Method Article

Tworzenie wysoce specyficznych, chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek poprzez stopniową selekcję fagów w kombinatorycznej bibliotece przeciwciał jednodomenowych

DOI:

10.3791/60738

⸱

January 14th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Institute for Protein Design, University of Washington

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tworzenie chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek o pożądanym powinowactwie i specyficzności dla dowolnego ligandu małych cząsteczek miałoby wiele zastosowań w biologicznym wykrywaniu i uruchamianiu. W tym miejscu opisujemy wydajną, uogólnioną metodę inżynierii de novo chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji poprzez krokowy wybór kombinatorycznej biblioteki przeciwciał jednodomenowych wyświetlanej przez fagi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdarzenia dimeryzacji białek, które występują tylko w obecności ligandu drobnocząsteczkowego, umożliwiają rozwój biosensorów małocząsteczkowych do analizy i manipulacji szlakami biologicznymi. Obecnie istnieje tylko ograniczona liczba systemów dimeryzacji indukowanej chemicznie (CID), a opracowanie nowych systemów o pożądanej czułości i selektywności dla określonych ligandów małocząsteczkowych pozostaje wyzwaniem w dziedzinie inżynierii białek. Opisujemy tutaj wysokoprzepustową metodę przesiewową, kombinatoryczny wybórCID (COMBINES-CID), do inżynierii de novo systemów CID mających zastosowanie do szerokiej gamy ligandów. Metoda ta wykorzystuje dwuetapową selekcję kombinatorycznej biblioteki nanoników wyświetlanej przez fagi w celu uzyskania 1) "spoiw kotwicznych", które najpierw wiążą się z interesującym ligandem, a następnie 2) "wiązań dimeryzacyjnych", które wiążą się tylko z kompleksami wiążącymi spoiwo-ligand. Aby wybrać wiązania kotwiczne, kombinatoryczna biblioteka ponad 109 randomizowanych nanociał w regionie determinującym komplementarność (CDR) jest przesiewana za pomocą biotynylowanego liganda, a trafienia są weryfikowane za pomocą nieznakowanego liganda za pomocą interferometrii warstwy biologicznej (BLI). Aby uzyskać spoiwa dimeryzacyjne, biblioteka nanoma jest przesiewana kompleksami wiążąco-ligandowymi jako celami do pozytywnego przesiewania i niezwiązanymi wiązaniami kotwicznymi do ujemnego przesiewu. COMBINES-CID ma szerokie zastosowanie do selekcji spoiw CID z innymi immunoglobulinami, nieimmunoglobulinami lub rusztowaniami zaprojektowanymi obliczeniowo w celu stworzenia bioczujników do wykrywania in vitro i in vivo leków, metabolitów, cząsteczek sygnałowych itp.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Systemy CID, w których dwa białka dimeryzują tylko w obecności liganda o małych cząsteczkach (Rysunek 1), oferują wszechstronne narzędzia do analizowania i manipulowania szlakami metabolicznymi, sygnałowymi i innymi szlakami biologicznymi1. Wykazali oni potencjał biologicznej aktywacji, takiej jak aktywacja limfocytów T kontrolowana przez leki2 i apoptoza3,4, w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności adoptywnej terapii limfocytami T. Ponadto opracowano nową metodologię wykrywania celów małocząsteczkowych in vivo lub in vitro. Na przykład, białka CID mogą być genetycznie łączone z systemami reporterowymi fluorescencji (np. transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET)5 i cyrkularnie permutowane białka fluorescencyjne)6 do pomiarów in vivo w czasie rzeczywistym lub służyć jako odczynniki powinowactwa do testów podobnych do testów immunoenzymatycznych (ELISA).

Pomimo ich szerokich zastosowań, tworzenie nowych systemów CID, które mogą być kontrolowane przez dany ligand małocząsteczkowy, stanowi poważne wyzwanie. Uznane metody inżynierii wiązarek białkowych, w tym immunizacja zwierząt7, selekcja in vitro8,9 i obliczeniowe projektowanie białek10 mogą generować białka wiążące ligandy, które działają poprzez binarne interakcje białko-ligand. Jednak metody te mają trudności z utworzeniem indukowanego ligandem trójskładnikowego kompleksu CID. Niektóre metody tworzą CID poprzez chemiczne połączenie dwóch ligandów, które niezależnie wiążą się z tymi samymi lub różnymi białkami11,12,13,14,15,16 lub polegają na wyborze białek wiążących, takich jak przeciwciała skierowane przeciwko istniejącym wcześniej kompleksom białko-cząsteczka drobnocząsteczkowa17,18, a zatem mają ograniczony wybór ligandów.

Niedawno opracowaliśmy kombinacyjnąmetodę wyboru CID (COMBINES-CID) do inżynierii de novo systemów CID19. Metoda ta pozwala uzyskać wysoką swoistość dimeryzacji indukowanej ligandem (np. stała dysocjacji spoiwa zakotwiczenia-dimeryzacji, KD (bez liganda) / KD (z ligandem) > 1 000). Specyficzność dimeryzacji uzyskuje się przy użyciu spoiw kotwiczących z elastycznymi miejscami wiązania, które mogą wprowadzać zmiany konformacyjne po związaniu liganda, stanowiąc podstawę do wyboru spoiw konformacyjnie selektywnych, rozpoznając tylko wiązania kotwiczne związane z ligandem. Wykazaliśmy dowód słuszności zasady, tworząc indukowane kannabidiolem (CBD) heterodimery nanociał, funkcjonalny fragment przeciwciała o sile 12-15 kDa z wielbłądowatych, składający się z uniwersalnego rusztowania i trzech elastycznych pętli CDR (Rysunek 2)20, które mogą tworzyć kieszeń wiążącą o rozmiarach dostosowanych do epitopów małocząsteczkowych21,22. Warto zauważyć, że selekcja in vitro kombinatorycznej biblioteki białek powinna być opłacalna i możliwa do uogólnienia dla inżynierii CID, ponieważ ta sama wysokiej jakości biblioteka może być stosowana do różnych ligandów.

W tym protokole i filmie skupiamy się na opisie dwuetapowej selekcji in vitro i walidacji spoiw kotwiczących (Rysunek 3A) i dimeryzacyjnych (Rysunek 3B) poprzez przesiewanie kombinatorycznej biblioteki nanokomórek o różnorodności wyższej niż 109 przy użyciu CBD jako celu, ale protokół powinien mieć zastosowanie do innych bibliotek białek lub celów małocząsteczkowych. Badanie przesiewowe spoiw CID trwa zwykle 6–10 tygodni (Rysunek 4).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa biblioteki

  1. Użyj syntetycznej kombinatorycznej biblioteki przeciwciał jednodomenowych o różnorodności ~1,23–7,14 x 109, jak opisano wcześniej19. Chociaż ten protokół nie obejmuje budowy bibliotek, może być stosowany do innych bibliotek wiążących kombinatorycznie.

2. Biotynylacja celu ligandowego lub liganda

  1. Biotynyluj wybrany ligand, na przykład CBD i tetrahydrokannabinol (THC)19, za pomocą różnych strategii syntezy chemicznej, w zależności od odpowiednich miejsc biotynylacji celu.

3. Przesiewanie segregatorów kotwicznych

  1. Początek selekcji
    1. Rozpocznij każdą rundę selekcji od zaszczepienia pojedynczej kolonii komórek TG1, świeżo wyhodowanej w 6 ml 2YT w temperaturze 37 °C i 250 obrotach na minutę (rpm) do absorbancji 600 nm (OD600) ~0,5. Inkubować komórki na lodzie w celu użycia w kroku 3.5.1.
  2. Selekcja negatywna za pomocą kulek streptawidyny związanych z biotyną
    1. Przygotować "kulki selekcyjne negatywne" przemywając 300 μl kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną za pomocą stojaka do separacji magnetycznej, 3x z 0,05% soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z buforem Tween (PBST, 1 x PBS z 0,05% obj. / obj. Tween 20%) i 2x z 1 x PBS.
    2. Ponownie zawiesić kulki 1 ml 1% kazeiny w 1 x PBS (pH = 7,4) i nasycić kulki, dodając 5-krotność podanej zdolności wiązania za pomocą biotyny. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) na rotatorze przez 1 godzinę.
    3. Umyj koraliki 5x używając 0,05% PBST i 3x używając 1 x PBS, co daje w sumie osiem prań.
    4. Dodać ~1013 cząstek fagów w 1% kazeinie/1% BSA w 1 x PBS (pH = 7,4) i inkubować w temperaturze RT na rotatorze przez 1 godzinę.
    5. Po inkubacji zebrać supernatant, który ma być użyty w kroku 3.3.6.
  3. Selekcja pozytywna z biotynylowanymi kulkami streptawidyny związanymi z ligandem
    1. Przygotować "koraliki selekcji pozytywnej", używając 1/2 objętości koralików użytych do "koralików selekcji negatywnej", wykonując czynności 3.2.1.
    2. Ponownie zawiesić kulki za pomocą 1 ml 1% kazeiny w 1 × PBS, pH 7,4 i nasycić kulki, dodając 5-krotność pełnej zdolności wiązania obliczonej na podstawie instrukcji przy użyciu wybranego biotynylowanego ligandu. Inkubować w temperaturze pokojowej na rotatorze przez 1 godzinę.
    3. Umyj koraliki 5x używając 0,05% PBST i 3x używając 1 x PBS, co daje w sumie osiem prań.
    4. Zablokuj kulki 1 ml 1% kazeiny/1% BSA w 1 x PBS (pH = 7,4) i inkubuj w temperaturze pokojowej na rotatorze przez 1 godzinę, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu między fagami a kulkami magnetycznymi pokrytymi streptawidyną.
    5. Umyj kulki magnetyczne pokryte streptawidyną 3 razy przy użyciu 0,05% PBST i jeden raz za pomocą 1 x PBS, co daje w sumie cztery prania.
    6. Zawiesić ponownie kulki magnetyczne pokryte streptawidyną, używając niezwiązanych fagów pobranych z kroku 3.2.5 i inkubować w temperaturze pokojowej na rotatorze przez 1 godzinę.
    7. Ekstrahować supernatant bez naruszania kulek magnetycznych. Zapisz niezwiązane fagi jako dane wejściowe, które zostaną użyte w kroku 3.5.1.
    8. Umyj koraliki 10x używając 0,05% PBST i 5x używając 1 x PBS. Pomiędzy każdymi trzema płukaniami przenieś je do nowej probówki, aby uniknąć fagów niespecyficznie związanych ze ściankami probówki.
  4. Elucja nanociał wyświetlanych przez fagi
    1. Kompetycyjnie eluować związane fagi przez dodanie 450 μl niebiotynylowanego ligandu, stosując stężenie w zakresie mikromolowym (np. 10–50 μM) i inkubując w temperaturze pokojowej na rotatorze przez 30 minut. Wybrane stężenie ligandów do konkurencyjnej elucji związanych fagów zależy od pożądanego K D "spoiwa kotwicznego". Stężenia ligandów mogą być stosunkowo wysokie w początkowych rundach selekcji, a następnie zmniejszać się w późniejszych rundach.
    2. Zebrać supernatant i zapisać wymyte fagi jako dane wyjściowe, które zostaną użyte w kroku 3.5.2.
  5. Miareczkowanie wejścia/wyjścia i infekcja
    1. Do miareczkowania wejściowego należy przygotować 10 seryjnych rozcieńczeń w 1 x PBS do 10 9-krotnie z fagiem wejściowym z kroku 3.3.7. Użyj10 7-10 9 seryjnych rozcieńczeń do przeprowadzenia infekcji, przenosząc 10 μl faga wejściowego z każdego rozcieńczenia do 70 μl komórek TG1 (OD600 ~ 0,5). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut, ułożyć zakażone komórki TG1 na trzech 90-milimetrowych szalkach agarowych 2YT zawierających 100 μg/ml ampicyliny i 2% (wag./obj.) glukozy i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Na podstawie nocnych płytek wprowadzanie fagów można obliczyć w następujący sposób:
      figure-protocol-1
    2. W celu uzyskania infekcji wyjściowej i miareczkowania przenieś eluowane fagi z etapu 3.4.2 do 3 ml komórek TG1 (OD600 ~0,5). Inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 45 minut. Następnie przygotować 10 rozcieńczeń seryjnych w 2YT do 103-krotnie, rozlać każde rozcieńczenie na 90 mm szalkach z agarem 2YT i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Na podstawie płytek nocnych produkcję fagów można obliczyć w następujący sposób:
      figure-protocol-2
    3. Podzielić pozostałe zakażone komórki TG1 na trzech 150-milimetrowych płytkach agarowych 2YT zawierających 100 μg/ml ampicyliny i 2% (wag./obj.) glukozy. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
  6. Wzmacnianie i odzyskiwanie biblioteki dla dalszych rund selekcji
    1. Dodać 3 ml 2YT na płytkę, zeskrobać sterylnym skrobakiem do komórek i zebrać wszystkie komórki w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Zebrane komórki wymieszać ze sterylnym glicerolem (20% wag./obj. stężenie końcowe). Zmierzyć OD600 mieszaniny i zrobić 3–5 porcji podstawowych. Przechowywać w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.
    2. W celu ratowania fagów rozcieńczyć mieszaninę bakteryjną TG1 zawierającą fagi za pomocą 25 ml pożywki 2YT uzupełnionej 2% glukozą i ampicyliną 100 μg/ml do OD600 ~0,1. Komórki hodowlane w temperaturze 37 °C i prędkości obrotowej 250 obr./min do OD600 ~0,5.
    3. Nadkażać komórki, dodając faga pomocniczego CM13 w stężeniach 5 x 10 9 pfu/ml i inkubować w temperaturze 37 °C i 250 obr./min przez 45 min. pomocniczy CM13 dostarcza białka płaszcza fagowego wymagane do składania kompletnych cząstek fagowych.
    4. Odwirować kulturę przy 8 000 x g przez 10 minut, aby usunąć glukozę. Zawiesić komórki za pomocą 50 ml pożywki 2YT uzupełnionej 100 μg/ml ampicyliny i 50 μg/ml kanamycyny i inkubować w temperaturze 25 °C i 250 obr./min przez noc.
    5. Odwirować komórki z hodowli przez noc w temperaturze 9 000 x g, 4 °C przez 30 minut. Przenieść supernatant do nowej probówki i wytrącić fagi w supernatancie za pomocą roztworu PEG/NaCl o objętości 1/5 (glikol polietylenowy 20% wag./obj.-6.000 i 2,5 M NaCl). Delikatnie wymieszaj i ułóż na lodzie na 1 godzinę.
    6. Zebrać cząstki fagów przez odwirowanie przy użyciu 12 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 min. Ponownie zawiesić granulki za pomocą 1 ml 1 x PBS i przenieść zawiesinę do probówki mikrowirówkowej. Odwirować probówkę przy 20 000 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut, aby usunąć resztki bakterii.
    7. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki, nie naruszając osadu bakteryjnego. Użyć rozcieńczenia 1:100, aby zmierzyć absorpcję przy 269 nm i 320 nm. Całkowitą liczbę fagów można obliczyć za pomocą następującego wzoru23:
      figure-protocol-3
    8. Przechowywać bibliotekę fagów w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego stosowania lub z 25% glicerolem w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.
    9. Powtarzaj rundy selekcji (kroki 3.1–3.6) przez 3–6 rund lub do momentu, gdy zaobserwuje się pożądane wzbogacenie (patrz sekcja Wyniki). Płytkować i wybierać pojedyncze klony (sekcja 4) w celu scharakteryzowania ich powinowactwa i swoistości do liganda (sekcje 5-7).

4. Izolacja pojedynczego klonu

  1. Aby wyizolować poszczególne klony ze wzbogaconej podbiblioteki, należy przygotować 10-krotne seryjne rozcieńczenia komórek TG1 zakażonych fagami (krok 3.5.2). Rozcieńczenia płytkowe należy rozcieńczać seryjnie na 90 mm szalkach agarowych 2YT zawierających 100 μg/ml ampicyliny i 2% (wag./obj.) glukozy i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  2. Z nocnych płytek pobrać pojedyncze kolonie do 250 μl pożywki 2YT uzupełnionej 100 μg/ml ampicyliny na dołek w sterylnych płytkach głębokich i rosnąć w temperaturze 37 °C przez noc.
  3. Z nocnych kultur zaszczepić 10 μl w 500 μl świeżej pożywki 2YT uzupełnionej 100 μg/ml ampicyliny.
  4. Hoduj komórki do OD600 ~0,5, dodaj pomocniczy CM13 przy 5 x 109 pfu / ml i inkubuj w temperaturze 37 °C i 250 obr./min przez 45 min.
  5. Dodać 500 μl pożywki 2YT uzupełnionej 100 μg/ml ampicyliny i 50 μg/ml kanamycyny. Inkubować przez noc w temperaturze 25 °C i 250 obr./min.
  6. Odwirować płytki głębinowe z nocnych kultur przy 3 000 x g przez 10 minut. Zebrać supernatant zawierający cząstki faga bez naruszania osadu komórkowego.
  7. Cząstki fagów można wykorzystać do testu ELISA w celu określenia specyficzności wybranych klonów w stosunku do liganda. Jako kontrolę ujemną można zastosować biotynę lub homolog strukturalny celu.

5. Walidacja segregatora kotwicznego przez ELISA

  1. Pokryj 96-dołkowe płytki ELISA przy użyciu 100 μl 5 μg/ml streptawidyny w buforze powlekającym (100 mM bufor węglanowy, pH = 8,6) w temperaturze 4 °C przez noc.
  2. Umyj płytki ELISA 3x przy użyciu 0,05% PBST i dodaj 100 μL 1 μM biotynylowanej tarczy do dołków docelowych. Dodać 100 μl 1 μM biotyny lub homologu docelowego do studzienek kontrolnych. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  3. Umyj płytki 5x używając 0,05% PBST i zablokuj niespecyficzne wiązanie, dodając 300 μL 1% kazeiny w 1 x PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  4. Umyj płytki ELISA 3x za pomocą 0,05%-PBST i dodaj oczyszczony supernatant fagowy. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  5. Umyj płytki ELISA 10x używając 0,05% PBST i dodaj 100 μl przeciwciała przeciwko białku peroksydazy chrzanowej (HRP)-M13 (rozcieńczenie 1:10 000 z 1 x PBS z 1% kazeiną). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  6. Umyj płytki ELISA 3x używając 0,05% PBST i dodaj 100 μl substratu tetrametylobenzydyny (TMB). Inkubować przez 10 minut lub do momentu, gdy zaobserwuje się widoczną zmianę koloru. Zatrzymać reakcję, dodając 100 μl 1 M HCl. Odczytać płytkę przy 450 nm na spektrofotometrze.
  7. Do ekspresji i oczyszczania białek wybierz klony wykazujące wysokie powinowactwo i swoistość dla celu (patrz Dyskusja).

6. Ekspresja, oczyszczanie i biotynylacja białek

  1. Jak wcześniej informowaliśmy19, subklonuj wybrane klony z sekcji 5 i wyrażaj się jako C-końcowe nanociała oznaczone tagiem Avi i His.
  2. Ekspresja wybranych nanociał w peryplazmie komórek E. coli WK6 (zwykle w hodowli 1 L), uwolnienie przez szok osmotyczny i oczyszczenie za pomocą kolumny niklowo-NTA (patrz tabela materiałów).
  3. Bufor wymienny z kolumną odsalającą (1 x PBS z 5% glicerolem; patrz tabela materiałów).
  4. Biotynyluj nanociała za pomocą zestawu komercyjnego (patrz Tabela materiałów) do dalszego wykorzystania.

7. Charakterystyka spoiwa kotwicznego przez BLI

  1. Analiza powinowactwa i kinetyki wiązania wybranych spoiw kotwiczących poprzez unieruchomienie 200 nM biotynylowanych spoiw kotwiczących na biosensorach streptawidyny (patrz tabela materiałów) z buforem do oznaczania wiązania (1 x PBS (pH = 7,4), 0,05% Tween 20, 0,2% BSA, 3% metanolu).
  2. Obliczyć stałe dysocjacji (KD) oddziaływań wiążących kotwicę-ligand za pomocą analizy w stanie ustalonym przy użyciu oprogramowania do analizy danych (patrz tabela materiałów). Uzyskane wartości K D zwykle wahają się od jedno- do dwucyfrowych mikromolowych.

8. Badanie przesiewowe spoiwa dimeryzacyjnego

UWAGA: Badanie przesiewowe biopanoramiczne "spoiw dimeryzacyjnych" jest podobne do tego w przypadku spoiw kotwicznych, z wyjątkiem dwóch krytycznych etapów: 1) Spoiwa dimeryzacyjne są wybierane przy użyciu wybranego biotynylowanego spoiwa kotwicznego i kompleksu wiążącego-ligandowego odpowiednio dla selekcji negatywnej i pozytywnej. 2) Na etapie elucji 100 mM trietyloaminy jest używane do elucji pozytywnie wybranych fagów, które były związane tylko z kompleksem wiążącym kotwicę - ligand. 100 mM roztwór trimetyloaminy (pH = 11,5) służy do elucji dodatnich klonów poprzez zakłócanie interakcji białkowych.

  1. Początek selekcji
    1. Rozpocznij każdą rundę selekcji od zaszczepienia pojedynczej kolonii komórek TG1, świeżo wyhodowanej na minimalnej pożywce, w 6 ml 2YT w temperaturze 37 °C i 250 obr./min do OD600 ~0,5. Inkubuj komórki na lodzie.
  2. Usuwanie negatywnie wybranych nanociał
    1. Przygotuj "rurkę odejmującą" za pomocą 400 μl kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną i postępuj zgodnie z krokiem 3.2. Jednak zamiast nasycać biotyną, dodaj 5-krotność obliczonej pełnej zdolności wiązania za pomocą wybranego biotynylowanego spoiwa kotwicznego i zachowaj niezwiązane fagi do użycia w kroku 8.3.3.
  3. Selekcja pozytywnie dobranych nanociał
    1. Przygotować "probówkę wychwytującą", używając 1/2 objętości kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną używanych do "rurki odejmującej" i wykonując kroki 3.3.2 do 3.3.3. Jednak zamiast nasycać biotynylowanym ligandem, dodaj pięciokrotność obliczonej pełnej zdolności wiązania przy użyciu wybranego biotynylowanego spoiwa kotwicznego.
    2. Aby utworzyć kompleks wiążący ligand dla wyboru spoiwa o dodatniej dimeryzacji, dodaj wystarczająco wysokie stężenie niebiotynylowanego ligandu. Pozwoli to większości spoiw kotwiczących związanych ze streptawidyną na utworzenie kompleksu związanego z ligandem.
    3. Wykonaj kroki od 3.3.3 do 3.3.8, używając niezwiązanych fagów pobranych z "rurki odejmującej".
  4. Elucja pozytywnie wybranych nanociał
    1. Eluować fagi związane z kompleksem wiążącym kotwicę-ligand, dodając 450 μl 100 mM trietyloaminy i inkubując w temperaturze pokojowej na rotatorze przez 10 minut.
    2. Zbierz konkurencyjnie eluowane fagi i wykonaj kroki od 3.4.1 do 3.4.2.
  5. Kolejne rundy wyboru spoiwa dimeryzacyjnego
    1. Wykonaj kroki 3.5 i 3.6, aby wzmocnić i odzyskać bibliotekę w celu przeprowadzenia kolejnych rund selekcji. Powtarzaj rundy selekcji przez 3–6 rund lub do momentu, gdy zaobserwuje się pożądane wzbogacenie. Płytki i wybieranie pojedynczych klonów (patrz sekcja 4) w celu scharakteryzowania ich powinowactwa i swoistości do celu.

9. Charakterystyka spoiwa dimeryzacyjnego za pomocą testu ELISA

  1. Postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi w sekcji 4, aby wyizolować poszczególne klony do charakterystyki za pomocą testu ELISA.
  2. Aby przetestować powinowactwo kandydatów na spoiwo dimeryzacyjne do kompleksu wiążącego kotwicę-ligand, pokryj płytkę docelową ELISA 100 μl biotynylowanego spoiwa kotwicznego. Po inkubacji przez 1 godzinę dodać 1 μM docelowego liganda, aby utworzyć kompleks wiążący ligand.
  3. Płytka kontrolna powinna być pokryta przy użyciu samego biotynylowanego spoiwa kotwicznego, aby odsiać klony, które mogą również wiązać się z wolnym spoiwem kotwowym. Dodać 100 μl biotynylowanego spoiwa kotwicznego o stężeniu 100 nM i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  4. Postępuj zgodnie z sekcjami 5.3–5.7.

10. Charakterystyka spoiwa dimeryzacyjnego za pomocą BLI

  1. Powinowactwo wiązania i kinetykę spoiw dimeryzacyjnych dla kompleksu wiążącego kotwica-ligand można analizować poprzez immobilizację biotynylowanych spoiw dimeryzacyjnych na bioczujnikach streptawidyny (SA) z buforem do oznaczania wiązania, a następnie oznaczać spoiwem kotwicznym 1 μM wstępnie zrównoważonym seryjnymi rozcieńczeniami ligandu. Wartości K,D, kon i koff interakcji można obliczyć za pomocą naszej raportowanej metody19.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy dwuetapową selekcję in vitro i walidację spoiw kotwiczących i dimeryzujących, przesiewając kombinatoryczną bibliotekę nanoników o różnorodności wyższej niż 109 przy użyciu CBD jako celu. Ważna jest ocena wzbogacenia biopanowania fagów podczas kolejnych rund selekcji zarówno dla spoiw kotwiczących, jak i dimeryzacyjnych. Typowe wyniki wzbogacania po 4–6 rundach selekcji, jak pokazano w Rysunek 5, są dobrą wskazówką, że istnieje wysoki współczynnik potencjalnych trafień w ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bardzo ważne jest, aby wybrać odpowiednie stężenia wejściowych bibliotek fagowych dla różnych rund biopanowania. Zazwyczaj zaczynaliśmy od biblioteki wejściowej składającej się z ~1012–1013 cząstek fagowych o różnorodności >109, co pozwalało na przedstawienie ~100–1,000 kopii każdego klonu faga w teście pull-down. Jeśli stężenie faga w teście wiązania jest zbyt wysokie lub niskie, prawdopodobieństwo niespecyficznego wiązania lub utraty dodatnich klonów wzrośnie. Wybór spoiwa kotwiczącego ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tymczasowy patent związany z tą pracą został złożony przez Uniwersytet Waszyngtoński.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez University of Washington Innovation Award (dla L.G.), grant od U.S. National Institutes of Health (1R35GM128918 dla L.G.) oraz fundusz startowy Uniwersytetu Waszyngtońskiego (dla L.G.). H.J. był wspierany przez stypendium licencjackie Washington Research Foundation. K.W. był wspierany przez stypendium licencjackie z University of Washington Institute for Protein Design.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-stopniowy roztwór substratu Ultra TMB ELISAThermo Fisher Scientific34029
AgarThermo Fisher ScientificBP1423-2
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15 (odcięcie 3 kDa)MiliporeUFC900324
AmpicylinaThermo Fisher ScientificBP1760-25
Bio-Rad Zestaw do oznaczania białek IIBio-Rad
BirA Standardowy zestaw reakcyjny ligazy biotynowo-białkowejAvidityBirA500
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA2153-50G
KazeinaSigma-AldrichC7078-1KG
CM13 pomocniczyPrzeciwciało Design LabsPH020L
D-(+)-Monohydrat glukozyAlfaAesar A11090
Dynabeads M-280 StreptavidinThermo Fisher Scientific11205D
Magnes DynaMag-2Thermo Fisher Scientific12321D
EDTAThermo Fisher ScientificBP120-1
Szybka drabina DNANew England BiolabsN3238S
FastDigest BglIThermo Fisher ScientificFD0074
GlycerolThermo Fisher ScientificBP229-1
HiLoad 16/600 Superdex 200 pgGE Healthcare28989335
HiPrep 26/10 Kolumna odsalającaGE Healthcare17508701
HisTrap-FF-1mlGE Healthcare11000458
ImidazolAlfa Aesar161-0718
IPTGThermo Fisher Scientific34060
KanamycinThermo Fisher ScientificBP906-5
M13 Przeciwciało białkowe MajorCoat Santa Cruz Biotechnologysc-53004
NaClSigma-AldrichS3014-500G
NanoDrop 2000/2000c SpektrofotometryThermo Fisher ScientificND-2000
Nunc 96-Well Polipropylen DeepWell Talerze do przechowywaniaThermo Fisher Scientific260251
Nunc MaxiSorpThermo Fisher Scientific44-2404-21
Octet RED96ForteBioN/A
pADL-23c Phagemid VectorAntibody Design LabsPD0111
PEG-6000Sigma-Aldrich81260-1KG
Platynowa polimerazaDNA SuperFiZestaw do oczyszczania PCR Invitrogen12351010
PureLinkThermo Fisher ScientificK310001
Zestaw QIAprep Spin M13Qiagen27704
Medium regeneracyjneLucigen80026-1
SpectraMax Plus 384Urządzenia molekularneNie dotyczy Sacharozy
Sigma-AldrichS0389-1KG
Biosensory Super Streptawidyny (SSA)ForteBio18-5057
Superdex 75 wzrost 10/300 GL KolumnaGE Healthcare28-9909-44
T4 Ligaza DNAThermo Fisher Scientific15224-025
TG1 Komórki elektrokompetentneLucigen60502-1
TrietyloaminaSigma-Aldrich471283-100mL
Trizma BaseSigma-AldrichT1503
TryptonThermo Fisher ScientificBP9726-5
Tween 20Thermo Fisher ScientificBP337-500
Ekstrakt drożdżowyThermo Fisher ScientificBP1422-2
Kolumna odsalająca Zeba SpinThermo Fisher Scientific89882
5000002

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. Chemically induced proximity in biology and medicine. Science. 359 (6380), (2018).
  2. Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), (2015).
  3. Straathof, K. C., et al. An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy. Blood. 105 (11), 4247-4254 (2005).
  4. Di Stasi, A., et al. Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy. The New England Journal of Medicine. 365 (18), 1673-1683 (2011).
  5. Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophysical Journal. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  6. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).
  7. Hunter, M. M., Margolies, M. N., Ju, A., Haber, E. High-affinity monoclonal antibodies to the cardiac glycoside, digoxin. Journal of Immunology. 129 (3), 1165-1172 (1982).
  8. Bradbury, A. R. M., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nature Biotechnology. 29 (3), 245-254 (2011).
  9. Chen, G., et al. Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS). Nature. Biotechnology. 19 (6), 537-542 (2001).
  10. Tinberg, C. E., et al. Computational design of ligand-binding proteins with high affinity and selectivity. Nature. 501 (7466), 212-216 (2013).
  11. Spencer, D. M., Wandless, T. J., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Controlling signal transduction with synthetic ligands. Science. 262 (5136), 1019-1024 (1993).
  12. Ho, S. N., Biggar, S. R., Spencer, D. M., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Dimeric ligands define a role for transcriptional activation domains in reinitiation. Nature. 382 (6594), 822-826 (1996).
  13. Belshaw, P. J., Ho, S. N., Crabtree, G. R., Schreiber, S. L. Controlling protein association and subcellular localization with a synthetic ligand that induces heterodimerization of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4604-4607 (1996).
  14. Farrar, M. A., AlberolaIla, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).
  15. Erhart, D., et al. Chemical Development of Intracellular Protein Heterodimerizers. Chemistry & Biology. 20 (4), 549-557 (2013).
  16. Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 17 (5), 5475(2014).
  17. Hill, Z. B., Martinko, A. J., Nguyen, D. P., Wells, J. A. Human antibody-based chemically induced dimerizers for cell therapeutic applications. Nature Chemical Biology. 14 (2), 112-117 (2018).
  18. Foight, G. W., et al. Multi-input chemical control of protein dimerization for programming graded cellular responses. Nature Biotechnology. 37 (10), 1209-1216 (2019).
  19. Kang, S., et al. COMBINES-CID: An efficient method for de novo engineering of highly specific chemically induced protein dimerization systems. Journal of the American Chemical Society. 141 (28), 10948-10952 (2019).
  20. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  21. Fanning, S. W., Horn, J. R. An anti-hapten camelid antibody reveals a cryptic binding site with significant energetic contributions from a nonhypervariable loop. Protein Science. 20 (7), 1196-1207 (2011).
  22. Zavrtanik, U., Luken, J., Loris, R., Lah, J., Hadzi, S. Structural basis of epitope recognition by heavy-chain camelid antibodies. Journal of Molecular Biology. 430 (21), 4369-4386 (2018).
  23. Denhardt, D. T., Dressler, D., Ray, D. S. The Single-Stranded DNA Phages. , 605-625 (1978).
  24. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Research. 22 (25), 5600-5607 (1994).
  25. Gu, L., et al. Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcoded proteins. Nature. 515 (7528), 554-557 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Chemically Induced DimerizationPhage Display SelectionCombinatorial Nanobody LibraryAnchor BindersDimerization BindersBio Layer InterferometryStreptavidin Coated BeadsCompetitive ElutionSingle Clone ELISASize Exclusion Chromatography

Related Articles