Artykuł metodologiczny

Przygotowanie granulek komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i osocza z pojedynczego pobrania krwi w ośrodkach badań klinicznych do analizy biomarkerów

20.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60776

⸱

20 marca 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Medicine, R&D Oncology, AstraZeneca, 2Acerta Pharma, AstraZeneca Group, 3Translational Medicine, R&D Oncology, AstraZeneca

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół szczegółowo opisuje klinicznie możliwe do wdrożenia przygotowanie wysokiej jakości PBMC i biopróbek osocza w ośrodku badań klinicznych, które mogą być wykorzystane do translacyjnej analizy biomarkerów.

Streszczenie

Analiza biomarkerów we krwi obwodowej staje się coraz ważniejsza w badaniach klinicznych, aby udowodnić mechanizm oceny efektów leczenia i pomóc w ustalaniu dawek i harmonogramu terapii. Z pojedynczego pobrania krwi komórki jednojądrzaste krwi obwodowej można wyizolować i przetworzyć w celu analizy i ilościowego określenia markerów białkowych, a próbki osocza można wykorzystać do analizy krążącego DNA guza, cytokin i metabolomiki osocza. Próbki podłużne z leczenia dostarczają informacji na temat ewolucji danego markera białkowego, statusu mutacji i krajobrazu immunologicznego pacjenta. Można to osiągnąć tylko wtedy, gdy przetwarzanie krwi obwodowej jest skutecznie przeprowadzane w miejscach klinicznych, a próbki są odpowiednio przechowywane od łóżka do stołu. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół ogólnego przeznaczenia, który można wdrożyć w ośrodkach klinicznych w celu uzyskania granulek PBMC i próbek osocza w wieloośrodkowych badaniach klinicznych, który umożliwi specjalistom klinicznym w laboratoriach szpitalnych skuteczne dostarczanie próbek wysokiej jakości, niezależnie od ich poziomu wiedzy technicznej. Przedstawiono również alternatywne warianty protokołów, które są zoptymalizowane pod kątem bardziej szczegółowych metod analitycznych. Stosujemy ten protokół do badania biomarkerów białkowych przeciwko odpowiedzi na uszkodzenie DNA (DDR) na krwi napromieniowanej promieniowaniem rentgenowskim, aby wykazać przydatność podejścia w warunkach onkologicznych, w których praktykowano leki DDR i / lub radioterapię, a także na etapach przedklinicznych, gdzie wymagane jest testowanie hipotez mechanistycznych.

Wprowadzenie

Rozwój leków ma na celu dostarczenie nowych terapii odpowiadających na niezaspokojone potrzeby medyczne i bardziej ukierunkowanej, spersonalizowanej medycyny. Wiele mechanizmów działania leków jest obecnie aktywnie badanych, w tym hamowanie enzymatyczne, takie jak kinase1, proteaza2 lub inhibitory polimerazy poli(ADP-rybozy) (PARP)3, degradery białek4, przeciwciała terapeutyczne5 oraz leki sprzężone z przeciwciałami (ADCs)6, wśród wielu innych. Przykładem wysiłków zmierzających do uzyskania lepszych metod leczenia w onkologii jest stosowanie inhibitorów kinaz w celu zatrzymania kaskad sygnałowych, które utrzymują proliferację komórek rakowych1,7. Pomiar poziomów fosforylacji substratów specyficznych dla tych kinaz jest najlepszym biomarkerem farmakodynamicznym do ilościowego określenia mechanizmu działania tych inhibitorów8. Inne leki mogą modulować ekspresję danego białka, a w takim przypadku kluczowe znaczenie ma możliwość ilościowego określenia zmian stężenia białka docelowego w ujęciu podłużnym w trakcie leczenia. W związku z tym, niezależnie od charakterystyki leku lub patologii, ocena biomarkerów w celu ustalenia związku farmakokinetyki (PK)/ farmakodynamiki (PD) między ekspozycją na lek a modulacją docelową jest najlepszą praktyką we wczesnym etapie rozwoju klinicznego i umożliwia określenie bezpiecznej i tolerowanej farmakologicznie aktywnej dawki/harmonogramu9.

Podczas gdy w onkologii analiza kliniczna, analiza biomarkerów w biopsjach może być najlepszym miejscem do ustalenia mechanizmu działania leku, liczba dostępnych biopsji w badaniu jest zazwyczaj dość ograniczona10,11. Alternatywnie, próbki krwi obwodowej są bardzo cenne dla badań klinicznych, ponieważ obejmują minimalnie inwazyjną procedurę, są szybkie i łatwe do uzyskania, co ułatwia analizę podłużną, są tańsze niż biopsje i dostarczają obszernych informacji do monitorowania wyników leczenia w czasie rzeczywistym. Dodatkową korzyścią płynącą z oceny biomarkerów PD we krwi obwodowej jest możliwość wykorzystania biopróbki do ilościowego określenia farmakokinekiki, co pozwala na dokładne określenie zależności ilościowych PK/PD i późniejsze modelowanie PK/PD12,13. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) z krwi pełnej można wyizolować w celu zbadania markerów białkowych, które doświadczają zmian w poziomie ekspresji lub w modyfikacjach potranslacyjnych. Ponadto PBMC mogą być wykorzystywane do celów immunofenotypowania14,15, testów funkcjonalności immunologicznej, takich jak ocena cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC)16 oraz analizy epigenetycznej poprzez izolację RNA. Podobnie, osocze z krwi pełnej może być wykorzystane do ilościowego oznaczania cytokin w celu scharakteryzowania odpowiedzi immunologicznej pacjenta, do przeprowadzenia badań metabolicznych, a także do wyizolowania i sekwencjonowania krążącego DNA guza (ctDNA) w celu monitorowania klonalnej ewolucji choroby wybieranej ze środka terapeutycznego, często zapewniając mechanistyczną podstawę oporności na leczenie17,18, 19 umożliwiający rozwój kolejnych generacji środków terapeutycznych20. Wreszcie, izolacja krążących komórek nowotworowych (CTC) z krwi obwodowej pozwala na ocenę postępu choroby poprzez liczenie podłużne, sekwencjonowanie DNA/RNA i analizę biomarkerów białkowych21. Chociaż ta izolacja jest zgodna z protokołem opisanym w22, niska obfitość CTC w wielu typach nowotworów i we wczesnych stadiach choroby sprawia, że stosowanie specjalistycznych probówek jest bardziej odpowiednie do minimalizacji degradacji CTC23.

W ostatnich latach użycie płynnych biopsji poprawiło informacje uzyskane w badaniach klinicznych, a zbiory PBMC zostały włączone do wielu badań w celu monitorowania zaangażowania celu i dowodu mechanizmu albo bezpośrednio w komórkach nowotworowych dla niektórych typów nowotworów hematologicznych, albo na samych PBMC jako substytuty PD komórek nowotworowych24, 25,26. Przygotowanie wysokiej jakości próbek pozytywnie wpływa na określenie najbezpieczniejszego i najskuteczniejszego leczenia danej patologii, ale z naszego doświadczenia wynika, że jakość preparatów PBMC uzyskanych z różnych ośrodków klinicznych została poddana dużej zmienności jakości, co spowodowało, że próbki nie nadają się do dalszej analizy. Wpłynęło to na ilość danych dotyczących choroby Parkinsona, które można było zebrać z tych badań.

Tutaj szczegółowo opisujemy łatwy do naśladowania protokół, który pokazuje, jak skutecznie izolować zarówno PBMCs, jak i próbki osocza z pojedynczego pobrania krwi w warunkach klinicznych. Protokół opiera się na instrukcjach dostarczonych przez producenta probówek do przygotowania komórek jednojądrzastych, które obejmują modyfikacje tam, gdzie rzeczywiste doświadczenia wykazały trudności w realizacji protokołu zgłaszane przez ośrodki kliniczne, takie jak problemy z wirowaniem, opóźnienia w przetwarzaniu i transfer próbek do kriowialiów. Istnieją alternatywne, komercyjnie dostępne metody stosowania probówek do przygotowania komórek jednojądrzastych opartych na separacji w gradinie gęstości przy użyciu roztworów polisacharydowych z lub bez bariery oddzielającej roztwór od krwi27. Jeśli dany ośrodek kliniczny ma już duże doświadczenie w stosowaniu tych alternatywnych metodologii, protokół ten można w akceptowalny sposób zastąpić tymi metodologiami. W takich przypadkach można wziąć pod uwagę dwa czynniki: niektóre alternatywne metody wymagają przeniesienia krwi pełnej z probówki do oddzielnej probówki do preparatu, w której dodatkowy transfer ludzkiego pierwotnego materiału biologicznego może stanowić nieznacznie zwiększone ryzyko bezpieczeństwa, a powodzenie metod bez barier oddzielających krew od roztworu polisacharydowego zależy od krytycznych etapów, takich jak nakładanie warstwy próbki krwi na podłoże o gradiencie gęstości, wymagające opracowania Wyrafinowany poziom wiedzy technicznej, który nie zawsze jest spotykany w warunkach szpitalnych laboratoriów. Niezależnie od powyższych punktów, ogólna żywotność i regeneracja komórek są porównywalne między tymi technikami15,28. Wybór metodologii jest więc w pewnym stopniu uzależniony od wcześniejszego doświadczenia technicznego, ale w naszych rękach probówki do preparacji komórek jednojądrzastych mogą być z powodzeniem stosowane w szerokim kontekście klinicznym i są naszym, skądinąd, zaleceniem.

Podczas gdy jednym z celów tego protokołu jest produkcja granulek PBMC do dalszego przetwarzania na lizaty, można by wdrożyć inne końcowe zastosowania kolekcji PBMC, takie jak izolacja kwasów nukleinowych lub produkcja rozmazów PBMC lub bloków PBMC odpowiednich dla metod immunohistochemicznych (IHC). Co ważne, ponieważ każda próbka biologiczna pobrana od pacjentów stanowi procedurę inwazyjną przynajmniej na pewnym poziomie, protokół ten maksymalizuje użyteczny materiał z każdej próbki, izolując również osocze, które można wykorzystać do analiz cytokin, badań metabolomicznych lub sekwencjonowania ctDNA.

Analiza biomarkerów obwodowych w badaniach onkologicznych jest jednym z wielu zastosowań lizatów PBMC. Jednym z przykładów jest ocena odpowiedzi na uszkodzenie DNA (DDR) w leczeniu takim jak chemioterapia, radioterapia lub stosowanie inhibitorów enzymów biorących udział w DDR, takich jak kinazy związane z kinazą fosfatydyloinozytolu-3 (PIKKs)7 i PARPs3,13. Celem tych zabiegów jest zwiększenie uszkodzeń DNA w komórkach proliferujących, co powoduje wysoką toksyczność w komórkach z upośledzonymi mechanizmami DDR i punktami kontrolnymi cyklu komórkowego, takich jak komórki rakowe. Poniżej przedstawiamy przykład z badaniem biomarkerów DDR we krwi obwodowej poddanej działaniu promieni rentgenowskich.

Protokół

Wymagana jest świadoma zgoda pacjenta oraz pełna zgodność z odpowiednimi krajowymi wymogami etycznymi w każdej jurysdykcji, np. z ustawą o tkankach ludzkich (Human Tissues Act – HTA, Wielka Brytania, 2004) oraz ustawą o przenoszalności i odpowiedzialności ubezpieczeń zdrowotnych (Health Insurance Portability and Accountability Act – HIPAA, Stany Zjednoczone, 1996). Przed rozpoczęciem jakichkolwiek prac na materiałach pochodzenia ludzkiego należy upewnić się, że uzyskano pełną, udokumentowaną zgodę komisji etycznej. Krew wykorzystana do optymalizacji niniejszego protokołu została dostarczona za odpowiednią zgodą panelu Volunteers Advancing Medicine Panel (VAMP) (referencja etyczna 16/EE/0459, badanie CRF494, podbadanie 001) prowadzonego przez NIHR Cambridge Clinical Research Facility w Cambridge w Wielkiej Brytanii, na podstawie umowy o dostawie ludzkich próbek biologicznych z National Institute for Health Research (NIHR) Cambridge Biomedical Research Centre. Biobank AstraZeneca w Wielkiej Brytanii posiada licencję Human Tissue Authority (numer licencji 12109) oraz zatwierdzenie National Research Ethics Service Committee (NREC) jako Bank Tkanki Badawczej (Research Tissue Bank – RTB) (numer REC 17/NW/0207).

1. Ogólne wytyczne dotyczące przygotowania

UWAGA: Wszystkie prace z niefiksowanym materiałem ludzkim, takim jak krew, osocze i PBMC w tym protokole, muszą być prowadzone z założeniem, że materiały te mogą przenosić potencjalnie zakaźne czynniki i dlatego muszą być wykonywane z zachowaniem odpowiednich środków ostrożności w zakresie bezpieczeństwa biologicznego. W przypadku pacjentów, u których wykazano brak znanych patogenów, nie należy zakładać, że próbki są niezakaźne, zatem nadal należy stosować odpowiednie środki ostrożności. Odpady powstające z tych materiałów powinny być traktowane z zachowaniem tych samych środków ostrożności biologicznych i utylizowane zgodnie z lokalnymi przepisami.

  1. Wybierz jeden z dwóch rodzajów probówek do przygotowywania komórek mononuklearnych, zawierających cytrynian sodu lub heparynę sodową jako przeciwkrzepliwe. W wielu zastosowaniach analitycznych oba te przeciwkrzepliwe mogą być stosowane zamiennie, jednak przed wyborem jednego z nich do badania należy przetestować oba środki.
  2. Oznakuj jedną probówkę do przygotowywania komórek mononuklearnych o pojemności 8 mL, przeznaczoną do pobrania krwi, kodem identyfikacyjnym pacjenta. Przechowuj probówki w temperaturze pokojowej (18-25 °C).
  3. Przechowuj 1x PBS w temperaturze pokojowej (18-25 °C). Zużywaj 30 mL na jedno przygotowanie.
  4. Upewnij się, że probówki na oddzielne próbki osocza oraz kriotubka na próbkę PBMC są precyzyjnie oznakowane unikalnymi identyfikatorami, zgodnie z instrukcjami zawartymi w odpowiedniej sekcji instrukcji laboratoryjnej.
  5. Jeśli PBMC mają zostać wykorzystane do monitorowania białek fosforylowanych, przygotuj PBS uzupełniony o inhibitory fosfataz: zmieszaj 5 mL PBS z 50 µL koktajlu inhibitorów fosfataz 2 + 50 µL koktajlu inhibitorów fosfataz 3. Przygotuj świeżą porcję i przechowuj w lodzie do momentu użycia.
  6. Jeśli PBMC mają zostać kriokonserwowane, przygotuj 1 mL mieszaniny do zamrażania na każdą próbkę, mieszając 90% FBS + 10% DMSO.

2. Pobieranie PBMC (Rycina 1A)

  1. Pobrać 8 mL krwi do probówki do izolacji komórek mononuklearnych, stosując standardową technikę opisaną przez producenta. Delikatnie odwrócić probówkę 8–10 razy, aby wymieszać krew z dodatkiem przeciwkrzepliwym. Nie wstrząsać, aby uniknąć hemolizy. Zapisać godzinę pobrania krwi.
  2. Po pobraniu przechowywać probówkę w pozycji pionowej w temperaturze pokojowej do momentu wirowania. Próbki należy przetworzyć jak najszybciej, idealnie w ciągu jednej godziny od pobrania krwi, ale nie później niż 4 h po pobraniu. Zapisać godzinę rozpoczęcia przetwarzania krwi.
  3. Bezpośrednio przed wirowaniem ponownie wymieszać próbkę krwi, delikatnie odwracając probówkę jeszcze 8–10 razy.
  4. Wirować probówkę/probówki z próbkami krwi w rotorze poziomym (z koszyczkami) przy 1 500 – 1 800 x g przez 30 min w temperaturze pokojowej (18-25 °C). Upewnić się, że wszystkie probówki są odpowiednio zrównoważone.

Schemat separacji plazmy i konfiguracja wirówki dla procesu izolacji i zamrażania PBMC.
Rysunek 1: Ogólny przegląd protokołu i reprezentatywne zdjęcia wirówki. (A) Schematyczny przegląd protokołu przygotowania PBMC i plazmy. *W przypadku ograniczeń czasowych krok 2.4 można skrócić do 20 min, a kroki 3.3 do 3.6 można pominąć. ** Pobrać alikwot do policzenia komórek, jeśli jest to wymagane. *** Wymagane są 2 dodatkowe etapy wirowania dla analizy ctDNA/metabolomiki (B) zdjęcie wirówki z rotorem z koszykami (swing-out) ustawionej do kroku 2.4. (C) Zdjęcie rotora, który obejmuje dwa koszyki zawierające adaptery do wirowania probówek do przygotowania komórek mononuklearnych. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

UWAGA: x g (oznaczane również jako RCF, względna siła odśrodkowa) oraz RPM (obroty na minutę) to różne jednostki. Należy upewnić się, że wirówka jest ustawiona na x g (RCF). Do przeliczeń należy użyć kalkulatora online (patrz Tabela materiałów). Jeśli dostępny jest tylko rotor z kątem stałym, należy wykonać ten krok przez 10 min przy 1,500 – 1,800 x g.

  1. Po wirowaniu należy sprawdzić obecność ciemnoczerwonej warstwy pod barierą (zawierającej głównie erytrocyty) oraz dwóch warstw powyżej bariery. Górna warstwa to osocze (słomkowej barwy), a znajdująca się pod nią białawą warstwa to tzw. buffy coat zawierający PBMC. Warstwy te są łatwo rozróżnialne podczas oglądania probówki na ciemnym lub czarnym tle.

Proces rozdzielania krwi; izolacja PBMC w probówkach; zestaw eksperymentalny w laboratorium.
Rycina 2: Probówki do izolacji PBMC. (A) Zdjęcie probówek przed wirowaniem (krok 2.4), pustych (po lewej) lub zawierających krew (po prawej). (B) Prawidłowe rozdzielenie warstwy PBMC po wirowaniu (krok 2.5). (C) Zdjęcie warstwy PBMC po wirowaniu z pozostawioną niewielką ilością osocza, aby zapewnić zebranie wszystkich PBMC (krok 2.7). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

UWAGA: Jeśli warstwy te nie są widoczne, prawdopodobnie wskazuje to na błąd w ustawieniach wirówek. Upewnij się, że zastosowano odpowiedni adapter do wirówki i ustawiono prawidłową wartość „x g”. Powtórz krok 2.4.

  1. Bezpośrednio po wirowaniu, za pomocą pipety serologicznej, przenieś około połowę plazmy (około 4-5 mL) do oznakowanej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mL z nakrętką, uważając, aby nie naruszyć warstwy PBMC. Przechowuj tę probówkę z plazmą tymczasowo w lodzie, aby wykorzystać ją później w kroku 4. Odstaw ją na ten moment.
  2. Zbierz całą warstwę PBMC za pomocą pipety Pasteura, umieszczając pipetę wewnątrz warstwy komórek, i przenieś ją do innej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mL z nakrętką. Dopuszczalne jest pobranie niewielkiej ilości plazmy, jeśli jest to konieczne, aby całkowicie zebrać całą warstwę PBMC. Objętość wynosi zazwyczaj 1-2 mL. Bezzwłocznie przejdź do kroku 3 poniżej.

3. Etapy płukania PBMC

UWAGA: Celem etapów płukania jest rozcieńczenie i usunięcie pozostałych płytek krwi oraz osocza z osadu PBMC. Wszystkie etapy wirowania należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej (18-25 °C).

  1. Do probówki z PBMC dodać PBS w temperaturze pokojowej, aby zwiększyć objętość do 15 mL. Zamknąć probówkę zakrętką. Pomieszać komórki, delikatnie odwracając probówkę 5 razy.
  2. Wiritować przez 15 min przy 300 x g. Należy pamiętać, że jest to znacznie łagodniejsze wirowanie niż wirowanie wstępne.
  3. Zlokalizować osad, obserwując probówkę na ciemnym/czarnym tle. Usunąć nadsącz za pomocą aspiratora próżniowego lub pipety (Rysunek 3A). Odrzucić nadsącz, pozostawiając objętość około 500 μL nad białawym osadem PBMC.

Proces wirowania z formowaniem osadu; obrazy przedstawiają probówki z widocznymi osadami.
Rycina 3: Osady PBMC. (A) Osad uzyskany w pierwszym etapie przemywania 3.3. (B) Osad wyizolowany w drugim przemywaniu (etap 3.7). (C) Osad z wysokim poziomem hemolizy, uzyskany z krwi przetworzonej później niż 4 h od pobrania, wyizolowany w drugim przemywaniu (etap 3.6). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

  1. Resuspenduj osad komórkowy, delikatnie pipetując go w górę i w dół w pozostałym supernatancie.
  2. Dodaj dodatkowy 1x PBS, aby zwiększyć objętość do 10 mL. Zamknij probówkę zakrętką. Wymieszaj komórki, delikatnie odwracając probówkę 5x. Jeśli protokół badania wymaga zliczenia komórek, przejdź do kroku 3.5.1; jeśli nie jest to wymagane, przejdź bezpośrednio do kroku 3.6.
    1. Pobierz 40 μL alikwot resuspendowanych komórek i wymieszaj z 40 μL błękitu trypanowego. Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
  3. Wirowarkuj zawiesinę z kroku 3.5 przez 10 min przy 300 x g. Usuń tak dużo supernatantu, jak to możliwe, nie naruszając osadu komórkowego.
  4. Ostrożnie usuń i odrzuć pozostały supernatant nad osadem komórkowym, pipetując go za pomocą cienkiej pipety Pasteura lub mikropipety, nie naruszając osadu komórkowego. Po zakończeniu tego kroku nad osadem nie powinno pozostać prawie żadnego płynu. Jeśli końcowym produktem tego protokołu jest osad PBMC, przejdź do kroku 3.8; jeśli końcowym produktem są kriokonserwowane PBMC, przejdź do kroku 3.10.
  5. Dodaj 50 µL nowego PBS (lub suplementowanego PBS przygotowanego w kroku 1.5, jeśli jest to właściwe dla Twojego celu) do osadu i delikatnie pipetuj w górę i w dół za pomocą mikropipety, aby homogenicznie resuspendować wszystkie komórki. Przenieś całą zawiesinę komórkową do oznakowanej krioprobówki 1,5 mL i natychmiast umieść na wilgotnym lodzie do czasu zamrożenia próbek.
  6. Zamroź oznakowane próbki, umieszczając je w ciekłym azocie lub bezpośrednio w suchym lodzie. Komórki można również mrozić w zamrażarce -80 °C, używając pojemników do mrożenia komórek. W takim przypadku całkowicie schłodź pojemniki w temperaturze -80 °C przed włożeniem probówek z komórkami. Zapisz godzinę zamrożenia osadów komórkowych. Po zamrożeniu komórek przechowuj je w temperaturze -80 °C i transportuj w stanie zamrożonym w suchym lodzie.
  7. Opcjonalnie, aby kriokonserwować PBMC, resuspenduj osad w 1 mL mieszaniny do mrożenia (krok 1.6) i przenieś do oznakowanej krioprobówki. Postępuj zgodnie z opisem w kroku 3.9, jednak w tym przypadku dopuszczalne jest wyłącznie użycie pojemników do mrożenia komórek w celu zamrożenia próbek. Po przebywaniu w pojemniku do mrożenia przez minimum 24 h przenieś próbki do ciekłego azotu w celu transportu i przechowywania.

4. Etapy przygotowania osocza (Rycina 1A)

  1. Po przechowywaniu pelletów PBMC w temperaturze -80 °C, przygotuj teraz alikwot osocza, który był tymczasowo przechowywany na mokrym lodzie w kroku 2.6. Wykonaj następujące etapy wirowania w celu oczyszczenia osocza, jeśli przeznaczeniem próbki jest analiza ctDNA; w przeciwnym razie przejdź bezpośrednio do kroku 4.2.
    1. Wirować osocze przez 10 min przy 1,600 - 2,000 x g w temperaturze 4 – 8 °C w rotorze z kątem stałym (lub przez 15 min w rotorze z kątem zmiennym).
    2. Ostrożnie odpipetować supernatant osocza, uważając, aby nie zaburzyć pelletu, i przenieść go do nowej probówki 15 mL. Probówkę zawierającą materiał osadu należy odrzucić.
    3. Wirować osocze przez 10 min przy 1,600 - 2,000 x g w temperaturze 4 – 8 °C w rotorze z kątem stałym (lub przez 15 min w rotorze z kątem zmiennym).
    4. Ostrożnie przenieść supernatant osocza do nowej probówki 15 mL, upewniając się, że materiał osadu nie został zaburzony. Probówkę zawierającą materiał osadu należy odrzucić.
      UWAGA: Jeśli chłodnica wirówki nie jest dostępna, przechowywać komórki na lodzie przez 5 min pomiędzy każdym wirowaniem lub wirować próbki w pomieszczeniu chłodniczym.
  2. Przenieść osocze w alikwotach po 1 mL do 5 świeżych mikroprobówek 2 mL. Użyć mniejszej liczby probówek, jeśli nie ma wystarczającej ilości osocza, aby wypełnić 5 probówek alikwotami po 1 mL i przewiduje się, że ostatnia probówka będzie zawierać mniej niż 1 mL osocza. Jeśli osocza jest więcej niż 5 mL, pozostałą część należy odrzucić. Zanotować całkowitą objętość osocza w każdej probówce.
  3. Bezzwłocznie zamrozić alikwoty osocza w pozycji pionowej, przechowując je w temperaturze -80 °C.

5. Wysyłka próbek

  1. Przesyłać zarówno osady PBMC, jak i próbki osocza na suchym lodzie.
  2. Upewnić się, że próbka nie została rozmrożona przed transportem ani w jego trakcie. Dołączyć do próbek wystarczającą ilość suchego lodu, aby zapewnić ich zamrożenie przez cały czas transportu, biorąc pod uwagę możliwe opóźnienia w przesyłce.

6. Naświetlanie krwi pełnej i analiza markerów DDR metodą western blot (Rysunek 4A)

UWAGA: Jest to zabieg ex vivo, który w większości przypadków klinicznych nie będzie wymagany, jednak eksperymenty te stanowią cenną strategię badawczą w celu znalezienia odpowiednich biomarkerów klinicznych. Próbki krwi powinny zostać poddane obróbce jak najszybciej po pobraniu, aby zapewnić najlepsze wyniki.

  1. Rozgrzać szafę do naświetlań rentgenowskich. Oznaczyć trzy probówki o pojemności 15 mL jako odpowiednio 0, 0.2 i 7 Gy.
  2. Pobrać trzy probówki do przygotowania komórek mononuklearnych zawierające świeżo pobraną krew od jednej osoby, a po delikatnym odwróceniu probówek 8 do 10 razy przenieść krew do trzech probówek 15 mL.
  3. Umieścić probówkę 0.2 Gy w szafie do naświetlań rentgenowskich, zamknąć drzwi i zastosować dawkę 0.2 Gy, wybierając numer półki i dawkę. Zastosować dawkę promieniowania 7 Gy do probówki 7 Gy, dostosowując wybraną w szafie dawkę.
  4. Inkubować trzy probówki w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę.
  5. Przenieść krew z powrotem do probówek do przygotowania komórek mononuklearnych i przeprowadzić protokół przygotowania PBMC zgodnie z procedurą kliniczną od kroku 2.4 do kroku 3.8.
  6. Do każdego osadu komórkowego dodać objętość buforu do lizy uzupełnionego o inhibitory proteaz i fosfataz równą objętości osadu komórkowego (w tym przypadku 70 μL buforu RIPA), wymieszać poprzez pipetowanie i inkubować na lodzie przez 10 min. Jeśli dostępny jest sonikator, poddać próbki sonikacji (3 cykle, 30 s włączony / 30 s wyłączony, 4 °C); alternatywnie przepuścić próbki przez strzykawkę, aby rozbić kwasy nukleinowe i wyeliminować lepkość próbki.
  7. Wirować próbki przez 10 min przy ≥ 15,000 x g w temperaturze 4 °C. Przenieść każdy nadsącz do nowej probówki 1.5 mL, jakościowo ocenić stopień hemolizy (inspekcja wizualna) i zmierzyć stężenie białka dowolną preferowaną metodą.
  8. Zmieszać 40 μg całkowitego lizatu z buforem do nakładania próbek zawierającym SDS i reduktorem próbek. Gotować próbki przez 5 min w bloku grzejnym.
  9. Nałożyć 20 μg każdej próbki na każdą z dwóch ścieżek w żelu białkowym bis-tris 4-12% i przeprowadzić elektroforezę SDS-PAGE.
  10. Po rozdzieleniu przenieść białka na membranę nitrocelulozową przy użyciu dostępnego komercyjnie systemu (20 V, 10 min) i zablokować 5% mlekiem w TBST.
  11. Wyciąć membranę na odpowiednich wielkościach cząsteczkowych i inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez noc w temperaturze 4 °C (zob. Tabela Materiałów w celu uzyskania informacji o przeciwciałach i rozcieńczeniach).
  12. Usunąć przeciwciała pierwszorzędowe i przemyć membrany 3 razy buforem TBST przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Inkubować z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z HRP przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
  13. Przemyć 3 razy buforem TBST przez 5 min.
  14. Zastosować odczynnik ECL i przeanalizować uzyskane obrazy w odniesieniu do sygnału HRP.

Wyniki

Aby poprawić jakość preparatów PBMC w naszych badaniach klinicznych, opracowaliśmy protokół zawierający zwięzłe i jasne kroki, które mogą być stosowane przez personel laboratoriów szpitalnych, niezależnie od ich doświadczenia w biologii molekularnej i umiejętności laboratoryjnych. Dostosowaliśmy protokół producenta, wprowadzając modyfikacje w tych etapach, w których zidentyfikowano lub zgłoszono problemy z wykonaniem w ośrodkach klinicznych uczestniczących w różnych wieloośrodkowych badaniach klinicznych. Protokół ten można jednak dalej optymalizować, aby spełnić konkretne wymagania, takie jak ograniczenia czasowe w ośrodku klinicznym lub rodzaj analizy końcowej (patrz: Plik uzupełniający). Wykazujemy, że DDR można analizować w PBMC, badając specyficzne biomarkery po uszkodzeniu DNA wywołanym promieniowaniem.

Najczęstsze zapytania otrzymywane od ośrodków klinicznych dotyczą etapów wirowania, które bezpośrednio wpływają na możliwość pomyślnej izolacji PBMC i otrzymania końcowego osadu PBMC. Kluczem do sukcesu protokołu jest zastosowanie odpowiedniego rodzaju wirówki z rotorem z koszyczkami odchylanymi (Rycina 1B,C). Jednakże, w przypadku gdy w ośrodku klinicznym dostępna jest wyłącznie wirówka z rotorem kątowym, sugerujemy przeprowadzenie kroku 2.4 w rotorie kątowym przy tej samej wartości RCF co w przypadku rotora z koszyczkami odchylanymi, ale tylko przez 10 minut. Zapewnia to oddzielenie warstwy PBMC od osocza (patrz Rycina 2B,C). Podczas gdy nakładanie krwi na medium do separacji gradientem gęstości wymaga wirowania z wyłączonym hamulcem, krew w probówkach do przygotowania komórek mononuklearnych może być wirowana z włączonym hamulcem ze względu na obecność bariery żelowej w probówce, która zapewnia zachowanie warstwy PBMC oddzielonej od gęstszych składników krwi27,28.

Z wirowania krwi w probówkach o pojemności 8 mL uzyskano co najmniej 4 mL wysokiej jakości, nierozcieńczonej plazmy, która mogła zostać następnie oczyszczona do zastosowania w specjalistycznych analizach, takich jak sekwencjonowanie ctDNA lub badania metabolomiczne29,30 (opcjonalne kroki 4.1.1-4.1.4). Innymi kwestiami zgłaszanymi przez ośrodki kliniczne oraz wynikającymi z doświadczeń w analizie próbek były ilość wyizolowanych PBMC, wielkość pelletu oraz hemoliza lub zanieczyszczenie erytrocytami. Liczba komórek uzyskanych z 8 mL krwi była zmienna w zależności od pacjenta i stadium choroby, jednak zazwyczaj otrzymany pellet jest mały i ma przezroczysty lub biały kolor (Rysunek 3A,B). Ze względu na te cechy istotne jest wizualizowanie pelletu na ciemnym tle, aby uniknąć jego przypadkowego odessania podczas etapów płukania (2.5 i 3.3). Czasami pellety mogą mieć czerwone zabarwienie z powodu zanieczyszczenia erytrocytami (Rysunek 3C), co negatywnie wpływa na jakość preparatu. Aby uniknąć utraty małych pelletów, takich jak te przedstawione na Rysunku 3, przenoszenie pelletu PBMC do krio probówki jest ułatwione dzięki krokowi 3.7, w którym pellet PBMC jest resuspendowany w 50 µL PBS.

Typowa wydajność przy zastosowaniu tych probówek i krwi od zdrowych osób mieści się w zakresie od 7 do 21 x 106 komórek dla 8 mL, a odzysk komórek wynosi od 70 do 80%, co wynika z naszego doświadczenia oraz zostało wcześniej wykazane27,28. Zależy to zarówno od indywidualnej liczby komórek, jak i od operatora, i jest porównywalne z liczbą komórek oraz wartościami odzysku uzyskanymi innymi metodami z wykorzystaniem gradientu gęstości (w tym systemami wykorzystującymi probówki z barierą separacyjną)15,27,28. Ilustracyjnym przykładem zmienności liczby PBMC wyizolowanych tą metodą w zależności od jednostki chorobowej jest analiza markerów PBMC u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (CLL). Liczba komórek odzyskanych z probówki do przygotowania komórek mononuklearnych o objętości 8 mL przy zastosowaniu tego protokołu wahała się od 1,62 x 104 do 1,99 x 109 w 45 próbkach pobranych od 7 pacjentów w badaniu NCT0332827331 (Tabela 1). Powiązanym parametrem jest stężenie białka w lizatach PBMC uzyskanych tą metodą, które zależy od liczby wyizolowanych komórek i wydajności ekstrakcji białka. Osady komórkowe poddane lizie w sekcji 6 zostały przygotowane z użyciem buforu RIPA i sonikacji (krok 6.6). Resuspensja osadów komórkowych w tej samej objętości buforu do lizy zazwyczaj skutkuje uzyskaniem stężeń w zakresie od 3 do 10 mg/mL, a w tym konkretnym przykładzie stężenia lizatów wynosiły odpowiednio 6,8, 8,3 i 8,6 mg/mL dla 0, 0,2 i 7 Gy. Wartości te podlegają jednak dużej zmienności w przypadku próbek otrzymanych z ośrodków klinicznych, które nie zostały przygotowane optymalnie, w zależności od choroby pacjenta oraz obecności hemoglobiny wynikającej z zanieczyszczenia erytrocytami. Na przykład bardzo małe osady muszą zostać zresuspensowane w objętości buforu do lizy większej niż objętość osadu komórkowego, aby umożliwić zarówno pomiar stężenia białka, jak i późniejszą analizę biomarkerów, co prowadzi do uzyskania bardziej rozcieńczonych próbek. W takim przypadku, jeśli stężenie próbki spadnie poniżej 1 mg/mL, może to stanowić utrudnienie w przeprowadzeniu takich testów jak western blot ze względu na wysoki czynnik rozcieńczenia. W przeciwieństwie do tego, w wspomnianych wcześniej próbkach CLL, objętość buforu do lizy dodana w celu resuspensji osadów komórkowych wahała się od 50 do 500 μL, a stężenie białka mieściło się w zakresie od 1,62 do 19,77 mg/mL (Tabela 1).

W przypadku próbek wykazujących zanieczyszczenie erytrocytami lub hemolizę (Rysunek 3C), stężenie białka w lizacie PBMC zostaje zawyżone ze względu na obecność hemoglobiny z erytrocytów. Z tego powodu należy przeprowadzić wizualną inspekcję i adnotację takich próbek, zgodnie z opisem w kroku 6.7 protokołu. Nałożenie nadmiaru próbki może zrekompensować obecność hemoglobiny podczas analizy biomarkerów, pod warunkiem że w badaniu zastosowano kontrolę załadunku. Można wdrożyć inne, bardziej ilościowe metody pomiaru hemolizy, takie jak pomiar absorbancji przy 414 nm32.

Odpowiedź na uszkodzenia DNA (DDR) analizowano w PBMC uzyskanych zgodnie z tym protokołem klinicznym. Aby zilustrować sytuację naśladującą kliniczne metody leczenia uszkadzające DNA, takie jak radioterapia lub chemioterapia, krew pełną od zdrowych ochotników poddano ex vivo promieniowaniu rentgenowskiemu (Rysunek 4A). Promieniowanie jonizujące (IR), takie jak promienie rentgenowskie, indukuje różne rodzaje uszkodzeń DNA, w tym pęknięcia obu nici DNA (DSBs). Wykrywanie tych uszkodzeń przez systemy sensorowe DNA aktywuje białka z rodziny PIKK, takie jak kinaza ATM (ataxia-telangiectasia mutated), kinaza ATR (ATM and Rad3-related) oraz kinaza DNA-PK (DNA-dependent protein kinase), które angażują mechanizmy naprawy DNA, takie jak rekombinacja homologiczna (HR) lub niehomologiczne łączenie końców (NHEJ). Aktywacja ATM w obecności DSBs następuje poprzez jego rekrutację do miejsc uszkodzeń przez kompleks MRN (MRE11-RAD50-NBS1), co powoduje autofosforylację ATM w kilku resztach, w tym w Ser1981. Z kolei aktywowana kinaza ATM fosforyluje składniki kompleksu MRN oraz inne białka, takie jak wariant histony H2AX w Ser139 (gdzie pSer139-H2AX jest znany również jako γH2AX), aby promować zmianę strukturalną chromatyny rozprzestrzeniającą się od miejsca DSB, co ułatwia rekrutację innych czynników DDR33. PBMC reagują na promieniowanie jonizujące pomimo niskiego tempa proliferacji, a metody spektrometrii mas pozwoliły na ilościowe określenie zwiększenia fosforylacji Ser635 w białku RAD50 przez ATM. Fosforylacja ta jest zmniejszona w obecności inhibitorów ATM, a RAD50 pS635 został dodatkowo zwalidowany jako biomarker farmakodynamiczny dla klinicznego leczenia inhibitorami ATM w nowotworach za pomocą immunohistochemii8. Aby ocenić odpowiedź PBMC na promieniowanie, krew od zdrowych ochotników poddano różnym dawkom IR, a próbki pobrano po 1 h inkubacji w 37 °C (Rysunek 4A). W tym celu krew przeniesiono do plastikowych probówek, aby uniknąć zmniejszenia wydajności izolacji PBMC ze względu na wysoką temperaturę (krok 6.2). Analizowano aktywację ATM nie tylko poprzez badanie wcześniej opisanego RAD50 pS635, ale także ATM pS1981 i γH2AX. W trzech badanych przypadkach zaobserwowano wzrost tych modyfikacji potranslacyjnych przy wyższych dawkach IR (Rysunek 4B). Co ciekawe, fosforylacja ATM i RAD50 była znacząca przy niskiej dawce 0,2 Gy, co sugeruje, że te modyfikacje potranslacyjne mogą być skutecznie badane jako biomarkery PD dla terapii wiążących się z generowaniem DSBs w DNA z dobrym zakresem dynamicznym, nie tylko w próbkach nowotworowych, ale i we krwi obwodowej. Pozwala to na monitorowanie odpowiedzi PD na leczenie poprzez pobieranie próbek podłużnych w trakcie trwania terapii. Czas od pobrania krwi do przetworzenia próbek jest krytyczny dla zapewnienia, że kaskady sygnalizacyjne są nadal aktywne, ponieważ opóźnienia w przetwarzaniu wpłyną na kinetykę takich kaskad, co może doprowadzić do przeoczenia zdarzeń fosforylacji wykorzystywanych jako fosfomarkery.

Schemat procesu napromieniowania krwi oraz wyniki Western blot przedstawiające ilościowe oznaczenie białek (ATM, RAD50).
Rycina 4: PBMC wyizolowane z krwi napromieniowanej ex vivo zgodnie z obecnym protokołem klinicznym wykazują biomarkery informujące o stopniu uszkodzeń DNA spowodowanych leczeniem. (A) Schematyczny przegląd protokołu przygotowania PBMC i analizy DDR po napromieniowaniu krwi pełnej. *Wymagane 2 dodatkowe etapy wirowania do analizy ctDNA/metabolomiki. (B) Western blot wykazujący zależną od dawki nadekspresję fosfo-biomarkerów DDR w PBMC. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

PróbkaLiczba PBMC/ 8 mL krwiObjętość uzupełnionego buforu RIPA (μL)Stężenie końcowe (mg/mL)
A.1391000007012.16
A.2974000001004.54
A.32330000001507.63
A.431600000015016.87
A.538700000015012.60
A.645900000015012.71
A.741400000020015.67
A.825300000015014.56
A.950900000030010.67
B.115200000702.96
B.210500000504.59
B.313200000503.99
B.43480000010010.41
B.51620000707.11
B.6702000001009.26
B.76540000010012.10
B.89110000015011.82
C.16330000704.04
C.2440000015019.77
C.3680000001008.96
C.435100000509.30
C.5354000007010.55
C.69920000010016.19
D.1402000000707.23
D.282600000030016.95
D.3199000000030014.87
D.4100000000030018.34
D.5116000000040016.13
D.680600000040019.40
E.130200000030013.86
E.299000000050019.04
E.3120000000040017.13
F.14010000501.62
F.25170000502.84
F.32810000503.69
F.43700000753.62
F.53460000704.03
F.67060000503.32
G.160700000706.57
G.2821000001507.78
G.330500000708.28
G.413400000010015.14
G.5919000001008.61
G.637200000015015.88
G.757400000020015.01
Podłużne próbki PBMC odpowiadające 7 pacjentom

Tabela 1: Liczba komórek i stężenie białka w pelletach PBMC od pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (CLL). Dane przedstawione w tej tabeli odpowiadają 45 próbkom PBMC od 7 pacjentów z CLL uczestniczących w badaniu NCT03328273, pobranym do probówek do przygotowania komórek mononuklearnych. Są to oryginalne dane wygenerowane z próbek pochodzących z cytowanego badania31.

Plik uzupełniający: Alternatywne opcje protokołu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Wysokiej jakości preparaty PBMC i osocza, które można przygotować w sposób solidny i powtarzalny w ośrodkach badań klinicznych, są nieocenione w informowaniu o peryferyjnych punktach końcowych predykcyjnych i farmakodynamicznych biomarkerów translacyjnych badań klinicznych. W tym miejscu przedstawiliśmy krótki, przejrzysty protokół, który odnosi się do typowo problematycznych kroków, które do tej pory były podatne na błędy wykonawcze w warunkach badania klinicznego. Protokół można jednak dodatkowo zoptymalizować, aby spełnić określone wymagania, takie jak ograniczenia czasowe w ośrodku klinicznym lub rodzaj dalszych analiz (patrz plik uzupełniający).

W tym celu pokazaliśmy, jak wyizolować zarówno PBMC, jak i osocze z krwi pełnej za pomocą probówek do przygotowania komórek jednojądrzastych do produkcji zamrożonych granulek PBMC i zamrożonego osocza nadających się do różnych dalszych analiz. Zwróciliśmy uwagę na szczególnie krytyczne kroki protokołu obejmujące wirowanie i identyfikację warstwy PBMC w kroku 2.5 oraz granulek PBMC w krokach 3.3 i 3.6. Historycznie rzecz biorąc, miejsca, w których ośrodki kliniczne często popełniały błędy, polegały na ustawianiu wirówki na właściwe jednostki (mylenie wartości RCF lub x g z wartością RPM), opóźnianie przetwarzania próbek krwi, temperatury i obecności dużych objętości PBS nad zamrożonym osadem komórkowym. W większości wirników wirówek błędne wprowadzenie wartości x g jako ustawienia prędkości obrotowej spowoduje znaczne niedowirowanie, co w rezultacie spowoduje słabo zdefiniowaną warstwę PBMC lub jej brak, a także potencjalne niezamierzone odrzucenie PBMC podczas etapów mycia z powodu nieefektywnego granulowania komórek. Istnieje jednak możliwość, że warstwa PBMC nie jest widoczna pomimo zastosowania odpowiednich ustawień wirowania i adaptera rotora, jeśli u pacjenta rozwinęła się leukopenia. Stan ten może wystąpić u pacjentów włączonych do badań onkologicznych z powodu chemioterapii lub radioterapii i powinien być brany pod uwagę. Innym krytycznym punktem, który został jasno określony w protokole, jest to, że próbki muszą być przetwarzane w ciągu 1-2 godzin od pobrania krwi, aby zmniejszyć możliwość negatywnego wpływu hemolizy na protokół. Co więcej, dążenie do przetworzenia próbek w ciągu pierwszej godziny pobierania krwi zmniejsza zmienność ex vivo, co może mieć ogromny wpływ na odczyty farmakokinetyki i na biomarkery, na które wpływa zachowanie krwi lub aktywne szlaki sygnałowe, takie jak przypadek pokazany na rycinie 4. Opóźnienia w przetwarzaniu próbek mogą mieć również szkodliwy wpływ na żywotność komórek, jeśli komórki mają być kriokonserwowane34. Innym czynnikiem, który może wpływać zarówno na plon, jak i zanieczyszczenie krwinek czerwonych, jest temperatura przechowywania i wirowania, która powinna być utrzymywana w temperaturze pokojowej (18-25 °C). Niższe temperatury zwiększają gęstość ośrodka gradientu gęstości, co powoduje wyższy stopień zanieczyszczenia krwinek czerwonych i granulocytów, ponieważ komórki te nie agregują się tak dobrze. Z drugiej strony, wyższe temperatury prowadzą do uwięzienia PBMC między zagregowanymi erytrocytami, zmniejszając w ten sposób wydajność preparatu 15,27,28. I wreszcie, ważne jest, aby w osadzie komórkowym w kriowiale nie było więcej niż 50-100 μl płynu, ponieważ wpływa to negatywnie na stężenie wszelkich lizatów białkowych uzyskanych w dalszym przetwarzaniu tych preparatów PBMC. Nadmiar cieczy spowoduje nadmierne rozcieńczenie próbek, co doprowadzi do powstania lizatów o bardzo niskim stężeniu białka, które nie nadają się do analizy biomarkerów. Ponadto zachowanie wszelkich modyfikacji potranslacyjnych zostanie osłabione, a wydajność lizy również zostanie znacznie zmniejszona.

Wybrano probówki do przygotowywania komórek jednojądrzastych, ponieważ oferują one najprostszy sposób izolowania zarówno PBMC, jak i osocza w jednym pobraniu krwi do badań klinicznych, z doskonałym doświadczeniem, z doskonałą odtwarzalnością. Przetwarzanie krwi nie wymaga wysoko wykwalifikowanych operatorów, a użycie pojedynczej probówki eliminuje potrzebę rozcieńczania krwi i przenoszenia jej do innej probówki, zmniejszając ryzyko zagrożenia; skraca protokół ze względu na wykonywanie etapów wirowania przy włączonych hamulcach; a wszystkie odczynniki znajdują się w probówce, co zmniejsza zmienność. Z naszego doświadczenia wynika, że korzyści te przewyższają wyższy koszt tych probówek w porównaniu z innymi klasycznymi metodami, polegającymi jedynie na użyciu pożywki do separacji w gradiacji gęstości27,28 (410 GBP za 60 jednostek, podczas gdy pożywka limfatyczna dla 66 preparatów o pojemności 50 ml wynosi 215 GBP). Są one dostępne w dwóch rodzajach antykoagulantów, heparynie i cytrynianu, z których oba są porównywalne pod względem utrzymania funkcjonalności izolowanych PBMC35, dlatego wybór jednego antykoagulantu zamiast drugiego będzie oparty na możliwym wpływie heparyny lub cytrynianu w dalszych badaniach biomarkerów. Chociaż wykazano, że probówki EDTA zapewniają najwyższą wydajność izolacji PBMC w porównaniu z heparyną lub cytrynianem13, korzyści płynące z łatwości użycia manipulacji tylko jedną probówką równoważą to rozważanie. Jeśli cytokiny mają być analizowane, antykoagulanty mogą mieć wpływ na poziomy wykryte w osoczu, dlatego oba antykoagulanty powinny zostać przetestowane przed wyborem jednego do badania klinicznego36. Jeśli osocze ma być wykorzystane do badań metabolomicznych, preferowane byłoby użycie heparyny jako antykoagulantu37. W związku z tym jedyną kwestią, która pozostaje użytkownikowi końcowemu lub naukowcowi zajmującemu się translacją badania klinicznego, jest to, czy cytrynian czy heparyna będą bardziej odpowiednie do ich celów po ocenie kosztów.

Chociaż korzyści płynące ze stosowania probówek do przygotowywania komórek są liczne w porównaniu z ograniczeniami, jakie stwarzają (wyższy koszt i dostępność ograniczonego zakresu antykoagulantów), główne ograniczenie stosowania PBMC lub osocza do uzyskiwania biomarkerów PD w badaniach klinicznych, zwłaszcza w onkologii, może być niezwiązane z metodą izolacji. Z wyjątkiem nowotworów hematologicznych, w których guz jest pobierany bezpośrednio z krwi obwodowej, w innych wskazaniach nowotworowych osocze i PBMC są tkankami zastępczymi, które niekoniecznie naśladują guz pierwotny. Tkanka obwodowa może nie dzielić genomu i epigenomu z guzem pierwotnym, dlatego obwodowa analiza biomarkerów zależnych od określonej mutacji nowotworu ogranicza się głównie do analizy ctDNA (z osocza) lub CTC (poprzez późniejsze sortowanie warstwy PBMC). Ponadto kaskady sygnalizacyjne napędzające lub przyczyniające się do proliferacji guza mogą nie być tak aktywne we krwi obwodowej. Wyzwanie to można przezwyciężyć poprzez zastosowanie metod odkrywania biomarkerów ukierunkowanych na krew8 w celu zidentyfikowania alternatywnych biomarkerów lub sprzężenie leczenia ex vivo z izolacją osocza38 i preparatów PBMC26.

W obecnym protokole zamrożone granulki PBMC mogą być łatwo przetworzone poza miejscem klinicznym w celu uzyskania lizatów białkowych, które można ocenić za pomocą technik western blotting lub ELISA. Przedstawiono również alternatywne metody wykorzystania PBMC do włączenia metod IHC (Plik Uzupełniający). Ponadto szczegółowo opisaliśmy również możliwość kriokonserwacji PBMC (patrz plik uzupełniający) do monitorowania komórek odpornościowych, co jest istotnym zastosowaniem w onkologii, z inhibitorami immunologicznych punktów kontrolnych i ADC coraz częściej testowanymi w badaniach klinicznych. Ocena funkcji immunologicznych, takich jak ADCC16 i immunofenotypowanie, są zastosowaniami kompatybilnymi z kriokonserwowanymi PBMC wyizolowanymi z probówek do przygotowania komórek jednojądrzastych15. Istnieje zastrzeżenie dotyczące krioprezerwacji, ponieważ może ona sprzyjać regulacji w dół niektórych markerów powierzchniowych i wewnętrznych oraz może upośledzać niektóre funkcje komórek, jednak kriokonserwacja PBMC jest jedynym możliwym sposobem wykonywania tych testów ze względu na ograniczenia czasowe podczas przenoszenia próbek z wielu miejsc klinicznych do przetwarzania w laboratoriach zewnętrznych14,15, a te szkodliwe skutki można znacznie przezwyciężyć dzięki dobrym metodom rozmrażania i okresom spoczynku39.

Podsumowując, przedstawiony tutaj protokół pozwoli na niezawodne przygotowanie PBMC i próbek osocza w każdej instytucji klinicznej dysponującej powszechnym sprzętem i materiałami, tak aby translacyjne punkty końcowe z krwi obwodowej mogły być solidnie włączone w globalnych badaniach klinicznych.

Na koniec pokazujemy, w jaki sposób analiza lizatów PBMC może mechanicznie informować o odpowiedzi na czynniki uszkadzające DNA, pokazując zależną od dawki modyfikację potranslacyjną kluczowych czynników DDR, które można wykorzystać do kształtowania rozwoju klinicznego. Perspektywiczne, wdrożenie metod, które są bardziej ilościowe niż western blotting (np. spektrometria mas40) i wymagają mniejszej ilości materiału wejściowego (takich jak kapilarne western blotting i ELISA) pomogłoby przesunąć te wyniki przedkliniczne w kierunku bardziej solidnej, systematycznej oceny próbek pacjentów PBMC.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy są lub byli pracownikami i udziałowcami firmy AstraZeneca. VM jest pracownikiem Acerta Pharma, posiada akcje AstraZeneca i Gilead Sciences.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować wszystkim członkom Medycyny Translacyjnej w AstraZeneca Oncology Research and Early Development za ich opinie na temat protokołu, szczególnie Hedley Carr, Tammie Yeh i Nathanowi Standiferowi za porady dotyczące przygotowania osocza do analizy ctDNA, izolacji PBMC oraz kriokonserwacji i immunofenotypowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml kriowialnegoNalgene, ThermoFisher5000-1020Do przechowywania granulek PBMC i ponownie zawieszonych PBMC
1,5 ml probówek do mikrowirówekVWR525-0990To jest przykład, skorzystaj z preferowanego dostawcy
15 ml stożkowa sterylna probówka wirówkowa propylenowaNunc, ThermoFisher339651Inne marki mogą być używane
2 ml probówka z zakrętką, sterylna, z dołączoną nakrętkąThermoFisher3463Do rozdzielania plazmy
20X TBS BuforThermoFisher Scientific28358Final to 25 mM Tris, 0,15 M NaCl; pH 7,5. To jest przykład, możesz przygotować własny zapas lub skorzystać z innego dostawcy
20X TBS Tween 20 BuforThermoFisher Scientific28360Lub uzupełnij TBS o 0,05%, aby przygotować bufor TBST
Automatyczny licznik komórek lub hemocytometrThermoScientificAMQAX1000Używamy urządzenia Countess i szkiełek, ale mogą to być inne metody.
Regulowana mikropipeta pozwalająca na 50 &mikro; PomiaryAby poradzić sobie z małymi objętościami (np. western blot, przenieś granulki PBMC do probówek o pojemności 1,5 ml)
BD Vacutainer CPT probówka do przygotowania komórek jednojądrzastych (cytrynian na-cytrynianu lub na-heparyna) 8 mlBD362761, 362753Istnieją probówki 4 ml, ale jeśli to możliwe, zaleca się probówki 8 ml, aby uzyskać więcej PBMC z jednego pobrania krwi
Pudełko do zamrażania komórekThermoFisher Scientific5100-0001To jest przykład, skorzystaj z preferowanego dostawcy.
Konwerter agregatów wirówkowychLabToolshttp://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/
DMSOSigma-Aldrich, MERKD2438Użyj preferowanego dostawcy. Używany do kriokonserwacji PBMC
Podłoże peroksydazy chrzanowej ECLThermoFisher34075Użyj preferowanego odczynnika zgodnie z czułością wymaganą do wykrycia biomarkera za pomocą western blot. Można stosować inne systemy, takie jak przeciwciała drugorzędowe IRDye z systemami obrazowania.
Szafa rentgenowska Faxitron MultiFocusFaxitron BiopticsDo naświetlania krwi. Dostępne są inne modele/producenci
Płodowa surowica bydlęca (FBS), inaktywowany termicznieThermoScientific102706Użyj preferowanego dostawcy. Ued do kriokonserwacji PBMC
Drobna końcówka, sterylna 1,5 ml Pipety PasteuraVWR414004-018Opcjonalnie
WirówkaOpcjonalnie do przygotowania osocza do ctDNA/metabolomiki
System obrazowania żelowego docSYNGENEDo obrazowania Membrany opracowane przez HRP
BlokgrzewczyAby denaturować lizaty przed uruchomieniem ich w western blot, każdy producent wyposażony w odpowiednie adaptery rurek
Wirówka z poziomym wirnikiem (głowica odchylana)ThermoscientificHeraeus Megafuge 40RTo jest przykład
Ciekły azot/suchy lódDo błyskawicznego zamrażania próbek
Cudowne mleko odtłuszczone w proszkuPremier FoodsTo jest przykład, skorzystaj z preferowanego dostawcy
Końcówki do mikropipet o rozmiarach 1-200 i mikro; LAby poradzić sobie z małymi objętościami (np. Western blot, przenieś granulki PBMC do probówek 1,5 ml)
NuPAGE 4-12% żel białkowy Bis-Tris, 1 mm, 10 dołkówThermoFisher ScientificNP0321BOXTo jest przykład, oddaj własny lub użyj preferowanego dostawcy
Bufor próbki NuPAGE LDS (4X)ThermoFisher ScientificNP0007Do obrazowania membran opracowanych przez HRP
Środek redukujący próbki NuPAGE (10X)ThermoFisher ScientificNP0009To jest przykład.
PBS, bez wapnia, bez magnezuGibco, ThermoFisher14190-144Jest to zwykle dostarczane w zestawie klinicznym.
Koktajl inhibitorów fosfatazy 2Sigma-Aldrich, MERKP5726-1MLOpcjonalnie dla kroku 3.7
Koktajl inhibitorów fosfatazy 3Sigma-Aldrich, MERKP0044-1MLOpcjonalnie dla kroku 3.7
Technologia sygnalizacji komórkowejkrólika anty GAPDHCST 21281:1000 rozcieńczenie w 5% mleku TBST
Królik anty γ H2AXCell Signaling TechnologyCST 2577, lot 111:2000 rozcieńczenie w 5 % mleku TBST
Królik anty pS1981 ATMAbcamab812921:2000 rozcieńczenie w 5 % mleku TBST
Królik anty pS635 RAD50Technologia sygnalizacji komórkowejCST 142231:1000 rozcieńczenie w 5 % mleka TBST
Królik anty total ATMAbcamab324201:1000 rozcieńczenie w 5 % mleku TBST
Królik anty całkowita technologiasygnalizacji komórkowejCST 3427, partia 21:1000 rozcieńczenie w 5 % mleku TBST
bufor RIPASigma-Aldrich, MERKR0278-50MLDo lizy komórek. To jest przykład, skorzystaj z preferowanego dostawcy
SonicatorDiagenodeB01060010Używany przez 3 cykle przy 30 s włączeniu / 30 s wyłączeniu, 4 oC. Jeśli używasz innego instrumentu, dostosuj liczbę cykli i intensywność do swojego sonikatora.
Sterylne pipety Pasteura 1,7 mlVWR414004-030To jest przykład, użyj preferowanego dostawcy
Sterylne pipety serologiczne (objętość 5 i 10 ml)Costar4101, 4051To jest przykład, użyj preferowanego dostawcy
Błękit trypanowyThermoScientificT10282Dotyczy to automatycznego licznika komórek wymienionego powyżej.
Mokry lódAby utrzymać próbki osocza i lizaty w niskiej temperaturze
L : z wirnikiem o stałym kącie RAD50

Bibliografia

  1. Hoelder, S., Clarke, P. A., Workman, P. Discovery of small molecule cancer drugs: successes, challenges. and opportunities. Molecular Oncology. 6, 155-176 (2012).
  2. Harrigan, J. A., Jacq, X., Martin, N. M., Jackson, S. P. Deubiquitylating enzymes and drug discovery: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 17, 57-77 (2018).
  3. Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. Targeting DNA repair in cancer: beyond PARP inhibitors. Cancer Discovery. 1, 20-37 (2017).
  4. Pettersson, M., Crews, C. M. PROteolysis TArgeting Chimeras (PROTACs)-Past, present and future. Drug Discovery Today: Technologies. 31, 15-27 (2019).
  5. Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J. Antibody therapy of cancer. Nature Reviews Cancer. 12, 278-287 (2012).
  6. Thomas, A., Teicher, B. A., Hassan, R. Antibody-drug conjugates for cancer therapy. The Lancet Oncology. 17 (6), 254(2016).
  7. Ferguson, F. M., Gray, N. S. Kinase inhibitors: the road ahead. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (5), 353-377 (2018).
  8. Jones, G. N., et al. pRAD50: a novel and clinically applicable pharmacodynamic biomarker of both ATM and ATR inhibition identified using mass spectrometry and immunohistochemistry. British Journal of Cancer. 119 (10), 1233-1243 (2018).
  9. Cook, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: a five-dimensional framework. Nature Reviews Drug Discovery. 13, 419-431 (2014).
  10. Overman, M. J., et al. Use of research biopsies in clinical trials: are risks and benefits adequately discussed. Journal of Clinical Oncology. 31 (1), 17-22 (2012).
  11. Olson, E. M., Lin, N. U., Krop, I. E., Winer, E. P. The ethical use of mandatory research biopsies. Nature reviews Clinical Oncology. 8, 620-625 (2011).
  12. O'Donnell, A., et al. Phase I pharmacokinetic and pharmacodynamic study of the oral mammalian target of rapamycin inhibitor Everolimus in patients with advanced solid tumors. Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1588-1595 (2008).
  13. Fong, P. C., et al. Inhibition of Poly(ADP-Ribose) polymerase in tumors from BRCA mutation carriers. The New England Journal of Medicine. 361 (2), 123-134 (2009).
  14. Verschoor, C. P., Kohli, V., Balion, C. A comprehensive assessment of immunophenotyping performed in cryopreserved peripheral whole blood. Cytometry B Clinical Cytometry. 94 (5), 662-670 (2018).
  15. Ruitenberg, J. J., et al. VACUTAINER®CPT™ and Ficoll density gradient separation perform equivalently in maintaining the quality and function of PBMC from HIV seropositive blood samples. BMC Immunology. 7 (11), (2006).
  16. Yamashita, M., et al. A novel method for evaluating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by flowcytometry using cryopreserved human peripheral blood mononuclear cells. Scientific Reports. 6 (19772), 1-10 (2016).
  17. Schiavon, G., et al. Analysis of ESR1 mutation in circulating tumor DNA demonstrates evolution during therapy for metastatic breast cancer. Science Translational Medicine. 7 (313), 182(2015).
  18. Lee, J., et al. Tumor genomic profiling guides metastatic gastric cancer patients to targeted treatment: the VIKTORY umbrella trial. Cancer Discovery. , (2019).
  19. Abbosh, C., et al. Phylogenetic ctDNA analysis depicts early-stage lung cancer evolution. Nature. 545, 545(2017).
  20. Thress, K. S., et al. Acquired EGFR C797S mutation mediates resistance to AZD9291 in non-small cell lung cancer harboring EGFR T790M. Nature Medicine. 21 (6), 560-562 (2015).
  21. Rossi, G., Ignatiadis, M. Promises and pitfalls of using liquid biopsy for precision medicine. Cancer Research. 79 (11), 2798-2804 (2019).
  22. Balasubramanian, P., et al. Isolation and characterisation of circulating tumor cells (CTCs) from peripheral blood specimens of patients with advanced solid tumor malignancies (using ApoStream® instrumentation) [abstract 3062]. Proceedings of the Annual meeting of the American Association for Cancer Research. , San Diego, CA. (2014).
  23. Qin, J., Alt, J. R., Hunsley, B. A., Williams, T. L., Fernando, M. R. Stabilization of circulating tumor cells in blood using a collection device with a preservative reagent. Cancer Cell International. 14 (13), 1-6 (2014).
  24. Biomarkers definitions working group. Biomarkers and surrogate endpoints: preferred definitions and conceptual framework. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 69 (3), 89-95 (2001).
  25. Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 472-484 (2013).
  26. Bundred, N., et al. Evaluation of the pharmacodynamics of the PARP inhibitor olaparib: a phase I multicentre trial in patients scheduled for elective breast cancer surgery. Investigational New Drugs. 31, 949-958 (2013).
  27. Rosado, M., et al. Advances in biomarker detection: Alternative approaches for blood-based biomarker detection. Advances in Clinical Chemistry. 92, 141-199 (2019).
  28. Grievink, H. W., et al. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: cell recovery and viability, population composition and cell functionality. Biopreservation and Biobanking. 14 (5), 410-415 (2016).
  29. Khadka, M., et al. The effect of anticoagulants, temperature, and time on the human plasma metabolome and lipidome from healthy donors as determined by liquid chromatography-mass spectrometry. Biomolecules. 9 (5), 1-15 (2019).
  30. Hellmann, M. D., et al. Circulating tumor DNA analysis to assess risk of progression after long-term response to PD-(L)1 blockade in NSCLC. Clinical Cancer Research. 26 (12), 2849-2858 (2020).
  31. ClinicalTrials.gov [Internet}. Identifier NCT03328273, A study of AZD6738 and Acalabrutinib in subjects with relapsed or refractory chronic lymphocytic leukemia (CLL). National Library of Medicine (US). , Bethesda (MD). Available from: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03328273 (2017).
  32. Kirschner, M. B., et al. The impact of hemolysis on cell-free microRNA biomarkers. Frontiers in Genetics. 4 (94), 1-13 (2013).
  33. Blackford, A. N., Jackson, S. P. ATM, ATR, and DNA-PK: The Trinity at the Heart of the DNA Damage Response. Molecular Cell. 66, 801-817 (2017).
  34. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral Blood Mononuclear Cells: Isolation, Freezing, Thawing, and Culture. Methods in Molecular Biology. 1304, 53-61 (2016).
  35. Basavaraj, M. G., Østerud, B., Hansen, J. B. Influence of different anticoagulants on monocyte procoagulant functions and monocyte-platelet aggregates formation. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1673-1676 (2011).
  36. Biancotto, A., Feng, X., Langweiler, M., Young, N. S., McCoy, J. P. Effect of anticoagulants on multiplexed measurements of cytokine/chemokines in healthy subjects. Cytokine. 60, 438-446 (2012).
  37. Wawrzyniak, R., et al. New plasma preparation approach to enrich metabolome coverage in untargeted metabolomics: plasma protein bound hydrophobic metabolite release with proteinase K. Scientific Reports. 8, 1-10 (2018).
  38. Duffy, D., et al. Standardized whole blood stimulation improves immunomonitoring of induced immune responses in multi-center study. Clinical Immunology. 183, 325-335 (2017).
  39. Wang, L., et al. Standardization of cryopreserved peripheral blood mononuclear cells through a resting process for clinical immunomonitoring- development of an algorithm. Cytometry A Clinical Cytometry. 89, 246-258 (2016).
  40. Whiteaker, J. R., et al. Targeted mass spectrometry enables robust quantification of FANCD2 mono-ubiquitination in response to DNA damage. DNA Repair. 65, 47-53 (2018).
  41. Lam, N. Y., Rainer, T. H., Chiu, R. W., Lo, Y. M. EDTA is a better anticoagulant than heparin or citrate for delayed blood processing for plasma DNA analysis. Clinical Chemistry. 50, 256-257 (2004).
  42. Parpart-Li, S., et al. The effect of preservative and temperature on the analysis of circulating tumor DNA. Clinical Cancer Research. 23 (10), 2471-2477 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mononuklearne komórki krwi obwodowejizolacja osoczaprzetwarzanie próbek krwiprotokół badania klinicznegoprzygotowanie osadu PBMCszybkie wirowanieizolacja warstwy leukocytowej (buffy coat)przechowywanie osoczaanaliza Western blotodpowiedź na uszkodzenia DNA
Przygotowanie granulek komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i osocza z pojedynczego pobrania krwi w ośrodkach badań klinicznych do analizy biomarkerów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.