Method Article

Wizualizacja, kwantyfikacja i mapowanie populacji komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza

DOI:

10.3791/60740

⸱

March 25th, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre de Recherche du Centre hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM), 2Département de Microbiologie, Infectiologie et Immunologie, Faculté de Médecine, Université de Montréal, 3Département de Pathologie et Biologie Cellulaire, Faculté de Médecine, Université de Montréal, 4Institut du Cancer de Montréal, 5Département de Neurosciences, Faculté de Médecine, Université de Montréal, 6Département de Chirurgie, Faculté de Médecine, Université de Montréal, 7Département de Médecine, Faculté de médecine, Université de Montréal

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy prostą i przystępną strategię wizualizacji, kwantyfikacji i mapowania komórek odpornościowych w utrwalonych w formalinie odcinkach tkanki nowotworowej zatopionej w parafinie. Metodologia ta łączy istniejące techniki obrazowania i analizy cyfrowej w celu rozszerzenia możliwości multipleksowania i analizy wieloparametrowej testów obrazowania.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krajobraz immunologiczny mikrośrodowiska guza (TME) jest czynnikiem decydującym o postępie raka i odpowiedzi na terapię. W szczególności gęstość i lokalizacja komórek odpornościowych w TME mają ważne wartości diagnostyczne i prognologiczne. Multiomiczne profilowanie TME wykładniczo poszerzyło naszą wiedzę na temat licznych sieci komórkowych i molekularnych regulujących inicjację i progresję guza. Jednak techniki te nie dostarczają informacji o organizacji przestrzennej komórek ani interakcjach komórka-komórka. Niedrogie, dostępne i łatwe do wykonania techniki multipleksowania, które umożliwiają przestrzenną rozdzielczość komórek odpornościowych w skrawkach tkanek, są potrzebne jako uzupełnienie wysokoprzepustowych technologii opartych na pojedynczych komórkach. W tym miejscu opisujemy strategię, która integruje obrazowanie seryjne, sekwencyjne etykietowanie i wyrównywanie obrazu w celu generowania wirtualnych wieloparametrowych slajdów całych odcinków tkanki. Wirtualne preparaty są następnie analizowane w sposób zautomatyzowany przy użyciu protokołów zdefiniowanych przez użytkownika, które umożliwiają identyfikację, kwantyfikację i mapowanie interesujących populacji komórek. Analiza obrazu jest wykonywana, w tym przypadku za pomocą modułów analitycznych Tissuealign, Author i HISTOmap. Przedstawiamy przykład, w którym z powodzeniem zastosowaliśmy tę strategię do jednej próbki klinicznej, maksymalizując informacje, które można uzyskać z ograniczonej liczby próbek tkanek i zapewniając bezstronny obraz TME w całym przekroju tkanki.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój raka jest wynikiem wieloetapowego procesu obejmującego wzajemne interakcje między komórkami nowotworowymi a TME. Oprócz komórek nowotworowych, TME składa się z komórek niezłośliwych, komórek zrębu, populacji komórek odpornościowych i macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)1. Organizacja przestrzenna różnych składników komórkowych i strukturalnych tkanki nowotworowej oraz dynamiczna wymiana między rakiem a sąsiednimi komórkami nienowotworowymi ostatecznie modulują progresję guza i odpowiedź na terapię2,3,4. Wykazano, że odpowiedź immunologiczna w chorobie nowotworowej jest regulowana czasowo5,6. Różne populacje komórek odpornościowych naciekających zmianę nowotworową i przyległą tkankę wykazują charakterystyczne wzorce rozmieszczenia przestrzennego oraz zróżnicowane stany aktywacji i różnicowania związane z różnymi funkcjami (np. pro- kontra przeciwnowotworowe). Te różne populacje immunologiczne i ich parametry współewoluują z czasem z guzem i przedziałami zrębu.

Pojawienie się technologii umożliwiających profilowanie multiomiczne pojedynczych komórek wykładniczo zwiększyło naszą wiedzę na temat licznych sieci komórkowych i molekularnych regulujących karcynogenezę i progresję nowotworu. Jednak większość wysokoprzepustowych narzędzi analitycznych opartych na pojedynczych komórkach wymaga rozerwania tkanek i izolacji pojedynczej komórki, co powoduje utratę informacji o organizacji przestrzennej komórek i interakcjach komórka-komórka7. Ze względu na to, że lokalizacja i rozmieszczenie określonych komórek odpornościowych w TME mają wartość diagnostyczną i prognostyczną, technologie pozwalające na rozdzielczość przestrzenną są niezbędnym uzupełnieniem technik profilowania immunologicznego opartych na pojedynczych komórkach.

Tradycyjnie, techniki obrazowania, takie jak immunohistochemia (IHC) i immunofluorescencja multipleksowa (mIF) były ograniczone do niewielkiej liczby biomarkerów, które mogą być wizualizowane jednocześnie. To ograniczenie utrudniło badanie czasoprzestrzennej dynamiki komórek odpornościowych naciekających nowotwór, które są zwykle definiowane przez kilka markerów fenotypowych. Ostatnie postępy w dziedzinie narzędzi obrazowych i analitycznych rozszerzyły możliwości multipleksowania. Nowe technologie znakowania oparte na przeciwciałach, takie jak histocytometria i obrazowa cytometria masowa, zostały wykorzystane do przestrzennego oddzielenia odpowiednio do 12 i 32 biomarkerów8,9. Obrazowanie metodą spektrometrii mas, technika niewymagająca znakowania, ma potencjał do jednoczesnego obrazowania tysięcy biomarkerów w jednym przekroju tkanki10,11. Chociaż techniki te wykazały już ogromny potencjał w zakresie analizy tkankowego krajobrazu immunologicznego w nowotworach, wykorzystują one wysoce wyrafinowany i drogi sprzęt i oprogramowanie i nie są łatwo dostępne dla większości badaczy.

Alternatywnie, możliwości multipleksowania tradycyjnego IHC i mIF zostały rozszerzone poprzez zastosowanie obrazowania szeregowego, sekwencyjnych rund etykietowania i obrazowania spektralnego7,12,13,14,15,16. Techniki te generują wiele obrazów z tego samego lub z seryjnych skrawków tkanki, które można skonsolidować w wirtualne szkiełka wieloparametrowe za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. W rezultacie zwiększa się liczba markerów, które mogą być jednocześnie wizualizowane i analizowane.

Tutaj proponujemy strategię racjonalnego projektowania testów multipleksowych tkanek przy użyciu dostępnych na rynku odczynników, niedrogiego sprzętu do mikroskopii i przyjaznego dla użytkownika oprogramowania (Rysunek 1). Metodologia ta integruje obrazowanie seryjne, sekwencyjne etykietowanie multipleksowe, obrazowanie całych tkanek i wyrównanie tkanek w celu generowania wirtualnych preparatów wieloparametrowych, które można wykorzystać do automatycznej kwantyfikacji i mapowania komórek odpornościowych w skrawkach tkanki. Korzystając z tej strategii, stworzyliśmy jeden wirtualny preparat składający się z 11 biomarkerów oraz dwóch często stosowanych barwników histologicznych: hematoksyliny i eozyny (H&E) oraz czerwieni picrosiriusa (PSR). Zidentyfikowano, zlokalizowano i określono ilościowo wiele populacji komórek odpornościowych w różnych przedziałach tkankowych, a ich rozmieszczenie przestrzenne rozwiązano za pomocą map cieplnych tkanek. Strategia ta maksymalizuje informacje, które można uzyskać z ograniczonej liczby próbek klinicznych i ma zastosowanie do zarchiwizowanych próbek tkanek zatopionych w parafinie (FFPE) utrwalonych w formalinie, w tym całych tkanek, biopsji gruboigłowych i mikromacierzy tkankowych. Proponujemy tę metodologię jako przydatny przewodnik do projektowania niestandardowych testów do identyfikacji, kwantyfikacji i mapowania populacji komórek odpornościowych w TME.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trzy seryjne odcinki FFPE z wyciętego ludzkiego raka wątrobowokomórkowego związanego z wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV) uzyskano z Centre hospitalier de l'Université de Montréal (CHUM) Hepatopancreatoto-żółciowej Bazy Danych Klinicznych Raka i Repozytorium Próbek Biologicznych (HBP Biobank). Pacjenci uczestniczący w tym banku tkanek wyrazili świadomą zgodę. Badanie to zostało zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyczną (numer protokołu 09.237) i przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską.

1. Protokół barwienia hematoksyliny i eozyny (H&E)

UWAGA: Barwienie H&E zostało przeprowadzone przez główny ośrodek patologii molekularnej Centre de Recherches du Centre hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM) przy użyciu wieloprogramowego robota do barwienia szkiełek w Shandon przy użyciu następującego programu.

  1. W celu deparafinowania zanurz szkiełka 3x na 2,5 minuty każda w substytucie ksylenu.
    UWAGA: Substytuty ksylenu są łatwopalne, działają drażniąco na skórę i są szkodliwe w przypadku wdychania.
  2. W celu nawodnienia zanurz szkiełka w 100% etanolu 3x na 2,5 minuty każda. Myć przez 1 minutę w wodzie podwójnie destylowanej (ddH2O) w celu nawodnienia.
  3. Inkubować przez 1 minutę w hematoksylinie. Prać 3x po 1 min w ddH2O.
  4. Inkubować przez 5 s z eozyną. Umyć 30 s 95% etanolem. Myć 2x przez 1 min 100% etanolem.
    UWAGA: Etanol jest łatwopalny i działa drażniąco na oczy. Eozyna działa drażniąco na oczy.
  5. W celu odwodnienia zanurz 3x na 1,5 minuty każdy w substytucie ksylenu. Ręczny montaż prowadnic.
    UWAGA: Szacowany czas wykonania tej części protokołu to 30 min.

2. Multipleksowy protokół barwienia immunofluorescencyjnego dla odcinków FFPE

UWAGA: Ten protokół został zaadaptowany z Robertson et al.17.

  1. Deparafinizacja i ponowne nawodnienie
    UWAGA: Przed znakowaniem skrawków FFPE za pośrednictwem przeciwciał za pomocą IHC lub mIF, parafinę należy usunąć. Brak skutecznego usunięcia parafiny powoduje nieoptymalne zabarwienie.
    1. Umieść szkiełka z 4 μm sekcją tkanki FFPE w szklanych uchwytach szkiełkowych. Pod wyciągiem zanurzyć szkiełka w słoiku Coplin zawierającym podgrzany ksylen o temperaturze 37°C na 10 minut.
      UWAGA: Ksylen jest łatwopalny, działa drażniąco na skórę i jest szkodliwy w przypadku wdychania.
    2. Ręcznie mieszaj szkiełka przez 10 s co 2 min. Powtarzaj 1x w świeżym ksylenie przez kolejne 5 minut.
    3. W okapie chemicznym zanurzać szkiełka kolejno na 5 minut w każdym z następujących roztworów: 1) ksylen: etanol (1:1 v/v); 2) 100% etanolu; 3) 70% etanolu; 4) 50% etanolu; 5) 30% etanolu; 6) sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS).
      UWAGA: Przechowuj szkiełka w PBS do czasu, gdy będą gotowe do pobrania antygenu. Utrzymuj odwoskowane sekcje nawodnione przez cały czas. Wysuszenie spowoduje niespecyficzne wiązanie przeciwciał, a tym samym wysokie zabarwienie tła.
  2. Pobieranie antygenu pod wpływem ciepła
    UWAGA: Antygeny mogą być maskowane po utrwaleniu formaliny, co zapobiega wiązaniu przeciwciał, a w konsekwencji wizualizacji. Zastosowanie i procedur demaskujących antygen częściowo przywraca natywną konformację epitopów, a tym samym przywraca rozpoznawanie przeciwciał. Rodzaj bufora do pobierania antygenu i czas jego trwania powinny być zoptymalizowane pod kątem konkretnych warunków oznaczania (np. celu, przeciwciała, tkanki itp.).
    1. Zanurz odparafinowane szkiełka w słoiku Coplin zawierającym roztwór do pobierania antygenu (przepis w Tabeli Materiałów).
    2. Umieść zamknięty słoik Coplin w szybkowarze elektrycznym z wodą z kranu. Poziom wody nie powinien przekraczać połowy wysokości słoika, aby woda nie zmieszała się z roztworem do pobierania antygenu.
    3. Zamknij pokrywę i zawór ciśnieniowy szybkowaru. Wybierz wysokie ciśnienie na 10 minut i zacznij. Po zakończeniu odłącz kuchenkę, zwolnij ciśnienie, otwórz pokrywkę i trzymaj słoik w szybkowarze przez 30 minut, pozwalając szkiełkom ostygnąć.
  3. Blokowanie niespecyficznego powiązania
    1. Przenieś stojak ze szkiełkami do słoika Coplin wypełnionego PBS. Płukać bufor do odzyskiwania antygenu za pomocą PBS 2x przez 5 minut każdy.
    2. Owiń skrawki tkanki pisakiem PAP, aby stworzyć barierę hydrofobową. Zanurz szkiełka w słoiku Coplin zawierającym 0,1 M glicyny w PBS. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).
      UWAGA: Glicyna nasyca grupy aldehydowe powstające podczas pobierania antygenu. Grupy te mogą niespecyficznie wiązać przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe.
    3. Spłucz roztwór glicyny, przemywając 2x PBS przez 5 min. Umieść szkiełka w komorze wilgotnościowej i dodaj tyle roztworu blokującego, aby pokryć wszystkie sekcje tkanki. Unikaj przepełnienia bariery hydrofobowej. Inkubować przez 30 minut w temperaturze RT.
      UWAGA: Przepis na roztwór blokujący można znaleźć w Tabeli materiałów. Roztwór blokujący powinien zawierać białko (np. BSA) blokujące niespecyficzne miejsca wiązania. Może również zawierać detergenty, takie jak Triton X-100 lub Tween 20, które zmniejszają hydrofobowe interakcje między przeciwciałami a celami tkankowymi, dzięki czemu rozpoznawanie antygenu jest bardziej selektywne. Dodanie 10% całkowitej surowicy z gatunku, z którego pochodzi tkanka, zablokowałoby receptory Fc, a tym samym zmniejszyłoby niespecyficzne wiązanie przeciwciał. Wreszcie, dodanie 10% surowicy z gatunków, w których wyhodowano przeciwciała drugorzędowe, zminimalizowałoby bezpośrednie niespecyficzne przyłączanie przeciwciał drugorzędowych do wycinka tkanki.
  4. Znakowanie immunofluorescencyjne
    1. Płukać PBS-Tween (0,1% v/v) 2x przez 5 minut każdy i umieścić szkiełka z powrotem w komorze wilgotnościowej.
    2. Dodać koktajl przeciwciał pierwszorzędowych zawieszonych w roztworze blokującym. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe użyte w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.
      UWAGA: Koktajl przeciwciał pierwszorzędowych powinien zawierać przeciwciała wyhodowane u różnych gatunków lub pochodzące od tego samego gatunku, ale o różnych izotypach. Wykaz par przeciwciał pierwszorzędowych-drugorzędowych użytych w tym badaniu znajduje się w Tabeli 2. Szczegółowe informacje na temat wszystkich użytych przeciwciał znajdują się w Tabeli materiałów i Tabeli 2.
    3. Płukać PBS-Tween (0,1% v/v) 3x przez 5 minut i umieścić szkiełka z powrotem w komorze wilgotnościowej. W ciemności dodać koktajl przeciwciał drugorzędowych i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze RT.
      UWAGA: Gdy przeciwciała pierwszorzędowe pochodzą od różnych gatunków, przeciwciała drugorzędowe należy dobrać tak, aby każde z nich wiązało się tylko z jednym z przeciwciał pierwszorzędowych, a nie ze sobą. Zwykle osiąga się to poprzez stosowanie przeciwciał drugorzędowych, z których wszystkie są hodowane u tego samego gatunku, o ile gatunek ten różni się od gatunku, w którym wytworzono przeciwciała pierwszorzędowe. W przypadkach, gdy przeciwciała pierwszorzędowe zostały wyhodowane u tego samego gatunku, ale mają różne izotypy, należy zastosować przeciwciała drugorzędowe specyficzne dla danej izotypu.
    4. Płukać PBS-Tween (0,1% v/v) 3x przez 5 minut. Spłukać środkiem ddH2O. Usunąć nadmiar płynu i zamontować w nośniku montażowym za pomocą DAPI. Użyta objętość zależy od wielkości sekcji. Zwykle 40 μL wystarcza do pokrycia powierzchni zwykłego szkiełka mikroskopowego.
    5. Umieść prowadnicę pokrywy na sekcji i delikatnie wyciśnij nadmiar nośnika montażowego, unikając tworzenia się pęcherzyków. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności i przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będą gotowe do pobrania.
    6. Pobieraj obrazy dla wszystkich kanałów za pomocą całego skanera slajdów (patrz Spis materiałów).
      UWAGA: Przeciwciała zwalidowano przy użyciu ludzkiej tkanki raka wątrobowokomórkowego jako kontroli pozytywnej. Dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego trzy sekwencje seryjne wybarwiono odpowiednio przeciwciałem pierwszorzędowym, kontrolą izotypu lub tylko roztworem blokującym, bez zmian w pozostałej części protokołu barwienia. Uzyskane obrazy porównano w celu ustalenia swoistości barwienia. Barwienie uznano za specyficzne, gdy sygnał w sekcji inkubowanej z przeciwciałem pierwszorzędowym miał oczekiwany wzór i był łatwy do odróżnienia od tła. Przeciwciała pierwszorzędowe dające wysoki sygnał tła lub znakujące składniki tkankowe w izotypie i brak pierwszorzędowych odcinków przeciwciał uznano za niespecyficzne. Szacowany czas na wypełnienie tej części protokołu to 2 dni. Wymagane kontrole obejmują: (1) kontrolę izotypu w celu ustalenia udziału niespecyficznego wiązania przeciwciała pierwszorzędowego z sygnałem tła. Jedna sekcja jest barwiona w taki sam sposób, jak inne tkanki próbki, z wyjątkiem tego, że jest inkubowana z przeciwciałem o tym samym izotypie i pochodzeniu przeciwciała pierwszorzędowego, ale specyficznym dla celu, który jest nieobecny w przekroju tkanki. Jeżeli odpowiednie przeciwciało kontrolne izotypu nie jest dostępne, można je zastąpić całkowitym IgG tego samego gatunku, w którym wyhodowano przeciwciało pierwszorzędowe; (2) Brak kontroli przeciwciał pierwszorzędowych (tj. kontroli ujemnej) w celu ustalenia swoistości barwienia i oszacowania udziału niespecyficznego wiązania przeciwciał drugorzędowych do sygnału tła. W takim przypadku sekcja kontrolna jest barwiona w taki sam sposób, jak inne sekcje, z wyjątkiem tego, że nie dodaje się przeciwciała pierwszorzędowego; (3) Kontrola pozytywna w celu ustalenia, czy barwienie działa. W tym przypadku barwienie wykonuje się na wycinku tkanki, o którym wiadomo, że wyraża marker rozpoznawany przez przeciwciało pierwotne
      7. .

3. Picro-sirius red (PSR)/protokół szybkiego zielonego barwienia

UWAGA: Celem tego barwienia jest wizualizacja fibrylarnych kolagenów I i III w sekcjach tkanek FFPE. Ten protokół został zaadaptowany z Segnani et al.18. Wszystkie kroki wykonywane są w okapie chemicznym.

  1. Przeprowadzić deparafinowanie i ponowne uwodnienie skrawków tkanek podobnie jak w protokole barwienia immunofluorescencyjnego multipleksu dla skrawków FFPE (sekcja 2.1).
    UWAGA: Jeśli sekcja, która ma być zabarwiona, była wcześniej używana do znakowania immunofluorescencyjnego, a parafina została już usunięta, etapy deparafinowania-ponownego uwodnienia są przydatne do usunięcia podłoża montażowego. DAPI nie jest usuwany przy użyciu tej procedury, ale nie odczuwalnie zakłóca barwienia PSR.
  2. Zanurzyć szkiełka w słoiku zawierającym czerwony/szybko zielony roztwór picro-sirius (przepis w Tabeli Materiałów) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej (ponad 30 minut powoduje niespecyficzne barwienie jąder hepatocytów).
  3. Szybko umyć szkiełka w ddH2O (5 zanurzeń). Następnie szybko umyć w etanolu 100% (5 zanurzeń). Prać przez 30 s w ksylenie-100% etanolu (1:1 v/v). Prać przez 30 s w ksylenie. Zamontuj za pomocą mediów montażowych (patrz Tabela materiałów) przed całkowitym odparowaniem ksylenu (pomaga to w montażu).
    UWAGA: Szacowany czas wykonania tej części protokołu to 1 godzina.

4. Elucja przeciwciał z wycinków tkanek

UWAGA: Aby ponownie wykorzystać skrawki tkanek w sekwencyjnych testach znakowania, wymagane jest całkowite usunięcie pierwotnych i drugorzędowych przeciwciał. Związane przeciwciała zostały usunięte zgodnie z wcześniejszym opisem13.

Rozgrzej łaźnię wodną do 56 °C. Umieść sekcje w słoiku zawierającym bufor do strippingu (przepis w Tabeli Materiałów), zamknij pokrywkę i uszczelnij ją taśmą z folii parafinowej, aby zapobiec wyciekom podczas wstrząsania.

  1. Umieść słoik w łaźni wodnej i inkubuj przez 30 minut z mieszaniem.
  2. Myć 4x po 15 min w ddH2O w temperaturze RT. Płukać PBS-Tween (0,1% v/v).
  3. Utrzymuj skrawki nawodnione w PBS-Tween lub wodzie, aż będą gotowe do ponownego zbadania sekcji z drugą rundą pierwszorzędowych przeciwciał.
    UWAGA: Szacowany czas wykonania tej części protokołu to 2 godziny.
  4. Sprawdzić skuteczność procedury elucji przeciwciał.
    UWAGA: Przed zastosowaniem protokołu elucji przeciwciał w sekwencyjnym teście znakowania należy sprawdzić skuteczność usuwania przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych.
    1. Wykonaj barwienie i akwizycję obrazu przekroju z daną parą przeciwciał pierwszorzędowych-drugorzędowych, zgodnie ze wskazaniami w protokole barwienia immunofluorescencyjnego multipleksu dla odcinków FFPE (sekcje 2.1–2.4.6).
    2. Po uzyskaniu obrazu należy przeprowadzić elucję kompleksów przeciwciał pierwszorzędowo-drugorzędowych związanych z tkanką, jak wskazano w punktach 4.1–4.3.
    3. Inkubować sekcję z tym samym przeciwciałem drugorzędowym i tymi samymi warunkami, co w kroku 2.4.3.
    4. Wykonaj czynności mycia, montażu i akwizycji obrazu, jak wskazano w 2.4.4–2.4.6.
    5. Porównaj obok siebie obrazy uzyskane przed i po strippingu, aby ustalić, czy określony sygnał zniknął, czy nie.
      UWAGA: Porównanie obrazów przed i po usunięciu przeciwciał potwierdzi skuteczność procedury elucji. Jednak normalne jest obserwowanie wzrostu sygnału tła we wszystkich kanałach, a także dyfuzji DAPI. Ogranicza to liczbę rund strippingu, które można wykonać na tym samym wycinku tkanki. Trzy rundy rozbierania wydają się być maksymalnym.

5. Akwizycja obrazu

  1. Generuj obrazy za pomocą całego skanera slajdów.
  2. Użyj soczewki obiektywowej 20x 0,75NA i rozdzielczości 0,3225 μm/piksel.

6. Analiza obrazu

UWAGA: Opisana tutaj metoda odnosi się do obecnego przykładu. Proszę zapoznać się z tabelą 1 i tekstem w celu dostosowania do innych konkretnych próbek.

  1. Wykonaj wyrównanie tkanek za pomocą modułu Tissualign w oprogramowaniu do analizy obrazu (VIS w tym protokole, patrz Tabela materiałów).
    1. Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu i kliknij kartę Tissuealign.
    2. Zaimportuj obrazy, które mają zostać wyrównane, do tacy slajdów, przechodząc do pozycji Plik | Baza danych i wybierz pierwszy obraz do wyrównania. Wróć do zakładki Tissuealign i załaduj obraz, klikając przycisk Załaduj w zasobniku slajdów. Obraz pojawi się na tacy slajdów i w obszarze roboczym.
      UWAGA: Do tacy na slajdy należy załadować tylko interesujący nas stos
      3. .
    3. Powtórz krok 6.1.2 dla wszystkich obrazów w kolejności, w jakiej chcesz je wyrównać, wczytując je jeden po drugim. Po załadowaniu wszystkich interesujących obrazów do zasobnika slajdów przystąp do łączenia obrazów, naciskając przycisk Dalej w krokach przepływu pracy na wstążce.
    4. Następnie przeciągnij i upuść drugi obraz na pierwszy obraz. Pierwszy i drugi obraz są teraz połączone. Powtórz ten krok, aby inne obrazy zostały wyrównane, jeden po drugim, w uporządkowany sposób. Nazwa pierwszego obrazu zmieni się, co oznacza, że został on połączony z innymi obrazami. Jednocześnie połączone obrazy zostaną wyświetlone w przestrzeni roboczej po prawej stronie tacy slajdów.
    5. W tym momencie wyrównaj obrazy za pomocą wyrównania automatycznego, wyrównania półautomatycznego lub wyrównania ręcznego. Zawsze lepiej jest najpierw spróbować automatycznego wyrównania. Aby automatycznie wyrównać, naciśnij przycisk Dalej w krokach przepływu pracy (krok 3) na wstążce.
    6. Przejrzyj automatyczne wyrównanie, nawigując po różnych lokalizacjach tkanki i wizualnie sprawdzając, czy odpowiednie struktury na różnych obrazach są ułożone w ten sam sposób w dwóch wymiarach obrazu.
    7. Jeśli wynik automatycznego wyrównania nie jest zadowalający, popraw go za pomocą szpilek (użyj co najmniej trzech szpilek na obraz) wskazujących homologiczne cechy tkanki na połączonych obrazach. Po umieszczeniu kołków w homologicznych lokalizacjach na połączonych obrazach, użytkownik ma dwie możliwości: wyrównanie półautomatyczne lub ręczne. Aby uzyskać półautomatyczne wyrównanie, kliknij przycisk Automatycznie wyrównaj na podstawie bieżących punktów na wstążce. Aby wyrównać ręcznie, kliknij przycisk Zastosuj pinezki na wstążce.
    8. Jeśli wyrównanie jest zadowalające, kliknij przycisk Dalej w krokach przepływu pracy i zapisz obraz kompozytowy w bazie danych.
      UWAGA: Wyrównanie sześciu slajdów obejmujących 11 znaczników oraz obrazów H&E i PSR zajęło 15 minut w przedstawionej analizie.
  2. Wykrywanie tkanek należy przeprowadzić przy użyciu zdefiniowanego przez użytkownika protokołu Analysis Protocol Package 1 (APP 1, Tabela 1).
    1. Otwórz moduł Analiza obrazu w oprogramowaniu, klikając kartę Analiza obrazu na wstążce.
    2. Zaimportuj obraz kompozytowy (wyrównany), przechodząc do punktu menu Plik | bazy danych i wybierając interesujący Cię obraz i klikając wstecz zakładkę Analiza obrazu.
    3. Otwórz okno dialogowe wyboru aplikacji, klikając ikonę Otwórz aplikację i wybierz pakiet protokołu analizy (APP), którego chcesz użyć. W takim przypadku wybierz APP 1 do wykrywania tkanek.
    4. Po otwarciu aplikacji APP 1 potwierdź, że APP1 działa poprawnie, przechodząc do wybranej lokalizacji tkanki i klikając przycisk Podgląd. Jeśli wyniki są zadowalające, przejdź do kolejnego kroku.
    5. Kliknij, aby uruchomić aplikację 1 i przetworzyć obraz za pomocą wybranej aplikacji.
    6. Eksportuj dane (np. obrazy, pomiary itp.) po zakończeniu analizy, klikając Plik/Eksport.
      UWAGA: APP 1 tworzy obszar zainteresowania (ROI) wyznaczający tkankę (Tkanka ROI) i oblicza obszar tkanki.
    7. Zapisz zmodyfikowany obraz z nowo utworzonym ROI, przechodząc do punktu menu Plik | Zapisać.
      UWAGA: Wykrycie tkanki i utworzenie ROI za pomocą APP 1 w podanym przykładzie zajęło 5 minut w opisanej stacji analizy obrazu. Powierzchnia obrabianej tkanki wynosiła 3,2cm2.
  3. Przeprowadzić segmentację tkanek na zrąb i miąższ za pomocą APP 2 (Tabela 1).
    UWAGA: APP 2 działa na predefiniowanej tkance ROI. APP 2 segmentuje tkankę na ROI, zrąb i miąższ.
    1. Otwórz moduł Analiza obrazu, klikając kartę Analiza obrazu na wstążce.
    2. Zaimportuj obraz zawierający tkankę ROI, przechodząc do Plik | Baza danych i wybór obrazu zapisanego w kroku 6.2.7. Wróć do karty Analiza obrazu i załaduj obraz, klikając przycisk Załaduj w zasobniku slajdów. Obraz pojawi się na tacy slajdów i w przestrzeni roboczej.
    3. Otwórz aplikację 2 za pomocą okna dialogowego wyboru aplikacji, jak w 6.2.3.
    4. Podgląd aplikacji 2 poprzez przetwarzanie w wybranym polu view. Jeśli wyniki są zadowalające, uruchom aplikację 2 na pełnym obrazie, klikając przycisk Uruchom. Jako wynik APP 2, tkanka ROI jest segmentowana na ROI Stroma i Miąższ oraz określa się ich odpowiednie obszary. Eksport wyników jak w punkcie 6.2.6. Zapisz zmodyfikowany obraz jak w 6.2.7.
      UWAGA: Segmentacja tkanki w zrębie i miąższu za pomocą APP 2 trwała 4 godziny w prezentowanej stacji analitycznej. Powierzchnia obrabianej tkanki wynosiła 3,2cm2.
  4. Zidentyfikuj i określ ilościowo komórki FoxP3hiCD4+ za pomocą zdefiniowanego przez użytkownika protokołu APP 3 (Tabela 1).
    UWAGA: APP 3 działa na predefiniowanych ROI Stroma i Parenchyma.
    1. Otwórz moduł Analiza obrazu i zaimportuj obraz zawierający ROI, zrąb i miąższ, jak w 6.3.1 i 6.3.2. Otwórz aplikację 3 za pomocą okna dialogowego wyboru aplikacji, jak w 6.2.3.
    2. Podgląd przetwarzania APP 3 w wybranym polu widzenia wzbogacony o komórki FoxP3hiCD4+. Jeśli wyniki są zadowalające, uruchom aplikację 3 na pełnym obrazie. Jako dane wyjściowe APP 3, wszystkie indywidualne obiekty FoxP3hiCD4+ zostaną oznaczone, a ich współrzędne tkankowe zapisane. Określone zostaną zagęszczenia obiektów FoxP3hiCD4+ w ROI Stroma i Parenchyma. Eksportuj wyniki jak w 6.2.6.
    3. Wykonaj mapowanie termiczne tkanek obiektów oznaczonych FoxP3hiCD4+.
      1. Otwórz zdefiniowany przez użytkownika protokół FoxP3hiCD4+ MAP za pomocą okna dialogowego wyboru aplikacji, jak w 6.2.3.
        UWAGA: FoxP3hiCD4+ MAP wykorzystuje współrzędne obiektów oznaczonych jako FoxP3hiCD4+ do generowania map cieplnych gęstości. Identyfikacja i zliczanie obiektów oznaczonych FoxP3hiCD4+ za pomocą APP 3 zajęło 25 minut w opisanej stacji analizy obrazu. Powierzchnia obrabianej tkanki wynosiła 3,2cm2.
      2. Uruchom FoxP3hiCD4+ MAP, naciskając przycisk Uruchom. Wyeksportuj mapę cieplną tkanki, klikając Plik | Eksport | Obszar roboczy.
        UWAGA: Mapowanie obiektów oznaczonych FoxP3hiCD4+ za pomocą FoxP3hiCD4+ MAP zajęło 5 min w opisanej stacji analizy obrazu.
  5. Zidentyfikuj i określ ilościowo obiekty CD8+, CD68+, MPO+, αSMA i CD34+ przy użyciu zdefiniowanych przez użytkownika protokołów APP 4, APP5, APP6, APP7 i APP 8 odpowiednio (Tabela 1), jak to zrobiono w sekcji 6.4 do 6.4.3.2, ładując APP będący przedmiotem zainteresowania w każdym przypadku.
    UWAGA: Aplikacje od 4 do 8 działają na predefiniowanych ROI Stroma i Parenchyma.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przegląd strategii wizualizacji, kwantyfikacji i mapowania interesujących populacji komórek w TME
Aby określić ilościowo interesujące populacje komórek (COI) w różnych przedziałach tkankowych (TC) i scharakteryzować ich organizację przestrzenną, zaprojektowaliśmy przepływ pracy, który integruje niedrogie i łatwe w użyciu techniki oraz maksymalizuje informacje o położeniu, które można uzyskać z cennych próbek klinicznych FFPE (Rysunek 1). Po pierwsze, seryjne skrawki FFPE całych tkanek zostały wybarwione w celu wizualizacji COI (np. komórek odpornościowych) i TC (np. zrąb kontra miąższ) (Rysunek 1, krok 1). Liczba kolejnych skrawków do barwienia powinna być ograniczona do minimum, które pozwala na wizualizację interesujących komórek lub cech tkanek potrzebnych do odpowiedzi na pytanie badawcze. Im mniejsza liczba odcinków szeregowych, tym większe podobieństwo i zgodność architektury tkankowej między sąsiadującymi sekcjami. Ponadto możliwości multipleksowania można rozszerzyć poprzez ponowne wykorzystanie fluorescencyjnie wybarwionych skrawków za pomocą technik strippingu i ponownego sondowania19.

Po zakończeniu etapów barwienia, do digitalizacji obrazów użyto całego skanera slajdów. Obrazy uzyskane z odcinków seryjnych zostały wyrównane i skonsolidowane w wirtualny slajd multipleksu w sposób zautomatyzowany (Rysunek 1, sekcja 2). Następnie określono zwrot z inwestycji dla tkanki za pomocą zdefiniowanego przez użytkownika protokołu, który zidentyfikował piksele związane z tkanką (TAP) (Rysunek 1, krok 3). Następnie tkanka ROI została podzielona na TC zdefiniowane jako dodatkowe ROI. (Rysunek 1, krok 4). Następnie zdefiniowane przez użytkownika protokoły wykryły i określiły ilościowo COI w różnych TC (Rysunek 1, krok 5). Na koniec wygenerowano mapy cieplne tkanek COI na podstawie ich gęstości i współrzędnych tkanek (Rysunek 1, krok 6).

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie strategii wizualizacji, kwantyfikacji i mapowania komórek odpornościowych w TME. (1) Seryjne całe skrawki tkanek zostały wybarwione w celu oznaczenia COI i TC. Barwione całe skrawki tkanek zostały zdigitalizowane przy użyciu skanera do tworzenia całych preparatów. (2) Obrazy uzyskane z odcinków seryjnych zostały połączone, wyrównane i współrejestrowane w sposób zautomatyzowany za pomocą modułu analitycznego Tissuealign. Obraz złożony został wygenerowany na podstawie bardzo precyzyjnego wyrównania poszczególnych obrazów. (3) Protokół zdefiniowany przez użytkownika został wykorzystany do automatycznego wykrywania pikseli związanych z tkanką (TAP) w obrazie kompozytowym. (4) Tkankę podzielono na TC (np. zrąb i miąższ) zdefiniowane jako ROI. (5) Do automatycznego wykrywania i ilościowego oznaczania COI w różnych TC wykorzystano protokoły zdefiniowane przez użytkownika. (6) Wygenerowano tkankowe mapy cieplne COI. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Obrazowanie COI i TCs
Trzy seryjne wycinki całych tkanek FFPE wyciętego guza od osoby z rakiem wątrobowokomórkowym związanym z HBV zostały wybarwione w jednej lub więcej rundach barwienia, jak w Rysunek 2A. Sekcja I została wybarwiona H&E w celu pokazania architektury tkanki, morfologii komórek i określenia klinicznie istotnych parametrów, takich jak rodzaj nowotworu, stopień nowotworu i ogólna ocena infiltracji immunologicznej (Rysunek 2C). W przyległej sekcji II dwie rundy mIF użyto do znakowania komórek miąższowych i niemiąższowych wątroby (Figura 2A). W pierwszej rundzie uwidoczniono naczynia normalne i nowotworowe za pomocą barwienia komórek śródbłonka CD34. Ponadto komórki nabłonkowe (hepatocyty i cholangiocyty) zidentyfikowano za pomocą cytokeratyny 8/18, a fibrogenne aktywowane komórki gwiaździste wątroby zidentyfikowano jako komórki alfa mięśni gładkich dodatnie (αSMA+) (Rysunek 2C). Po uzyskaniu obrazu skrawki tkanek zostały ogołocone i ponownie poddane próbie przeciwciał przeciwko makrofagom (CD68) i miofibroblastom (desmina). Aby lepiej scharakteryzować naciek immunologiczny guza, sąsiedni odcinek szeregowy III wybarwiono przy użyciu dwóch rund mIF dla markerów komórkowych CD3, CD4, CD8, skrzynki widłowej P3 (FoxP3) i mieloperoksydazy (MPO). We wszystkich przypadkach DAPI był używany jako przeciwbarwnik jądrowy. Na koniec sekcja III została wybarwiona barwnikiem PSR i wybarwiona na szybko zielono, aby uwidocznić kolagen fibrylarny i podzielić tkankę na zrąb i miąższ (Rysunek 2C).

Cały skaner slajdów wyposażony w obiektyw o 20X został użyty do digitalizacji poplamionych sekcji i tworzenia wirtualnych slajdów. Sześć obrazów uzyskano z trzech sekcji szeregowych (Rysunek 2B), a następnie wirtualne slajdy przeanalizowano za pomocą oprogramowania VIS zgodnie ze schematycznym przedstawieniem w Rysunek 1.

Analiza obrazu
Analiza obrazu składała się z pięciu etapów: 1) wyrównania tkanek; 2) wykrywanie tkanek; 3) segmentacja tkanek; 4) zautomatyzowana kwantyfikacja COI; i 5) mapowanie cieplne tkanek. Wszystkie protokoły do analizy obrazu zostały opracowane przy użyciu modułu Author oprogramowania do analizy obrazu i są określane w tekście jako APP.

Wyrównanie tkanki
Sześć wirtualnych preparatów z trzech seryjnych sekcji, obejmujących 11 markerów oraz barwniki H&E i PSR, zostało załadowanych do modułu Tissualign w oprogramowaniu do analizy obrazu. Następnie obrazy zostały połączone, wyrównane i współrejestrowane w sposób zautomatyzowany, generując 11-pleksowy wirtualny obraz kompozytowy H&E i PSR, zawierający wszystkie warstwy poszczególnych obrazów (rysunki 2A–C). Wyrównanie było dokładne w przypadku obrazów pochodzących z sąsiednich odcinków szeregowych, pokazujących odpowiadające im struktury tkankowe ustawione i ułożone w sposób homologiczny po wyrównaniu (Rysunek 2C i Rysunek S1A). Co więcej, wyrównanie było precyzyjne na poziomie poszczególnych komórek dla obrazów pochodzących z tej samej sekcji (rysunek S1B). Czas automatycznego wyrównywania zależy od liczby, rozmiaru, złożoności i podobieństwa obrazów, które mają być wyrównane. Wyrównanie wyżej wymienionych sześciu wirtualnych slajdów zajęło 15 minut w naszej stacji VIS.

figure-results-2
Rycina 2: Barwienie seryjnych skrawków tkanek i wyrównanie obrazu. (A) Podsumowanie barwień wykonanych na trzech sekcjach seryjnych w celu wizualizacji COI i TC. Liczby w nawiasach oznaczają oznaczenie obrazu. W przypadku sekcji II i III tkanki zostały ogołocone i ponownie poddane próbie za pomocą drugiego koktajlu przeciwciał. (B) Przegląd sześciu pojedynczych obrazów całych tkanek przed i po wyrównaniu tkanek (odpowiednio po lewej i prawej stronie). Podziałka liniowa = 3,500 μm. (C) Powiększony widok wyrównanych obrazów. Podziałka = 80 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykrywanie tkanek
Po połączeniu i wyrównaniu obrazów staraliśmy się zidentyfikować TAP-y (Rysunek 3A). Aby zaprojektować aplikację do automatycznego wykrywania TAPów (APP 1, Tabela 1), wykorzystaliśmy dwie właściwości, które odróżniają TAP-y od pikseli niezwiązanych z tkanką. Po pierwsze, sygnał DAPI (niebieskie pasmo) jest ograniczony do jąder, które znajdują się wyłącznie w tkance, co oznacza, że wszystkie piksele DAPI+ są podzbiorem TAP. Po drugie, TAP-y mają wyższy sygnał autofluorescencji w zielonym i żółtym pasie w porównaniu z pikselami niezwiązanymi z tkanką. W związku z tym opracowaliśmy APP 1 do wykrywania tkanek (Tabela 1), który wykrywa TAPs na podstawie sygnału wyjściowego w tych kanałach przy użyciu prostych technik progowania. Progi dla pasm niebieskiego, zielonego i żółtego zostały ustawione w taki sposób, że TAPy miały wartości intensywności tła powyżej progów, podczas gdy piksele niezwiązane z tkanką miały wartości poniżej. APP 1 do wykrywania tkanek zastosowano do obrazu IIA, który zawiera warstwy w kanałach niebieskim, zielonym i żółtym (Rysunek 3A). Jako dane wyjściowe APP 1, jasnozielona maska została nałożona na TAPy i nakreślono ROI o nazwie "Tkanka" (wyjście, Rysunek 3A). Ponadto określono powierzchnię tkanki jako ilościową zmienną wyjściową. Ponieważ APP 1 nie obejmuje pikseli niezwiązanych z tkanką w tkance ROI, zostały one wykluczone z późniejszej analizy na podstawie tego ROI (Rysunek 3A). Precyzja APP 1 w identyfikacji TAPów jest pokazana w Rysunek 3A.

Segmentacja tkanek i wyznaczanie ROI dla TCs
Następnie przystąpiliśmy do definiowania różnych przedziałów w tkance ROI, dzieląc tkankę na zrąb i miąższ. Użyliśmy obrazu barwionego PSR (IIIC, Rysunek 2C), gdzie zrąb można zdefiniować jako obszar związany z odkładaniem się kolagenów fibrylarnych (czerwony pasek), miąższ jako obszar, w którym nie ma kolagenów fibrylarnych, a przeważa szybki zielony barwnik przeciwbarwiący (zielony pasek) (Rysunek 3B). Stworzyliśmy aplikację 2 (Tabela 1) do cyfrowego rozgraniczenia TC Stroma i Parenchyma. Ta aplikacja działa na predefiniowanej tkance ROI (wyjście, Rysunek 3A) i wykorzystuje reprezentatywne obszary zrębu i miąższu do trenowania narzędzia Klasyfikator zintegrowanego z modułem Analiza obrazu. Wytrenowany klasyfikator przypisuje piksele do etykiety zrębu lub miąższu (odpowiednio łosoś i zielony, Rysunek 3B). Po sklasyfikowaniu pikseli, APP 2 wykonał operacje morfologiczne mające na celu zdefiniowanie ROI Stroma i Parenchyma (Rysunek 3B i Tabela 1). Wydajność APP 2 w klasyfikowaniu pikseli i generowaniu odpowiednich ROI jest pokazana na Rysunek 3B. Dodatkowo APP 2 określa ilościowo obszar zrębu i miąższu. Wreszcie, mimo że segmentacja jest wykonywana przy użyciu wybarwionego PSR, zarysowane obszary zrębu i miąższu można przenieść na dowolny obraz wyrównany do obrazu PSR.

figure-results-3
Rysunek 3: Automatyczne wykrywanie/segmentacja tkanek i generowanie odpowiednich zwrotów z inwestycji. (A) Obraz IIA został wykorzystany do identyfikacji TAPów (obraz po lewej, podziałka = 6 000 μm). Jasnozielona maska została przypisana do TAPów za pomocą APP 1 (Tabela 1), generując zwrot z inwestycji o nazwie Tkanka (wyjście 1). Po prawej stronie wstawka pokazuje powiększony widok demonstrujący precyzję APP 1 w wykrywaniu TAP. Pasek skali = 350 μm. (B) Tkanka ROI (wyjście 1) jest segmentowana na zrąb i miąższ za pomocą APP 2. Obraz po lewej stronie przedstawia widok tkanki ROI podzielonej na zrąb ROI (łosoś) i miąższ ROI (zielony). Podziałka = 4 500 μm. Po prawej stronie powiększone widoki wstawki dla tkanki ROI, oryginalnego barwienia PSR (zdjęcie IIIC) oraz zrębu i miąższu ROI. Podziałka = 250 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Automatyczna kwantyfikacja COIs
Następnie przystąpiliśmy do identyfikacji, lokalizacji i ilościowego określania COI w ROI Stroma i Miąższu. Aplikacje od 3 do 8 (Tabela 1) zostały stworzone w celu zlokalizowania i zliczenia następujących COI: odpowiednio komórki CD4 + FoxP3 +, CD8 +, CD68 +, MPO +, αSMA + i CD34 +. APP 3 został zaprojektowany do lokalizowania i liczenia komórek CD4 + FoxP3 + (obraz IIIA, Figura 2C) jako markery zastępcze regulatorowych limfocytów T (Treg). Protokół ten wykrywa kolokalizację sygnału z jądrowego czynnika transkrypcyjnego FoxP3 (czerwona wstęga) i barwnika znakującego DNA DAPI (niebieska wstęga). Biorąc pod uwagę, że ostatnio aktywowane limfocyty T zwiększają regulację FoxP3, aby wzbogacić Treg, ustawiamy progi wstępnej selekcji tylko jasnych komórek FoxP3 + (FoxP3 hi). Następnie, spośród wszystkich wstępnie wybranych komórekDAPI + FoxP3 hi, tylko te, które były otoczone jasnymi sygnałami CD4 w kształcie pierścienia (zielone pasmo) zostały oznaczone i policzone jako komórki FoxP3hiCD4 + (różowa etykieta, Rysunek 4A). Gęstość komórek FoxP3hiCD4 + w ROI Stroma i Parenchyma została określona jako ilościowe zmienne wyjściowe APP 3 (Rysunek 4A).

Podobnie, aplikacje od 4 do 6 zostały zaprojektowane do wykrywania komórek CD8+, CD68+ i MPO+. Te aplikacje mają ten sam podstawowy projekt wykrywania i ilościowego określania COI. W szczególności COI są identyfikowane na podstawie intensywności sygnału z biomarkera określonej populacji komórek, a następnie wykonywanych jest kilka etapów morfologicznych przetwarzania końcowego w celu wyznaczenia poszczególnych komórek (Tabela 1). Poszczególne komórki lub COI są znakowane, zliczane, a ich współrzędne tkankowe rejestrowane. Aplikacje od 4 do 6 określają również gęstość COI w ROI Stroma i Parenchyma (Rysunek 4B–D).

Jakość naszego barwienia DAPI nie była wystarczająco dobra, aby zintegrować segmentację jąder z aplikacjami od 3 do 6, więc nie możemy zagwarantować, że wszystkie indywidualnie oznaczone obiekty są pojedynczymi komórkami. Z tego powodu wyraziliśmy gęstość komórek w liczbie oznaczonych obiektów/mm2 (Rysunek 4). Jednak agregaty komórkowe zostały z powodzeniem rozdzielone na pojedyncze komórki w krokach przetwarzania końcowego wbudowanych w aplikacje od 3 do 6, a szeroko zakrojone oględziny wykazały, że większość oznaczonych obiektów odpowiadała pojedynczym komórkom.

Do wykrywania obszaru αSMA+ i CD34+ opracowaliśmy odpowiednio aplikacje 7 i 8 (Tabela 1). Obie aplikacje wykrywają określony sygnał na podstawie progów i określają procent dodatniego obszaru w ROI Stroma i Parenchyma (Rysunek 4E–F).

Jedną z najciekawszych możliwości generowania slajdów wirtualnego multipleksu jest analiza wyrażenia kolokalizacji. Stworzyliśmy APP 10 w celu wykrycia kolokalizacji między αSMA i desminą, dwoma markerami ulegającymi jednoczesnej ekspresji miofibroblastów w wątrobie. Aplikacja 10 wykorzystuje progi do znajdowania pikseli dodatnich dla αSMA, desmin i αSMA plus desmin (Tabela 1). Jako ilościowe zmienne wyjściowe, APP 10 określa obszar αSMA+, obszar desmin+ i obszar kolokalizowanej ekspresji tych dwóch markerów (Rysunek S3).

figure-results-4
Rysunek 4: Identyfikacja i kwantyfikacja COI w zrębie i miąższu TC. (A–F) Automatyczne wykrywanie i oznaczanie ilościowe CD4 + FoxP3 +, CD8 +, CD68 +, MPO +, αSMA+ i CD34 + COI w ROI Stroma i Miąższu przy użyciu protokołów odpowiednio 3, 4, 5, 6, 7 i 8 (Tabela 1). Po lewej stronie pokazane są oryginalne obrazy, pośrodku przetworzone obrazy, a po prawej kwantyfikacje. Dla rysunków 4A–D podziałka liniowa = 40 μm. Dla rysunków 4E i F, podziałka = 350 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Jako alternatywę dla ilościowego oznaczania COI w TCs Stroma i Parenchyma, określiliśmy gęstość komórek odpornościowych w różnych złośliwych guzkach o nazwach od 1 do 4 (Rysunek 5A, H i I). Zwrot z inwestycji dla każdego guzka został ręcznie nakreślony, jak wskazano w Rysunek 5A. Charakterystyczne tkankowe sygnatury immunologiczne charakteryzowały każdy guzek, dodatkowo ujawniając wewnętrzną heterogeniczność TME.

Mapy cieplne tkanek
Jak wspomniano powyżej, aplikacje od 3 do 8 przechowują współrzędne tkanek każdego indywidualnie oznakowanego obiektu. Funkcja ta umożliwia automatyczne generowanie map tkankowych, w których obszary o dużej gęstości danej populacji komórek są wyświetlane jako gorące punkty (kolor czerwony), a obszary o stosunkowo niskiej gęstości jako zimne punkty (kolor ciemnoniebieski). Pośrednie wartości gęstości są przypisywane do kolorów zgodnie ze skalą kolorów pokazaną na Rysunek 5. Mapy cieplne tkanek zostały wygenerowane przez aplikacje, które podzieliły obrazy na okręgi o średnicy 50 μm i przypisały kolor zgodnie ze względną gęstością danego COI wewnątrz okręgu. Jak pokazano w Rysunek 5B–G, wzorce pozycjonowania i rozkład intensywności różnych COI w TME były dość zróżnicowane. Co więcej, na poziomie pojedynczych guzków układ różnych populacji w obszarze tkanki był unikalny (ryc. S2A–C). Aby dać przykład mocy tej techniki i zobrazować przestrzenną organizację gorących punktów z różnych populacji w tym samym guzku, gorące punkty z poszczególnych typów komórek zostały ręcznie wyodrębnione i zmapowane razem na konturze guzka 2 (Rysunek S2, Rysunek D i Rysunek E).

figure-results-5
Rysunek 5: Tkankowe mapy cieplne COI w TME. (A) Czerwone zabarwienie Picrosiriusa pokazujące lokalizację guzków 1, 2, 3 i 4. (B–G) Tkankowe mapy cieplne odpowiednio dla COI CD4 + FoxP3 +, CD8 +, CD68 +, MPO +, CD34 + i αSMA+. Ciemnoniebieski oznacza względnie niską gęstość, a czerwony oznacza względnie wysoką gęstość. Pośrednim wartościom gęstości przypisywane są kolory zgodnie z pokazaną skalą kolorów. (H i I) Kwantyfikacja COI w guzkach 1, 2 i 3 + 4 zorganizowanych odpowiednio według typu komórki i guzka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek uzupełniający S1: Walidacja wyrównania tkanek. (A) Barwienie CD34 (na czerwono) wykonane na sekcji II (wejście 1) służy do generowania maski CD34 w kolorze zielonym (wyjście 1). Zielona maska (wyjście 1) jest nałożona na obraz H&E z wyrównanej sekcji szeregowej I (wejście 2). Obraz scalania pokazuje idealną zgodność struktur naczyniowych. Podziałka = 50 μm. (B) Obraz IIIA przedstawiający połączenie DAPI, CD4 i FoxP3 (wejście 1) został użyty do wygenerowania etykiety dla komórek CD4 + FoxP3 + (wyjście 1 w kolorze magenta). Etykieta wyjścia 1 została przeniesiona na wyrównany obraz IIIB (wejście 2) i pokazuje idealną zgodność między parami FoxP3/DAPI i CD4/CD3 w obrazie scalania. Podziałka skali = 15 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek uzupełniający S2: Powiększony widok map cieplnych tkanek. (A–C) Mapy cieplne tkanek dla komórek CD4 + FoxP3 +, CD8 +, CD68 + i MPO + w guzkach 1–4. Paski skali w guzkach 1, 2 i 3 + 4 reprezentują odpowiednio 1,500 μm, 700 μm i 500 μm. (D) Obrys guzka 2 czarną ciągłą linią. (E) Gorące punkty dla komórek CD4 + FoxP3 +, CD8 +, CD68 + i MPO + w guzku 2 zostały wyekstrahowane i zmapowane razem na konturze guzka 2 zdefiniowanym w D. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek uzupełniający S3: Analiza kolokalizacji. (A) Po lewej i w środku znajdują się obrazy etykiety αSMA w kolorze zielonym i etykiety desmin w kolorze czerwonym. Po prawej stronie znajduje się obszar podwójnie dodatni αSMA/desmin w kolorze żółtym. (B) Kwantyfikacja obszaru αSMA+, obszaru desmin + i obszaru podwójnie dodatniego αSMA/desmin. Podziałka = 150 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

APLIKACJAPrzeznaczenieklasyfikacjaklasyfikacjaKroki przetwarzania końcowegoZmienne wyjściowe
metodaFunkcje
(wartość piksela)
1Wykrywanie tkanekprógKanał DAPI (150)o Oznacz obiekty z kolokalizowanymi wartościami powyżej progu dla 3 kanałówo Tkanka ROI
Kanał FITC/A488 (120)o Zamknij obiekt pozytywowy 5 pikselio Obszar tkanki
Kanał TRITC/A568 (40)o Utwórz tkankę ROI
2Segmentacja tkanekLas decyzyjnyMediana RGB-Ro Wypełnianie otworówo ROI Stroma
Mediana RGB-Go Utwórz ROI Stromao Obszar Stroma
Mediana RGB-Bo Utwórz miąższ ROIo ROI Parenchyma
Mediana IHS-So Obszar miąższu
Mediana H&E Eosin
3Aby zlokalizować i określić ilościowo komórki CD4+ FoxP3+prógKanał DAPI (>600)o Etykietowanie obiektów z kolokalizacją DAPI i Cy5/A647, otoczonych sygnałem FITC/A488o Liczba i gęstość komórek CD4 + FoxP3 + w ROI Zrębu i Miąższu
Kanał FITC/A488 wygładzanie poli (>850)o Przezroczyste obiekty mniejsze niż 7μm2o Współrzędne poszczególnych komórek CD4+FoxP3+
Kanał Cy5/A647(>800)
4Aby zlokalizować i określić ilościowo komórki CD8+prógKanał DAPI (<1200)o Wyraźne obiekty dodatnie mniejsze niż 15μm2o Liczba i gęstość komórek CD8 + w ROI Zręb i Miąższ
Kanał Cy5/A647 mediana (>80)o Zamknij obiekty pozytywowe 2 pikseleo Współrzędne poszczególnych komórek
o Oddzielne obiekty
5Aby zlokalizować i określić ilościowo komórki CD68+prógkanał FITC/A488 (>200)o Wyraźne obiekty pozytywowe mniejsze niż 20 μm2o Liczba i gęstość komórek CD68+ w ROI, zrębie i miąższu
o Rozszerzanie obiektów pozytywowych o 3 pikseleo Współrzędne poszczególnych komórek CD68+
o Oddzielne obiekty
6Aby zlokalizować i określić ilościowo komórki MPO+prógKanał DAPI (>400)o Przezroczyste przedmioty mniejsze niż 5μm2o Liczba i gęstość komórek MPO + w ROI, zrębie i miąższu.
Kanał TRITC/A568 (900-4000)o Rozszerz 3 piksele obiektów pozytywowycho Współrzędne poszczególnych komórek MPO+.
o Oddzielne obiekty
7Aby zlokalizować i określić ilościowo obszar αSMA+prógkanał TRITC/CF568 (>1050)o Wyraźne obiekty pozytywowe mniejsze niż 25μm2o Liczebność i gęstość obszaru αSMA+ w ROI, zrębie i miąższu
o Rozszerz 3 piksele obiektów pozytywowycho Współrzędne pikseli αSMA+
8Aby zlokalizować i określić ilościowo obszar CD34+prógKanał DAPI (<5000)o Wyraźne obiekty pozytywowe mniejsze niż 25μm2o Liczebność i gęstość obszaru CD34+ w ROI Zrębu i Miąższu
Kanał Cy5/A647 mediana (>120)o Rozszerz 3 piksele obiektów pozytywowycho Współrzędne pikseli CD34+
9Utwórz mapy cieplne tkanek dla danej populacji komórekMapa cieplna obiektuMapa termiczna obiektuo Mapa cieplna
Promień ciągnienia 50 μm---
10Określ ilościowo kolokalizację między αSMA i DesminprógKanał TRITC (CF568) (>1050)o Oznacz obiekty z powyższymi wartościami progowymi dla TRITC (CF568)o Ilościowe określenie kolokalizowanego wyrażenia αSMA i Desmin
Kanał Cy5 (A647) (>1000)o Oznacz obiekty z powyższymi wartościami progowymi dla Cy5 (A647)
o Oznacz obiekty z kolokalizacją ponadprogowych wartości dla TRITC (CF568) i Cy5 (A647)
o Wyraźne obiekty pozytywowe mniejsze niż 25μm2

Tabela 1: Ogólne parametry używane do projektowania aplikacji wykorzystywanych do analizy obrazu. Parametry określone w tej tabeli są dostosowane do unikalnych cech obrazów użytych w tej analizie (np. tło, artefakty itp.) i mogą nie mieć zastosowania do innych obrazów. Ponieważ wspomniane kroki przetwarzania końcowego zostały zdefiniowane dla konkretnych obrazów analizowanych w tym badaniu, celowo nie są one szczegółowe. Użytkownik powinien dostosować aplikacje do obrazów, które mają być analizowane.

Przekrój/BarwieniePrzeciwciało pierwszorzędowePrzeciwciało drugorzędowe
Sekcja II/1 st BarwienieMysi IgG2a anty-ludzki αSMA
Mysi IgG1 anty-ludzki CD34
Królik anty-ludzki Cytokeratyna 8/18		Kozia anty-mysia IgG2a CF568
Szczurzy anty-mysz IgG1 A647
Osioł anty-królik A488
Sekcja II/2i barwienieKrólik anty-ludzki Desmin
Mysz anty-ludzka CD68		Osioł anty-królik A647
Osioł anty-mysz DyLight 755
Sekcja III/1 st BarwienieMysz anty-ludzka CD4
Królik anty-ludzki FoxP3
Koza anty-ludzka MPO		Oślica przeciw myszom A488
Osioł anty-królik A647
Osioł anty-koza A568
Sekcja III/2i barwienieKrólik anty-ludzki CD3
Mysz anty-ludzka CD8		Oślica przeciw myszom DyLight 755
Osioł anty-królik A647

Tabela 2: Pary przeciwciał pierwszorzędowych-drugorzędowych dla mIF.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proste, dostępne i łatwe do wykonania techniki multipleksowania, które umożliwiają przestrzenną rozdzielczość komórek odpornościowych w skrawkach tkanki, są potrzebne do mapowania krajobrazu immunologicznego w nowotworach i innych zaburzeniach immunologicznych. W tym miejscu opisujemy strategię, która integruje szeroko dostępne techniki etykietowania i analizy cyfrowej w celu rozszerzenia możliwości multipleksowania i wielowymiarowej oceny testów obrazowania 12,13,17,19. Barwienie trzech odcinków seryjnych dla różnych markerów oraz ponowne wykorzystanie skrawków za pomocą technik strippingu i ponownego sondowania umożliwiło nam wizualizację 11 parametrów oprócz barwienia H&E i PSR. Sześć obrazów z tych sekcji zostało wyrównanych w sposób zautomatyzowany za pomocą modułu wyrównywania tkanek. Wyrównanie było precyzyjne na poziomie poszczególnych komórek dla obrazów pochodzących z tej samej sekcji i wysoce zgodne dla obrazów pochodzących z sąsiednich sekcji. Wirtualne multipleksowanie pozwoliło nam określić, w jaki sposób znaczniki wizualizowane w jednej sekcji odnoszą się przestrzennie do znaczników wizualizowanych w innej sąsiadującej sekcji. Podczas gdy niektóre z barwień oznaczały COI, inne oznaczały TC, co pozwala nam na ilościowe określenie COI w różnych TC. Zastosowanie narzędzi programowych do automatycznego określania ilościowego COI znacznie uprościło i przyspieszyło przetwarzanie obrazów. Co więcej, analiza cyfrowa została zastosowana do całych wycinków tkanek zamiast wybranych pól widzenia, co zaowocowało bezstronnym odwzorowaniem TME. Ponadto, ponieważ współrzędne tkankowe COI zostały zarejestrowane, możliwe było wygenerowanie map cieplnych tkanek.

W tym protokole jest kilka obszarów, w których może być konieczne rozwiązywanie problemów. Po pierwsze, słabe pobieranie antygenu może wpływać na jakość mIF, dlatego rodzaj bufora do pobierania antygenu i czas trwania powinny być zoptymalizowane pod kątem określonych warunków zastosowanych testów/biomarkerów. Po drugie, rodzaj zastosowanego roztworu blokującego powinien być dostosowany do tkanek/antygenu/gatunku przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych. W naszych rękach dodanie 10% całkowitej surowicy z gatunku, z którego pochodzi tkanka, zablokowało receptory Fc, a tym samym zmniejszyło niespecyficzne wiązanie przeciwciał. Dodanie 10% surowicy z gatunku, w którym wyhodowano przeciwciała drugorzędowe, zminimalizowałoby bezpośrednie niespecyficzne przyłączanie przeciwciał drugorzędowych do wycinka tkanki. Po trzecie, niezbędna jest walidacja swoistości przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych przy użyciu odpowiednich kontroli dodatnich i ujemnych. Po czwarte, powszechna jest również zwiększona autofluorescencja w niektórych kanałach i dyfuzja DAPI po usunięciu przeciwciał pierwotnych. Aby rozwiązać problem zwiększonej autofluorescencji, użyliśmy par przeciwciał pierwszorzędowych/drugorzędowych, w których specyficzny sygnał miał wartości intensywności co najmniej 5 razy większe niż tło. Wreszcie, niektóre przeciwciała o wysokim powinowactwie nie mogą być eluowane za pomocą regularnych procedur strippingu. W takim przypadku zalecamy użycie takich przeciwciał w ostatniej rundzie znakowania. Użytkownik może być zmuszony do wypróbowania różnych sekwencji barwienia, aby znaleźć optymalną konfigurację dla interesujących go przeciwciał. Skuteczność usuwania powłok powinna zostać potwierdzona przed przejściem do drugiej lub trzeciej rundy etykietowania.

Głównym ograniczeniem i wyzwaniem tej strategii jest znalezienie odpowiednich kombinacji pierwszorzędowych i drugorzędowych przeciwciał fluorescencyjnych dla markerów będących przedmiotem zainteresowania. Znalezienie przeciwciał pierwszorzędowych wyhodowanych u różnych gatunków lub o różnych izotypach, które mogłyby być stosowane jednocześnie, jest ograniczone przez to, co jest dostępne na rynku. Większość skanerów całych preparatów jest wyposażona w lampy i filtry, które umożliwiają obrazowanie maksymalnie pięciu kanałów, a przeciwciała drugorzędowe we właściwych gatunkach i fluoroforach nie zawsze są dostępne. Częściowo pokonaliśmy te ograniczenia za pomocą barwienia seryjnego i sekwencyjnego etykietowania. Może być konieczne przetestowanie kilku kombinacji przeciwciał w celu uzyskania najlepszej kombinacji dla markerów będących przedmiotem zainteresowania. Kolejnym ograniczeniem jest jakość barwienia DAPI, ponieważ stripping i resonding nie zawsze pozwalają na przeprowadzenie segmentacji jąder.

Moduł wyrównywania tkanek wymaga minimalnego szkolenia i nie wymaga od użytkowników umiejętności programowania. Oprogramowanie teoretycznie pozwala na wyrównanie nieograniczonej liczby obrazów. Jednak precyzyjne wyrównanie zależy od pokrewieństwa sekcji, przy czym bliższe sekcje, które są bardziej zgodne histologicznie, są dokładniej wyrównane. Do generowania aplikacji użyliśmy modułu Author programu VIS. Podstawowa wiedza na temat analizy obrazu jest potrzebna do tworzenia aplikacji, ale dotyczy to również korzystania z każdego innego oprogramowania do analizy obrazu. Do unikalnych zalet VIS w porównaniu z innymi programami do analizy obrazów należy automatyczne wyrównywanie obrazów z przekrojów przygotowanych przy użyciu różnych metod (np. IF, histochemia, IHC). Pozwala to na badania kolokalizacyjne wielu markerów zainteresowania przy użyciu multipleksowania wirtualnego. Co więcej, elastyczna i przyjazna dla użytkownika konstrukcja aplikacji pozwala na dostosowanie do potrzeb użytkownika. Zautomatyzowana kwantyfikacja i mapowanie oraz możliwość przetwarzania całych skrawków tkanek oszczędza czas i zmniejsza błąd systematyczny w porównaniu z ręcznym liczeniem za pomocą kontroli wizualnej.

Strategia ta jest bardzo przydatnym narzędziem badawczym dla immunologii tkankowej w kontekście raka i autoimmunizacji, ale pozostaje niezwalidowana do użytku klinicznego. Dzięki dodatkowej standaryzacji i walidacji może być używany w przyszłości do wielu zastosowań (np. do mapowania krajobrazu immunologicznego w nowotworach w celu przewidywania i monitorowania odpowiedzi na leki immunoterapeutyczne). Można go również dostosować do różnych stanów zapalnych (np. nieswoistego zapalenia jelit), aby połączyć ocenę patologiczną z biomarkerami prognostycznymi.

Głównymi krytycznymi etapami w tym protokole są skuteczność/swoistość etykietowania oraz solidność zaprojektowanych aplikacji dla zamierzonego zastosowania lub biomarkera. Dlatego niezbędna jest regularna walidacja poprzez oględziny, zwłaszcza przy projektowaniu nowej aplikacji. Efektywne stosowanie wielu rund usuwania i ponownego próbkowania lub różnych rodzajów barwienia na tym samym odcinku jest krytycznym elementem i może być specyficzne dla tkanki lub sekcji. Weryfikacja wydajności takich procesów przed przystąpieniem do analizy dużych partii ma kluczowe znaczenie.

Podsumowując, zapewniamy strategię, która maksymalizuje informacje ilościowe i przestrzenne, które można uzyskać z cennych próbek tkanek klinicznych. Zasoby, sprzęt i wiedza wymagane do wdrożenia tej metodologii są powszechnie dostępne. Proponujemy tę metodologię jako przydatny przewodnik do planowania testów mających na celu identyfikację, kwantyfikację i mapowanie populacji komórek odpornościowych w TME.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy uczestnikowi badania. Dziękujemy Louise Rousseau, koordynatorce biobanku HBP, za odzyskanie próbek tkanek i wszystkich związanych z nimi informacji klinicznych. Dziękujemy za doskonałe wsparcie techniczne dla głównych obiektów w zakresie patologii molekularnej i obrazowania komórek w CRCHUM oraz Michaela Perscha z Visiopharm. Finansowanie: Badanie to było wspierane przez granty z Canadian Liver Foundation, Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS) AIDS and Infectious Disease Network (Réseau SIDA-MI) oraz Canadian Network on Hepatitis C (CanHepC). CanHepC jest finansowany przez wspólną inicjatywę Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (CIHR) (NHC-142832) i Kanadyjskiej Agencji Zdrowia Publicznego. M.F.M. otrzymał stypendia na Université de Montréal, Bourse Gabriel Marquis i FRQS. T.F. był stypendystą CIHR i CanHepC. S.T. jest kierownikiem Katedry Roger-Des-Groseillers w dziedzinie chirurgii onkologicznej wątroby i dróg żółciowych oraz trzustki na Uniwersytecie w Montrealu.

Wkład autora: M.F.M. zaprojektował, przeprowadził eksperymenty i przeanalizował dane. T.F. zaprojektował eksperymenty. A.C-B. udzielił wskazówek technicznych. G.S. przeprowadził całą ocenę patologiczną uczestnika badania i dostarczył informacji na temat wszystkich aspektów patologicznych. L.M. przeprowadził barwienie H&E, zoptymalizował i przeprowadził akwizycję obrazu. Firma M.N.A. wykonała bejcowanie PSR i wniosła cenny wkład techniczny. N.B. przyczynił się do analizy obrazu. S.T. jest głównym badaczem biobanku HBP i jest odpowiedzialny za nadzór nad jego ogólnym funkcjonowaniem. Wniósł również nieoceniony wkład we wszystkie aspekty projektu i jego implikacje kliniczne. M.F.M., T.F. i N.H.S. opracowali koncepcję i zaprojektowali badanie. N.H.S. nadzorowała prace i pozyskała dofinansowanie. M.F.M., T.F., A.C-B i N.H.S. napisali manuskrypt. Wszyscy autorzy zrecenzowali i zatwierdzili manuskrypt.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Roztwór do odzyskiwania antygenu: Bufor cytrynianu sodu (10 mM cytrynianu sodu, 0,05% v/v Tween 20, pH 6,0)
Roztwór blokujący: 1 % BSA, 10 % przefiltrowana surowica ludzka, 10 % przefiltrowana surowica osła, 0,1 % Tween 20 i 0,3% Triton w PBS
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Słoiki Multicell800-095-EG
Coplin (EASYDIP SLIDE STAINING SYSTEM)Nowościzaopatrzenie5300KIT
Prowadnice osłonoweFisherbrand12-545E 22*50
Czerwień bezpośrednia 80Sigma Aldrich365548
Serum osłaSigma AldrichD9663
Etanol 100%
szybkowar elektrycznySalton
EosinLeica Biosystems3801600UWAGA, działanie drażniące na oczy
Fast Green FCFSigma AldrichF7252UWAGA, działa szkodliwie przez drogi oddechowe, spożycie i wchłanianie przez skórę
Sekcja FFPE (4μ m) szkiełka
Glicyna 0,1 M w PBS
Roztwór barwienia hematoksyliny, Gil 1. Preparat, regularna siłaRicca Chemical Company3535-32
Uchwyt (uchwyt na słoik do barwienia EasyDip)Newcomersupply5300RK
Ludzka surowicaGemini22210
Komora wilgotnościowaMillipore SigmaZ670138-1EA
Pióro do papkiabcamab2601
PBS
PBS-Tween 20 (0,1% v/v)
Nośnik montażowy PermountFisher ChemicalSP15-500
Kwas pikrynowy 1,3Sigma AldrichP6744UWAGA, działanie drażniące na skórę i oczy
Picro-Sirius Red/Fast Green roztwór: Fast Green 0,1% w/v + Sirius Red 0,2% w/v w 1,3% roztworze
Przeciwciało pierwotne Anti-ΑSMAMysz IgG2a 1A4Sigma A2547Rozcieńczenie 1/100
Pierwszorzędowe przeciwciało anty-CD34Mysz IgG1 HPCA1/763Novus Biologicals NBP2-44568Rozcieńczenie 1/250
Pierwszorzędowe przeciwciało anty-cytokeratyna 8/18Królik EP17/EP30Agilent IR09461-2Gotowy do użycia
Pierwszorzędowe przeciwciało anty-CD68Mysz KP1Abcam ab955Rozcieńczenie 1/200
Pierwszorzędowe przeciwciało anty-DesminKrólik PoliklonalnyInvitrogen PA5-16705Rozcieńczenie 1/200
Pierwszorzędowe przeciwciało anty-CD4Mysz N1UG0Affymetrix 14-2444Rozcieńczenie 1/250
Pierwszorzędowe przeciwciało anty-FoxP3Królik 1054CR & D MAB8214Rozcieńczenie 1/100
Pierwszorzędowe przeciwciało anty-MPOkozie poliklonalneR & D Systems AF3667Rozcieńczenie 1/250
Przeciwciało pierwszorzędowe Anty-CD3Królik SP7Abcam ab16669Rozcieńczenie 1/200
Przeciwciało pierwszorzędowe anty-CD8Mysz C8/144BInvitrogen 14-0085-80Rozcieńczenie 1/200
Przeciwciało drugorzędowe Osioł anty-mysie A488PoliklonalnyInvitrogen A-21202Rozcieńczenie 1/500
Przeciwciało drugorzędowe Osioł anty-królik A488PoliklonalnyInvitrogen A-21206Rozcieńczenie 1/500
Przeciwciało drugorzędowe Przeciwciało przeciw kozom A568PoliklonalnyInvitrogen A-11057Rozcieńczenie 1/500
Przeciwciało drugorzędowe Osioł anty-królik A647PoliklonalnyInvitrogen A-31573Rozcieńczenie 1/500
Przeciwciało drugorzędowe Szczur anty-mysie IgG1 A647RMG1-1Biolegend 406618Rozcieńczenie 1/500
Przeciwciało drugorzędowe Koza anty-mysie IgG2a CF568PoliklonalnySigma Aldrich SAB4600315Rozcieńczenie 1/500
Przeciwciało wtórne Osioł anty-mysz DyLight 755PoliklonalnyInvitrogen SA5-10171Rozcieńczenie 1/500
Przeciwciało drugorzędowe Osioł anty-królik DyLight 755PolyclonalInvitrogen SA5-10043Rozcieńczenie 1/500
SDSBioShopSDS001,500UWAGA, doustna toksyczność dla skóry i oczu
Wieloprogramowy automatyczny barwnik do szkiełek ShandonLabX11384903
Substytut ksylenu Shandon,Thermo Fisher ScientificCA89413-336UWAGA, Łatwopalny, drażniący skórę i oczy, Szkodliwy przy wdychaniu Kąpiel
wodna Wytrząsająca
Odczynnik przeciwblaknięcia SlowFade Gold z DAPIInvitrogenS36938
Cytrynian sodu DihydrateMillipore Sigma1545801UWAGA, podrażnienie oczu
Bufor odpędzający: zmieszaj 20 ml 10% w/v SDS z 12,5 ml 0,5 M Tris-HCl (pH 6,8) i 67,5 ml ultraczystej wody. Pod wyciągiem dodaj 800 uL etanolu 2-merkapto (stężenie końcowe 114,4 mM)
Triton X-100Sigma AldrichT8787-50ML
Tris-HClBioShop77-86-1
Tween 20Fisher ScientificBP337-500
VIS SoftwareVisiopharm
Skaner do wszystkich slajdów Olympus BX61VSOlympusMikroskop: Olympus Slide Scanner BX61VS, skaner 5 slajdów, zmotoryzowany stolik, autofokus. Kamera: Źródło światła: Xcite-120. Filtry: BrightLine® Zestaw filtrów Sedat (# LED-DA/FI/TR/Cy5-4X4M-B-000, Semrock)
XyleneSigma Aldrich214736-4LUWAGA, Łatwopalny, drażniący skórę i oczy, Szkodliwy przy wdychaniu
Ksylen: Roztwór etanolu (1:1 v/v)
2-merkaptoetanolSigmaM6250UWAGA, szkodliwy po spożyciu, wdychaniu, śmiertelny w przypadku zatarcia. Podrażnienie oczu. Używać dygestorium
% kwasu pikrynowego

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Greten, F. R., Grivennikov, S. I. Inflammation and Cancer:Triggers, Mechanisms, and Consequences. Immunity. 51 (1), 27-41 (2019).
  2. Pages, F., et al. International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study. Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).
  3. Binnewies, M., et al. Understanding the tumor immune microenvironment (TIME) for effective therapy. Nature Medicine. 24 (5), 541-550 (2018).
  4. Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 31 (2), 214-234 (2018).
  5. Bindea, G., et al. Spatiotemporal dynamics of intratumoral immune cells reveal the immune landscape in human cancer. Immunity. 39 (4), 782-795 (2013).
  6. Galon, J., et al. Towards the introduction of the 'Immunoscore' in the classification of malignant tumours. The Journal of Pathology. 232 (2), 199-209 (2014).
  7. Finotello, F., Eduati, F. Multi-Omics Profiling of the Tumor Microenvironment: Paving the Way to Precision Immuno-Oncology. Frontiers in Oncology. 8, 430(2018).
  8. Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
  9. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  10. Porta Siegel, T., et al. Mass Spectrometry Imaging and Integration with Other Imaging Modalities for Greater Molecular Understanding of Biological Tissues. Molecular Imaging and Biology : MIB: the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 20 (6), 888-901 (2018).
  11. Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
  12. Pirici, D., et al. Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).
  13. Gendusa, R., Scalia, C. R., Buscone, S., Cattoretti, G. Elution of High-affinity (>10-9 KD) Antibodies from Tissue Sections: Clues to the Molecular Mechanism and Use in Sequential Immunostaining. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (7), 519-531 (2014).
  14. van der Loos, C. M. Multiple immunoenzyme staining: methods and visualizations for the observation with spectral imaging. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 313-328 (2008).
  15. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  16. Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
  17. Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labeling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9, 13(2008).
  18. Segnani, C., et al. Histochemical Detection of Collagen Fibers by Sirius Red/Fast Green Is More Sensitive than van Gieson or Sirius Red Alone in Normal and Inflamed Rat Colon. PloS One. 10 (12), 0144630(2015).
  19. Bolognesi, M. M., et al. Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tumor MicroenvironmentImmune Cell MappingMultiplex ImmunofluorescenceTissue AlignmentImage AnalysisAntibody StainingHeatmap GenerationStroma Parenchyma SegmentationWhole Slide ScannerUser Defined Protocol

Related Articles