
- Wyjmij sondę i przechowuj w temperaturze -20 °C.
UWAGA: 1x rozcieńczenie sondy może być ponownie użyte do trzech razy przed wyrzuceniem. - Przepłukać płytkę 0,2x SSC.
- Myć świeżym 0,2x SSC przez 1 h w temperaturze 60 °C.
- Przenieś płytki do temperatury pokojowej i równoważ przez 5 minut.
- Myć płytkę 0,2x SSC przez 5 min.
- Myj płytkę 1x PBT przez 15 min.
- Umyj płytkę 2% H2O2 w 1x PBT (0,1% Triton-x-100) przez 1 godz.
UWAGA: Ten roztwór jest wrażliwy na światło, więc powinien być świeży do każdego eksperymentu i osłonięty przed światłem. Podczas tej inkubacji płytki powinny być również osłonięte przed światłem lub foliowane. - Myć płytkę 1x TBST (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1%Tween-20) przez 15 min.
- Rozcieńczyć odczynnik blokujący do 2% w buforze kwasu maleinowego (100 mM kwas maleinowy, 150 mM NaCl, pH 7,5). Zablokuj komórki w tej mieszaninie na co najmniej 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Zastąp roztwór blokujący przeciwciałem anty-digoksygeninowo-POD rozcieńczonym 1:1,000 w 2% odczynniku blokującym w buforze kwasu maleinowego. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
- Opłucz płytkę 3x za pomocą 1x TBST.
- Umyj 4x z 2 ml 1x TBST przez co najmniej 15 minut na pranie z ciągłym kołysaniem.
- Prać 2x z 1x PBT przez co najmniej 10 minut na pranie z ciągłym kołysaniem.
- Rozcieńczyć tyramid sprzężony z Cy3 w stosunku 1:25 w 1x PBT. Umyć płytkę 750 μl tego rozcieńczenia przez 5 min.
UWAGA: To rozwiązanie jest niezwykle wrażliwe na światło, a płytki powinny być zafoliowane lub osłonięte przed światłem przez pozostałą część eksperymentu, aby uniknąć pogorszenia sygnału. - Dodać 2,5 μl 0,3% H2O2 do tego roztworu i inkubować z ciągłym kołysaniem przez dodatkowe 40 minut w temperaturze pokojowej.
- Prać 4x z 1x TBST przez co najmniej 15 minut na pranie z ciągłym kołysaniem.
- Spłucz 1x PBT.
- Utrwal komórki przez inkubację przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w 1x MEMFA (100 mM MOPS, 1 mM EGTA i 1 mMMgSO4 w 3,7% formaldehydzie).
- Usuń roztwór i zastąp go 1x PBS. Przechowywać płytki w foliowanym pojemniku w temperaturze 4 °C do czasu dalszej obróbki.
6. Komórki obrazowania
UWAGA: Obrazowanie zostało wykonane przy użyciu odwróconego mikroskopu konfokalnego.
- Umieść płytkę z próbką na stoliku mikroskopu, wyrównując znak wykonany w kroku 3.1 z przodu stolika.
- Ustawić ostrość obrazu tak, aby szkiełko nakrywkowe wyłożone siatką było widoczne, a następnie korzystając z obrazu siatki wykonanego w kroku 3.4 jako odniesienia, dostosować pole widzenia tak, aby odpowiadało polu widzenia uchwyconemu na obrazie wapniowym (sekcja 3).
- Uzyskuj obrazy w jasnym polu zarówno siatki, jak i komórek.
- Oświetlić próbki laserem TRITC o długości fali 595 nm. Dostosuj wartości wzmocnienia, aby odpowiednio odróżnić sygnał od tła za pomocą obrazów z komórek kontroli negatywnej i uzyskać nieruchomy obraz.
UWAGA: Idealnie, poziomy fluorescencji tła są określane na podstawie płytki kontroli ujemnej przetwarzanej równolegle z sondą RNA non-targeting. Ustawienia wzmocnienia są dostosowywane tak, aby ta płyta wydawała się całkowicie (odpowiadająca poziomom tła), a następnie utrzymywana na stałym poziomie dla innych płyt zobrazowanych z tej eksperymentalnej partii.
7. Przetwarzanie danych
UWAGA: Przetwarzanie danych odbyło się przy użyciu oprogramowania Nikon Elements.
- Otwórz obraz wapnia z 2 godzin z kroku 3.7. Zidentyfikuj piksele odpowiadające każdej pojedynczej komórce, wybierając opcję Binarne wykrywanie > punktowe > Jasne punkty. Upewnij się, że wybrany jest kanał FITC.
- Kolorowe kółka pojawią się nad poszczególnymi komórkami po wygenerowaniu tej warstwy. Dostosuj parametry rozmieszczenia i rozmiaru komórek tak, aby jak najwięcej komórek było rozpoznawanych i kojarzonych z unikatowym identyfikatorem.
- Śledź komórki we wszystkich klatkach obrazu, przechodząc do opcji Widok > Formanty analizy > Opcje śledzenia. Ustaw 5 klatek jako maksymalny odstęp między ścieżkami, usuń obiekty skojarzone z mniej niż 600 klatkami i wybierz opcję Zamknij przerwy. Wybierz opcję Pliki binarne ścieżek, aby zastosować śledzenie komórek do obrazu.
- Po śledzeniu komórek ręcznie usuń wszystkie obiekty, które nie odpowiadają pojedynczej komórce (na przykład zlepek komórek). Nie należy jednak wykluczać punktów danych z dalszej analizy opartej na morfologii śladu aktywności wapnia.
- W okienku Obraz wybierz opcję Wyświetl nakładkę, > Pokaż identyfikator obiektu binarnego. Przewiń do końca obrazu (klatka 901) i wybierz opcję Edytuj > Utwórz migawkę widoku (8-bitowe RGB)> Bieżąca klatka > OK. Spowoduje to utworzenie migawki ostatniej klatki obrazu z widocznym identyfikatorem binarnym powiązanym z każdą komórką. Zapisz ten obraz.
- Eksportuj dane szeregów czasowych, zaznaczając wszystkie obiekty, a następnie eksportuj dane do programu Excel. Zapisz dane wyjściowe jako plik CSV.
- Otwórz obraz FISH. Zoptymalizuj wykrywanie punktowe, jak w krokach 7.1–7.2, używając kanału TRITC zamiast kanału FITC. Ręcznie usuń wszystkie nieprawidłowo przypisane pliki binarne, a następnie wybierz opcję Automatyczne wyniki pomiarów > Aktualizuj pomiar, aby obliczyć intensywność sygnału każdej komórki. Wyeksportuj migawkę obrazu i tabelę danych, powtarzając kroki 7.5 i 7.6.
- Utwórz arkusz kalkulacyjny, w którym kolumna A jest oznaczona jako FISH Binary ID, a kolumna B jest oznaczona jako Calcium Binary ID. Otwórz obrazy wyeksportowane w krokach 7.5 i 7.7. Dla każdego obiektu zidentyfikowanego na obrazie FISH (krok 7.7) zapisz identyfikator binarny w kolumnie A. Następnie zlokalizuj odpowiednią komórkę na obrazie wapnia (krok 7.5) i zapisz ten binarny identyfikator w kolumnie B. Komórki, których nie można jednoznacznie zidentyfikować na obu obrazach, nie powinny być dodawane do arkusza kalkulacyjnego.
UWAGA: Pomocne może być użycie programu do edycji zdjęć, takiego jak Adobe Photoshop lub edytor obrazów GIMP, aby otworzyć oba obrazy, ustawić jeden z nich jako półprzezroczysty i nałożyć go na obraz partnerski, aby łatwiej zidentyfikować i połączyć dwa identyfikatory binarne powiązane z każdą komórką. - Dla każdej zidentyfikowanej komórki należy zestawić (ręcznie lub za pomocą skryptu) jej dane dotyczące wapnia w szeregach czasowych (skojarzone z binarnym identyfikatorem wapnia i wyeksportowane w kroku 7.6) oraz dane dotyczące ekspresji genów (skojarzone z identyfikatorem binarnym FISH i wyeksportowane w kroku 7.7).
UWAGA: Dalsze przetwarzanie i analiza danych może obejmować zestawienie tych danych w jedną tabelę danych i zastosowanie szeregu technik analitycznych, w tym zliczania spajków, analizy fraktalnej i entropii Markowa, które pozwalają badaczowi dostrzec nowe wzorce aktywności wapnia 17,18.
Wyniki
Udany przykład dysocjowanych komórek przygotowanych do obrazowania wapnia przedstawiono na Rysunku 2A. Komórki są wysiane gęsto, co pozwala na zebranie maksymalnej ilości informacji z każdego obrazu, ale nie na tyle gęsto, aby nie można było z pewnością odróżnić poszczególnych komórek od siebie. Fluorescencja jest wykrywana dla każdej zdefiniowanej komórki przez 2-godzinny okres obrazowania. Wizualizacja wykresu zbiorczego zawierającego ślady dla wszystkich komórek zarejestrowanych w eksperymencie ujawnia stopień, w jakim pomiary masowe lub populacyjne mogą zaciemniać bardziej subtelne wzorce aktywności impulsowej (Rysunek 2B). Po wyizolowaniu zarejestrowanych profili poszczególnych komórek można wyraźnie zidentyfikować przykłady nieregularnej aktywności impulsowej charakterystycznej dla neuralnych komórek progenitorowych. W przeciwieństwie do dojrzałych neuronów, embrionalne komórki neuronalne wykazują nieregularny, wysoce zmienny i złożony charakter aktywności wapniowej (Rysunek 2B). Aby ilościowo określić tę złożoność, zastosowano różne metody analizy danych17,18, w tym różnorodne parametry definiujące impuls (Rysunek 2C).
Poprawność przeprowadzenia fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ, w tym prawidłowy projekt i synteza antysensownej sondy mRNA, można ocenić poprzez porównanie płytki eksperymentalnej z kontrolą tła inkubowaną z niewiążącą kontrolną RNA sensowną (Rysunek 3A,B). Kontrolę pozytywną sondy można również przeprowadzić, analizując typ komórek, o którym wiadomo, że wykazuje ekspresję docelowego mRNA na poziomach mierzalnych.
Identyfikacja tej samej komórki w obrazowaniu wapniowym oraz FISH wymaga, aby komórki zachowały w przybliżeniu tę samą pozycję podczas hybrydyzacji sond i dalszej obróbki. Jeśli płytki są traktowane niedbale lub płukanie jest wykonywane zbyt intensywnie, komórki mogą zostać oderwane od powierzchni płytki i albo utracone podczas usuwania roztworu, albo osadzone w innym miejscu na płytce, co uniemożliwia ich dopasowanie między obrazami (Rysunek 4A). Jeśli takie zaburzenie dotyczy tylko części komórek w polu widzenia, nadal może być możliwe wykrycie i przypisanie niektórych komórek w obrębie obrazu (Rysunek 4B). Jednak maksymalną ilość danych uzyskuje się w eksperymencie, w którym FISH jest przeprowadzany starannie, a niewiele komórek zostaje utraconych lub przesuniętych między obrazami (Rysunek 4C).
Po zebraniu danych opisujących zarówno aktywność wapniową, jak i ekspresję genów w odpowiedniej liczbie komórek na interesujących etapach rozwoju, można przeprowadzić dalsze analizy w celu oceny korelacji między tymi dwiema cechami (Rysunek 1). W celu ilościowego określenia wzorców aktywności wapniowej zastosowano szereg wskaźników, w tym zliczanie/częstotliwość impulsów, średnią moc, szacowanie wykładnika Hursta oraz pomiar entropii markowowskiej17,18. Ekspresję genów można zdefiniować ilościowo poprzez bezwzględny poziom fluorescencji lub ocenić w skali binarnej (tak/nie), w zależności od stawianych pytań badawczych.
Wyniki eksperymentów korelujących aktywność wapniową z ekspresją genów markerowych progenitorów neuronalnych ujawniły liczne powiązania między konkretnymi wzorcami aktywności wapniowej a fenotypami neuroprzekaźników. Na etapie płytki neuronalnej (Stadium 14) komórki GABAergiczne wykazujące ekspresję markera neuronów hamujących gad1.1 wykazują aktywność wapniową o większej regularności i wyższej amplitudzie niż komórki pozbawione ekspresji gad1.1 (Rysunek 5A). Co więcej, podczas gdy komórki te wykazujące ekspresję gad1.1 są powiązane z wyższym poziomem impulsacji o wysokiej amplitudzie, impulsacja o niskiej amplitudzie występuje częściej w komórkach glutaminergicznych wykazujących ekspresję markera neuronów pobudzających slc17a7.
Rycina 1: Schemat przebiegu eksperymentu. Pasek skali = 100 μm. Obrazy w panelach 3-5 zostały pobrane z pracy Paudel i wsp. (2019)17. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 2: Obrazowanie wapnia i przykładowe profile aktywności. (A) Aktywność wapnia wewnątrzkomórkowego raportowana przez Fluo4-AM. Każdy obraz z 2 h składa się z 901 klatek, z czego jedna reprezentatywna klatka jest pokazana tutaj. (B) Zbiorczy wykres intensywności fluorescencji w czasie dla wszystkich komórek w obrazowanym polu widzenia. Ślady wyraźnie wskazują na fotobleaching barwnika wskaźnikowego (Fluo4) w czasie. Wykres rastrowy w lewym górnym rogu przedstawia reprezentatywne ślady aktywności wapnia po zastosowaniu algorytmu usuwania trendu opracowanego przez Eilersa i Boelena19, gdzie przedstawione tutaj komórki wykazują zróżnicowany wzorzec zachowań impulsowych. (C) Zastosowanie różnych progów (150% i 200% linii bazowej, gdzie linia bazowa jest średnią zdetrendowanej intensywności fluorescencji) w celu zdefiniowania impulsu (zielona i niebieska strzałka). Pasek skali = 100 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 3: Obrazowanie FISH. (A) Metoda FISH przeprowadzona z użyciem nie wiążącej się sondy RNA sens jako kontroli negatywnej. Ustawienia obrazowania zostały dostosowane tak, aby żadne komórki nie wykazywały fluorescencji. Niektóre pola widzenia mogą zawierać niekomórkowe zanieczyszczenia wykazujące pewną fluorescencję, jak widać w prawym górnym i prawym dolnym rogu (A); można je zignorować przy ustawianiu tła. (B) Te same ustawienia obrazowania zostały następnie zastosowane do obrazowania płytki eksperymentalnej (sonda RNA antysens). Fluorescencja w tych warunkach odpowiada ekspresji genu powyżej poziomu tła. Pasek skali = 100 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 4: Nakładanie obrazów i korejestracja. Schematyczne przedstawienie próbki obrazowanej pod kątem aktywności wapniowej (komórki przedstawione jako wypełnione zielone kółka) oraz po FISH (komórki przedstawione jako zacieniowane czerwone kółka). (A) Komórki, które znacząco przesunęły się podczas manipulowania próbką i jej przetwarzania, nie mogą być wiarygodnie zidentyfikowane na obu obrazach. (B) Uszkodzenie komórek może dotyczyć tylko niektórych komórek w polu widzenia. Niektóre komórki można wyraźnie zidentyfikować na obu obrazach, podczas gdy inne nie mogą zostać pewnie dopasowane. (C) Jeśli próbkami manipuluje się ostrożnie, większość komórek pozostanie niezakłócona i będzie można je zidentyfikować na obu obrazach. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 5: Przykład zastosowania tej metody; wykresy pudełkowe przedstawiające korelacje między aktywnością wapnia a ekspresją genów (odpowiednio GABA i Glut dla genów gad1.1 oraz slc17a7) w stadium płytki nerwowej Xenopus laevis. W stadium 14 komórki gad1.1-dodatnie (GABA) wykazują wyższą amplitudę i bardziej regularną aktywność wapnia, zdefiniowaną przez (A) entropię markowską18 oraz (B) liczbę impulsów przy użyciu progów 125%, 150%, 200% i 300% średniej odtrendowanej intensywności fluorescencji (baseline)17, niż komórki slc17a7-dodatnie (Glut). Gwiazdki oznaczają różnice istotne statystycznie zgodnie z testem Kołmogorowa-Smirnowa dla dwóch prób z korektą Bonferroniego (p < 0.05) oraz statystyką d Cohena dla wielkości efektu (n = 5 kultur i >100 komórek; * 0.2 ≤ |d| < 0.5). Rysunek został przerysowany i zaadaptowany na podstawie zbioru danych uzyskanych od Paudel et al.17. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
W komórkach tworzących rozwijający się układ nerwowy zaobserwowano charakterystyczne wzorce aktywności wapnia, przy czym określone typy aktywności są związane z odrębnymi procesami neurorozwojowymi. Jednak dalsze zrozumienie mechanizmów, za pomocą których te gęste od informacji wzorce aktywności są przekształcane w odpowiedzi transkrypcyjne, wymaga zebrania informacji o aktywności wapnia i ekspresji genów z rozdzielczością pojedynczej komórki. Podczas gdy systemy, które wykazują bardziej stereotypową aktywność wapnia, takie jak dojrzałe neurony, mogą być rozsądnie oceniane na poziomie masowym, nieregularne wzorce, które charakteryzują embrionalny układ nerwowy, można łatwo zamaskować za pomocą mniej precyzyjnych zapisów.
Ramy eksperymentalne ustanowione w tym protokole można łatwo dostosować do szerokiej gamy typów komórek i reporterów fluorescencyjnych. Tkanka zawierająca praktycznie dowolny typ komórki lub kombinację typów komórek może zostać wypreparowana z organizmu modelowego będącego przedmiotem zainteresowania i posiew w celu obrazowania pojedynczych komórek. Oprócz umożliwienia identyfikacji komórek i wyizolowania efektu procesów autonomicznych komórek, podejście oparte na pierwotnej hodowli komórkowej pozwala eksperymentatorowi zdefiniować składniki pożywki zgodnie z życzeniem. Na przykład przeprowadzono eksperymenty porównujące aktywność prekursorów neuronalnych w roztworze 2 mM Ca2 + w celu zbadania, czy relacje między częstotliwością skoków a fenotypem neuroprzekaźnika w embrionalnym rdzeniu kręgowym można podsumować bez wpływu interakcji komórka-komórka13,20.
Chociaż protokół ten wykorzystuje marker fluorescencyjny Fluo4-AM do wykrywania wewnątrzkomórkowej aktywności wapnia, w zależności od kryteriów wyboru, użytkownicy mogą wybrać inne dostępne na rynku markery21, w tym genetycznie kodowane wskaźniki wapnia. Podobnie, alternatywne markery mogą być używane do monitorowania dynamicznych zmian stężenia jonu będącego przedmiotem zainteresowania (w tym K+, Na+ i Zn2+), potencjału błonowego lub pH komórkowego. Ustawienia obrazowania i czas trwania obrazu można modyfikować w razie potrzeby.
Chociaż skorelowaliśmy aktywność wapnia i fenotyp neuronów jako konkretne zastosowanie, metoda ta ma również zastosowanie do wielu innych właściwości komórkowych. Na przykład fluorescencyjna hybrydyzacja in situ może być przeprowadzana za pomocą sond przeciwko dowolnemu genowi będącemu przedmiotem zainteresowania, w tym markerowi neuronalnemu ChAT lub czynnikowi transkrypcyjnemu Engrailed, co pozwala na czułe wykrywanie konfigurowalnego panelu gatunków mRNA. Sondy te można zaprojektować tak, aby były specyficzne dla izoformy, w razie potrzeby obsługując dodatkową specyficzność docelową. Double FISH można przeprowadzić za pomocą sond sprzężonych z kilkoma dwoma różnymi fluoroforami, co pozwala na jednoczesną ocenę ekspresji wielu genów. Jednak dodatkowe płukania wymagane w tego typu eksperymencie wiążą się ze zwiększonym ryzykiem utraty lub ruchu komórek i wymagają doświadczenia i delikatności, aby można je było pomyślnie przeprowadzić.
Niezależnie od wszelkich modyfikacji specyficznych dla eksperymentu wprowadzonych do tego protokołu, istnieje kilka kluczowych kroków, które wymagają szczególnej uwagi. Sekcje powinny być wykonywane z ostrożnością, aby usunąć wszystkie zanieczyszczające tkanki lub populacje komórek; Ponieważ wzorzec przestrzenny zostaje utracony, gdy eksplantaty są dysocjowane, wszelkie pozostałe komórki z sąsiednich tkanek będą przeplatać się i nie do odróżnienia od komórek będących przedmiotem zainteresowania. Po poszczepieniu komórek z próbkami należy obchodzić się tak delikatnie, jak to możliwe, aby zapobiec ich przemieszczeniu. Co najważniejsze, oznacza to, że wszystkie zmiany roztworu powinny być wykonywane powoli i ostrożnie, z pipetą umieszczoną na krawędzi płytki podczas wyjmowania i dodawania roztworu. Zapewni to pewność identyfikacji komórek zarówno na obrazach wapnia, jak i FISH. Jeśli komórki zostaną zakłócone podczas przetwarzania, identyfikacja niektórych lub wszystkich odpowiadających im komórek między dwoma obrazami może być niemożliwa. Zalecamy ostrożność przy tych przypisaniach, tak aby do dalszej analizy używane były tylko jednoznacznie odpowiadające komórki.
W zależności od poruszanej kwestii biologicznej odpowiednie mogą być różne podejścia analityczne. Aktywność wapnia w szeregach czasowych może być przetwarzana i określana ilościowo na różne sposoby, przy czym eksperymentator może elastycznie wybierać parametry detrendingu, metryki analizy i parametry analizy (na przykład % progu wyjściowego używany do definiowania skoku wapnia). Korelacje między aktywnością wapnia a poziomem ekspresji genów można wyznaczyć, analizując ekspresję genów jako bezwzględną lub względną wartość fluorescencji wyekstrahowaną z obrazu FISH. Alternatywnie, korelacje między aktywnością wapnia a ekspresją genów (obecność/brak) można wyznaczyć poprzez zdefiniowanie progu fluorescencji dla pozytywnego sygnału ekspresji genów i przypisanie identyfikatorów "tak" lub "nie" poszczególnym komórkom. Ogólnie rzecz biorąc, ten schemat eksperymentalny zapewnia niezwykle elastyczny potok do zbierania i wstępnej analizy danych szeregów czasowych w połączeniu z danymi dotyczącymi ekspresji genów dopasowanymi do komórek. Takie eksperymenty będą miały kluczowe znaczenie dla lepszego zrozumienia złożonych relacji między dynamiką komórkową a zmianami transkrypcyjnymi, czego przykładem jest identyfikacja wzorców aktywności wapnia charakterystycznych dla prekursorów neuronów o losie hamującym i pobudzającym u embrionalnego Xenopus laevis.
Oświadczenia
Nie stwierdzono konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy Wendy Herbst i Lindsay Schleifer za ich wkład w rozwój tych protokołów. Prace te były wspierane przez granty z National Institutes of Health (1R15NS067566-01, 1R15HD077624-01 i 1R15HD096415-01) dla MSS.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Do hodowli zwierząt i Hodowla komórkowa | |||
| CHORULON (gonodotropina kosmówkowa) | Merck Animal Health | ||
| Sól siarczanu gentamycyny | Millipore Sigma | G1264 | |
| Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Płytki Petriego Pyrex, 100 mm x 20 mm | Millipore Sigma | CLS3160102 | |
| Naczynia do hodowli tkankowych Corning Falcon Easy-Grip, 35 mm | Fisher Scientific | 08-772A | |
| Naczynia do hodowli tkankowych Corning Falcon Easy-Grip, 60 mm | Fisher Scientific | 08-772F | |
| Standardowe naczynia do hodowli tkankowych | Falcon Fisher Scientific | 08-772E | |
| Thermo Scientifc Kultura komórkowa Nunc / szalki Petriego, szalka 35x10mm, nunclon Delta | Fisher Scientific | 12-565-90 | |
| Fisherbrand Standardowe jednorazowe pipety transferowe, bez podziałki; Długość: 5,875 cala; Pojemność: 7,7 ml | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| 3-aminobenzoesan etylu metanosulfonian | Millipore Sigma | E10521 | |
| Kolagenaza B | Milipore Kleszcze Sigma | 11088807001 | |
| Dumont #55, Dumostar | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dumont #5 Kleszcze, Dumostar | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Powierzchnia hodowli komórkowych Cellattice Micro-Lined | Nexcelom Bioscience | CLS5-25D-050 | |
| Do obrazowania wapnia | |||
| Fluo-4, AM, permeant komórkowa | Thermo Fisher Scientific | F14201 | |
| Pluronic F-127, 0,2 i mikro; m przefiltrowany (10% roztwór w wodzie) | Thermo Fisher Scientific | P6866 | |
| Do generowania sondy RNA | |||
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | |
| rATP | Promega | P1132 | |
| rCTP | Promega | P1142 | |
| rGTP | Promega | P1152 | |
| rUTP | Promega | P1162 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Millipore Sigma | 3359247910 | |
| Inhibitor RNAZY | Thermo Fisher Scientific | N8080119 | |
| Polimeraza RNA | T3 Promega | P2083 | |
| Polimeraza RNA T7 | Promega | P2075 | |
| SP6 Polimeraza RNA | Promega | P1085 | |
| RQ1 Bezrnazowy roztwór | Dnazy Promega | M6101 | |
| LiCl (7,5 M) | Thermo Fisher Scientific | AM9480 | |
| Do fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ | |||
| Acetic Anhydro | Thermo Fisher Scientific | 320102 | |
| Odczynnik blokujący | Millipore Sigma | ||
| Anti-Digoxigenin-POD, fragmenty Fab | Millipore Sigma | 11207733910 | |
| Cy3 Mono-Reactive NHS Ester | Millipore Sigma | GEPA13105 | |
| Solution Składniki | |||
| Chlorek wapnia, 96% ekstra czysty, proszek, bezwodny, ACROS Organixs | Fisher Scientific | AC349610 | |
| Dwuwodny chlorek wapnia | Milipore Sigma | C3306 | |
| CHAPS hydrat | Millipore Sigma | C3023 | |
| Roztwór Denhardta (50X) | Thermo Fisher Scientific | 750018 | |
| DTT, klasa molekularna (DL-Ditiothreitol) | Promega | P1171 | |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy, sól disodowa dwuwodzian | Fisher Scientific | S311 | |
| Kwas bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-tetraoctowy | Millipore Sigma | E3889 | |
| Formamid (dejonizowany) | Thermo Fisher Scientific | AM9342 | |
| Sól sodowa herparyny z błony śluzowej jelit świń | Millipore Sigma | H3393 | |
| HEPES (Ultra Pure) | Thermo Fisher Scientific | 11344041 | |
| Roztwór nadtlenku wodoru | Millipore Sigma | H1109 | |
| L-Cysteina | Millipore Sigma | 168149 | |
| Chlorek magnezu, czysty, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC223211000 | |
| Siarczan magnezu, czystość 97%, ACROS Organixs, bezwodny | Kwas | AC413480050 | |
| 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | ACS125231000 | |
| MOPS (drobne białe kryształy/biologia molekularna), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP308 | |
| Chlorek potasu | Millipore Sigma | P9541 | |
| Kwas rybonukleinowy z drożdży torula, typ IX | Milipore Sigma | R3629 | |
| Chlorek sodu | Millipore Sigma | S7653 | |
| Trietanoloamina | Millipore Sigma | 90279 | |
| Tris | Millipore Sigma | GE17-1321-01 | |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P9416 | |
| Equipment | |||
| Laminar Flow Hood | model do wyboru | ||
| model | mikroskopu preparacyjnego | ||
| Odwrócony mikroskop fluorescencyjny | Nikon | TE200 | |
| Oprogramowanie do obrazowania elementów NIS | Nikon | ||
| wyboru | |||
| wirówki | |||
| różny< / mocny> | |||
| System filtrów próżniowych butelkowych Corning, 0,22 μ m porów, pojemność butelki 500 ml | Millipore | ||
| Falcon 50 ml | Fisher Scientific | 14-432-22 |
Bibliografia
- Humeau, J., et al. Calcium signaling and cell cycle: Progression or death. Cell Calcium. 70, 3-15 (2017).
- Kim, J. M., Lee, M., Kim, N., Heo, W. D. Optogenetic toolkit reveals the role of Ca2+ sparklets in coordinated cell migration. PNAS. 112 (21), 5951-5957 (2016).
- Orrenius, S., Zhivotovsky, B., Nicotera, P. Regulation of cell death: the calcium-apoptosis link. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 552-565 (2003).
- Pham, K., et al. Ca2+ and Mg2+ module conformational dynamics and stability of downstream regulatory element antagonist modulator. Protein Science. 24 (5), 741-751 (2015).
- Smedler, E., Uhlén, P. Frequency decoding of calcium oscillations. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 964-969 (2014).
- Moreau, M., Néant, I., Webb, S. E., Miller, A. L., Riou, J. F., Leclerc, C. Ca(2+) coding and decoding strategies for the specification of neural and renal precursor cells during development. Cell Calcium. 59 (2-3), 75-83 (2016).
- Tomida, T., Hirose, K., Takizawa, A., Shibasaki, F., Iino, M. NFAT functions as a working memory of Ca2+ signals in decoding Ca2+ oscillation. EMBO. 22 (15), 3825-3832 (2003).
- Hannanta-Anan, P., Chow, B. Y. Optogenetic Control of Calcium Oscillation Waveform Defines NFAT as an Integrator of Calcium Load. Cell Systems. 2 (4), 283-288 (2016).
- Li, L., Stefan, M. I. Le Novère N. Calcium input frequency, duration and amplitude differentially module the relative activation of calcineurin and CaMKII. PLoS One. 7 (9), 43810(2012).
- Romano, D. R., Pharris, M. C., Patel, N. M., Kinzer-Ursem, T. L. Competitive tuning: Competition's role in setting the frequency-dependence of Ca2+-dependent proteins. PLoS Computational Biology. 13 (11), 1005820(2017).
- Pharris, M. C., Patel, N. M., Kinzer-Ursen, T. L. Competitive Tuning Among Ca2+/Calmodulin-Dependent Proteins: Analysis of in silico Model Robustness and Parameter Variability. Cellular and Molecular Bioengineering. 11 (5), 353-365 (2018).
- Gu, X., Olson, E. C., Spitzer, N. C. Spontaneous neuronal calcium spikes during early differentiation. Journal of Neuroscience. 14 (11), 6325-6335 (1994).
- Borodinsky, L. N., Root, C. M., Cronin, J. A., Sann, S. B., Gu, X., Spitzer, N. C. Activity-dependent homeostatic specification of transmitter expression in embryonic neurons. Nature. 429 (6991), 523-530 (2004).
- Ciccolini, F., Collins, T. J., Sudhoelter, J., Lipp, P., Berridge, M. J., Bootman, M. D. Local and Global Spontaneous Calcium Events Regulate Neurite Outgrowth and Onset of GABAergic Phenotype during Neural Precursor Differentiation. Journal of Neuroscience. 23 (1), 103-111 (2003).
- Weissman, T. A., Riquelme, P. A., Ivic, L., Flint, A. C., Kriegstein, A. R. Calcium Waves Propagate through Radial Glial Cells and Modulate Proliferation in the Developing Neocortex. Neuron. 43 (5), 647-661 (2004).
- Nieuewkoop, P. D., Faber, J. The stages of Xenopus embryonic development. Normal Table of Xenopus laevis. , North Holland Publishing Company. (1994).
- Paudel, S., et al. Calcium Activity Dynamics Correlate with Neuronal Phenotype at a Single Cell Level and in a Threshold-Dependent Manner. International Journal of Molecular Science. 20 (8), 1880(2019).
- Marken, J. P., et al. A Markovian Entropy Measure for the Analysis of Calcium Activity Time Series. PLoS One. 11 (12), 0168342(2016).
- Eilers, P. H. C., Boelens, H. F. M. Baseline Correction with Asymmetric Least Squares Smoothing. Leiden University Medical Centre Report. , (2005).
- Guemez-Gamboa, A., et al. Non-cell-autonomous mechanism of activity-dependent neurotransmitter switching. Neuron. 82 (5), 1004-1016 (2014).
- Paredes, R., Madelaine,, et al. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
Przedruki i uprawnienia
