Artykuł metodologiczny

Odkrywanie celów regulatorowych CsgD w biofilmie Salmonelli przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq)

9.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60736

⸱

18 stycznia 2020

 ,  , 
1Vaccine and Infectious Disease Organization-International Vaccine Centre, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, University of Saskatchewan, 3Department of Cell Biology and Genetics, Shenzhen University Health Science Center

W tym artykule

Podsumowanie

Immunoprecypitacja chromatyny w połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji (ChIP-seq) to metoda stosowana do ustalania interakcji między czynnikami transkrypcyjnymi a kontrolowanymi przez nie sekwencjami genomowymi. Protokół ten przedstawia techniki wykonywania sekwencji ChIP-seq z biofilmami bakteryjnymi, na przykładzie biofilmu bakteryjnego Salmonella enterica Typhimurium serovar

.

Streszczenie

Immunoprecypitacja chromatyny, a następnie sekwencjonowanie (ChIP-seq) to technika, która może być wykorzystana do odkrycia celów regulacyjnych czynników transkrypcyjnych, modyfikacji histonów i innych białek związanych z DNA. Dane ChIP-seq mogą być również wykorzystane do znalezienia zróżnicowanego wiązania czynników transkrypcyjnych w różnych warunkach środowiskowych lub typach komórek. Początkowo ChIP wykonywano poprzez hybrydyzację na mikromacierzy (chip ChIP); jednak ChIP-seq stał się preferowaną metodą dzięki postępowi technologicznemu, zmniejszeniu barier finansowych dla sekwencjonowania i ogromnym ilościom wysokiej jakości danych wyjściowych. W niniejszym protokole opisano techniki wykonywania sekwencji ChIP-seq z biofilmami bakteryjnymi, które są głównym źródłem uporczywych i przewlekłych infekcji. ChIP-seq przeprowadza się na biofilmie serowarycznym Typhimurium i komórkach planktonowych Salmonella enterica, celując w główny regulator biofilmu, CsgD, w celu określenia różnicowego wiązania w dwóch typach komórek. Tutaj demonstrujemy odpowiednią ilość biofilmu do zbioru, normalizując do planktonowej próbki kontrolnej, homogenizując biofilm w celu uzyskania dostępu do środka sieciującego i wykonując rutynowe kroki sekwencjonowania ChIP, aby uzyskać wysokiej jakości wyniki sekwencjonowania.

Wprowadzenie

Biofilmy bakteryjne, strukturalne agregaty komórek osadzone w samodzielnie wyprodukowanej matrycy, są odporne na wysuszenie, antybiotyki i reakcje immunologiczne gospodarza1. W związku z tym powodują uporczywe i przewlekłe infekcje i stanowią wyjątkowe wyzwanie dla naukowców ze względu na ich rozwiązania w zakresie przetrwania i przenoszenia. Stwierdzono, że serowar Salmonella enterica Typhimurium (S. Typhimurium) tworzy fenotypowo heterogeniczne populacje agregatów biofilmu, które są odporne na wysuszanie i antybiotyki, oraz komórek planktonowych, które wyrażają czynniki wirulencji w czystej kulturze pod wpływem stresu środowiskowego (28 °C, ograniczające składniki odżywcze)2. Te dwa typy komórek powstają w wyniku bistabilnej ekspresji głównego regulatora biofilmu, CsgD3. Postawiliśmy hipotezę, że może to być strategia zabezpieczająca przed Salmonellą, w której komórki planktonowe uczestniczą w krótkotrwałej transmisji, a komórki biofilmu są w stanie przetrwać w środowisku przez długi czas, dopóki nie pojawi się okazja do zainfekowania nowego gospodarza2,4. Wiele elementów regulacyjnych, które kontrolują wyrażenie operonu csg, jest dobrze scharakteryzowanych5. Jednak poza adrA i csg operon6, znanych jest kilka celów regulacyjnych CsgD. Zidentyfikowanie sieci regulacyjnej CsgD pomogłoby nam lepiej zrozumieć cykl życiowy Salmonelli i rolę, jaką biofilmy odgrywają w przenoszeniu.

Immunoprecypitacja chromatyny, po której następuje sekwencjonowanie wysokoprzepustowe (ChIP-seq) to potężna technika in vivo do identyfikacji całego genomu interakcji białko-DNA i dostarcza informacji na temat procesów regulacyjnych obejmujących czynniki transkrypcyjne, modyfikacje histonów lub nukleosomy7. Nowsze badania wykorzystały tę technikę do oceny różnicowego wiązania białek między warunkami wzrostu a typami komórek8. W immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) fragmenty DNA z oddziałującymi białkami są wzbogacane poprzez selekcję przeciwciał białek docelowych. Komórki są zbierane, a białka wiążące DNA są sieciowane z DNA in vivo poprzez obróbkę sieciującą formaldehydem. Komórki są poddawane lizie, uwalniając zawartość komórki, a chromatyna jest ścinana na fragmenty o długości około 200–600 pz7. Fragmenty DNA związane z białkiem docelowym są immunoprecypitowane za pomocą przeciwciała i izolowane przez de-sieciowanie, a następnie trawienie białek9. Te fragmenty DNA reprezentują miejsca wiązania białek dopasowane przez hybrydyzację do mikromacierzy (chip ChIP) lub przez głębokie sekwencjonowanie i mapowanie do sekwencji genomu10,11. Chociaż eksperymenty z chipami ChIP dostarczają odpowiednich danych regulacyjnych, są one ograniczone ze względu na użycie drogich sond, a także hybrydyzację i stronniczość macierzy12. ChIP-seq ma większy zakres dynamiki ze zwiększoną rozdzielczością i pokryciem nukleotydów, lepszym stosunkiem sygnału do szumu i mniejszą liczbą artefaktów w porównaniu do ChIP-chip7.

ChIP został użyty do analizy regulacji Sfh i OmpR w Salmonella serowar Typhimurium13,14, regulacja AphA wyczuwająca kworum w Vibrio alginolyticus15, regulacja RpoS w Escherichia coli16, regulacja EspR regulatora wirulencji w Mycobacterium tuberculosis17, potencjalne cyklazy diguanylate poprzez regulację AmrZ w Pseudomonas aeruginosa18, a także regulację VraSR w Staphylococcus aureus19. Opisane eksperymenty bakteryjne ChIP-seq rozpoczynają się od hodowli komórek w płynnych pożywkach i zbierania w postaci pojedynczej komórki. Jednak analiza biofilmów i odpowiadająca im regulacja genów stanowi nowy zestaw wyzwań w celu wygenerowania skutecznego protokołu ChIP-seq. W tym protokole ChIP-seq służy do znajdowania zróżnicowanych celów regulacyjnych CsgD, głównego regulatora biofilmu S. Typhimurium w typach komórek biofilmu i planktonu. Protokół ten opisuje techniki stosowane do określania odpowiednich ilości biofilmu dla sekwencji ChIP, zbierania biofilmu z hodowli kolbowej, normalizacji biofilmu i próbek kontrolnych pojedynczych komórek, homogenizacji biofilmu i całkowitego immunoprecypitacji. Będzie to przydatne do badania celów regulacyjnych w biofilmach bakteryjnych i może być dostosowane do wielu gatunków.

Protokół

1. Wzrost komórek w hodowli kolbowej

  1. Z zamrożonych zapasów wysiać kreskami szczepy Salmonella serovar Typhimurium na agar LB (20 mL pożywki stałej w szalce Petri 100 mm) z odpowiednim antybiotykiem i inkubować w temperaturze 37 °C przez 16–20 h w celu uzyskania kolonii izolowanych.
  2. Zaszczepić 5 mL bulionu LB zawierającego odpowiedni antybiotyk w borokrzemianowej probówce do hodowli o wymiarach 25 mm x 150 mm, wykorzystując 1–3 kolonie z szalek z kroku 1.1. Inkubować w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 200 rpm przez 7 h.
  3. Zmierzyć OD600 hodowli w bulionie za pomocą spektrofotometru. Alikwot hodowli rozcieńczyć 1:4 w PBS w kuwecie 2 mL i zmierzyć absorbancję przy 600 nm. Stwierdzono, że krytycznym czynnikiem na tym etapie jest czas wzrostu. Wartości OD służą do normalizacji hodowli w celu dostarczenia pożądanej liczby komórek w kroku 1.4.
  4. Dodać objętość hodowli komórkowej odpowiadającą 1,0 OD600 (tj. ~109 komórek) do kolby Erlenmeyera zawierającej 100 mL 1% tryptony z odpowiednim antybiotykiem. Inkubować w temperaturze 28 °C przy wytrząsaniu z prędkością 200 rpm przez 13 h.
    Uwaga: Komórki biofilmu będą widoczne jako zagregowane płatki, natomiast pojedyncze komórki planktoniczne znajdują się w zmętniałym medium.

2. Pozyskiwanie wolnego od komórek kondycjonowanego 1% tryptonu

  1. Pobrać hodowlę z kolby w celu przygotowania bezkomórkowego pożywienia kondycjonowanego (1% tryptony). Kilkukrotnie pipetować hodowlę z kolby w celu wymieszania przed przeniesieniem do probówki do wirowania.
  2. Wirować przy 12,000 x g przez 10 min w temperaturze 10 °C, aby z pelletować wszystkie komórki.
  3. Zlać nadsącz do jednostki filtrującej 0,2 µm, przefiltrować próżniowo i przelać do nowej probówki.
    Uwaga: Agregaty biofilmu są adhezyjne w konwencjonalnych roztworach (np. PBS) i będą przywierać do ścianek probówek oraz końcówek pipet. Ponieważ ułatwia to manipulację, używamy pożywienia kondycjonowanego (1% tryptony) do wstępnego przenoszenia biofilmu, a bezpośrednio przed sieciowaniem (krok 4.5) stosujemy ciepły PBS, aby usunąć wszelkie substraty sieciujące białka, które mogłyby znajdować się w pożywce.

3. Oddzielanie biofilmu i komórek planktonicznych z kultur w kolbach2

  1. Za pomocą sterylnej pipety 25 mL przenieś kulturę z kolby do probówek 15 mL. Wiruj z małą prędkością (210 x g) przez 2 min, aby rozdzielić dwa typy komórek.
    Uwaga: Komórki biofilmu powinny utworzyć luźny osad na dnie probówki
  2. Przenieś pipetą nadsącz zawierający komórki planktoniczne do dwóch probówek wirówkowych 40 mL do późniejszego użycia (krok 5). Usuń całą pozostałą ciecz, uważając, aby nie naruszyć osadu. Powtarzaj czynność, aż typy komórek zostaną oddzielone z całej objętości pożywki z kolby.

4. Przygotowanie agregatów biofilmu

Uwaga: Biofilm jest zbierany na podstawie masy mokrej, aby uzyskać 25 µg DNA, co jest zalecaną minimalną ilością materiału wyjściowego do ChIP. Współczynnik Konwersji Biofilmu (BCF) dla S. Typhimurium wynosi 1,73 x 108 CFU/mg2. Badacze przygotowujący inne typy biofilmu będą musieli empirycznie określić liczbę komórek na jednostkę masy biofilmu, co zostanie wykorzystane do obliczenia masy biofilmu wymaganej do uzyskania 25 µg DNA jako materiału wyjściowego przy użyciu następującego równania:
Wzór obliczeniowy dla biofilmu, przedstawiający konwersję DNA na biofilm w schemacie analizy mikrobiologicznej.

  1. Dokładnie zważ probówkę 2 mL z nakrętką typu snap cap lub nakrętką wkręcaną.
  2. Resuspenduj osad biofilmu w 1 mL kondycjonowanego tryptonu. Przenieś resuspendowany biofilm do wcześniej zważonej probówki 2 mL z nakrętką typu snap cap lub nakrętką wkręcaną.
  3. Wiruj przez 1 min w 11 000 x g w temperaturze 20 °C
  4. Ostrożnie usuń cały nadsącz z probówki i dokładnie zważ probówkę. Odejmij masę probówki od masy probówki z biofilmem, aby obliczyć masę biofilmu. Powinna ona wynosić ±10% docelowej masy biofilmu.
  5. Przemyj komórki, aby usunąć pozostały kondycjonowany trypton. Dodaj do probówki 1 mL ciepłego PBS i delikatnie wymieszaj na vortexie, aby resuspendować osad. Wiruj przez 3 min w 8 000 x g, aby odwirować biofilm, a następnie usuń nadsącz. Dodaj do probówki 1 mL PBS i wymieszaj na vortexie, aby resuspendować osad.

5. Przygotowanie komórek planktonicznych

  1. Za pomocą spektrofotometru zmierz i zapisz objętość oraz OD600 nadnadstanku planktonicznego uzyskanego po wirowaniu z niską prędkością (krok 3.2)
  2. Oblicz objętość wymaganą do uzyskania końcowego OD600 na poziomie 6,0:
    Równanie do obliczenia końcowej objętości nadnadstanku planktonicznego; pomiar OD, metoda eksperymentalna.
  3. Schłodź wirówkę do 10 °C i osadź komórki planktoniczne poprzez wirowanie (10,000 x g, 10 min w 10 °C)
  4. Odsącz nadnadstanek i resuspenduj osad komórkowy w końcowej objętości PBS obliczonej w kroku 5.2.
  5. Ponownie zmierz OD600 komórek planktonicznych za pomocą spektrofotometru i przenieś objętość komórek planktonicznych o OD600 wynoszącym 6,0 do probówki 2 mL z nakrętką typu snap cap lub gwintowaną.
  6. Uzupełnij objętość do 1 mL za pomocą PBS.

6. Homogenizacja komórek

  1. Do każdej z probówek dodaj jedną wysterylizowaną stalową kulkę o średnicy 5 mm.
  2. Homogenizuj za pomocą młyna homogenizującego przez 5 min przy częstotliwości 30 Hz. Obserwuj probówki z aglomeratami, aby potwierdzić rozbicie biofilmu.
  3. Przenieś zhomogenizowane komórki do nowej probówki o pojemności 1,5 mL, unikając pobrania metalowej kulki. Uzupełnij objętość do 1 mL za pomocą PBS.
    Uwaga: Wykonaj rozcieńczenia seryjne, aby policzyć komórki wejściowe i sprawdzić, czy końcowa liczba komórek jest zbliżona do liczby pożądanej lub przewidywanej.

7. Sieciowanie białek z DNA

  1. Dodaj świeży formaldehyd do probówek z próbkami do uzyskania stężenia końcowego 1%. Inkubuj przez 30 min w temperaturze pokojowej na rotatorze.
    Uwaga: Formaldehyd jest substancją żrącą, łatwopalną oraz drażniącą skórę, oczy i drogi oddechowe. Rozdzielanie należy przeprowadzać w dygestorium.
  2. Dodaj glicynę 1 M do stężenia końcowego 125 mM, aby zatrzymać proces sieciowania. Inkubuj przez 5 min w temperaturze pokojowej na rotatorze.

8. Przemywanie komórek w celu usunięcia nadmiaru czynnika sieciującego

  1. Odwiruj komórki z prędkością 8,000 x g przez 3 min i usuń nadsącz
  2. Resuspenduj osad w 20 µL 25x inhibitorów proteaz oraz 500 µL sterylnego PBS filtrowanego.
  3. Wiruj probówkę przez 3 min przy 8000 x g i usuń nadsącz.

9. Lizowanie komórek

  1. Resuspenduj osad w 600 µL buforu lizującego (patrz Tabela 1) i inkubuj na lodzie przez 10 min.
  2. Dodaj 1,4 mL buforu rozcieńczającego do IP (patrz Tabela 1) do sterylnej probówki 15 mL i przenieś zlizowane komórki do tej probówki. Przechowuj probówkę na lodzie przez 1,5–2 h, delikatnie i sporadycznie mieszając na wortexie.
    Uwaga: W probówkach może pozostać część materiału komórkowego odpornego na lizę. Długi czas inkubacji na lodzie z okazjonalnym mieszaniem na wortexie pozwoli na rozbicie tego materiału. Pozostałości zostaną rozbite podczas sonikacji.

10. Fragmentacja DNA poprzez sonikację

  1. Umieść probówkę 15 mL w zlewce z lodem i wprowadź sondę 3 mm do wnętrza probówki.
  2. Przeprowadź 5 cykli sonikacji trwających po 30 s przy mocy 20–40% z 400 W, z 2 min przerwy na chłodzenie w lodzie pomiędzy impulsami.
  3. Osadź wytrącony materiał poprzez wirowanie (8000 x g, 10 min w 4 °C). Przenieś nadsącz do nowej probówki.
  4. Opcjonalnie przeprowadź proces usuwania wiązań krzyżowych (decrosslinking) w 65 °C przez 30–60 min, a następnie straw przez 30-60 min RNA i białka w 45 °C przed naniesieniem na 2% żel agarozowy w celu sprawdzenia rozmiaru fragmentów.
    Uwaga: Zanurz sondę w lizacie komórkowym. Podczas sonikacji i przerw utrzymuj roztwór w lodzie. Nie wyjmuj probówki w czasie pulsowania sondy sonikatora. Przed sonikacją roztwór powinien być mętny, a po jej zakończeniu klarowny.

11. Immunoprecypitacja kompleksów DNA-białko-przeciwciało

  1. Przygotowanie
    1. Odmierz jedną alikwotę 1,35 mL do immunoprecypitacji oraz jedną alikwotę 200 µL jako kontrolę wejściową (input control). Przechowuj kontrolę wejściową w temperaturze -80 °C do momentu przeprowadzenia etapów usuwania wiązań krzyżowych i trawienia.
  2. Immunoprecypitacja z użyciem przeciwciała pierwszorzędowego
    1. Dodaj 10 µg oczyszczonego, białkowo-specyficznego przeciwciała pierwszorzędowego do alikwoty 1,35 µL. Inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C na rotatorze.
      Uwaga: Przeciwciało pierwszorzędowe może być przeciwciałem monoklonalnym, wysokiej jakości surowicą poliklonalną lub komercyjnym przeciwciałem przeciwko epitopowi (np. anty-FLAG).
    2. Dodaj 50 µL magnetycznych kulek Protein G do probówek z kroku 11.2.1 i inkubuj w temperaturze 4 °C przez 3 h na rotatorze.
    3. Umieść bufor do płukania IP 1, bufor do płukania IP 2 oraz bufor TE pH 8,0 (patrz tabela 1) w pojemniku z lodem. Podgrzej bufor do elucji do 65 °C.
      Uwaga: Nie umieszczaj roztworu zawierającego bufor do elucji na lodzie.
    4. Przyciągnij magnetyczne kulki Protein G do ścianek probówek, używając statywu magnetycznego.
    5. Przeprowadź płukanie: płucz 2x 750 µL zimnym buforem do płukania IP 1, płucz 1x 750 µL zimnym buforem do płukania IP 2 i płucz 2x 750 µL zimnym buforem TE o pH 8,0. Podczas płukania trzymaj probówki na statywie magnetycznym.
    6. Dodaj 450 µL buforu do elucji IP (patrz tabela 1) do każdej probówki i inkubuj w temperaturze 65 °C przez 30 min, delikatnie wierzgając na wortexie co 5 min.
    7. Przyciągnij kulki do ścianek probówek, używając statywu magnetycznego. Odczekaj co najmniej 2 min, aż roztwór stanie się przejrzysty.
    8. Przenieś klarowny nadsącz do nowej probówki 1,5 mL, uważając, aby nie naruszyć osadu z magnetycznych kulek.

12. Dekroslinkowanie kompleksów DNA-białko oraz trawienie współoczyszczanego RNA i białek

  1. Do każdej probówki dodać 2 µg RNazy A oraz NaCl do stężenia końcowego 0,3 M.
  2. Inkubować w temperaturze 65 °C przez ≥6 h lub przez noc.
  3. Dopełnić trawienie białek, dodając do każdej probówki 180 µg Proteinazy K, a następnie inkubując w temperaturze 45 °C przez 3–5 h.

13. Przygotowanie biblioteki i sekwencjonowanie

  1. Oczyść DNA przy użyciu kulek magnetycznych
    Uwaga: Kuleczki magnetyczne są preferowane do izolowania niewielkich ilości DNA, które zazwyczaj uzyskuje się podczas ChIP z komórkami bakteryjnymi.
  2. Przygotuj biblioteki za pomocą zestawu kompatybilnego z wybraną platformą sekwencjonowania.
  3. Sprawdź stężenie biblioteki za pomocą fluorometru i zestawu do dsDNA o szerokim zakresie lub zestawu do ilościowego oznaczania bibliotek metodą qRT-PCR.
    Uwaga: W naszym doświadczeniu pomiary fluorometryczne mogą zawyżać stężenie DNA.
  4. Połącz biblioteki, uwzględniając odpowiednie pokrycie dla każdej próbki biblioteki. W przypadku sekwencjonowania Illumina dla Salmonella połączyliśmy 10–12 bibliotek. Dodaj Tris-HCl pH 8.0 do stężenia końcowego 1 mM.
  5. Przeprowadź sekwencjonowanie zgodnie ze specyfikacją wybranej platformy.

Wyniki

Przygotowanie próbek do immunoprecypitacji chromatyny z biofilmu bakteryjnego obejmuje kilka etapów, przedstawionych na Rysunku 1. Obejmują one hodowlę biofilmu w kolbie, pobieranie medium kondycjonowanego, pobieranie odpowiedniej ilości biofilmu oraz komórek planktonicznych jako kontroli, przemywanie komórek w PBS, homogenizację, sieciowanie białek z DNA, lizę komórek, fragmentację DNA poprzez sonikację, immunoprecypitację DNA przy użyciu odpowiednich przeciwciał i kulek z białkiem G, przemywanie i elucję immunoprecypitowanego DNA oraz oczyszczanie DNA w celu przygotowania biblioteki i sekwencjonowania.

S. Typhimurium hodowane w kulturze płynnej w warunkach indukujących tworzenie biofilmu ulegają zmianie fenotypu, tworząc wielokomórkowe agregaty biofilmu oraz komórki planktoniczne. Populacja ta będzie zawierać około 40% agregatów biofilmu, które wykazują wyższy poziom cyklaz diguanylanowych (DGCs) i regulatorów biofilmu, oraz 60% komórek planktonicznych, które wykazują wyższy poziom genów związanych z wirulencją2,4 (Rysunek 2A). W niniejszym protokole opisujemy metodę pozyskiwania obu typów komórek w celu porównania miejsc transkrypcji za pomocą ChIP-seq; protokół ten można jednak dostosować do innych typów biofilmów tworzonych przez inne gatunki bakterii. Agregaty biofilmu i komórki planktoniczne są rozdzielane poprzez wirowanie z niską prędkością, w wyniku czego biofilm osadza się w formie pelletu, a komórki planktoniczne pozostają w nadosadzie2 (Rysunek 2B). Następnie oba typy komórek są oddzielnie poddawane kolejnym etapom protokołu.

Zalecana ilość wejściowego DNA dla ChIP-seq wynosi 10-25 µg20. W kulturze kolbowej S. Typhimurium 30 mg biofilmu dostarcza około 25 µg DNA. Ponieważ agregaty biofilmu zawierają obfitą ilość białkowego materiału zewnątrzkomórkowego, założyliśmy, że może to zakłócać wydajność sieciowania. Gdybyśmy ograniczyli się do normalizacji różnych typów komórek według liczby komórek, opracowanie komórek planktonicznych mogłoby doprowadzić do uzyskania nierównej ilości produktu sieciowanego poddanego immunoprecypitacji. Przeprowadzono analizę białek, aby określić równoważną ilość materiału z komórek planktonicznych odpowiadającą 30 mg biofilmu (Rysunek 3). Zebrano 6,0 OD600 komórek planktonicznych, aby dopasować je do 30 mg biofilmu.

Agregaty biofilmu muszą zostać najpierw rozbite, aby zapewnić równy dostęp czynnika sieciującego do wszystkich komórek. Stwierdziliśmy, że najbardziej jednolitym i wydajnym sposobem homogenizacji komórek było użycie młyna mieszalnikowego i kulek ze stali nierdzewnej o średnicy 5 mm (Rysunek 4A). Komórki planktoniczne są traktowane w ten sam sposób, aby zredukować zmienne w eksperymencie ChIP-seq (Rysunek 4B).

Po sfragmentowaniu DNA poprzez sonikację, sieciowaniu oraz poddaniu działaniu RNazy i Proteinazy K, można je zwizualizować na 2% żelu agarozowym. Sonikowane DNA rozpada się na zbiór fragmentów, które w żelu agarozowym widoczne są jako rozmycie (smear). Średnia wielkość fragmentów maleje wraz ze zwiększeniem liczby impulsów sonikacji (Rycina 5). Transfer energii różni się w zależności od urządzenia do sonikacji, dlatego zaleca się przeprowadzenie testu sonikacji w celu określenia liczby impulsów niezbędnych do sfragmentowania DNA do średniej wielkości poniżej 1 kb. W naszym eksperymencie ChIP-seq wybraliśmy 5 impulsów.

Wytyczne ENCODE zalecają potwierdzenie aktywności wiązania celu przez przeciwciało za pomocą immunoblottingu21. W tym przypadku zmierzyliśmy specyficzność i siłę wiązania naszego przeciwciała za pomocą immunoblottingu lizatów całych komórek przygotowanych do ChIP (Rycina 6). Potwierdziliśmy, że przeciwciało wiąże się z CsgD-3xFLAG; sygnały przeciw-FLAG i przeciw-CsgD kolokalizują przy oczekiwanej masie cząsteczkowej (28 kDa)22.

Procedury ChIP często dają niskie stężenia DNA. Dlatego wybrano metodę oczyszczania, która usuwa zanieczyszczenia i pozwala zachować wysoki odsetek DNA. Oczyszczanie za pomocą kulek magnetycznych wybrano zamiast oczyszczania kolumnowego, ponieważ lepiej zachowywało niskie stężenia wejściowego DNA z ChIP (Rycina 7) i skuteczniej usuwało zanieczyszczenia (dane nie pokazano).

Ze względu na mniejszą ilość wyjściowego DNA, przygotowanie biblioteki z DNA z ChIP może wymagać zastosowania rozcieńczonych adapterów i wzbogacenia metodą PCR. Przed sekwencjonowaniem biblioteki można zwizualizować za pomocą analizy Bioanalyzer, aby potwierdzić prawidłowy rozkład wielkości fragmentów przed i po wzbogaceniu metodą PCR (Rycina 8). Dodatkowo, w przypadku znanych celów regulacyjnych czynnika transkrypcyjnego, należy zastosować qPCR w celu potwierdzenia wzbogacenia regionów wiązania poprzez porównanie krotności zmiany (∆∆Ct) między znanym celem a sekwencją genu referencyjnego w immunoprecypitowanym DNA oraz w sonikowanym DNA wejściowym (input).

Dane z sekwencjonowania ChIP-seq należy analizować poprzez przypisanie wyników jakościowych, przycinanie zasad o niskiej jakości, dopasowanie odczytów forward i reverse (w sekwencjonowaniu paired-end), mapowanie do wysokiej jakości genomu referencyjnego, wyszukiwanie pików powyżej tła oraz przeprowadzenie analizy końcowej (Rysunek 9A). Analiza końcowa powinna obejmować wizualizację i adnotację pików, ocenę spójności z biologicznymi próbkami powtórzonymi oraz analizę motywów, a także może obejmować analizę różnicowego wiązania między warunkami lub typami komórek oraz integrację danych z ekspresją genów znanych szlaków. W przypadku danych ChIP-seq, takich jak nasze, piki powinny być identyfikowane jako istotnie wyższe od tła (Rysunek 9B,C, czerwone słupki) na podstawie wyznaczenia wartości p, a nie tylko na podstawie krotności zmiany (fold-change). W analizie końcowej zmapowane odczyty są wizualizowane względem adnotacji genomu referencyjnego (Rysunek 9D). Słaby wynik ChIP-seq wyglądałby jak input-seq, bez żadnych istotnych pików powyżej tła.

Schemat procesu edycji genów CRISPR-Cas9; przebieg modyfikacji i analizy DNA.
Rycina 1: Ilustracja etapów ChIP-seq w biofilmach bakteryjnych. W opisanym protokole komórki S. Typhimurium są hodowane w kulturze kolbowej w 1% tryptonie w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem (1), zbierane jest wolne od komórek pożywka kondycjonowana do manipulacji z typami komórek biofilmu (2), która służy do zebrania odpowiedniej ilości komórek biofilmu i komórek planktonicznych (3). Komórki te są przemywane PBS i homogenizowane w celu rozbicia biofilmu (4). Białka są sieciowane z DNA przy użyciu sieciującego formaldehydu, po czym komórki są lizowane w celu uwolnienia zawartości wewnątrzkomórkowej (5). DNA w lizacie komórkowym jest fragmentowane poprzez sonikację (6). DNA sieciowane z docelowym białkiem jest wyodrębniane poprzez immunoprecypitację z użyciem przeciwciała wiążącego docelowe białko oraz magnetycznych kulek Protein G (7). Wyselekcjonowane DNA jest przemywane i eluowane z magnetycznych kulek Protein G (8), a następnie oczyszczane w celu przygotowania biblioteki i sekwencjonowania (9). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces oczyszczania białek, układ do flokulacji, probówki do wirowania, wyniki przed i po rozdziałem.
Rycina 2: Model in vitro w kolbie do badania rozwoju biofilmu S. Typhimurium. (A) Komórki S. Typhimurium hodowane w 1% tryptonie przez 13 h w 28 °C ulegają zmianie fenotypu, tworząc agregaty biofilmu oraz komórki planktoniczne w fazie ciekłej kultury w kolbie. (B) Agregaty biofilmu i komórki planktoniczne z kultury w kolbie z (A) zostały rozdzielone poprzez wirowanie przy 210 x g przez 2 min. Nadlewkę pobrano do przygotowania zawiesin komórek planktonicznych, a osad do przygotowania zawiesin komórek biofilmu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Stężenie białka w zależności od biofilmu i kultur planktonicznych; wykres słupkowy, porównanie eksperymentalne, mg/mL.
Rycina 3: Całkowite stężenia białka dla próbek komórek planktonicznych i komórek biofilmu pobranych z hodowli kolbowej S. Typhimurium. Wykonano kolorymetryczne oznaczenia białka, a ilość białka względem krzywej wzorcowej BSA zmierzono przy 750 nm. Zawartość białka w lizowanych próbkach komórek planktonicznych przy OD600 równych 4,0, 6,0 i 8,0 porównano z 30 mg agregatów biofilmu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces homogenizacji, porównanie probówek, rozbicie osadu, wyniki układu eksperymentalnego.
Rysunek 4: Homogenizacja próbek komórek z hodowli kolbowych biofilmu S. Typhimurium. (A) Agregaty biofilmu z hodowli kolbowej resuspenderowane w PBS (po lewej) zostały zhomogenizowane przy użyciu młyna mieszalnikowego przy 30 Hz przez 5 min (po prawej). (B) Komórki planktoniczne z hodowli kolbowej resuspenderowane w PBS zostały poddane działaniu młyna mieszalnikowego przy 30 Hz przez 5 min w celu zapewnienia spójności między próbkami różnych typów komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Fragmentacja DNA, wynik elektroforezy w żelu, efekt sonikacji, analiza długości par zasad.
Rycina 5: Test sonikacji lizatów komórkowych przed etapem ChIP. Próbki agregatów biofilmu oraz komórek planktonicznych zostały rozdzielone, homogenizowane, poddane sieciowaniu i lizie. Kompleksy białko-DNA sonikowano do 8 razy (cykle: 30 s włączone, 2 min wyłączone) w lodzie, aby rozbić DNA na mniejsze fragmenty. Część sonikowanego lizatu rozdzielono w 2% żelu agarozowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza immunoblotting SDS-PAGE ekspresji białka, przeciwciała anti-FLAG i anti-CsgD, biofilm/planktoniczne.
Rycina 6: Specyficzność wiązania docelowego przeciwciała anti-FLAG użytego w ChIP-seq. Specyficzność przeciwciał oceniono za pomocą immunoblottingu lizatów całych komórek przygotowanych z kultur w kolbach szczepów S. Typhimurium, zgodnie z przedstawionym schematem. Próbki biofilmu szczepu ∆csgD + p3xFLAG/csgD oraz WT reprezentują agregaty biofilmu zebrane z kolb, natomiast komórki planktoniczne szczepu ∆csgD ± p3xFLAG oraz WT reprezentują komórki planktoniczne. Jako kontrolę naniesiono oczyszczone białko CsgD z tagiem His. Lizaty całych komórek znormalizowano tak, aby w każdej ścieżce analizowano 30 µg całkowitego białka. Liczby po lewej stronie odnoszą się do wielkości (w kDa) wstępnie barwionych markerów masy cząsteczkowej. Przeciwciałem pierwszorzędowym użytym w górnym blotcie było poliklonalne przeciwciało królicze anti-FLAG (Sigma-Aldrich #F7425), natomiast dolny blot inkubowano z przeciwciałem króliczym anti-FLAG wraz z monoklonalnym przeciwciałem specyficznym dla CsgD2. Jako przeciwciała drugorzędowe zastosowano przeciwciało kozie anti-rabbit IgG (LiCor IRDye 680RD, 925-68071) oraz przeciwciało kozie anti-mouse IgG (LiCor IRDye 800CW, 925-32210). Sygnały fluorescencyjne wizualizowano przy użyciu systemu obrazowania Odyssey CLx i pakietu oprogramowania Image Studio 4.0 (Li-Cor Biosciences). Przedstawiono reprezentatywne obrazy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres metod oczyszczania; stężenia DNA przed i po oczyszczaniu; kolumna, kulki magnetyczne.
Rycina 7: Strategie oczyszczania małych ilości DNA z eksperymentów ChIP-seq z wykorzystaniem kolumn lub kulek magnetycznych. Próbki o znanych ilościach DNA zostały oczyszczone przy użyciu zestawów kolumnowych lub kulek magnetycznych, a następnie zmierzono stężenie eluatu po oczyszczaniu. Kulki magnetyczne wykazały lepszą odzyskiwalność przy niskich poziomach DNA, podobnych do małych ilości DNA typowo spotykanych na koniec protokołu ChIP-seq, przed przygotowaniem biblioteki NGS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy analizy DNA z ChIP; DNA wejściowe (input) w porównaniu z ChIP oraz wyniki bibliotek ChIP; dane z elektroforezy.
Rycina 8: Preparaty DNA z ChIP oraz późniejsze biblioteki wizualizowane za pomocą Bioanalyzer.** (A) Średnia wielkość fragmentów genomowego DNA po lizie komórek i sonikacji wynosiła <1000 bp, przy czym większość fragmentów mieściła się w zakresie 200–500 bp. (B) Materiał wyjściowy do przygotowania biblioteki znajdował się poniżej granicy wykrywalności. (C) Ligacja adapterów i wzbogacanie metodą PCR umożliwia amplifikację fragmentów biblioteki. (D) Nieprawidłowo przygotowana biblioteka charakteryzuje się niskimi pikami DNA, pikami o nietypowym kształcie lub wysokiej masie cząsteczkowej albo licznymi pikami adapterów przy około 100 bp. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat procesu sekwencjonowania ChIP-DNA i wyznaczania pików z dopasowaniem odczytów i asocjacją genów.
Rysunek 9: Dane ChIP-seq są analizowane za pomocą narzędzi bioinformatycznych i wizualizowane w przeglądarce genomu. A. Schemat blokowy typowej analizy bioinformatycznej danych ChIP-seq. Surowe odczyty dla biofilmu (szczep ∆csgD + p3xFLAG/csgD) i komórek planktonicznych (∆csgD + p3xFLAG) zostały oczyszczone z odczytów niskiej jakości i adapterów, a następnie zmapowane do genomów S. Typhimurium 14028s (NC_016856.1 dla chromosomu i NC_016855.1 dla plazmidu) za pomocą Bowtie2 (v2.3.3.1) z parametrami domyślnymi23. Do wyznaczania pików wykorzystano MACS2 (v2.1.2) z parametrami '-q 0.01 -- nomodel', przyjmując powtórzenia dla biofilmu jako zestawy testowe, a dla komórek planktonicznych jako kontrolne24. Moduł bdgcmp programu MACS2 został następnie użyty do wygenerowania ścieżki wzbogacenia (fold-enrichment) z parametrami '-m FE'. Plik istotnych pików ze ścieżką wzbogacenia przekształcono do formatu wig za pomocą bedtools/bedClip/bedGraphToBigWig25 i zwizualizowano na genomie referencyjnym przy użyciu Integrative Genomics Viewer v2.5.126. Przedstawiono reprezentatywne piki (czerwone słupki). (B) Duży region o wielkości ~40 kbp zawierający wiele pików jest wynikiem nietypowym, lecz potencjalnie wartościowym. (C) Jest to wynik bardziej typowy, wykazujący dwa istotne regiony pików. (D) Powiększenie lewego piku z panelu C, pokazujące odczyty zmapowane do regionu genomu S. Typhimurium 14028s zawierającego rozbieżne promotory dla uspA i uspB. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Bufory do lizy komórek
Bufor lizujący
50 mM Tris-HCl pH 8,1
10 mM EDTA
1% SDS
inhibitory proteaz
bufor do rozcieńczania IP
20 mM Tris-HCl pH 8,1
2 mM EDTA
150 mM NaCl
1% Triton X-100
0,01% SDS
Bufory do immunoprecypitacji
bufor płukania IP 1
20 mM Tris-HCl pH 8,1
2 mM EDTA
50 mM NaCl
1% Triton X-100
0,1% SDS
bufor do płukania IP 2
10 mM Tris-HCl pH 8,1
250 mM LiCl
1 mM EDTA
1% NP-40
1% kwas deoksycholowy
TE (T10E1) pH 8,0
10 mM Tris-HCl
1 mM EDTA
Bufor elucyjny
1% SDS
100 mM NaHCO3

Tabela 1. Składy buforów.

Dyskusja

Protokół ten przedstawia technikę wykonywania sekwencji ChIP-seq z biofilmem serowarycznym Typhimurium Salmonella enterica i komórkami planktonowymi z czystej hodowli, w celu znalezienia celów regulacyjnych głównego regulatora biofilmu, CsgD. Spodziewamy się różnicowej informacji o wiązaniu ze względu na dwustabilność CsgD w dwóch typach komórek, z wysokimi poziomami w agregatach biofilmu i niskimi poziomami w komórkach planktonowych 2,3. Jednak technika ta może być również stosowana do innych bakteryjnych czynników transkrypcyjnych, typów komórek lub warunków wzrostu. W szczególności technikę tę można dostosować do innych biofilmów bakteryjnych przy użyciu eksperymentalnie wyznaczonego współczynnika konwersji dla CFU na jednostkę masy komórek biofilmu.

ChIP-seq może być podatny na amplifikację błędu technicznego poprzez sekwencjonowanie; Jednak potwierdzenie na krytycznych etapach może temu zapobiec27. Swoistość przeciwciał pierwotnych jest ważna dla wyboru tylko docelowego czynnika transkrypcyjnego i DNA, które kontroluje podczas immunoprecypitacji7. W tym eksperymencie csgD został połączony z kodowanym plazmidem znacznikiem 3xFLAG na końcu 3' genu, odpowiadającym C-końcowi CsgD22. Jako "kontrolę" użyto plazmidu p3xFLAG bez csgD (S. Typhimurium 14028 ∆csgD + p3xFLAG). Wytyczne ENCODE zalecają wykonywanie immunoblotów z pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania oraz lizatami szczepów ChIP i szczepów delecyjnych21. Ważne jest, aby zapewnić spójność warunków wzrostu we wszystkich kontrpróbach, aby zmniejszyć zmienność w wiązaniu czynników transkrypcyjnych i dalszych wynikach sekwencjonowania. Jeśli ktoś jest ostrożny, aby upewnić się, że rozmiary inokulum i warunki wzrostu przed inokulum są spójne, wzrost biofilmu w kulturze kolby jest stały4. Ważne jest, aby potwierdzić, że cały biofilm został rozbity po homogenizacji, aby zapewnić równy dostęp odczynników, w szczególności środka sieciującego formaldehyd, do wszystkich komórek.

Kilka modyfikacji może umożliwić naukowcom wykorzystanie tego protokołu do innych białek wiążących DNA, typów komórek, szczepów, warunków wzrostu lub sprzętu laboratoryjnego. Jeżeli stosuje się go w odniesieniu do gatunków tworzących biofilm innych niż S. Typhimurium, współczynnik konwersji jednostek tworzących kolonie na jednostkę masy biofilmu należy określić doświadczalnie poprzez zebranie różnych ilości biofilmu, dokładną homogenizację biofilmu oraz wykonanie seryjnych rozcieńczeń i liczenia płytek w celu stworzenia krzywej standardowej, która może nie być dokładna przy niższych masach biofilmu2. Przenoszenie energii Sonikator i rezystancja typu ogniwa mogą się różnić; W związku z tym zaleca się wykonanie testu sonikacyjnego w celu znalezienia liczby impulsów sonikacji, które wytworzą zakres wielkości fragmentu wymagany do przygotowania i sekwencjonowania biblioteki11. Fragmentacja chromatyny przez nukleazę mikrokokową jest alternatywą dla sonikacji, która zapewnia wysoką rozdzielczość miejsc zamieszkania; Jednak ta metoda może wprowadzić błąd fragmentacji 7,28. Zakres rozmiarów DNA może ulec zmianie w zależności od zestawów przygotowawczych biblioteki i platform sekwencjonowania. Inne metody homogenizacji mogą być stosowane zamiast młyna miksującego. Na przykład homogenizator tkanek szklanych może zostać zastąpiony, ale może on rozpylać lub niecałkowicie rozbijać biofilm. Jeśli chodzi o kontrole, DNA przed immunoprecypitatem można znormalizować w przetwarzaniu i analizie po sekwencjonowaniu. Jako kontrolę można również zastosować próbną kontrolę IP z dopasowaną do gatunku normalną surowicą przeciwciał13.

Badacze muszą wziąć pod uwagę ograniczenia tej metody, rozważając eksperyment ChIP-seq. Konieczne mogą być znaczne modyfikacje w celu dostosowania go do innych rodzajów biofilmu. Na przykład w przypadku Salmonella Typhimurium natychmiastowe ponowne zawieszenie biofilmu w PBS prowadzi do mierzalnej utraty agregatów biofilmu. Immunoprecypitacja ukierunkowana na cele regulacyjne czynników transkrypcyjnych u bakterii może skutkować bardzo małymi ilościami DNA, co stanowi wyzwanie dla oczyszczania i wykrywania na późniejszych etapach. Odchylenie może być wprowadzone podczas ścinania i manipulacji w dół podczas wykrywania biblioteki9. Ponadto metoda ta nie ujawnia poziomów ekspresji in vivo w odpowiedzi na wiązanie czynnika transkrypcyjnego. Naukowcy, którzy mają niewielkie doświadczenie w bioinformatyce, mogą napotkać wyzwanie związane z procesem analizy. Ta metoda może być czasochłonna i kosztowna; Jednak koszt sekwencjonowania jest często niższy niż w przypadku mikromacierzy i maleje z czasem, ponieważ nadal dokonuje się ulepszeń technologicznych.

Niewiele metod w literaturze opisuje ChIP z bakteriami, a większość eksperymentów bakteryjnych zaczyna się od prostego warunku wzrostu 13,14,15,17,18. Przygotowanie próbki ChIP za pomocą pojedynczych komórek jest proste i stanowi mniej wyzwań niż przygotowanie próbki ChIP za pomocą agregatów biofilmu. Jeśli chodzi o ChIP-seq, poprzednie metody badania obwodów cis-regulatorowych, w tym systematyczna ewolucja ligandów przez wzbogacenie wykładnicze (SELEX), testy przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA), chip ChIP, delecję promotora i analizę reporterową, zostały uzupełnione lub zastąpione przez ChIP-seq29. ChIP-seq zastępuje ChIP-chip ze względu na zaawansowane technologie i dostępność sekwencjonowania. Głębokie sekwencjonowanie dostarcza naukowcom ogromnych ilości danych, które mogą zidentyfikować miejsca o niższym powinowactwie wiązania i wyższej rozdzielczości par zasad przy mniejszej ilości materiału wyjściowego niż ChIP-chip11,30. Analiza danych ChIP z organizmów o wysokiej jakości genomach referencyjnych jest na ogół szybka i szczegółowa. Dodatkowo, ChIP-seq jest dokładną metodą odkrywania in silico przewidywanych miejsc wiązania, które mogą nie być zajęte we wszystkich typach komórek, fazie wzrostu lub warunkach środowiskowych31.

W przyszłości protokół ten może zostać wykorzystany do ułatwienia zrozumienia patogenezy bakterii, w szczególności organizmów tworzących biofilm. Szerokie zastosowanie tej techniki i dostępność nowych zestawów danych może prowadzić do integracji danych w celu zidentyfikowania grup białek, które kolokalizują się w celu kontrolowania procesów komórkowych w mikroorganizmach tworzących biofilm32. Ponadto dane sekwencyjne ChIP-seq i RNA-seq można zintegrować w celu zbudowania modeli systemów regulacyjnych33.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez grant z Rady Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) (#2017-05737) dla AW oraz przez Jarislowsky Chair in Biotechnology. MP był wspierany przez stypendium NSERC-CREATE w ramach Zintegrowanego Programu Szkoleniowego w zakresie Chorób Zakaźnych, Bezpieczeństwa Żywności i Polityki Publicznej (ITraP) na Uniwersytecie Saskatchewan.

Autorzy chcieliby podziękować Dani Dale za filmowanie i montaż.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agaroza w proszkuFroggaBioA87-500G
Balance (Explorer pro)OhausEP214
(8510R)Eppendorf022627023
Bioanalyzer 2100AgilentG2939BA
Zestaw dsDNA BRThermoFisher ScientificQ32850
Kulki magnetyczne G z białkiem klasy ChIPCell Signaling Technology9006
cKompletny, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazySigma-AldrichCOEDTAF-RO ROCHE
Rurka stożkowa 15 mlFroggaBioTB15-500
Rurka stożkowa 50 mlFroggaBioTB50-500
Zestaw do oznaczania białek DC IIJednorazowa5000112
1,5 mlFisher Scientific14-955-127
Sprzęt do elektroforezy (mini-PROTEAN)Bio-Rad1658000
Wirówka podłogowa (Sorvall Evolution RC)Termo Scientific728211
Fluorometr (Qubit 3.0)Thermo Fisher ScientificQ33216
FormaldehydSigma-Aldrich252549
GelRed® Barwnik w żelu kwasu nukleinowego 10 000x w wodzieBiotium41003
Zestaw DNA o wysokiej czułościAgilent5067-4626
Inkubator (wytrząsanie)VWR1570-ZZMFG
(wytrząsanie w kąpieli wodnej)New BrunswickG76D
LB MediaVWR90000-808
Stojak magnetyczny (DynaMag)Fisher Scientific12321D
Mikrowirówka (chłodzona)Eppendorf5415R
, 1,5 mlFisher Scientific05-408-129
Zestaw odczynników MiSeq v3 (150 cykli)IlluminaMS-102-3001
Młyn miksującyRetschMM400
Nalgene 115 mL Jednostki filtrujące, sterylne, 0,2 i mikro; m wielkość porówThermo Scientific73520-980
NEBNext Ultra Zestaw do przygotowania biblioteki DNA dla IlluminaNew England BioLabsE7370S
NGS Cleanup and Size Select Koraliki magnetyczneMachery-Nagel744970.5
Normalna surowica dla myszyAbCamab188776
Szalki Petriego z przezroczystą pokrywką (100 mm x 15 mm)Fisher ScientificFB0875712
Kontroler pipetFroggaBioMP001
Proteinaza KThermoFisher ScientificAM2542
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104
Królicze przeciwciało poliklonalne anty-FLAGSigma-AldrichF7425
RNaza A (10 mg/mL; Bez DNaz i proteaz)ThermoFisher ScientificEN0531
z obrotowym kołemi BranżeTR 01A
Probówki Safe-Lock (2,0 ml, bezbarwne)Eppendorf22363344
Pipeta serologiczna 25 mlFroggaBio94024
SpektrofotometrMontreal Biotech Inc.Libra S22
Koraliki ze stali nierdzewnej, 5 mmQiagen69989
Stożkowa mikrokońcówka 1/8" (3mm) Sonda SonicatorSonics & Materiały, Inc.630-0418
Media tryptonoweVWR90000-286
Ultradźwiękowy procesor cieczy (Sonikator)Sonics & Materiały, Inc.VC300
Urządzenie próżniowe (Vacufuge plus)Eppendorf022820001
Łaźnia wodna 1 (Lab-line aquabath)Thermo Scientific18000-1
Łaźnia wodna 2 (Precision)Thermo Scientific51221044
Wirówka stołowa kuweta BioRad , Inkubator Probówki do mikrowirówek Technologie kryształów

Bibliografia

  1. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
  2. MacKenzie, K. D., et al. Bistable Expression of CsgD in Salmonella enterica Serovar Typhimurium Connects Virulence to Persistence. Infection and Immunity. 83 (6), 2312-2326 (2015).
  3. Grantcharova, N., Peters, V., Monteiro, C., Zakikhany, K., Römling, U. Bistable expression of CsgD in biofilm development of Salmonella enterica serovar typhimurium. Journal of Bacteriology. 192 (2), 456-466 (2010).
  4. MacKenzie, K. D., Palmer, M. B., Köster, W. L., White, A. P. Examining the Link between Biofilm Formation and the Ability of Pathogenic Salmonella Strains to Colonize Multiple Host Species. Frontiers in Veterinary Science. 4, 307(2017).
  5. Steenackers, H., Hermans, K., Vanderleyden, J. Salmonella biofilms: an overview on occurrence, structure, regulation and eradication. Food Research International. 45 (2), 502-531 (2012).
  6. Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J. B., Landini, P. The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli. Microbiology. 149, Pt 10 2847-2857 (2003).
  7. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
  8. Wu, D. -Y., Bittencourt, D., Stallcup, M. R., Siegmund, K. D. Identifying differential transcription factor binding in ChIP-seq. Frontiers in Genetics. 6, 169(2015).
  9. Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nature Methods. 5 (9), 829-834 (2008).
  10. Lieb, J. D. Genome-wide mapping of protein-DNA interactions by chromatin immunoprecipitation and DNA microarray hybridization. Methods in Molecular Biology. 224, Clifton, N.J. 99-109 (2003).
  11. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
  12. Kim, T. H., et al. A high-resolution map of active promoters in the human genome. Nature. 436 (7052), 876-880 (2005).
  13. Dillon, S. C., et al. Genome-wide analysis of the H-NS and Sfh regulatory networks in Salmonella Typhimurium identifies a plasmid-encoded transcription silencing mechanism. Molecular Microbiology. 76 (5), 1250-1265 (2010).
  14. Perkins, T. T., et al. ChIP-seq and transcriptome analysis of the OmpR regulon of Salmonella enterica serovars Typhi and Typhimurium reveals accessory genes implicated in host colonization. Molecular Microbiology. 87 (3), 526-538 (2013).
  15. Gu, D., Liu, H., Yang, Z., Zhang, Y., Wang, Q. Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Technology Reveals Global Regulatory Roles of Low-Cell-Density Quorum-Sensing Regulator AphA in the Pathogen Vibrio alginolyticus. Journal of Bacteriology. 198 (21), 2985-2999 (2016).
  16. Peano, C., et al. Characterization of the Escherichia coli σ(S) core regulon by Chromatin Immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq) analysis. Scientific Reports. 5 (1), 10469(2015).
  17. Blasco, B., et al. Virulence regulator EspR of Mycobacterium tuberculosis is a nucleoid-associated protein. PLoS Pathogens. 8 (3), 1002621(2012).
  18. Jones, C. J., et al. ChIP-Seq and RNA-Seq reveal an AmrZ-mediated mechanism for cyclic di-GMP synthesis and biofilm development by Pseudomonas aeruginosa. PLoS pathogens. 10 (3), 1003984(2014).
  19. Sengupta, M., Jain, V., Wilkinson, B. J., Jayaswal, R. K. Chromatin immunoprecipitation identifies genes under direct VraSR regulation in Staphylococcus aureus. Canadian Journal of Microbiology. 58 (6), 703-708 (2012).
  20. Gill, A. Cross-linking chromatin immunoprecipitation (X-ChIP) protocol. , Available from: https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/x_CHip_protocol.pdf (2017).
  21. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  22. MacKenzie, K. D., et al. Parallel evolution leading to impaired biofilm formation in invasive Salmonella strains. PLoS Genetics. 15 (6), 1008233(2019).
  23. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  24. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), 137-139 (2008).
  25. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  26. Thorvaldsdóttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  27. Schoppee Bortz, P. D., Wamhoff, B. R. Chromatin immunoprecipitation (ChIP): revisiting the efficacy of sample preparation, sonication, quantification of sheared DNA, and analysis via PCR. PloS One. 6 (10), 26015(2011).
  28. Tolstorukov, M. Y., Kharchenko, P. V., Goldman, J. A., Kingston, R. E., Park, P. J. Comparative analysis of H2A.Z nucleosome organization in the human and yeast genomes. Genome Research. 19 (6), 967-977 (2009).
  29. Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).
  30. Mardis, E. R. ChIP-seq: welcome to the new frontier. Nature Methods. 4 (8), 613-614 (2007).
  31. Lee, T. I., et al. Transcriptional regulatory networks in Saccharomyces cerevisiae. Science. 298 (5594), 799-804 (2002).
  32. Wade, J. T., Struhl, K., Busby, S. J. W., Grainger, D. C. Genomic analysis of protein-DNA interactions in bacteria: insights into transcription and chromosome organization. Molecular Microbiology. 65 (1), 21-26 (2007).
  33. Myers, K. S., Park, D. M., Beauchene, N. A., Kiley, P. J. Defining bacterial regulons using ChIP-seq. Methods (San Diego, Calif). 86, 80-88 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Regulacja CsgDr nicowe wi zaniepozyskiwanie biofilmulizy kom reksonikacja DNAprzygotowanie bibliotekianaliza danych
Odkrywanie celów regulatorowych CsgD w biofilmie Salmonelli przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.