Artykuł metodologiczny

Analiza rozmieszczenia nowotworów i tkanek przeciwciała terapeutycznego specyficznego dla antygenu docelowego

DOI:

10.3791/60727

⸱

16 maja 2020

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Novel Biologics, University of Virginia School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Genetics, UVA Cancer Center, University of Virginia School of Medicine, 3Center for Comparative Medicine, University of Virginia

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do badania lokalizacji in vivo przeciwciał w modelach ksenoprzeszczepów guza myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeciwciała monoklonalne to wielofunkcyjne leki o wysokim powinowactwie, które działają na zasadzie zmiennych, niezależnych mechanizmów w celu eliminacji komórek rakowych. W ciągu ostatnich kilku dekad dziedzina koniugatów przeciwciało-lek, przeciwciał bispecyficznych, chimerycznych receptorów antygenowych (CAR) i immunoterapii nowotworów stała się najbardziej obiecującym obszarem badań podstawowych i terapeutycznych. Dzięki licznym udanym badaniom na ludziach ukierunkowanym na receptory immunologicznych punktów kontrolnych i komórki CAR-T w białaczce i czerniaku w przełomowym tempie, są to bardzo ekscytujące czasy dla terapii onkologicznych wywodzących się z różnych odmian inżynierii przeciwciał. Niestety, znacznie duża liczba terapii opartych na przeciwciałach i CAR okazała się również rozczarowująca w badaniach na ludziach nad nowotworami litymi ze względu na ograniczoną dostępność komórek efektorowych układu odpornościowego w łożysku guza. Co ważne, niespecyficzna dystrybucja przeciwciał terapeutycznych w tkankach innych niż nowotwory również przyczynia się do braku skuteczności klinicznej, związanej z tym toksyczności i niepowodzenia klinicznego. Ponieważ wierne przełożenie badań przedklinicznych na ludzkie szlaki kliniczne jest w dużym stopniu uzależnione od badań skuteczności i bezpieczeństwa ksenoprzeszczepu guza u myszy, w tym miejscu przedstawiamy metodę badania guza i ogólnej dystrybucji przeciwciał terapeutycznych w tkankach. Osiąga się to poprzez znakowanie oczyszczonego przeciwciała białka-A barwnikiem fluorescencyjnym w bliskiej podczerwieni, a następnie obrazowanie na żywo myszy z nowotworem.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FDA zatwierdziła pierwsze przeciwciało monoklonalne skierowane przeciwko CD3 (OKT3, Muromonab) w 1986 roku1,2. Od tego czasu przez następne dwadzieścia lat nastąpiła gwałtowna eksplozja w dziedzinie inżynierii przeciwciał ze względu na przytłaczający sukces przeciwciał przeciwko inhibitorom immunologicznych punktów kontrolnych3. Oprócz pośredniej aktywacji układu odpornościowego, przeciwciała mają na celu bezpośrednie oznaczanie komórek nowotworowych, aby precyzyjnie angażować komórki efektorowe układu odpornościowego, wyzwalać cytotoksyczność poprzez agonistę receptora śmierci, blokowa....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury związane z obchodzeniem się ze zwierzętami i badaniami nad ksenoprzeszczepami nowotworowymi zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) tutaj na Uniwersytecie Wirginii i są zgodne z odpowiednimi standardami regulacyjnymi

1. Ekspresja i oczyszczanie przeciwciał

  1. Utrzymanie komórek CHO
    1. Hoduj komórki CHO w pożywce FreeStyle CHO uzupełnionej dostępnym w handlu 1x suplementem glutaminy w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 130 obr./min z 5%CO2 przy użyciu delongowych kolb Erlenmeyera, szklanych lub jednorazowych.
      UWA....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W opisanej metodologii, najpierw sklonowaliśmy przeciwciała skierowane przeciwko receptorowi kwasu foliowego alfa-1 (FOLR1) o nazwie farletuzumab oraz bispecyficzne przeciwciało o nazwie BaCa, składające się z farletuzumabu i leksatumumabu wraz z przeciwciałami kontrolnymi, takimi jak abagovomab (sekwencje podane w pliku uzupełniającym 1). Szczegóły dotyczące reprezentatywnych domen o zmiennym ciężkim (VH) i zmiennym świetle (VL) w klonach DNA (pVH, pVL) są pokazane w Rysunek 1A

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Selektywne i specyficzne dla tkanki nowotworowej dostarczanie przeciwnowotworowego środka terapeutycznego jest kluczem do pomiaru skuteczności i bezpieczeństwa danej terapii celowanej13. W tym miejscu opisaliśmy szybkie i skuteczne podejście do badania szczegółowego rozmieszczenia tkanek i guza klinicznego, farletuzumabu i nieklinicznego przeciwciała BaCa. Opisane podejście ma zastosowanie do każdego nowo wytworzonego przeciwciała i może być stosowane wraz z klinicznie skutecznym przeciwciałem (o .......

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni University of Virginia Cancer Center Core Imaging Facility, Biomolecular Analysis Facility, Advanced Microscopy Facility oraz Core Vivarium Facility za pomoc. J. T-S jest badaczem na wczesnym etapie kariery w Ovarian Cancer Academy (OCA-DoD). Praca ta była wspierana przez grant NCI/NIH (R01CA233752) dla J. T-S, nagrodę U.S. DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) za przełom poziom 1 dla J. T-S (BC17097) oraz nagrodę finansowania U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OCRP) (OC180412) dla J. T-S

....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Nośnik FreeStyle CHOGibco Life TechnologiesCat # 12651-014
Anti-Anti (100X)Gibco Life Technologies Cat# 15240-062
Środek przeciwzbrylającyGibco Life TechnologiesCat # 01-0057DG
BD Strzykawka insulinowaBD BioSciencesCat #329420
Suwmiarka IVIS SpectrumPerkinElmerKot #124262
CHO CD EfficientFeed BGibco Life TechnologiesCat #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)CorningCat # 10-13-CV
Corning 500 mL RPMI 1640CorningCat # 10-040-CV
Cy5 sprzężone anty-ludzkie IgG (H+L)Jackson ImmunoResearchCat # 709-175-149
GlutaMax-I (100X)Gibco Life TechnologiesCat # 35050-061
Zestaw HiPure Plasmid MaxiprepInvitrogenCat # K21007
HiTrap MabSelect SuRe KolumnaGE HealthcareCat # 11-0034-93
NaparTakara BioScienceSTO344
IRDye 800CW NHS EsterLI-CORCat # 929-70020
Isoflurane, USPCovetrusCat # 11695-6777-2
Lubrykant Maść do oczuOdśwież Lacri-LubeCat #4089
MatrigelCorningCat # 354234
Odczynnik do transfekcji PEIThermo FisherCat # BMS1003A
Kasety do dializy Slide-A-LyzerThermo ScientificCat # 66333
Steritop Vacuum FiltryMillipore ExpressCat #S2GPT02RE
Trypsin-EDTAGibco Life TechnologiesCat # 15400-054
Modele eksperymentalne: Linie komórkowe
Human: OVCAR-3American Type Culture CollectionATCC HTB-161
Człowiek: Komórki CHO-KStabilny przekształcona w naszym laboratoriumATCC CCL-61
Mysz: 4T1Miły prezent od dr Chipa Landena, UVA
Mysz: MC38Miły prezent od dr Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBCUwierzytelniony przez profilowanie
Mysz: MC38 hFOLR1Wygenerowany w naszym laboratorium (ten artykuł)
Modele eksperymentalne: Zwierzę
Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+EnvigoWiele rzędów
Myszy: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJJackson LaboratoryWielokrotne zamówienia
STR

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
  2. Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 1....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Therapeutic AntibodyAntibody PurificationProtein A ColumnFluorescent LabelingIn Vivo ImagingTumor DistributionTissue DistributionAntibody ConjugationCHO Cell CultureIVIS Imaging

Powiązane artykuły