Method Article

Tworzenie wysoce specyficznych, chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek poprzez stopniową selekcję fagów w kombinatorycznej bibliotece przeciwciał jednodomenowych

DOI:

10.3791/60738

⸱

January 14th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Institute for Protein Design, University of Washington

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tworzenie chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek o pożądanym powinowactwie i specyficzności dla dowolnego ligandu małych cząsteczek miałoby wiele zastosowań w biologicznym wykrywaniu i uruchamianiu. W tym miejscu opisujemy wydajną, uogólnioną metodę inżynierii de novo chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji poprzez krokowy wybór kombinatorycznej biblioteki przeciwciał jednodomenowych wyświetlanej przez fagi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdarzenia dimeryzacji białek, które występują tylko w obecności ligandu drobnocząsteczkowego, umożliwiają rozwój biosensorów małocząsteczkowych do analizy i manipulacji szlakami biologicznymi. Obecnie istnieje tylko ograniczona liczba systemów dimeryzacji indukowanej chemicznie (CID), a opracowanie nowych systemów o pożądanej czułości i selektywności dla określonych ligandów małocząsteczkowych pozostaje wyzwaniem w dziedzinie inżynierii białek. Opisujemy tutaj wysokoprzepustową metodę przesiewową, kombinatoryczny wybórCID (COMBINES-CID), do inżynierii de novo systemów CID mających zastosowanie do szerokiej gamy ligandów. Metoda ta wykorzystuje dwuetapową selekcję kombinatorycznej biblioteki nanoników wyświetlanej przez fagi w celu uzyskania 1) "spoiw kotwicznych", które najpierw wiążą się z interesującym ligandem, a następnie 2) "wiązań dimeryzacyjnych", które wiążą się tylko z kompleksami wiążącymi spoiwo-ligand. Aby wybrać wiązania kotwiczne, kombinatoryczna biblioteka ponad 109 randomizowanych nanociał w regionie determinującym komplementarność (CDR) jest przesiewana za pomocą biotynylowanego liganda, a trafienia są weryfikowane za pomocą nieznakowanego liganda za pomocą interferometrii warstwy biologicznej (BLI). Aby uzyskać spoiwa dimeryzacyjne, biblioteka nanoma jest przesiewana kompleksami wiążąco-ligandowymi jako celami do pozytywnego przesiewania i niezwiązanymi wiązaniami kotwicznymi do ujemnego przesiewu. COMBINES-CID ma szerokie zastosowanie do selekcji spoiw CID z innymi immunoglobulinami, nieimmunoglobulinami lub rusztowaniami zaprojektowanymi obliczeniowo w celu stworzenia bioczujników do wykrywania in vitro i in vivo leków, metabolitów, cząsteczek sygnałowych itp.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systemy CID, w których dwa białka dimeryzują tylko w obecności liganda o małych cząsteczkach (Rysunek 1), oferują wszechstronne narzędzia do analizowania i manipulowania szlakami metabolicznymi, sygnałowymi i innymi szlakami biologicznymi1. Wykazali oni potencjał biologicznej aktywacji, takiej jak aktywacja limfocytów T kontrolowana przez leki2 i apoptoza3,4, w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności adoptywnej terapii limfocytami T. Ponadto opracowano nową metodologię wykrywania celów małocząsteczkowych in vivo lub in vitro. Na pr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa biblioteki

  1. Użyj syntetycznej kombinatorycznej biblioteki przeciwciał jednodomenowych o różnorodności ~1,23–7,14 x 109, jak opisano wcześniej19. Chociaż ten protokół nie obejmuje budowy bibliotek, może być stosowany do innych bibliotek wiążących kombinatorycznie.

2. Biotynylacja celu ligandowego lub liganda

  1. Biotynyluj wybrany ligand, na przykład CBD i tetrahydrokannabinol (THC)19, za pomocą różnych strategii syntezy chemicznej, w zależności od odpowiednich miejsc biotynylacji celu.

3. Przesiewanie segregatorów ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy dwuetapową selekcję in vitro i walidację spoiw kotwiczących i dimeryzujących, przesiewając kombinatoryczną bibliotekę nanoników o różnorodności wyższej niż 109 przy użyciu CBD jako celu. Ważna jest ocena wzbogacenia biopanowania fagów podczas kolejnych rund selekcji zarówno dla spoiw kotwiczących, jak i dimeryzacyjnych. Typowe wyniki wzbogacania po 4–6 rundach selekcji, jak pokazano w Rysunek 5, są dobrą wskazówką, że istnieje wysoki współczynnik potencjalnych trafień w .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bardzo ważne jest, aby wybrać odpowiednie stężenia wejściowych bibliotek fagowych dla różnych rund biopanowania. Zazwyczaj zaczynaliśmy od biblioteki wejściowej składającej się z ~1012–1013 cząstek fagowych o różnorodności >109, co pozwalało na przedstawienie ~100–1,000 kopii każdego klonu faga w teście pull-down. Jeśli stężenie faga w teście wiązania jest zbyt wysokie lub niskie, prawdopodobieństwo niespecyficznego wiązania lub utraty dodatnich klonów wzrośnie. Wybór spoiwa kotwiczącego .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tymczasowy patent związany z tą pracą został złożony przez Uniwersytet Waszyngtoński.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez University of Washington Innovation Award (dla L.G.), grant od U.S. National Institutes of Health (1R35GM128918 dla L.G.) oraz fundusz startowy Uniwersytetu Waszyngtońskiego (dla L.G.). H.J. był wspierany przez stypendium licencjackie Washington Research Foundation. K.W. był wspierany przez stypendium licencjackie z University of Washington Institute for Protein Design.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-stopniowy roztwór substratu Ultra TMB ELISAThermo Fisher Scientific34029
AgarThermo Fisher ScientificBP1423-2
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15 (odcięcie 3 kDa)MiliporeUFC900324
AmpicylinaThermo Fisher ScientificBP1760-25
Bio-Rad Zestaw do oznaczania białek IIBio-Rad
BirA Standardowy zestaw reakcyjny ligazy biotynowo-białkowejAvidityBirA500
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA2153-50G
KazeinaSigma-AldrichC7078-1KG
CM13 pomocniczyPrzeciwciało Design LabsPH020L
D-(+)-Monohydrat glukozyAlfaAesar A11090
Dynabeads M-280 StreptavidinThermo Fisher Scientific11205D
Magnes DynaMag-2Thermo Fisher Scientific12321D
EDTAThermo Fisher ScientificBP120-1
Szybka drabina DNANew England BiolabsN3238S
FastDigest BglIThermo Fisher ScientificFD0074
GlycerolThermo Fisher ScientificBP229-1
HiLoad 16/600 Superdex 200 pgGE Healthcare28989335
HiPrep 26/10 Kolumna odsalającaGE Healthcare17508701
HisTrap-FF-1mlGE Healthcare11000458
ImidazolAlfa Aesar161-0718
IPTGThermo Fisher Scientific34060
KanamycinThermo Fisher ScientificBP906-5
M13 Przeciwciało białkowe MajorCoat Santa Cruz Biotechnologysc-53004
NaClSigma-AldrichS3014-500G
NanoDrop 2000/2000c SpektrofotometryThermo Fisher ScientificND-2000
Nunc 96-Well Polipropylen DeepWell Talerze do przechowywaniaThermo Fisher Scientific260251
Nunc MaxiSorpThermo Fisher Scientific44-2404-21
Octet RED96ForteBioN/A
pADL-23c Phagemid VectorAntibody Design LabsPD0111
PEG-6000Sigma-Aldrich81260-1KG
Platynowa polimerazaDNA SuperFiZestaw do oczyszczania PCR Invitrogen12351010
PureLinkThermo Fisher ScientificK310001
Zestaw QIAprep Spin M13Qiagen27704
Medium regeneracyjneLucigen80026-1
SpectraMax Plus 384Urządzenia molekularneNie dotyczy Sacharozy
Sigma-AldrichS0389-1KG
Biosensory Super Streptawidyny (SSA)ForteBio18-5057
Superdex 75 wzrost 10/300 GL KolumnaGE Healthcare28-9909-44
T4 Ligaza DNAThermo Fisher Scientific15224-025
TG1 Komórki elektrokompetentneLucigen60502-1
TrietyloaminaSigma-Aldrich471283-100mL
Trizma BaseSigma-AldrichT1503
TryptonThermo Fisher ScientificBP9726-5
Tween 20Thermo Fisher ScientificBP337-500
Ekstrakt drożdżowyThermo Fisher ScientificBP1422-2
Kolumna odsalająca Zeba SpinThermo Fisher Scientific89882
5000002

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. Chemically induced proximity in biology and medicine. Science. 359 (6380), (2018).
  2. Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Chemically Induced DimerizationPhage Display SelectionCombinatorial Nanobody LibraryAnchor BindersDimerization BindersBio Layer InterferometryStreptavidin Coated BeadsCompetitive ElutionSingle Clone ELISASize Exclusion Chromatography

Related Articles