Method Article

Lokalizacja i kwantyfikacja begomowirusów w tkankach mączlika metodą immunofluorescencji i ilościowego PCR

DOI:

10.3791/60731

⸱

February 8th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Ministry of Agriculture Key Laboratory of Molecular Biology of Crop Pathogen and Insects, Institute of Insect Sciences, Zhejiang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę immunofluorescencji i ilościowego PCR do lokalizacji i kwantyfikacji begomowirusów w tkankach owadów. Protokół immunofluorescencji może być stosowany do kolokalizacji białek wirusowych i wektorowych. Ilościowy protokół PCR można rozszerzyć w celu ilościowego oznaczania wirusów w całych ciałach mączlika i roślinach zakażonych wirusem.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Begomowirusy (rodzaj Begomovirus, rodzina Geminiviridae) są przenoszone przez mączliki z kompleksu Bemisia tabaci w sposób trwały, krążący. Biorąc pod uwagę rozległe szkody wyrządzane przez begomowirusy w produkcji roślinnej na całym świecie, konieczne jest zrozumienie interakcji między begomowirusami a ich wektorem mączlika. W tym celu kluczowe znaczenie ma lokalizacja i kwantyfikacja wirusa w tkankach wektora. Tutaj, używając jako przykładu wirusa żółtej kędzierzawości liści pomidora (TYLCV), opisujemy szczegółowy protokół lokalizacji begomowirusów w jelicie środkowym mączlika, pierwotnych gruczołach ślinowych i jajnikach za pomocą immunofluorescencji. Metoda opiera się na zastosowaniu specyficznych przeciwciał przeciwko białku płaszcza wirusowego, przeciwciał drugorzędowych znakowanych barwnikiem oraz mikroskopu konfokalnego. Protokół może być również stosowany do kolokalizacji białek begomowirusa i mączlika. Dalej opisujemy protokół oznaczania ilościowego TYLCV w jelicie środkowym mączlika, pierwotnych gruczołach ślinowych, hemolimfie i jajnikach za pomocą ilościowego PCR (qPCR). Stosując startery specjalnie zaprojektowane dla TYLCV, protokoły oznaczania ilościowego pozwalają na porównanie ilości TYLCV w różnych tkankach mączlika. Opisany protokół jest potencjalnie przydatny do ilościowego oznaczania begomowirusów w ciele mączlika i rośliny zakażonej wirusem. Protokoły te mogą być wykorzystywane do analizy szlaku krążenia begomowirusów w mączliku lub jako uzupełnienie innych metod badania interakcji mączlik-begomowirus.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich dziesięcioleciach begomowirusy (rodzaj Begomovirus, rodzina Geminiviridae) spowodowały poważne szkody w produkcji wielu roślin warzywnych, włóknistych i ozdobnych na całym świecie1. Begomowirusy są przenoszone w sposób trwały przez mączlika Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae), który jest złożonym gatunkiem zawierającym ponad 35 gatunków kryptycznych2,3. Begomowirusy mogą bezpośrednio lub pośrednio wpływać na fizjologię i zachowanie mączlików, takich jak płodność4, długowieczność4 i preferencje gos....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mączlik, wirus, rośliny i nabycie wirusa

  1. Mączliki tylne (MEAM1) na bawełnie (Gossypium hirsutum cv. Zhemian 1793) w klatkach odpornych na owady w szklarni w temperaturze 26 ± 1 °C przy cyklu 14:10 światło:ciemność i wilgotności względnej 60 ± 10%.
  2. Wykonaj konwencjonalny PCR oparty na genie mitochondrialnej oksydazy cytochromowej I mączlika, aby określić czystość populacji mączlików.
    1. Zbierz 20 dorosłych mączlików i przenieś je pojedynczo do probówki PCR zawierającej 30 μl buforu do lizy (10 mM Tris, pH = 8,4, 50 mM KCl, 0,45% [wt/vol] Tween-20, 0,2% [wt/vol] żelatyna, 0,45% [vol/vol] Nonidet P 40, 60 g/mL Proteinaza K).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mączliki MEAM1 kompleksu B. tabaci i TYLCV zostały użyte jako przykład do opisania procedur. Przegląd procedur immunofluorescencji i kwantyfikacji wirusów opisanych w tym manuskrypcie jest pokazany na Rysunek 1. Rysunek 2 pokazuje reprezentatywne wyniki wykrywania immunofluorescencji barwienia TYLCV i DAPI w PSG, jelicie środkowym i jajnikach, wskazując, że TYLCV gromadziło się więcej w PSG i jelicie środkowym, a mniej w jajnikach. .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół lokalizacji i kwantyfikacji begomowirusa w tkankach jego wektora mączlika za pomocą immunofluorescencji i qPCR. Sekcja stanowi pierwszy krok do lokalizacji i ilościowego określenia wirusa w tkankach mączlika. Ciało mączlika ma około 1 mm długości, co oznacza, że tkanki są niezwykle małe i trudno je wypreparować. Poza tym istnieją silne połączenia między tkankami. Na przykład jajniki są ściśle połączone z bakteriocytami, co utrudnia ich izolację. Tutaj, biorąc pod uwagę charakterystykę i lokalizac.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Key Research and Development Program (numer grantu: 2017YFD0200600), fundusz przeznaczony na Chiński System Badań Rolniczych (numer grantu: CARS-23-D07) oraz Fundację Billa i Melindy Gatesów (ID Inwestycji OPP1149777). Dziękujemy prof. Jian-Xiang Wu za dostarczenie przeciwciał przeciwko TYLCV CP.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4% ParaformaldehydMultiSciencesF0001
4',6-diamidyno-2-phé nyindol (DAPI)Abcamab104139
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)MultiSciencesA3828
CFX Connect System wykrywania PCR w czasie rzeczywistymBio-RAD185-5201
Mikroskopia konfokalnaZeissLSM800
Dylight 549-koza anty-mysiaEarthoxE032310-02Przeciwciało drugorzędowe
Monoklonalne przeciwciało (MAb 1C4)Przeciwciało pierwszorzędowe
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Sangon BiotechB548119-0500
Mikroskop stereoskopowyZeissStemi 2000-C
TB zielony premiks Ex Taq (Tli RNase H Plus)TaKaRaRR820AqPCR master mix
TermocyklerThermofisherA41182
TissuelyzerShaghai jingxinTissuelyser-48
Triton-X-100BBI nauki przyrodnicze9002-93-1
Tween 20BBI nauki przyrodnicze9005-64-5

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rojas, M. R., et al. World management of geminiviruses. Annual Review of Phytopathology. 56, 637-677 (2018).
  2. De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Begomovirus LocalizationWhitefly Tissue DissectionImmunofluorescence ProtocolQuantitative PCRConfocal MicroscopyTYLCV DetectionStromal Vascular FractionHemolymph CollectionPrimary Salivary GlandsVirus Quantification

Related Articles