Method Article

Profilowanie interakcji białko-RNA w całym transkryptomie poprzez sieciowanie krzyżowe i immunoprecypitację za pośrednictwem tandemowego oczyszczania FLAG-biotyna

DOI:

10.3791/60730

⸱

May 18th, 2020

 ,  , 
1Tsinghua-Peking Center for Life Sciences, School of Medicine and School of Life Sciences, Tsinghua University, 2Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy zmodyfikowany protokół CLIP-seq o nazwie FbioCLIP-seq z tandemowym oczyszczaniem FLAG-biotyna w celu określenia celów RNA białek wiążących RNA (RBP) w komórkach ssaków.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA i białka wiążące RNA (RBP) kontrolują wiele procesów biologicznych. Przestrzenne i czasowe ułożenie RNA i RBP leży u podstaw delikatnej regulacji tych procesów. Opracowano strategię o nazwie CLIP-seq (cross-linking and immunoprecipitation) w celu wychwytywania endogennych interakcji białko-RNA z sieciowaniem UV, a następnie immunoprecypitacją. Pomimo szerokiego zastosowania konwencjonalnej metody CLIP-seq w badaniu RBP, metoda CLIP jest ograniczona dostępnością wysokiej jakości przeciwciał, potencjalnymi zanieczyszczeniami z oczyszczonych RBP, wymogiem manipulacji izotopami oraz potencjalną utratą informacji podczas żmudnej procedury eksperymentalnej. Tutaj opisujemy zmodyfikowaną metodę CLIP-seq o nazwie FbioCLIP-seq wykorzystującą tandemowe oczyszczanie znacznika FLAG-biotyna. Dzięki oczyszczaniu tandemowemu i rygorystycznym warunkom mycia prawie wszystkie oddziałujące białka wiążące RNA są usuwane. W ten sposób RNA oddziałujące pośrednio, w których pośredniczą te oczyszczone RBP, są również redukowane. Nasza metoda FbioCLIP-seq umożliwia skuteczne wykrywanie bezpośrednich RNA związanych z białkami bez SDS-PAGE i procedur transferu błonowego w sposób wolny od izotopów i przeciwciał specyficznych dla białka.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA i białka wiążące RNA (RBP) kontrolują różnorodne procesy komórkowe, w tym splicing, translację, biogenezę rybosomów, regulację epigenetyczną i przejście losu komórki1,2,3,4,5,6. Delikatne mechanizmy tych procesów zależą od unikalnego przestrzennego i czasowego ułożenia RNA i RBP. Dlatego ważnym krokiem w kierunku zrozumienia regulacji RNA na poziomie molekularnym jest ujawnienie informacji o położeniu miejsc wiązania RBP.

Strategia określana jako cross-linking and immunoprecipitation (CLIP-seq) została opracowana w celu wychwytywania interakcji białko-RNA z sieciowaniem UV, a następnie immunoprecypitacji białka będącego przedmiotem zainteresowania7. Kluczową cechą metodologii jest indukcja kowalencyjnych wiązań krzyżowych między białkiem wiążącym RNA a jego bezpośrednio związanymi cząsteczkami RNA (w obrębie ~1 A) przez promieniowanie UV8. Ślady RBP można określić za pomocą grupowania znaczników CLIP i wywoływania szczytów, które zwykle mają rozdzielczość 30−60 nt. Alternatywnie, etap odwrotnej transkrypcji CLIP może prowadzić do indeli (insercji lub delecji) lub podstawień do miejsc sieciowania, co umożliwia identyfikację miejsc wiązania białek na RNA w rozdzielczości pojedynczego nukleotydu. Potoki, takie jak Novoalign i CIMS, zostały opracowane do analizy wyników sekwencjonowania o wysokiej przepustowości CLIP-seq8. Zaproponowano również kilka zmodyfikowanych metod CLIP-seq, w tym sieciowanie i immunoprecypitację z rozdzielczością poszczególnych nukleotydów (iCLIP), ulepszony CLIP (eCLIP), irCLIP oraz fotoaktywowane sieciowanie i immunoprecypitację wzmocnione rybonukleozydami (PAR-CLIP)9,10,11,12.

Pomimo szerokiego zastosowania tradycyjnych metod CLIP-seq w badaniu RBP, metody CLIP mają kilka wad. Po pierwsze, żmudna elektroforeza żelu denaturowanego i procedura przenoszenia membrany może prowadzić do utraty informacji i powodować ograniczoną złożoność sekwencji. Po drugie, metoda CLIP oparta na przeciwciałach swoistych dla białka może pociągnąć za sobą kompleks białkowy zamiast pojedynczego białka docelowego, co może prowadzić do fałszywie dodatnich interakcji białko-RNA z oczyszczonych RBP. Po trzecie, strategia oparta na przeciwciałach wymaga dużej ilości wysokiej jakości przeciwciał, co sprawia, że zastosowanie tych metod jest nieodpowiednie do badania RBP bez dostępnych przeciwciał wysokiej jakości. Po czwarte, tradycyjna metoda CLIP wymaga znakowanego radioaktywnie ATP do znakowania RNA związanych z białkiem.

Wysokie powinowactwo streptawidyny do biotynylowanych białek sprawia, że jest to bardzo skuteczne podejście do oczyszczania określonych białek lub kompleksów białkowych. Efektywna biotynylacja białek przenoszących sztuczną sekwencję peptydową przez ektopowo eksprymowaną bakteryjną ligazę biotyny BirA w komórkach ssaków sprawia, że jest to skuteczna strategia przeprowadzania oczyszczania biotyny in vivo13. Opracowaliśmy zmodyfikowaną metodę CLIP-seq o nazwie FbioCLIP-seq (F LAG-Biotin-mediated Cross-l inking and I mmunoprecipitation and Immuno p recipitation, a następnie sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości) przy użyciu tandemowego oczyszczania znacznika FLAG-biotyna14 (Rysunek 1). Dzięki oczyszczaniu tandemowemu i rygorystycznym warunkom mycia, prawie wszystkie oddziałujące RBP są usuwane (Rysunek 2). Rygorystyczne warunki prania pozwalają również na obejście SDS-PAGE i transferu membranowego, co jest pracochłonne i stanowi wyzwanie techniczne. Podobnie jak w przypadku eCLIP i irCLIP, metoda FbioCLIP-seq nie zawiera izotopów. Pominięcie etapów działania i transferu żelu pozwala uniknąć utraty informacji, utrzymuje autentyczne interakcje białko-RNA w stanie nienaruszonym i zwiększa złożoność biblioteki. Co więcej, wysoka skuteczność systemu znakowania sprawia, że jest to dobry wybór dla RBP bez dostępnych przeciwciał wysokiej jakości.

Tutaj podajemy krok po kroku opis protokołu FbioCLIP-seq dla komórek ssaków. Krótko mówiąc, komórki są sieciowane przez promieniowanie UV o długości 254 nm, a następnie następuje liza komórek i immunoprecypitacja FLAG (FLAG-IP). Następnie kompleksy białko-RNA są dalej oczyszczane przez wychwytywanie powinowactwa do biotyny, a RNA są fragmentowane przez częściowe trawienie MNazą. Następnie RNA związane z białkiem jest defosforylowane i ligowane łącznikiem 3'. Łącznik 5' RNA dodaje się po fosforylacji RNA za pomocą PNK i elucji przez trawienie proteinazy K. Po odwrotnej transkrypcji sygnały RNA związane z białkami są amplifikowane przez PCR i oczyszczane przez oczyszczanie w żelu agarozowym. Wybrano dwa RBP jako przykład wyniku FbioCLIP-seq. LIN28 jest dobrze scharakteryzowanym białkiem wiążącym RNA, zaangażowanym w dojrzewanie mikroRNA, translację białek i przeprogramowywanie komórek15,16,17. WDR43 to białko zawierające domenę WD40, które koordynuje biogenezę rybosomów, transkrypcję eukariotyczną i kontrolę pluripotencji embrionalnych komórek macierzystych14,18. Zgodnie z wcześniej zgłoszonymi wynikami dla LIN28 z CLIP-seq, FbioCLIP-seq ujawnia miejsca wiązania LIN28 na motywach "GGAG" w mikroRNA mir-let7g i mRNAs16,19 (Rysunek 3). WDR43 FbioCLIP-seq zidentyfikował również preferencję wiązania WDR43 z 5' zewnętrznymi transkrybowanymi przekładkami (5'-ETS) pre-rRNAs20 (Rysunek 4). Wyniki te potwierdzają wiarygodność metody FbioCLIP-seq.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa linii komórkowej

  1. Sklonuj interesujący nas gen do wektora PiggyBac pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA odnoszącego zainteresowanie]-(odpornego na higromycynę) plazmidu, który przenosi epitop biotyny FLAG13,21, aby wyrazić znacznik FLAG-biotyna połączony RBP (FBRBP).
  2. Kotransfekcja wektora wyrażającego RBP FBz wektorem pBase do linii komórkowej wyrażającej enzym BirA22.
    UWAGA: W tym badaniu gen FBRBP został transfekowany do mysich embrionalnych komórek macierzystych (mESC) przenoszących zintegrowany wektor ekspresyjny BirA21. Alternatywnie, wektor ekspresji RBP FBmoże być kotransfekowany do komórek z pBase i pPiggyBac-BirA-V5 razem.
  3. Hodować komórki w mESC na żelatynizowanych szalkach i utrzymywać w pożywce hodowlanej mES (tabela materiałów) w 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Wybrać transfekowane komórki z higromycyną b (100 μg/ml) przez 1 tydzień.
  4. Po wyborze leku należy pobrać komórki za pomocą bufora ładującego SDS (Tabela 1) i użyć Western blot 23, aby potwierdzić znakowanie i ekspresję genu odpowiednio przeciwciałem FLAG i streptawidyną-HRP.

2. Sieciowanie

  1. Płytka ~3 x 106 mES komórek w 10 cm płytce 1 dzień przed eksperymentem, tak aby komórki rosły do 70−90% konfluencji po pobraniu (~5−10 milionów komórek na próbkę).
  2. Usuń podłoże za pomocą próżni. Potraktuj komórki 2 ml 0,25% trypsyny-EDTA przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT) i wygadź trypsynę przez 4 ml świeżej pożywki mESC. Przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przez odwirowanie przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
  3. Zawieś komórki za pomocą 4 ml zimnego PBS i umieść komórki z powrotem na 10-centymetrowej płytce w celu usieciowania. Sieciować ogniwa za pomocą promieniowania światłem UV o długości fali 254 nm (ustawić sieciownik UV na parametr 400 mJ/cm2).
    UWAGA: W przypadku monowarstw komórkowych komórki można usieciować światłem UV bezpośrednio na płytce przed leczeniem trypsyną.
  4. Przenieś usieciowane komórki do probówki o pojemności 15 ml. Wirować przez odwirowanie w stężeniu 300 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant.
    UWAGA: Usieciowany osad komórkowy można przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.

3. Przygotowanie lizatu komórkowego

  1. Lizować komórki za pomocą 500 μl buforu płuczącego A (Tabela 1) świeżo uzupełnionego 1 mM DTT, 1 mM PMSF, koktajlem inhibitorów proteazy 1/500 i inhibitorem RNazy 400 U/mL. Przenieś komórki do probówki 1,5 ml bez RNaz. Inkubować komórki przez 30−60 minut na wirniku z delikatnymi obrotami w temperaturze 4 °C.
  2. Potraktować lizat 30 μl DNazy I w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Zatrzymać reakcję, dodając 4 μl 0,5 M EDTA. Odwirować nierozpuszczalny osad o objętości 12 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C i przenieść supernatant do nowej, wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Do natychmiastowego użycia przechowywać na lodzie. Jeżeli supernatant nie zostanie natychmiast użyty, należy przechowywać go do czasu użycia w temperaturze -80 °C.

4. Przygotowanie koralików FLAG

  1. Dodaj 40 μl kulek FLAG zawiesiny na próbkę do świeżej probówki o pojemności 1,5 ml.
  2. Szybko umyj kulki 0,5 ml lodowatego buforu do płukania A i odwiruj 3 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
  3. Powtórz krok 4.2 raz. Obracać kulki o gramaturze 3 000 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Ostrożnie wyjąć bufor za pomocą wąskiej końcówki do pipety. Unikaj usuwania koralików.

5. Immunoprecypitacja

  1. Przenieś lizat komórkowy z kroku 3.2 do wstępnie zrównoważonych kulek FLAG. Delikatnie obrócić wszystkie próbki na wytrząsarce rolkowej w temperaturze 4 °C. Inkubować kulki FLAG z lizatem przez 2-4 godziny lub przez noc.
  2. Odwirować kulki przez 2 minuty przy 3 000 x g i usunąć supernatant.
  3. Przepłukać kulki 0,5 ml wstępnie schłodzonego buforu A do płukania przez inkubację przez 5 minut w rotatorze w temperaturze 4 °C, odwirować kulki z 3 000 x g przez 2 minuty i usunąć supernatant. Powtórz pranie 1x.
  4. Powtórzyć płukanie 2 razy, jak opisano w kroku 5.3, z 0,5 ml wstępnie schłodzonego buforu do płukania B (Tabela 1).

6. Elucja z 3x peptydem FLAG

  1. Przygotować 3x roztwór elucyjny FLAG, rozpuszczając 1 mg peptydu 3x FLAG w 5 ml buforu płuczącego A do końcowego stężenia 200 ng / ml.
  2. Obracaj koraliki FLAG z kroku 5.4 za pomocą 3 000 x g przez 2 minuty. Ostrożnie usuń supernatant. Upewnij się, że większość supernatantu została usunięta za pomocą wąskiej końcówki pipety.
  3. Dodać 200 μl 3x roztworu elucyjnego FLAG do każdej próbki. Inkubować próbki, delikatnie obracając je przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Obracać kulki FLAG przez 2 minuty przy 3 000 x g. Przenieść supernatanty do świeżych probówek.
  4. Powtórzyć elucję 2 razy, jak opisano w krokach 6.2 i 6.3 i połączyć eluenty razem. Zaoszczędź 5% eluentów do analizy Western blot lub barwienia srebrem, aby sprawdzić skuteczność FLAG-IP.

7. Przygotowanie kulek streptawidyny

  1. Przygotować 50 μl zawiesiny z kulkami streptawidyny dla każdej próbki. Zbieraj kulki za pomocą stojaka magnetycznego przez 30 s i usuń supernatant za pomocą końcówki pipety.
  2. Szybko umyj koraliki 0,5 ml lodowatego buforu do mycia A i zbieraj kulki za pomocą stojaka magnetycznego przez 30 sekund.
  3. Powtórzyć pranie 1x. Usunąć supernatant po umyciu.

8. Oczyszczanie powinowactwa do biotyny

  1. Przenieść zebrane eluenty z kroku 6.4 do kulek streptawidyny z kroku 7.3 i delikatnie obracać próbki w temperaturze 4 °C przez 1-3 godziny lub przez noc.
  2. Zbieraj kulki za pomocą stojaka magnetycznego przez 30 s i usuń supernatant. Przemyć kulki 2x 500 μl buforu do przemywania C (tabela 1) delikatnie obracając w temperaturze RT przez 5 minut.
  3. Zbierz koraliki za pomocą podstawki magnetycznej i usuń supernatant. Przemyć kulki 2x 500 μl buforu płuczącego D (tabela 1), obracając w pozycji RT przez 5 minut.
  4. Zbierz koraliki za pomocą podstawki magnetycznej i usuń supernatant. Szybko umyj kulki 2x za pomocą 500 μl lodowatego buforu PNK (Tabela 1).

9. Częściowe trawienie RNA

  1. Wykonać10-krotne 5-krotne rozcieńczenie MNazy za pomocą buforu reakcyjnego MNazy (Tabela 1). Dodać 100 μl roztworu MNazy do każdej próbki. Wirować kulki w temperaturze 37 °C za pomocą mieszalnika termicznego ustawionego na 1 200 obr./min (5 s biegu, 30 s zatrzymania) przez 10 minut, zbierać kulki za pomocą stojaka magnetycznego przez 30 s i usuwać supernatant.
    UWAGA: Stężenie MNazy powinno być zoptymalizowane dla różnych białek wiążących RNA. Stężenie MNazy, które może trawić RNA na fragmenty 30-50 nt (określone przez wielkość insertu końcowej biblioteki) jest optymalne.
  2. Szybko umyj kulki 2x 500 μl lodowatego buforu PNK+EGTA (Tabela 1). Zbierz kulki za pomocą podstawki magnetycznej i usuń supernatant między każdym etapem mycia.
  3. Przemyć kulki 2x 500 μl buforu myjącego C, delikatnie obracając przez 5 minut w temperaturze suchej masy. Następnie szybko umyj kulki 2x 500 μl lodowatego buforu PNK.

10. Defosforylacja RNA

  1. Przygotować mieszankę reakcyjną fosfatazy jelita cielęcego () z 8 μl 10x buforu (tabela materiałów), 3 μl enzymu i 69 μl wody. Całkowita objętość wynosi 80 μl na reakcję.
  2. Zbierz koraliki za pomocą podstawki magnetycznej i wyjmij bufor. Dodaj mieszaninę reakcyjną do kulek. Wirować kulki w temperaturze 37 °C za pomocą mieszarki termicznej ustawionej na 1 200 obr./min (5 s bieg, 30 s zatrzymania) przez 10 min.
  3. Szybko umyj kulki 2x za pomocą 500 μl lodowatego buforu PNK+EGTA. Szybko umyj kulki 2x za pomocą 500 μl lodowatego buforu PNK.

11. 3' podwiązanie łącznika

  1. Przygotuj 3' mieszankę łącznika z 4 μL 20 μM 3' łącznika, 4 μL 10x buforu ligazy T4 RNA, 4 μL 50% PEG8000, 2 μL ligazy T4 RNA 2 (obcięte) i 26 μL wody. Całkowita objętość wynosi 40 μl na reakcję.
  2. Zbierz koraliki z kroku 10.3 za pomocą podstawki magnetycznej i wyjmij bufor. Dodaj 40 μl 3-calowej mieszanki ligacyjnej łącznika do kulek. Wirować kulki w temperaturze 16 °C za pomocą mieszarki termicznej ustawionej na 1 200 obr./min (5 s biegu, 30 s zatrzymania) przez 3 godziny lub przez noc.
  3. Szybko umyj kulki 2x za pomocą 500 μl lodowatego buforu PNK+EGTA. Szybko umyj kulki 2x za pomocą 500 μl lodowatego buforu PNK.

12. Leczenie PNK

  1. Przygotuj mieszaninę PNK z 4 μl 10x buforu PNK, 2 μl enzymu T4 PNK, 1 μl 10 mM ATP i 33 μl wody. Całkowita objętość wynosi 40 μl na reakcję.
  2. Zbierz koraliki za pomocą podstawki magnetycznej i wyjmij bufor. Dodaj 40 μl mieszanki PNK do kulek. Delikatnie mieszać kulki w temperaturze 37 °C za pomocą mieszarki termicznej ustawionej na 1 200 obr./min (5 s biegu, 30 s zatrzymania) przez 10 min.
  3. Szybko umyj kulki za pomocą 500 μl lodowatego buforu PNK+EGTA.
  4. Szybko umyj kulki 500 μl lodowatego buforu PNK. Zaoszczędź 5% koralików do analizy barwienia zachodniego lub srebrem, aby potwierdzić skuteczność immunoprecypitacji.

13. Izolacja RNA

  1. Zbierz koraliki z kroku 12.4 za pomocą podstawki magnetycznej i wyjmij bufor. Dodać 200 μl buforu do trawienia proteinazy K (Tabela 1). Wirować kulki przez 30 minut w temperaturze 37 °C za pomocą mieszarki termicznej ustawionej na 1 200 obr./min (5 s biegu, 30 s zatrzymania). Magnetycznie odizoluj koraliki i weź supernatant do eksperymentu.
  2. Dodać 400 μl odczynnika do izolacji RNA (tabela materiałów) do supernatantu z kroku 13.1, dokładnie wymieszać i inkubować na lodzie przez 5 minut. Dodać 80 μl chloroformu i dokładnie wymieszać, a następnie inkubować na lodzie przez 5 min. Wirować z 12 000 x g przez 10 min 4 °C.
    UWAGA: Ten krok należy wykonać w okapie chemicznym.
  3. Pobrać sklarat (~500 μl) i dodać dwie objętości mieszaniny izopropanolu i etanolu (1:1), 1/10 objętości 3 M octanu sodu (pH = 5,5) i 1 μl glikogenu. Zamrażać w temperaturze -20 °C przez 2 godziny. Wirować w temperaturze 4 °C z 12 000 x g przez 20 min.
  4. Umyj pellet 2x lodowatym 70% etanolem. Wirować granulkę w temperaturze 4 °C z 12 000 x g przez 5 minut. Usunąć sklarowany osad i wysuszyć osad. Rozpuścić RNA w 5 μl H2O wolnego od RNaz.

14. 5' Ligacja łącznika RNA

  1. Wykonaj mieszaninę ligacji 5' RNA z 1 μl 10x buforu ligazy T4 RNA, 0,5 μl BSA (1 μg/μL), 1 μl 10 mM ATP, 1 μl inhibitora RNazy i 0,5 μl ligazy T4 RNA. Całkowita objętość wynosi 4 μL na reakcję.
  2. Dodać 1 μl łącznika RNA 5' 20 μM do RNA z kroku 13.4, zdenaturować RNA przez ogrzewanie w temperaturze 70 °C przez 2 minuty i natychmiast schłodzić na lodzie.
  3. Dodaj mieszankę ligacji 5' RNA do RNA z kroku 14.2. Inkubować w temperaturze 16 °C przez noc.

15. Odwrotna transkrypcja

  1. Oczyść RNA zgodnie z opisem w sekcji 13 i rozpuść RNA w 11,5 μl wody wolnej od RNaz.
  2. Dodać 1 μl 10 μM startera do odwrotnej transkrypcji do oczyszczonego RNA, ogrzewać w temperaturze 70 °C przez 2 minuty i natychmiast schłodzić na lodzie.
  3. Przygotuj mieszaninę odwrotnej transkrypcji z 4 μl 5x buforu do odwrotnej transkrypcji, 1 μl 10 mM dNTP, 1 μl 0,1 M DTT, 1 μl inhibitora RNazy i 0,5 μl odwrotnej transkryptazy (tabela materiałów). Całkowita objętość wynosi 7,5 μl na reakcję.
  4. Dodać 7,5 μl mieszaniny odwrotnej transkrypcji do RNA, inkubować w temperaturze 50 °C przez 30 minut i zatrzymać reakcję przez inkubację w temperaturze 70 °C przez 10 minut. Pozostawić w temperaturze 4 °C.

16. Amplifikacja PCR

  1. Przygotuj mieszaninę do amplifikacji PCR z 15 μl 2x głównej mieszanki PCR (tabela materiałów), 5 μl cDNA z kroku 15.4, 0,6 μl 10 μM startera do przodu 1 (tabela 2), 0,6 μl 10 μM startera odwrotnego 1 (tabela 2) i 8,8 μlH2O. Całkowita objętość wynosi 30 μL.
  2. Amplifikuj cDNA w następujących ustawieniach: 98 °C 30 s, 98 °C 10 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s (powtórz kroki 2−4 przez 15−20 cykli), 72 °C 2 min i przytrzymaj w temperaturze 4 °C. Uruchom produkt PCR na 2-3% żelu agarozowym. Wytnij DNA o wartości ~100−150 pz, wyekstrahuj DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji żelem (tabela materiałów) i wymyj DNA 20 μl wody.
  3. Pobrać 3 μl oczyszczonego produktu PCR, amplifikować starterem do przodu 2 (tabela 2) i starterem odwrotnym 2 (starter indeksowy; Tabela 2) Jak opisano w kroku 16.2 dla pięciu cykli w celu wprowadzenia sekwencji indeksów. Oczyść produkt PCR zgodnie z opisem w kroku 16.2.
  4. Sekwencjonowanie biblioteki za pomocą platformy sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.

17. Analiza bioinformatyczna

  1. Przeprowadź analizę danych za pomocą komercyjnych programów, jak opisano wcześniej8.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematyczne przedstawienie procedury FbioCLIP-seq jest pokazane w Rysunek 1. W porównaniu z jednoetapowym oczyszczaniem powinowactwa za pośrednictwem FLAG lub streptawidyny, oczyszczanie tandemowe FLAG-biotyna usunęło prawie wszystkie oczyszczone białka, unikając zanieczyszczenia pośrednich interakcji białko-RNA (Ryc. 2). Reprezentatywne wyniki dla FbioCLIP-seq dla LIN28 i WDR43 są przedstawione na Rysunek 3 i

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj wprowadzamy zmodyfikowaną metodę CLIP-seq o nazwie FbioCLIP-seq, wykorzystującą system podwójnego znakowania FLAG-biotyna do przeprowadzania tandemowego oczyszczania kompleksów białko-RNA. Wykazano, że system podwójnego znakowania FLAG-biotyna jest skuteczny w identyfikacji interakcji białko-białko i białko-DNA13,21. Tutaj pokazujemy wysoką specyficzność i wygodę tego systemu w identyfikacji RNA oddziałujących z białkami. Dzięki oczyszczaniu tand...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wsparcie grantowe pochodzi z Narodowego Programu Badań Podstawowych Chin (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31630095) oraz Centrum Nauk Przyrodniczych na Uniwersytecie Tsinghua.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
UV crosslinkerUVPHL-2000 HybrilLinker
Koraliki oczyszczające affinity
ANTI-FLAG KoralikiSigma-AldrichA2220
StreptavidinInvitrogen112.06D
Reodczynniki
10x PBSGibco70013032
3 M NaOAcAmbionAM9740
3 x peptyd FLAGSigma-AldrichF4799
ATPSigma-AldrichA6559
Chlorek wapnia (CaCl2)Sigma-AldrichC1016
NEBM0290Sznajduje się w tym samym pakiecie.
DTTSigma-AldrichD0632
EDTASigma-AldrichE9884
EGTASigma-AldrichE3889
Zestaw do oczyszczania żeluQIAGEN28704
GlikogenAmbionAM9510
Chlorek magnezu (MgCl2)Sigma-Aldrich449172
MNazaNEBM0247S
NP-40AmrescoM158-500ML
PMSFSigma-Aldrich10837091001
Porteinase KTAKARA9033
Koktajl inhibitorów proteazySigma-AldrichP8340
Q5 High-Fidelity 2X Master MixNEB0492S
odwrócona trankryptotaza ( SupperScriptIII)Invitrogen18080093
odczynnik do izolacji RNA (Trizol)Invitrogen15596018
Inhibitor RNazyThermoFisherEO0381
RNaseOUTInvitrogen10777019
RQ1 DnasePromegaM6101
SDSSigma-Aldrich1614363
Chlorek soduSigma-AldrichS9888
Deoksycholan soduSigma-AldrichD6750
T4 PNKNEBM0201SBufor PNK znajduje się w tym samym opakowaniu.
Ligi RNA T4BuforEL0021T4 i BSA znajdują się w tym samym opakowaniu.
Ligaza RNA T42, obciętyNEBM0242ST4 i 50% PEG są w tym samym pakiecie.
Trypsin-EDTAThermoFisher25200072
MocznikSigma-Aldrich208884
mESC pożywka hodowlana
DMEM (80%)Gibco11965126
2-merkaptoetanolGibco21985023
FCS (15%)Hyclon
Glutamax (1%)Gibco35050061
LIFoczyszczone białko rekombinowane; 10 000-krotne rozcieńczenie
NEAA (1%)Gibco
1%)MiliporES-008-D
Penicylina-Streptomycyna (1%)Gibco15140122
Kit
DNA zestaw do ekstrakcji żeluQIAGEN28704
Bufor ligazy RNA ThermoFisher bufor ligazy RNA Mieszanka nukleozydów 11140050 (

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
  2. Guallar, D., et al. RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells. Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).
  3. Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3' Ends. Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).
  4. Wei, C., et al. RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes. Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).
  5. Kim, D. S., et al. Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21. Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).
  6. Yao, R. W., et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus. Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).
  7. Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
  8. Moore, M. J., et al. Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis. Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).
  9. Konig, J., et al. iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638(2011).
  10. Zarnegar, B. J., et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions. Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).
  11. Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
  12. Hafner, M., et al. PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), e2034(2010).
  13. de Boer, E., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).
  14. Bi, X., et al. RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control. Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).
  15. Heo, I., et al. TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation. Cell. 138 (4), 696-708 (2009).
  16. Cho, J., et al. LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
  17. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  18. Zhao, C., et al. Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development. PLoS Genetics. 10 (1), 1004074(2014).
  19. Wilbert, M. L., et al. LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance. Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).
  20. Hunziker, M., et al. UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly. Nature Communications. 7, 12090(2016).
  21. Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).
  22. Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).
  23. Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
  24. Aktas, T., et al. DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).
  25. Xu, Q., et al. Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59681(2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

FLAG Biotin CLIP seqProtein RNA InteractionsCross Linking ImmunoprecipitationTandem PurificationRNA Binding ProteinsUV Cross LinkingStreptavidin BeadsFLAG BeadsRNA IsolationMotif Analysis

Related Articles