Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Tworzenie wysoce specyficznych, chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek poprzez stopniową selekcję fagów w kombinatorycznej bibliotece przeciwciał jednodomenowych

7.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60738

⸱

14 stycznia 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Institute for Protein Design, University of Washington

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tworzenie chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek o pożądanym powinowactwie i specyficzności dla dowolnego ligandu małych cząsteczek miałoby wiele zastosowań w biologicznym wykrywaniu i uruchamianiu. W tym miejscu opisujemy wydajną, uogólnioną metodę inżynierii de novo chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji poprzez krokowy wybór kombinatorycznej biblioteki przeciwciał jednodomenowych wyświetlanej przez fagi.

Streszczenie

Zdarzenia dimeryzacji białek, które występują tylko w obecności ligandu drobnocząsteczkowego, umożliwiają rozwój biosensorów małocząsteczkowych do analizy i manipulacji szlakami biologicznymi. Obecnie istnieje tylko ograniczona liczba systemów dimeryzacji indukowanej chemicznie (CID), a opracowanie nowych systemów o pożądanej czułości i selektywności dla określonych ligandów małocząsteczkowych pozostaje wyzwaniem w dziedzinie inżynierii białek. Opisujemy tutaj wysokoprzepustową metodę przesiewową, kombinatoryczny wybórCID (COMBINES-CID), do inżynierii de novo systemów CID mających zastosowanie do szerokiej gamy ligandów. Metoda ta wykorzystuje dwuetapową selekcję kombinatorycznej biblioteki nanoników wyświetlanej przez fagi w celu uzyskania 1) "spoiw kotwicznych", które najpierw wiążą się z interesującym ligandem, a następnie 2) "wiązań dimeryzacyjnych", które wiążą się tylko z kompleksami wiążącymi spoiwo-ligand. Aby wybrać wiązania kotwiczne, kombinatoryczna biblioteka ponad 109 randomizowanych nanociał w regionie determinującym komplementarność (CDR) jest przesiewana za pomocą biotynylowanego liganda, a trafienia są weryfikowane za pomocą nieznakowanego liganda za pomocą interferometrii warstwy biologicznej (BLI). Aby uzyskać spoiwa dimeryzacyjne, biblioteka nanoma jest przesiewana kompleksami wiążąco-ligandowymi jako celami do pozytywnego przesiewania i niezwiązanymi wiązaniami kotwicznymi do ujemnego przesiewu. COMBINES-CID ma szerokie zastosowanie do selekcji spoiw CID z innymi immunoglobulinami, nieimmunoglobulinami lub rusztowaniami zaprojektowanymi obliczeniowo w celu stworzenia bioczujników do wykrywania in vitro i in vivo leków, metabolitów, cząsteczek sygnałowych itp.

Wprowadzenie

Systemy CID, w których dwa białka dimeryzują tylko w obecności liganda o małych cząsteczkach (Rysunek 1), oferują wszechstronne narzędzia do analizowania i manipulowania szlakami metabolicznymi, sygnałowymi i innymi szlakami biologicznymi1. Wykazali oni potencjał biologicznej aktywacji, takiej jak aktywacja limfocytów T kontrolowana przez leki2 i apoptoza3,4, w celu poprawy bezpieczeństwa i skuteczności adoptywnej terapii limfocytami T. Ponadto opracowano nową metodologię wykrywania celów małocząsteczkowych in vivo lub in vitro. Na przykład, białka CID mogą być genetycznie łączone z systemami reporterowymi fluorescencji (np. transfer energii rezonansu fluorescencji (FRET)5 i cyrkularnie permutowane białka fluorescencyjne)6 do pomiarów in vivo w czasie rzeczywistym lub służyć jako odczynniki powinowactwa do testów podobnych do testów immunoenzymatycznych (ELISA).

Pomimo ich szerokich zastosowań, tworzenie nowych systemów CID, które mogą być kontrolowane przez dany ligand małocząsteczkowy, stanowi poważne wyzwanie. Uznane metody inżynierii wiązarek białkowych, w tym immunizacja zwierząt7, selekcja in vitro8,9 i obliczeniowe projektowanie białek10 mogą generować białka wiążące ligandy, które działają poprzez binarne interakcje białko-ligand. Jednak metody te mają trudności z utworzeniem indukowanego ligandem trójskładnikowego kompleksu CID. Niektóre metody tworzą CID poprzez chemiczne połączenie dwóch ligandów, które niezależnie wiążą się z tymi samymi lub różnymi białkami11,12,13,14,15,16 lub polegają na wyborze białek wiążących, takich jak przeciwciała skierowane przeciwko istniejącym wcześniej kompleksom białko-cząsteczka drobnocząsteczkowa17,18, a zatem mają ograniczony wybór ligandów.

Niedawno opracowaliśmy kombinacyjnąmetodę wyboru CID (COMBINES-CID) do inżynierii de novo systemów CID19. Metoda ta pozwala uzyskać wysoką swoistość dimeryzacji indukowanej ligandem (np. stała dysocjacji spoiwa zakotwiczenia-dimeryzacji, KD (bez liganda) / KD (z ligandem) > 1 000). Specyficzność dimeryzacji uzyskuje się przy użyciu spoiw kotwiczących z elastycznymi miejscami wiązania, które mogą wprowadzać zmiany konformacyjne po związaniu liganda, stanowiąc podstawę do wyboru spoiw konformacyjnie selektywnych, rozpoznając tylko wiązania kotwiczne związane z ligandem. Wykazaliśmy dowód słuszności zasady, tworząc indukowane kannabidiolem (CBD) heterodimery nanociał, funkcjonalny fragment przeciwciała o sile 12-15 kDa z wielbłądowatych, składający się z uniwersalnego rusztowania i trzech elastycznych pętli CDR (Rysunek 2)20, które mogą tworzyć kieszeń wiążącą o rozmiarach dostosowanych do epitopów małocząsteczkowych21,22. Warto zauważyć, że selekcja in vitro kombinatorycznej biblioteki białek powinna być opłacalna i możliwa do uogólnienia dla inżynierii CID, ponieważ ta sama wysokiej jakości biblioteka może być stosowana do różnych ligandów.

W tym protokole i filmie skupiamy się na opisie dwuetapowej selekcji in vitro i walidacji spoiw kotwiczących (Rysunek 3A) i dimeryzacyjnych (Rysunek 3B) poprzez przesiewanie kombinatorycznej biblioteki nanokomórek o różnorodności wyższej niż 109 przy użyciu CBD jako celu, ale protokół powinien mieć zastosowanie do innych bibliotek białek lub celów małocząsteczkowych. Badanie przesiewowe spoiw CID trwa zwykle 6–10 tygodni (Rysunek 4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Konstrukcja biblioteki

  1. Należy użyć syntetycznej kombinatorycznej biblioteki przeciwciał jednodomenowych o różnorodności ok. 1,23–7,14 x 109, zgodnie z wcześniejszym opisem19. Choć niniejszy protokół nie obejmuje konstrukcji biblioteki, można go zastosować do innych kombinatorycznych bibliotek ligandów.

2. Biotynylacja celu ligandu lub ligandu

  1. przeprowadź biotynylację wybranego ligandu, na przykład CBD oraz tetrahydrokanabinolu (THC)19, stosując różne strategie syntezy chemicznej, w zależności od odpowiednich miejsc biotynylacji w cząsteczce docelowej.

3. Przesiewanie wiążących kotwic

  1. Rozpoczęcie selekcji
    1. Każdą rundę selekcji rozpocznij od inokulacji pojedynczej kolonii komórek TG1, świeżo wyhodowanej w 6 mL pożywki 2YT w temperaturze 37 ˚C i przy 250 obrotach na minutę (rpm), do absorbancji 600 nm (OD600) na poziomie ~0,5. Inkubuj komórki na lodzie do wykorzystania w kroku 3.5.1.
  2. Selekcja negatywna z użyciem kulek streptawidyny związanych z biotyną
    1. Przygotuj „kuleczki do selekcji negatywnej”, przemywając 300 µL magnetycznych kuleczek pokrytych streptawidyną za pomocą statywu do separacji magnetycznej: 3x buforem fosforanowym z Tweenem 0,05% (PBST, 1 x PBS z 0,05% obj. obj. Tween 20%) oraz 2x buforem 1 x PBS.
    2. Resuspenduj kuleczki w 1 mL 1% kazeiny w 1 x PBS (pH = 7,4) i nasyć je, dodając biotynę w ilości 5-krotnie przekraczającej zgłoszoną pojemność wiązania. Inkubuj w temperaturze pokojowej (RT) na rotatorze przez 1 h.
    3. Przemyj kuleczki 5x buforem 0,05% PBST i 3x buforem 1 x PBS, łącznie osiem razy.
    4. Dodaj ~1013 cząsteczek fagów w 1% kazeinie/1% BSA w 1 x PBS (pH = 7,4) i inkubuj w RT na rotatorze przez 1 h.
    5. Po inkubacji zbierz nadsącz do wykorzystania w kroku 3.3.6.
  3. Selekcja pozytywna z użyciem kulek streptawidyny związanych z biotynilowanym ligandem
    1. Przygotuj „kuleczki do selekcji pozytywnej”, używając połowy objętości kuleczek stosowanych w przypadku „kuleczek do selekcji negatywnej”, zgodnie z krokiem 3.2.1.
    2. Resuspenduj kuleczki w 1 mL 1% kazeiny w 1 × PBS, pH 7,4 i nasyć je, dodając wybrany biotynilowany ligand w ilości 5-krotnie przekraczającej pełną pojemność wiązania obliczoną na podstawie instrukcji. Inkubuj w RT na rotatorze przez 1 h.
    3. Przemyj kuleczki 5x buforem 0,05% PBST i 3x buforem 1 x PBS, łącznie osiem razy.
    4. Zablokuj kuleczki, dodając 1 mL 1% kazeiny/1% BSA w 1 x PBS (pH = 7,4) i inkubuj w RT na rotatorze przez 1 h, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu fagów z magnetycznymi kuleczkami pokrytymi streptawidyną.
    5. Przemyj magnetyczne kuleczki pokryte streptawidyną 3x buforem 0,05% PBST i jeden raz buforem 1 x PBS, łącznie cztery razy.
    6. Resuspenduj magnetyczne kuleczki pokryte streptawidyną, używając nie związanych fagów pobranych z kroku 3.2.5, i inkubuj w RT na rotatorze przez 1 h.
    7. Odbierz nadsącz, nie naruszając kuleczek magnetycznych. Zachowaj nie związane fagi jako materiał wejściowy (input) do wykorzystania w kroku 3.5.1.
    8. Przemyj kuleczki 10x buforem 0,05% PBST i 5x buforem 1 x PBS. Po każdych trzech przemyciach przenieś je do nowej probówki, aby uniknąć niespecyficznego wiązania fagów do ścianek probówki.
  4. Elucja nanociał prezentowanych na fagach
    1. Przeprowadź konkurencyjną elucję związanych fagów, dodając 450 µL liganda niebiotynilowanego w stężeniu z zakresu mikromolarnego (np. 10–50 µM) i inkubując w RT na rotatorze przez 30 min. Wybrane stężenie liganda do konkurencyjnej elucji związanych fagów zależy od pożądanej wartości KD „wiązacza kotwiczącego”. Stężenia liganda mogą być stosunkowo wysokie w początkowych rundach selekcji, a następnie zmniejszane w późniejszych rundach.
    2. Zbierz nadsącz i zachowaj eluowane fagi jako materiał wyjściowy (output) do wykorzystania w kroku 3.5.2.
  5. Tytrowanie wejścia/wyjścia i infekcja
    1. Do tytrowania wejścia przygotuj 10-krotne rozcieńczenia szeregowe w 1 x PBS aż do rozcieńczenia 109-krotnego, używając fagów wejściowych z kroku 3.3.7. Wykorzystaj rozcieńczenia szeregowe 107–109 do przeprowadzenia infekcji, przenosząc 10 µL fagów wejściowych z każdego rozcieńczenia do 70 µL komórek TG1 (OD600 ~0,5). Inkubuj w 37 ˚C przez 45 min, wysiej zainfekowane komórki TG1 na trzy 90-mm szalki z agarem 2YT zawierającym 100 μg/mL ampicyliny i 2% (mas/obj) glukozy, a następnie inkubuj przez noc w 37 ˚C. Na podstawie szalek inkubowanych przez noc można obliczyć ilość fagów wejściowych według następującego wzoru:
      Równanie miana fagów, metoda biopanningu, układ eksperymentalny dla prezentacji fagowej, wzór na liczbę kolonii.
    2. W celu infekcji i tytrowania wyjścia, przenieś eluowane fagi z kroku 3.4.2 do 3 mL komórek TG1 (OD600 ~0,5). Inkubuj w kąpieli wodnej w 37 ˚C przez 45 min. Następnie przygotuj 10-krotne rozcieńczenia szeregowe w 2YT aż do 103-krotnego, wysiej każde rozcieńczenie na 90-mm szalki z agarem 2YT i inkubuj przez noc w 37 ˚C. Na podstawie szalek inkubowanych przez noc można obliczyć ilość fagów wyjściowych według następującego wzoru:
      Równanie miana fagów, metoda biopanningu, układ eksperymentalny dla prezentacji fagowej, wzór na liczbę kolonii.
    3. Pozostałe zainfekowane komórki TG1 rozdziel na trzy 150-mm szalki z agarem 2YT zawierające 100 μg/mL ampicyliny i 2% (mas/obj) glukozy. Inkubuj szalki przez noc w 37 ˚C.
  6. Amplifikacja biblioteki i odzysk do kolejnych rund selekcji
    1. Dodaj 3 mL pożywki 2YT na szalkę, zeskrob komórki sterylnym skrobakiem i zbierz wszystkie komórki do 50-mL probówki stożkowej. Wymieszaj zebrane komórki ze sterylnym glicerolem (końcowe stężenie 20% mas/obj). Zmierz OD600 mieszaniny i przygotuj 3–5 aliquotów zapasowych. Przechowuj w -80 ˚C do długotrwałego przechowywania.
    2. W celu odzyskania fagów, rozcieńcz bakteryjną mieszaninę TG1 zawierającą fagmid w 25 mL pożywki 2YT uzupełnionej o 2% glukozy i 100 μg/mL ampicyliny do OD600 ~0,1. Hoduj komórki w 37 ˚C i przy 250 rpm do uzyskania OD600 ~0,5.
    3. Przeprowadź superinfekcję komórek, dodając faga pomocniczego CM13 w stężeniu 5 x 109 pfu/mL i inkubuj w 37 ˚C i przy 250 rpm przez 45 min. Fag pomocniczy CM13 dostarcza niezbędnych białek kapsydu faga do montażu kompletnych cząsteczek fagowych.
    4. Wirowarkuj kulturę przy 8 000 x g przez 10 min, aby usunąć glukozę. Resuspenduj komórki w 50 mL pożywki 2YT uzupełnionej o 100 μg/mL ampicyliny i 50 μg/mL kanamycyny i inkubuj w 25 ˚C i przy 250 rpm przez noc.
    5. Wirowarkuj komórki z kultury nocnej przy 9 000 x g w 4 ˚C przez 30 min. Przenieś nadsącz do nowej probówki i wytrącaj fagi z nadsączu, używając 1/5 objętości roztworu PEG/NaCl (20% mas/obj glikolu polietylenowego-6000 i 2,5 M NaCl). Wymieszaj delikatnie i pozostaw na lodzie na 1 h.
    6. Zbierz cząsteczki fagowe poprzez wirowanie przy 12 000 x g w 4 ˚C przez 30 min. Resuspenduj osad w 1 mL 1 x PBS i przenieś zawiesinę do probówki do mikrowirowarki. Wirowarkuj probówkę przy 20 000 x g i w 4 ˚C przez 10 min, aby usunąć pozostałości bakterii.
    7. Przenieś nadsącz do nowej probówki do mikrowirowarki, nie naruszając osadu bakteryjnego. Użyj rozcieńczenia 1:100, aby zmierzyć absorbancję przy 269 nm i 320 nm. Całkowitą liczbę fagów można obliczyć za pomocą następującego wzoru23:
      Schemat wzoru na miano fagów, obliczanie liczby fagów na ml przy użyciu absorbancji i wielkości wektora.
    8. Przechowuj bibliotekę fagową w 4 ˚C do krótkotrwałego użytku lub z 25% glicerolem w -80 ˚C do długotrwałego przechowywania.
    9. Powtarzaj rundy selekcji (kroki 3.1–3.6) przez 3–6 rund lub do momentu zaobserwowania pożądanego wzbogacenia (patrz sekcja Wyniki). Wysiej i wybierz pojedyncze klony (sekcja 4) w celu scharakteryzowania ich powinowactwa i specyficzności do liganda (sekcje 5–7).

4. Izolacja pojedynczych klonów

  1. Aby wyizolować pojedyncze klony z wzbogaconej subbiblioteki, przygotować 10-krotne rozcieńczenia szeregowe zainfekowanych fagami komórek TG1 (krok 3.5.2). Rozcieńczenia szeregowe wysiać na 90 mm szalki z agarem 2YT zawierającym 100 μg/mL ampicyliny i 2% (mas/obj) glukozy, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 37 ˚C.
  2. Z szalek inkubowanych przez noc wybrać pojedyncze kolonie do sterylnych płytek głębokodnnych zawierających w każdym dołku 250 μL pożywki 2YT uzupełnionej o 100 μg/mL ampicyliny i hodować przez noc w temperaturze 37 ˚C.
  3. Z kultur hodowanych przez noc zaszczepić 10 µL do 500 µL świeżej pożywki 2YT uzupełnionej o 100 μg/mL ampicyliny.
  4. Hodować komórki do osiągnięcia OD600 na poziomie ~0,5, dodać pomocnicze fagi CM13 w stężeniu 5 x 109 pfu/mL i inkubować w temperaturze 37 ˚C przy 250 rpm przez 45 min.
  5. Dodać 500 µL pożywki 2YT uzupełnionej o 100 μg/mL ampicyliny i 50 μg/mL kanamycyny. Inkubować przez noc w temperaturze 25 ˚C przy 250 rpm.
  6. Płytki głębokodnne z kulturami hodowanymi przez noc wirować z prędkością 3,000 x g przez 10 min. Zebrać nadsącz zawierający cząsteczki fagów, nie naruszając osadu komórkowego.
  7. Cząsteczki fagów można wykorzystać w teście ELISA w celu określenia swoistości wybranych klonów względem liganda. Jako kontrolę negatywną można zastosować biotynę lub homolog strukturalny celu.

5. Walidacja wiązania kotwicy metodą ELISA

  1. Płytki ELISA z 96 dołkami pokryć 100 μL streptawidyny o stężeniu 5 μg/mL w buforze do pokrywania (bufor węglanowy 100 mM, pH = 8.6) i inkubować przez noc w temperaturze 4 ˚C.
  2. Płytki ELISA przemyć 3x roztworem 0.05% PBST, a następnie do dołków z celem dodać 100 μL biotynilowanego celu o stężeniu 1 μM. Do dołków kontrolnych dodać 100 μL biotyny lub homologu celu o stężeniu 1 μM. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 h.
  3. Płytki przemyć 5x roztworem 0.05% PBST i zablokować nieswoiste wiązania, dodając 300 µL 1% kazeiny w 1 x PBS. Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 h.
  4. Płytki ELISA przemyć 3x roztworem 0.05%-PBST i dodać oczyszczony nadsącz fagowy. Inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej (RT).
  5. Płytki ELISA przemyć 10x roztworem 0.05% PBST i dodać 100 μL przeciwciał przeciwko głównemu białku otoczki M13 znakowanych peroksydazą chrzanową (HRP) (rozcieńczenie 1:10 000 w 1 x PBS z 1% kazeiną). Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 h.
  6. Płytki ELISA przemyć 3x roztworem 0.05% PBST i dodać 100 μL substratu tetrametylobenzytydyny (TMB). Inkubować przez 10 min lub do momentu zaobserwowania widocznej zmiany barwy. Reakcję zatrzymać, dodając 100 μL 1 M HCl. Odczytać wynik z płytki przy 450 nm za pomocą spektrofotometru.
  7. Do ekspresji i oczyszczania białka wybrać klony wykazujące wysokie powinowactwo i specyficzność względem celu (patrz sekcja Dyskusja).

6. Ekspresja, oczyszczanie i biotinylacja białka

  1. Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami19, przeprowadzić subklonowanie wybranych klonów z sekcji 5 i wyekspresować je jako nanociała z C-końcowymi znacznikami Avi i His.
  2. Wyekspresować wybrane nanociała w periplazmie komórek E. coli WK6 (zazwyczaj w 1 L hodowli), uwolnić je poprzez szok osmotyczny i oczyścić przy użyciu kolumny niklowo-NTA (patrz Tabela materiałów).
  3. Wymienić bufor za pomocą kolumny odsalającej (1 x PBS z 5% glicerolu; patrz Tabela materiałów).
  4. Biotynilować nanociała za pomocą komercyjnego zestawu (patrz Tabela materiałów) do dalszego wykorzystania.

7. Charakterystyka wiązania kotwicy metodą BLI

  1. Przeanalizować powinowactwo i kinetykę wiązania wybranych binderów kotwic poprzez unieruchomienie 200 nM biotinylowanych binderów kotwic na biosensorach z streptawidyną (patrz Tabela materiałów) w buforze do testów wiązania (1 x PBS (pH = 7.4), 0,05% Tween 20, 0,2% BSA, 3% metanolu).
  2. Obliczyć stałe dysocjacji (KD) dla oddziaływań binder kotwica-ligand za pomocą analizy stanu stacjonarnego przy użyciu oprogramowania do analizy danych (patrz Tabela materiałów). Uzyskane wartości KD zazwyczaj mieszczą się w zakresie od jedności do kilkunastu mikromoli.

8. Przesiewowe badanie wiązania dimerów

UWAGA: Przesiewanie metodą biopanningu w celu wyłonienia „wiązań dimeryzujących” jest podobne do przesiewania wiązań kotwiczących, z wyjątkiem dwóch kluczowych kroków: 1) Wiązania dimeryzujące są selekcjonowane przy użyciu wybranego biotynurowanego wiązania kotwiczącego oraz kompleksu wiązania kotwiczącego z ligandem, odpowiednio dla selekcji negatywnej i pozytywnej. 2) Podczas etapu elucji stosuje się 100 mM trietyloaminy w celu elucji fagów wyselekcjonowanych pozytywnie, które związały się wyłącznie z docelowym kompleksem wiązania kotwiczącego i ligandu. Roztwór 100 mM trietyloaminy (pH = 11.5) jest wykorzystywany do elucji klonów pozytywnych poprzez rozrywanie oddziaływań białkowych.

  1. Rozpoczęcie selekcji
    1. Każdą rundę selekcji należy rozpocząć od zaszczepienia pojedynczej kolonii komórek TG1, świeżo wyhodowanej na pożywce minimalnej, w 6 mL 2YT w temperaturze 37 ˚C i przy 250 rpm do osiągnięcia OD600 ~0,5. Komórki należy inkubować w lodzie.
  2. Usuwanie nanociał selekcjonowanych negatywnie
    1. Przygotować „probówkę do subtrakcji”, używając 400 µL magnetycznych kulek pokrytych streptawidyną, postępując zgodnie z krokiem 3.2. Jednak zamiast nasycania biotyną, należy dodać 5-krotność obliczonej pełnej pojemności wiążącej, używając wybranego biotynolowanego wiązacza kotwiczącego, a nieprzypisane fagi zachować do wykorzystania w kroku 8.3.3.
  3. Selekcja nanociał selekcjonowanych pozytywnie
    1. Przygotować „probówkę do wychwytywania”, używając 1/2 objętości magnetycznych kulek pokrytych streptawidyną wykorzystanych w „probówce do subtrakcji” i postępując zgodnie z krokami od 3.3.2 do 3.3.3. Jednak zamiast nasycania biotynolowanym ligandem, należy dodać pięciokrotność obliczonej pełnej pojemności wiążącej, używając wybranego biotynolowanego wiązacza kotwiczącego.
    2. Aby utworzyć kompleks wiązacz kotwiczący–ligand dla pozytywnej selekcji wiązacza dimeryzującego, należy dodać odpowiednio wysokie stężenie liganda niebiotynolowanego. Pozwoli to większości związanych ze streptawidyną wiązaczy kotwiczących utworzyć kompleks związany z ligandem.
    3. Postępować zgodnie z krokami od 3.3.3 do 3.3.8, używając nieprzypisanych fagów pobranych z „probówki do subtrakcji”.
  4. Elucja nanociał selekcjonowanych pozytywnie
    1. Fagi związane z kompleksem wiązacz kotwiczący–ligand należy eluować poprzez dodanie 450 µL 100 mM trietyloaminy i inkubowanie w RT na rotatorze przez 10 min.
    2. Zebrać fagi eluowane konkurencyjnie i postępować zgodnie z krokami od 3.4.1 do 3.4.2.
  5. Kolejne rundy selekcji wiązacza dimeryzującego
    1. Postępować zgodnie z krokami 3.5 i 3.6, aby namnożyć i odzyskać bibliotekę w celu przeprowadzenia kolejnych rund selekcji. Powtarzać rundy selekcji przez 3–6 cykli lub do momentu zaobserwowania pożądanego wzbogacenia. Wysiać na płytki i wyselekcjonować pojedyncze klony (patrz sekcja 4), aby scharakteryzować ich powinowactwo i swoistość względem celu.

9. Charakterystyka wiązania dimerów metodą ELISA

  1. Należy postępować zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 4 w celu wyizolowania poszczególnych klonów do charakterystyki za pomocą testu ELISA.
  2. Aby przetestować powinowactwo kandydatów na białka wiążące dimeryzację do kompleksu białka wiążącego kotwicę z ligandem, należy pokryć płytkę docelową ELISA 100 μL 100 nM biotynilowanego białka wiążącego kotwicę. Po inkubacji przez 1 h należy dodać 1 μM liganda docelowego w celu utworzenia kompleksu białka wiążącego kotwicę z ligandem.
  3. Płytkę kontrolną należy pokryć samym biotynilowanym białkiem wiążącym kotwicę, aby wyeliminować klony, które mogą wiązać się również z wolnym białkiem wiążącym kotwicę. Należy dodać 100 μL 100 nM biotynilowanego białka wiążącego kotwicę i inkubować w RT przez 1 h.
  4. Należy postępować zgodnie z sekcjami 5.3–5.7.

10. Charakterystyka wiązania dimerów metodą BLI

  1. Powinowactwo wiązania i kinetykę dimeryzujących cząsteczek wiążących dla kompleksu kotwica wiążąca--ligand można analizować poprzez unieruchomienie biotynylowanych dimeryzujących cząsteczek wiążących na biosensorach z streptawidyną (SA) w buforze do analizy wiązania, a następnie przeprowadzenie testu z użyciem 1 μM kotwicy wiążącej uprzednio równoważonej z szeregiem rozcieńczeń liganda. Wartości KD, kon oraz koff oddziaływań można obliczyć, korzystając z naszej opisanej metody19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisujemy dwuetapową selekcję in vitro oraz walidację wiążących nanociał kotwiczących i dimeryzujących poprzez przesiewanie kombinatorycznej biblioteki nanociał o różnorodności przekraczającej 109 z wykorzystaniem CBD jako celu. Ważna jest ocena wzbogacenia podczas biopanningu fagowego w kolejnych rundach selekcji zarówno dla wiążących nanociał kotwiczących, jak i dimeryzujących. Typowe wyniki wzbogacenia po 4–6 rundach selekcji, przedstawione na Rysunku 5, stanowią dobrą wskazówk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Bardzo ważne jest, aby wybrać odpowiednie stężenia wejściowych bibliotek fagowych dla różnych rund biopanowania. Zazwyczaj zaczynaliśmy od biblioteki wejściowej składającej się z ~1012–1013 cząstek fagowych o różnorodności >109, co pozwalało na przedstawienie ~100–1,000 kopii każdego klonu faga w teście pull-down. Jeśli stężenie faga w teście wiązania jest zbyt wysokie lub niskie, prawdopodobieństwo niespecyficznego wiązania lub utraty dodatnich klonów wzrośnie. Wybór spoiwa kotwiczącego ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Tymczasowy patent związany z tą pracą został złożony przez Uniwersytet Waszyngtoński.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez University of Washington Innovation Award (dla L.G.), grant od U.S. National Institutes of Health (1R35GM128918 dla L.G.) oraz fundusz startowy Uniwersytetu Waszyngtońskiego (dla L.G.). H.J. był wspierany przez stypendium licencjackie Washington Research Foundation. K.W. był wspierany przez stypendium licencjackie z University of Washington Institute for Protein Design.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-stopniowy roztwór substratu Ultra TMB ELISAThermo Fisher Scientific34029
AgarThermo Fisher ScientificBP1423-2
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-15 (odcięcie 3 kDa)MiliporeUFC900324
AmpicylinaThermo Fisher ScientificBP1760-25
Bio-Rad Zestaw do oznaczania białek IIBio-Rad
BirA Standardowy zestaw reakcyjny ligazy biotynowo-białkowejAvidityBirA500
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA2153-50G
KazeinaSigma-AldrichC7078-1KG
CM13 pomocniczyPrzeciwciało Design LabsPH020L
D-(+)-Monohydrat glukozyAlfaAesar A11090
Dynabeads M-280 StreptavidinThermo Fisher Scientific11205D
Magnes DynaMag-2Thermo Fisher Scientific12321D
EDTAThermo Fisher ScientificBP120-1
Szybka drabina DNANew England BiolabsN3238S
FastDigest BglIThermo Fisher ScientificFD0074
GlycerolThermo Fisher ScientificBP229-1
HiLoad 16/600 Superdex 200 pgGE Healthcare28989335
HiPrep 26/10 Kolumna odsalającaGE Healthcare17508701
HisTrap-FF-1mlGE Healthcare11000458
ImidazolAlfa Aesar161-0718
IPTGThermo Fisher Scientific34060
KanamycinThermo Fisher ScientificBP906-5
M13 Przeciwciało białkowe MajorCoat Santa Cruz Biotechnologysc-53004
NaClSigma-AldrichS3014-500G
NanoDrop 2000/2000c SpektrofotometryThermo Fisher ScientificND-2000
Nunc 96-Well Polipropylen DeepWell Talerze do przechowywaniaThermo Fisher Scientific260251
Nunc MaxiSorpThermo Fisher Scientific44-2404-21
Octet RED96ForteBioN/A
pADL-23c Phagemid VectorAntibody Design LabsPD0111
PEG-6000Sigma-Aldrich81260-1KG
Platynowa polimerazaDNA SuperFiZestaw do oczyszczania PCR Invitrogen12351010
PureLinkThermo Fisher ScientificK310001
Zestaw QIAprep Spin M13Qiagen27704
Medium regeneracyjneLucigen80026-1
SpectraMax Plus 384Urządzenia molekularneNie dotyczy Sacharozy
Sigma-AldrichS0389-1KG
Biosensory Super Streptawidyny (SSA)ForteBio18-5057
Superdex 75 wzrost 10/300 GL KolumnaGE Healthcare28-9909-44
T4 Ligaza DNAThermo Fisher Scientific15224-025
TG1 Komórki elektrokompetentneLucigen60502-1
TrietyloaminaSigma-Aldrich471283-100mL
Trizma BaseSigma-AldrichT1503
TryptonThermo Fisher ScientificBP9726-5
Tween 20Thermo Fisher ScientificBP337-500
Ekstrakt drożdżowyThermo Fisher ScientificBP1422-2
Kolumna odsalająca Zeba SpinThermo Fisher Scientific89882
5000002

Bibliografia

  1. Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. Chemically induced proximity in biology and medicine. Science. 359 (6380), (2018).
  2. Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350 (6258), (2015).
  3. Straathof, K. C., et al. An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy. Blood. 105 (11), 4247-4254 (2005).
  4. Di Stasi, A., et al. Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy. The New England Journal of Medicine. 365 (18), 1673-1683 (2011).
  5. Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophysical Journal. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  6. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3197-3202 (2001).
  7. Hunter, M. M., Margolies, M. N., Ju, A., Haber, E. High-affinity monoclonal antibodies to the cardiac glycoside, digoxin. Journal of Immunology. 129 (3), 1165-1172 (1982).
  8. Bradbury, A. R. M., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nature Biotechnology. 29 (3), 245-254 (2011).
  9. Chen, G., et al. Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS). Nature. Biotechnology. 19 (6), 537-542 (2001).
  10. Tinberg, C. E., et al. Computational design of ligand-binding proteins with high affinity and selectivity. Nature. 501 (7466), 212-216 (2013).
  11. Spencer, D. M., Wandless, T. J., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Controlling signal transduction with synthetic ligands. Science. 262 (5136), 1019-1024 (1993).
  12. Ho, S. N., Biggar, S. R., Spencer, D. M., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Dimeric ligands define a role for transcriptional activation domains in reinitiation. Nature. 382 (6594), 822-826 (1996).
  13. Belshaw, P. J., Ho, S. N., Crabtree, G. R., Schreiber, S. L. Controlling protein association and subcellular localization with a synthetic ligand that induces heterodimerization of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4604-4607 (1996).
  14. Farrar, M. A., AlberolaIla, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).
  15. Erhart, D., et al. Chemical Development of Intracellular Protein Heterodimerizers. Chemistry & Biology. 20 (4), 549-557 (2013).
  16. Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 17 (5), 5475(2014).
  17. Hill, Z. B., Martinko, A. J., Nguyen, D. P., Wells, J. A. Human antibody-based chemically induced dimerizers for cell therapeutic applications. Nature Chemical Biology. 14 (2), 112-117 (2018).
  18. Foight, G. W., et al. Multi-input chemical control of protein dimerization for programming graded cellular responses. Nature Biotechnology. 37 (10), 1209-1216 (2019).
  19. Kang, S., et al. COMBINES-CID: An efficient method for de novo engineering of highly specific chemically induced protein dimerization systems. Journal of the American Chemical Society. 141 (28), 10948-10952 (2019).
  20. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  21. Fanning, S. W., Horn, J. R. An anti-hapten camelid antibody reveals a cryptic binding site with significant energetic contributions from a nonhypervariable loop. Protein Science. 20 (7), 1196-1207 (2011).
  22. Zavrtanik, U., Luken, J., Loris, R., Lah, J., Hadzi, S. Structural basis of epitope recognition by heavy-chain camelid antibodies. Journal of Molecular Biology. 430 (21), 4369-4386 (2018).
  23. Denhardt, D. T., Dressler, D., Ray, D. S. The Single-Stranded DNA Phages. , 605-625 (1978).
  24. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Research. 22 (25), 5600-5607 (1994).
  25. Gu, L., et al. Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcoded proteins. Nature. 515 (7528), 554-557 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Chemicznie indukowana dimeryzacjaselekcja metodą phagingukombinatoryczna biblioteka nanociałwiązadła kotwiczącewiązadła dimeryzująceinterferometria warstw biologicznychkulki pokryte streptawidynąelucja konkurencyjnaELISA dla pojedynczych klonówchromatografia żelowa
Tworzenie wysoce specyficznych, chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek poprzez stopniową selekcję fagów w kombinatorycznej bibliotece przeciwciał jednodomenowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.