Przygotowanie granulek komórek jednojądrzastych krwi obwodowej i osocza z pojedynczego pobrania krwi w ośrodkach badań klinicznych do analizy biomarkerów

Podsumowanie

Ten protokół szczegółowo opisuje klinicznie możliwe do wdrożenia przygotowanie wysokiej jakości PBMC i biopróbek osocza w ośrodku badań klinicznych, które mogą być wykorzystane do translacyjnej analizy biomarkerów.

Streszczenie

Analiza biomarkerów we krwi obwodowej staje się coraz ważniejsza w badaniach klinicznych, aby udowodnić mechanizm oceny efektów leczenia i pomóc w ustalaniu dawek i harmonogramu terapii. Z pojedynczego pobrania krwi komórki jednojądrzaste krwi obwodowej można wyizolować i przetworzyć w celu analizy i ilościowego określenia markerów białkowych, a próbki osocza można wykorzystać do analizy krążącego DNA guza, cytokin i metabolomiki osocza. Próbki podłużne z leczenia dostarczają informacji na temat ewolucji danego markera białkowego, statusu mutacji i krajobrazu immunologicznego pacjenta. Można to osiągnąć tylko wtedy, gdy przetwarzanie krwi obwodowej jest skutecznie przeprowadzane w miejscach klinicznych, a próbki są odpowiednio przechowywane od łóżka do stołu. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół ogólnego przeznaczenia, który można wdrożyć w ośrodkach klinicznych w celu uzyskania granulek PBMC i próbek osocza w wieloośrodkowych badaniach klinicznych, który umożliwi specjalistom klinicznym w laboratoriach szpitalnych skuteczne dostarczanie próbek wysokiej jakości, niezależnie od ich poziomu wiedzy technicznej. Przedstawiono również alternatywne warianty protokołów, które są zoptymalizowane pod kątem bardziej szczegółowych metod analitycznych. Stosujemy ten protokół do badania biomarkerów białkowych przeciwko odpowiedzi na uszkodzenie DNA (DDR) na krwi napromieniowanej promieniowaniem rentgenowskim, aby wykazać przydatność podejścia w warunkach onkologicznych, w których praktykowano leki DDR i / lub radioterapię, a także na etapach przedklinicznych, gdzie wymagane jest testowanie hipotez mechanistycznych.

Wprowadzenie

Rozwój leków ma na celu dostarczenie nowych terapii odpowiadających na niezaspokojone potrzeby medyczne i bardziej ukierunkowanej, spersonalizowanej medycyny. Wiele mechanizmów działania leków jest obecnie aktywnie badanych, w tym hamowanie enzymatyczne, takie jak kinase¹, proteaza² lub inhibitory polimerazy poli(ADP-rybozy) (PARP)³, degradery białek⁴, przeciwciała terapeutyczne⁵ oraz leki sprzężone z przeciwciałami (ADCs)⁶, wśród wielu innych. Przykładem wysiłków zmierzających do uzyskania lepszych metod leczenia w onkologii jest stosowanie inhibitorów kinaz w celu zatrzymania kaskad sygnałowych, które utrzymują proliferację komórek rakowych^1,7. Pomiar poziomów fosforylacji substratów specyficznych dla tych kinaz jest najlepszym biomarkerem farmakodynamicznym do ilościowego określenia mechanizmu działania tych inhibitorów⁸. Inne leki mogą modulować ekspresję danego białka, a w takim przypadku kluczowe znaczenie ma możliwość ilościowego określenia zmian stężenia białka docelowego w ujęciu podłużnym w trakcie leczenia. W związku z tym, niezależnie od charakterystyki leku lub patologii, ocena biomarkerów w celu ustalenia związku farmakokinetyki (PK)/ farmakodynamiki (PD) między ekspozycją na lek a modulacją docelową jest najlepszą praktyką we wczesnym etapie rozwoju klinicznego i umożliwia określenie bezpiecznej i tolerowanej farmakologicznie aktywnej dawki/harmonogramu⁹.

Podczas gdy w onkologii analiza kliniczna, analiza biomarkerów w biopsjach może być najlepszym miejscem do ustalenia mechanizmu działania leku, liczba dostępnych biopsji w badaniu jest zazwyczaj dość ograniczona^10,11. Alternatywnie, próbki krwi obwodowej są bardzo cenne dla badań klinicznych, ponieważ obejmują minimalnie inwazyjną procedurę, są szybkie i łatwe do uzyskania, co ułatwia analizę podłużną, są tańsze niż biopsje i dostarczają obszernych informacji do monitorowania wyników leczenia w czasie rzeczywistym. Dodatkową korzyścią płynącą z oceny biomarkerów PD we krwi obwodowej jest możliwość wykorzystania biopróbki do ilościowego określenia farmakokinekiki, co pozwala na dokładne określenie zależności ilościowych PK/PD i późniejsze modelowanie PK/PD^12,13. Komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) z krwi pełnej można wyizolować w celu zbadania markerów białkowych, które doświadczają zmian w poziomie ekspresji lub w modyfikacjach potranslacyjnych. Ponadto PBMC mogą być wykorzystywane do celów immunofenotypowania^14,15, testów funkcjonalności immunologicznej, takich jak ocena cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC)¹⁶ oraz analizy epigenetycznej poprzez izolację RNA. Podobnie, osocze z krwi pełnej może być wykorzystane do ilościowego oznaczania cytokin w celu scharakteryzowania odpowiedzi immunologicznej pacjenta, do przeprowadzenia badań metabolicznych, a także do wyizolowania i sekwencjonowania krążącego DNA guza (ctDNA) w celu monitorowania klonalnej ewolucji choroby wybieranej ze środka terapeutycznego, często zapewniając mechanistyczną podstawę oporności na leczenie^{17,18, 19} umożliwiający rozwój kolejnych generacji środków terapeutycznych²⁰. Wreszcie, izolacja krążących komórek nowotworowych (CTC) z krwi obwodowej pozwala na ocenę postępu choroby poprzez liczenie podłużne, sekwencjonowanie DNA/RNA i analizę biomarkerów białkowych²¹. Chociaż ta izolacja jest zgodna z protokołem opisanym w²², niska obfitość CTC w wielu typach nowotworów i we wczesnych stadiach choroby sprawia, że stosowanie specjalistycznych probówek jest bardziej odpowiednie do minimalizacji degradacji CTC²³.

W ostatnich latach użycie płynnych biopsji poprawiło informacje uzyskane w badaniach klinicznych, a zbiory PBMC zostały włączone do wielu badań w celu monitorowania zaangażowania celu i dowodu mechanizmu albo bezpośrednio w komórkach nowotworowych dla niektórych typów nowotworów hematologicznych, albo na samych PBMC jako substytuty PD komórek nowotworowych^{24, 25,26}. Przygotowanie wysokiej jakości próbek pozytywnie wpływa na określenie najbezpieczniejszego i najskuteczniejszego leczenia danej patologii, ale z naszego doświadczenia wynika, że jakość preparatów PBMC uzyskanych z różnych ośrodków klinicznych została poddana dużej zmienności jakości, co spowodowało, że próbki nie nadają się do dalszej analizy. Wpłynęło to na ilość danych dotyczących choroby Parkinsona, które można było zebrać z tych badań.

Tutaj szczegółowo opisujemy łatwy do naśladowania protokół, który pokazuje, jak skutecznie izolować zarówno PBMCs, jak i próbki osocza z pojedynczego pobrania krwi w warunkach klinicznych. Protokół opiera się na instrukcjach dostarczonych przez producenta probówek do przygotowania komórek jednojądrzastych, które obejmują modyfikacje tam, gdzie rzeczywiste doświadczenia wykazały trudności w realizacji protokołu zgłaszane przez ośrodki kliniczne, takie jak problemy z wirowaniem, opóźnienia w przetwarzaniu i transfer próbek do kriowialiów. Istnieją alternatywne, komercyjnie dostępne metody stosowania probówek do przygotowania komórek jednojądrzastych opartych na separacji w gradinie gęstości przy użyciu roztworów polisacharydowych z lub bez bariery oddzielającej roztwór od krwi²⁷. Jeśli dany ośrodek kliniczny ma już duże doświadczenie w stosowaniu tych alternatywnych metodologii, protokół ten można w akceptowalny sposób zastąpić tymi metodologiami. W takich przypadkach można wziąć pod uwagę dwa czynniki: niektóre alternatywne metody wymagają przeniesienia krwi pełnej z probówki do oddzielnej probówki do preparatu, w której dodatkowy transfer ludzkiego pierwotnego materiału biologicznego może stanowić nieznacznie zwiększone ryzyko bezpieczeństwa, a powodzenie metod bez barier oddzielających krew od roztworu polisacharydowego zależy od krytycznych etapów, takich jak nakładanie warstwy próbki krwi na podłoże o gradiencie gęstości, wymagające opracowania Wyrafinowany poziom wiedzy technicznej, który nie zawsze jest spotykany w warunkach szpitalnych laboratoriów. Niezależnie od powyższych punktów, ogólna żywotność i regeneracja komórek są porównywalne między tymi technikami^15,28. Wybór metodologii jest więc w pewnym stopniu uzależniony od wcześniejszego doświadczenia technicznego, ale w naszych rękach probówki do preparacji komórek jednojądrzastych mogą być z powodzeniem stosowane w szerokim kontekście klinicznym i są naszym, skądinąd, zaleceniem.

Podczas gdy jednym z celów tego protokołu jest produkcja granulek PBMC do dalszego przetwarzania na lizaty, można by wdrożyć inne końcowe zastosowania kolekcji PBMC, takie jak izolacja kwasów nukleinowych lub produkcja rozmazów PBMC lub bloków PBMC odpowiednich dla metod immunohistochemicznych (IHC). Co ważne, ponieważ każda próbka biologiczna pobrana od pacjentów stanowi procedurę inwazyjną przynajmniej na pewnym poziomie, protokół ten maksymalizuje użyteczny materiał z każdej próbki, izolując również osocze, które można wykorzystać do analiz cytokin, badań metabolomicznych lub sekwencjonowania ctDNA.

Analiza biomarkerów obwodowych w badaniach onkologicznych jest jednym z wielu zastosowań lizatów PBMC. Jednym z przykładów jest ocena odpowiedzi na uszkodzenie DNA (DDR) w leczeniu takim jak chemioterapia, radioterapia lub stosowanie inhibitorów enzymów biorących udział w DDR, takich jak kinazy związane z kinazą fosfatydyloinozytolu-3 (PIKKs)⁷ i PARPs^3,13. Celem tych zabiegów jest zwiększenie uszkodzeń DNA w komórkach proliferujących, co powoduje wysoką toksyczność w komórkach z upośledzonymi mechanizmami DDR i punktami kontrolnymi cyklu komórkowego, takich jak komórki rakowe. Poniżej przedstawiamy przykład z badaniem biomarkerów DDR we krwi obwodowej poddanej działaniu promieni rentgenowskich.

Protokół

Świadoma zgoda pacjenta i pełna zgodność z odpowiednimi krajowymi wymogami etycznymi w każdej jurysdykcji, np. Ustawa o tkankach ludzkich (HTA - Wielka Brytania, 2004) i Ustawa o przenośności i odpowiedzialności w ubezpieczeniach zdrowotnych (HIPAA - Stany Zjednoczone, 1996) są obowiązkowe. Upewnij się, że masz w pełni udokumentowaną zgodę etyczną przed rozpoczęciem jakichkolwiek prac nad materiałami pochodzącymi od ludzi. Krew wykorzystana do optymalizacji tego protokołu została dostarczona za odpowiednią zgodą Volunteers Advancing Medicine Panel (VAMP) (numer etyczny 16/EE/0459, badanie CRF494, podbadanie 001) prowadzonego przez NIHR Cambridge Clinical Research Facility, Cambridge, Wielka Brytania, na podstawie umowy na dostawę próbek biologicznych dla ludzi z National Institute for Health Research (NIHR) Cambridge Biomedical Research Centre. Biobank AstraZeneca w Wielkiej Brytanii jest licencjonowany przez Human Tissue Authority (licencja nr 12109) i posiada zatwierdzenie National Research Ethics Service Committee (NREC) jako Bank Tkanek Badawczych (RTB) (REC No 17/NW/0207).

1. Ogólne wskazówki dotyczące przygotowania

UWAGA: Wszystkie prace z nieustalonym materiałem ludzkim, takim jak krew, osocze i PBMC w tym protokole, muszą działać przy założeniu, że materiały te mogą przenosić potencjalnie zakaźne czynniki i dlatego muszą być wykonywane z zachowaniem odpowiednich środków bezpieczeństwa biologicznego. W przypadku pacjentów, którzy zostali przebadani jako negatywni na obecność znanych patogenów, nie należy zakładać, że próbki nie są zakaźne, dlatego nadal należy stosować odpowiednie środki ostrożności. Produkty odpadowe wytwarzane z tych materiałów powinny być traktowane z zachowaniem tych samych środków bezpieczeństwa biologicznego i utylizowane zgodnie z lokalnymi przepisami.

1. Wybierz jeden z dwóch rodzajów probówek do przygotowania komórek jednojądrzastych, które wykorzystują cytrynian sodu lub heparynę sodu jako antykoagulanty. W wielu dalszych zastosowaniach te dwa antykoagulanty mogą być stosowane zamiennie, ale oba antykoagulanty powinny zostać przetestowane przed wyborem jednego z nich do badania.
2. Oznaczyć jedną probówkę do przygotowania komórek jednojądrzastych o pojemności 8 ml, która ma być użyta do pobrania krwi, zakodowanym identyfikatorem pacjenta. Probówki należy przechowywać w temperaturze pokojowej (18-25 °C).
3. Przechowywać 1x PBS w temperaturze pokojowej (18-25 °C). Stosować 30 ml na preparat.
4. Upewnij się, że probówki do oddzielnych próbek osocza i kriowial do próbki PBMC są dokładnie oznaczone unikalnymi identyfikatorami, jak określono w odpowiedniej sekcji instrukcji laboratoryjnej.
5. Jeśli PBMC mają być używane do monitorowania fosforylowanych białek, przygotuj PBS uzupełniony inhibitorami fosfatazy: wymieszaj 5 ml PBS z 50 μl koktajlu inhibitorów fosfatazy 2 + 50 μl koktajlu inhibitorów fosfatazy 3. Przygotuj świeże i trzymaj na lodzie do czasu użycia.
6. Jeśli PBMC mają być kriokonserwowane, przygotuj 1 ml mieszaniny do zamrażania na próbkę, mieszając 90% FBS + 10% DMSO.

2. Kolekcja PBMC (Rysunek 1A)

1. Pobrać 8 ml krwi do probówki do przygotowania komórek jednojądrzastych przy użyciu standardowej techniki opisanej przez producenta. Delikatnie odwróć probówkę 8 do 10 razy, aby wymieszać dodatek przeciwzakrzepowy z krwią. Nie potrząsać, aby uniknąć hemolizy. Zapisz czas, w którym pobrano krew.
2. Po zebraniu przechowuj probówkę w pozycji pionowej w temperaturze pokojowej do momentu odwirowania. Próbki należy przetworzyć tak szybko, jak to możliwe, najlepiej w ciągu jednej godziny od pobrania krwi, ale nie później niż 4 godziny po pobraniu. Zapisz czas rozpoczęcia przetwarzania krwi.
3. Bezpośrednio przed wirowaniem należy ponownie wymieszać próbkę krwi, delikatnie odwracając probówkę jeszcze 8 do 10 razy.
4. Odwirować probówki/probówki z próbką krwi w poziomym wirniku (odchylana głowica) przy 1 500 – 1 800 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej (18-25 °C). Upewnij się, że wszystkie rurki są odpowiednio wyważone.

Rysunek 1: Ogólny przegląd protokołu i reprezentatywne obrazy wirówki. (A) Schematyczny przegląd protokołu przygotowania PBMC i osocza. *Jeśli istnieją ograniczenia czasowe, krok 2.4 można skrócić do 20 minut, a kroki od 3.3 do 3.6 można usunąć. ** W razie potrzeby weź podwielokrotność, aby policzyć komórki. 2 dodatkowe etapy wirowania wymagane do analizy ctDNA/metabolomiki (B) obraz wirówki z odchylanym wirnikiem głowicowym ustawiony dla kroku 2.4. (C) Obraz wirnika, który zawiera dwa wiadra zawierające adaptery do wirowania probówek do przygotowania komórek jednojądrzastych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

UWAGA: x g (określane również jako RCF, względne jednostki odśrodkowe) i RPM (obroty na minutę) to różne jednostki. Pamiętaj, aby ustawić wirówkę na x g (RCF). Do konwersji należy skorzystać z kalkulatora online (patrz Spis materiałów). Jeśli dostępny jest tylko wirnik o stałym kącie nachylenia, wykonuj ten krok przez 10 minut przy 1,500 – 1,800 x g.

5. Po odwirowaniu sprawdź, czy pod barierą znajduje się ciemnoczerwona warstwa (zawierająca głównie czerwone krwinki) i 2 warstwy powyżej bariery. Górna warstwa to osocze (w kolorze słomkowym), a biaława warstwa pod spodem to kożuszek zawierający PBMC. Warstwy te można łatwo rozróżnić, oglądając tubę na ciemnym/czarnym tle.

Rysunek 2: Probówki do izolacji PBMC. (A) Obraz probówek przed odwirowaniem (krok 2.4), pustych (po lewej) lub zawierających krew (po prawej). (B) Pomyślne oddzielenie warstwy PBMC po odwirowaniu (etap 2.5). (C) Obraz warstwy PBMC po odwirowaniu i pozostawienie odrobiny osocza, aby upewnić się, że wszystkie PBMC zostały zebrane (krok 2.7). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

UWAGA: Jeśli te warstwy nie są widoczne, prawdopodobnie oznacza to błąd w ustawianiu jednostek wirowania. Upewnij się, że używany jest odpowiedni adapter wirówki i ustawione są prawidłowe "x g". Powtórz krok 2.4.

6. Bezpośrednio po odwirowaniu za pomocą pipety serologicznej przenieś około połowy osocza do oznakowanej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml z nakrętką, uważając, aby nie naruszyć warstwy PBMC (około 4-5 ml). Tymczasowo przechowuj tę probówkę z plazmą na mokrym lodzie, aby użyć jej później w kroku 4. Na razie odłóż na bok.
7. Zebrać całą warstwę PBMC za pomocą pipety Pasteura, umieszczając pipetę w warstwie komórek i przenieść do innej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml z nakrętką. Dopuszczalne jest również pobranie niewielkiej ilości osocza, jeśli to konieczne, aby całkowicie uzyskać całą warstwę PBMC. Objętość wynosi zwykle 1-2 ml. Natychmiast przejdź do kroku 3 poniżej.

3. Etapy mycia PBMC

UWAGA: Celem etapów mycia jest rozcieńczenie i usunięcie resztek płytek krwi i osocza z granulki PBMC. Wszystkie etapy wirowania powinny być wykonywane w temperaturze pokojowej (18-25 °C).

1. Dodaj PBS o temperaturze pokojowej do probówki PBMC, aby doprowadzić objętość do 15 ml. Zakryj rurkę. Wymieszaj komórki, delikatnie odwracając rurkę 5 razy.
2. Wirować przez 15 minut przy 300 x g. Należy pamiętać, że jest to znacznie łagodniejsze wirowanie niż wirowanie początkowe.
3. Wizualizuj kulkę, patrząc na rurkę na ciemnym/czarnym tle. Usunąć supernatant przez zasysanie próżniowe lub za pomocą pipety (Rysunek 3A). Odrzucić supernatant, pozostawiając objętość około 500 μl powyżej białawego osadu PBMC.

Rysunek 3: Granulki PBMC. (A) Osady otrzymane w pierwszym etapie mycia 3.3. (B) Osad wyizolowany w drugim praniu (krok 3.7). (C) Osad o wysokim poziomie hemolizy, uzyskany z krwi przetworzonej później niż 4 godziny od pobrania krwi, wyizolowany w drugim płukaniu (etap 3.6). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Zawiesić osad komórkowy, delikatnie pipetując w górę i w dół w pozostałym supernatantze.
5. Dodaj dodatkowy 1x PBS, aby zwiększyć objętość do 10 ml. Zakryj rurkę. Wymieszaj komórki, delikatnie odwracając probówkę 5x. Jeśli w protokole badania wymagane jest zliczanie komórek, przejdź do kroku 3.5.1, jeśli nie jest to wymagane, przejdź bezpośrednio do kroku 3.6.
   1. Pobrać 40 μl podwielokrotności ponownie zawieszonych komórek i wymieszać z 40 μl błękitu trypanowego. Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
6. Odwirować zawiesinę z kroku 3.5 przez 10 minut przy 300 x g. Usunąć tyle supernatantu, ile jest to możliwe, bez naruszania osadu komórkowego.
7. Ostrożnie usunąć i wyrzucić pozostały supernatant nad osadem komórkowym, pipetując za pomocą pipety Pasteura z cienką końcówką lub mikropipety, nie naruszając osadu komórkowego. Po wykonaniu tego kroku pozostaw niewiele lub wcale płynu nad granulką. Jeśli punktem końcowym tego protokołu jest granulka PBMC, przejdź do kroku 3.8; jeśli punktem końcowym jest kriokonserwacja PBMC, przejdź do kroku 3.10.
8. Dodać 50 μl nowego PBS (lub uzupełnionego PBS przygotowanego w kroku 1.5, jeśli ma to zastosowanie do punktu końcowego) do osadu i delikatnie pipetować w górę i w dół za pomocą mikropipety, aby równomiernie zawiesić wszystkie komórki. Przenieść całą zawiesinę komórek do oznakowanego kriowialu o pojemności 1,5 ml i natychmiast umieścić na mokrym lodzie do momentu zamrożenia próbek.
9. Oznakowane próbki należy zamrozić, umieszczając je w ciekłym azocie lub bezpośrednio w suchym lodzie. Komórki można również zamrażać w temperaturze -80 °C za pomocą zamrażarek do komórek. W takim przypadku należy całkowicie schłodzić pudełka w temperaturze -80 °C przed dodaniem probówek z komórkami. Zapisz czas, w którym granulki komórek zostały zamrożone. Po zamrożeniu komórek przechowywać w temperaturze -80 °C, wysyłać zamrożone na suchym lodzie.
10. Opcjonalnie, w celu kriokonserwacji PBMC, ponownie zawiesić osad w 1 ml mieszaniny do zamrażania (krok 1.6) i przenieść do oznakowanego kriowialu. Postępować zgodnie z opisem w kroku 3.9, ale w tym przypadku dopuszczalne jest jedynie użycie komór do zamrażania komórek w celu zamrożenia próbek. Przenieść do ciekłego azotu w celu transportu i przechowywania po pobycie w zamrażalni przez co najmniej 24 godziny.

4. Etapy przygotowania plazmy (Rysunek 1A)

1. Po przechowywaniu granulek PBMC w temperaturze -80 °C, należy teraz przygotować porcję osocza, która była tymczasowo przechowywana na mokrym lodzie w kroku 2.6. Wykonaj następujące etapy wirowania, aby sklarować osocze, jeśli celem próbki jest analiza ctDNA, w przeciwnym razie przejdź bezpośrednio do kroku 4.2.
   1. Odwirowywać osocze przez 10 minut w temperaturze 1 600 - 2 000 x g w temperaturze 4 – 8 °C w wirniku o stałym kącie nachylenia (lub 15 minut w rotorze odchylanym).
   2. Ostrożnie odpipetować supernatant osocza, uważając, aby nie naruszyć żadnych osadów i przenieść do nowej probówki o pojemności 15 ml. Wyrzucić probówkę zawierającą granulowany materiał.
   3. Odwirowywać osocze przez 10 minut w temperaturze 1 600 - 2 000 x g w temperaturze 4 – 8 °C w wirniku o stałym kącie nachylenia (lub 15 minut w rotorze odchylanym).
   4. Ostrożnie przenieść supernatant osocza do nowej probówki o pojemności 15 ml, uważając, aby nie naruszyć żadnego granulowanego materiału. Wyrzucić probówkę zawierającą granulowany materiał.
      UWAGA: Jeśli wirówka z chłodzeniem nie jest dostępna, należy przechowywać komórki na lodzie przez 5 minut między każdym wirowaniem lub odwirować próbki w chłodni.
2. Przenieś osocze w podwielokrotnościach o pojemności 1 ml do 5 świeżych mikroprobówek o pojemności 2 ml. Należy użyć mniej niż 5 fiolek, jeśli nie ma wystarczającej ilości osocza, aby napełnić 5 fiolek podwielokrotnościami o pojemności 1 ml i oczekuje się, że ostatnia fiolka będzie zawierać mniej niż 1 ml osocza. Jeśli osocze jest więcej niż 5 ml, wyrzuć pozostałą część. Zapisz całkowitą objętość osocza w każdej probówce.
3. Porcje osocza należy natychmiast zamrozić w pozycji pionowej, przechowując je w temperaturze -80 °C.

5. Przesyłka próbna

1. Wysyłaj zarówno granulki PBMC, jak i próbki osocza na suchym lodzie.
2. Upewnij się, że próbka nie została rozmrożona przed i w trakcie transportu. Do próbek należy zapakować wystarczającą ilość suchego lodu, aby zapewnić, że pozostaną zamrożone przez cały proces wysyłki, biorąc pod uwagę możliwe opóźnienia, które mogą wystąpić podczas transportu.

6. Napromienianie krwi pełnej i analiza western blot biomarkerów DDR (Rysunek 4A)

UWAGA: To jest leczenie ex vivo, które nie będzie wymagane w większości przypadków w klinice, ale te eksperymenty są cenną strategią eksploracyjną w celu znalezienia odpowiednich biomarkerów klinicznych. Próbki krwi należy poddać leczeniu tak szybko, jak to możliwe po pobraniu, aby zapewnić najlepsze wyniki.

1. Rozgrzej szafkę rentgenowską. Oznacz trzy probówki o pojemności 15 ml odpowiednio jako 0, 0,2 i 7 Gy.
2. Weź trzy probówki do przygotowania komórek jednojądrzastych zawierające świeżo pobraną krew od jednej osoby i po delikatnym odwróceniu probówek 8 do 10 razy, przenieś krew do trzech probówek o pojemności 15 ml.
3. Umieścić probówkę 0,2 Gy w szafie rentgenowskiej, zamknąć drzwiczki i nałożyć dawkę 0,2 Gy na probówkę, wybierając numer półki i dawkę. Zastosuj dawkę promieniowania 7 Gy do rurki 7 Gy, dostosowując dawkę wybraną w szafce.
4. Inkubować trzy probówki w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę.
5. Przenieść krew z powrotem do probówek do przygotowania komórek jednojądrzastych i przeprowadzić protokół przygotowania PBMC jak w warunkach klinicznych od kroku 2.4 do kroku 3.8.
6. Dodać objętość buforu do lizy uzupełnioną inhibitorami proteazy i fosfatazy równą objętości osadu komórkowego (w tym przypadku 70 μl buforu RIPA) do każdej z osadów komórkowych, pipetować w górę i w dół i inkubować na lodzie przez 10 minut. Sonikować próbki, jeśli dostępny jest sonikator (3 cykle, 30 s WŁĄCZONE / 30 s WYŁĄCZONE, 4 °C), alternatywnie strzykawkę próbki w celu rozbicia kwasów nukleinowych w celu wyeliminowania lepkości w próbce.
7. Odwirować próbki przez 10 minut w temperaturze ≥ 15 000 x g, w temperaturze 4 °C. Przenieść każdy supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml, ocenić jakościowo poziom hemolizy (kontrola wzrokowa) i zmierzyć stężenie białka dowolną preferowaną metodą.
8. Zmieszać 40 μg całkowitego lizatu z buforem ładującym próbkę zawierającym SDS i środek redukujący próbkę. Gotuj próbki przez 5 minut w bloku grzewczym.
9. Załaduj 20 μg każdej próbki na linię w dwóch egzemplarzach do 4-12% żelu białkowego bis-tris i uruchom SDS-PAGE.
10. Po rozdzieleniu przenieść białka do membrany nitrocelulozowej za pomocą dostępnego w handlu systemu (20 V, 10 min) i zablokować 5 % mleka w TBST.
11. Przeciąć błonę do odpowiednich rozmiarów molekularnych i inkubować z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez noc w temperaturze 4 °C (patrz tabela materiałów dla przeciwciał i rozcieńczeń).
12. Usuń przeciwciała pierwszorzędowe i przemyj błony 3 razy TBST przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z HRP przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
13. Umyć 3 razy łyżką łyżkową przez 5 minut.
14. Zastosuj odczynnik ECL i przeanalizuj uzyskane obrazy w stosunku do sygnału HRP.

Wyniki

Aby poprawić jakość preparatów PBMC w naszych badaniach klinicznych, stworzyliśmy protokół ze zwięzłymi, jasnymi krokami, które mogą być wykonane przez pracowników laboratoriów szpitalnych, niezależnie od ich wiedzy z zakresu biologii molekularnej i umiejętności laboratoryjnych. Dostosowaliśmy protokół producenta, wprowadzając modyfikacje na tych etapach, w których zidentyfikowano lub zgłoszono problemy z wykonaniem z ośrodków klinicznych zaangażowanych w różne wieloośrodkowe badania kliniczne. Protokół można jednak dodatkowo zoptymalizować, aby spełnić określone wymagania, takie jak ograniczenia czasowe w ośrodku klinicznym lub rodzaj dalszych analiz (patrz plik uzupełniający). Pokazujemy, że DDR można analizować w PBMC, patrząc na specyficzne biomarkery uszkodzenia DNA generowanego przez promieniowanie.

Najczęstsze zapytania, które otrzymaliśmy z ośrodków klinicznych, dotyczą etapów wirowania, które bezpośrednio wpływają na możliwość skutecznego wyizolowania PBMC i uzyskania końcowego granulatu PBMC. Użycie odpowiedniego typu wirówki z wirnikiem z odchylaną głowicą (Rysunek 1B,C) jest kluczem do sukcesu protokołu. Jeśli jednak w ośrodku klinicznym dostępna jest tylko wirówka z wirnikiem o stałym kącie nachylenia, sugerujemy wykonanie kroku 2.4 w wirniku o stałym kącie nachylenia przy tym samym RCF, co w przypadku wirnika z odchylaną głowicą, ale tylko przez 10 minut. Gwarantuje to, że warstwa PBMC jest oddzielona od plazmy (patrz Rysunek 2B,C). Podczas gdy nakładanie krwi na podłoże separacyjne o gradiencie gęstości wymaga wirowania z przerwaniem, krew w probówkach do przygotowania komórek jednojądrzastych może być odwirowywana z włączonymi hamulcami ze względu na obecność w probówce bariery żelowej, która zapewnia zachowanie warstwy PBMC oddzielonej od gęstszych składników krwi^27,28.

Co najmniej 4 ml wysokiej jakości, nierozcieńczonego osocza uzyskano z odwirowania krwi w formacie probówki 8 ml, co może być dalej wyjaśnione do wykorzystania w specjalistycznych analizach, takich jak sekwencjonowanie ctDNA lub badania metabolomiczne^29,30 (opcjonalne kroki 4.1.1-4.1.4). Ilość izolowanych PBMC, wielkość granulek i hemoliza lub zanieczyszczenie krwinek czerwonych to inne obawy wynikające z ośrodków klinicznych i doświadczenia w analizie próbek. Liczba komórek uzyskanych z 8 ml krwi była zmienna w zależności od pacjenta i otoczenia choroby, ale ogólnie rzecz biorąc, otrzymany osad jest mały i ma przezroczyste/białe zabarwienie (Ryc. 3A,B). Ze względu na te cechy ważne jest, aby wizualizować granulat na ciemnym tle, aby uniknąć jego przypadkowego zassania podczas etapów prania (2,5 i 3,3). Czasami granulki mogą mieć pewne czerwone zabarwienie z powodu zanieczyszczenia czerwonymi krwinkami (Ryc. 3C), co ma negatywny wpływ na jakość preparatu. Aby uniknąć utraty małych granulek, takich jak te pokazane w Rysunek 3, przeniesienie osadu PBMC do kriowialu jest ułatwione przez krok 3.7, w którym osad PBMC jest ponownie zawieszany w 50 μl PBS.

Typowy plon przy użyciu tych probówek i krwi od zdrowych osób waha się między 7 do 21 x 10⁶ komórek na 8 ml, a regeneracja komórek między 70 a 80%, jak to jest w naszym doświadczeniu i jak to zostało wcześniej pokazane^27,28. Zależy to zarówno od liczby pojedynczych komórek, jak i operatora i jest porównywalne z liczbą komórek i wartościami odzyskiwania komórek uzyskanymi innymi metodami wykorzystującymi gradient gęstości (w tym systemami wykorzystującymi rurki z barierą separacyjną)^15,27,28. Obrazowym przykładem zmienności liczby PBMC izolowanych tą metodą w zależności od stanu choroby jest analiza markerów PBMC u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (PBL). Liczba komórek odzyskanych z probówki do przygotowania komórek jednojądrzastych o pojemności 8 ml przy zastosowaniu tego protokołu wahała się od 1,62 x 10⁴ do 1,99 x 10⁹ w 45 próbkach pobranych od 7 pacjentów w badaniu NCT03328273³¹ (Tabela 1). Powiązanym parametrem jest stężenie białek w lizatach PBMC otrzymanych tą metodą, a to zależy od liczby wyizolowanych komórek i efektywności ekstrakcji białka. Osady komórkowe poddane lizie w sekcji 6 zostały wygenerowane za pomocą buforu RIPA i sonikacji (krok 6.6). Ponowne zawieszenie osadów komórkowych w ich tej samej objętości buforu do lizy zwykle skutkuje zakresem stężeń od 3 do 10 mg / ml, aw tym konkretnym przykładzie stężenia lizatu wynosiły 6,8, 8,3 i 8,6 mg / ml odpowiednio dla 0, 0,2 i 7 Gy. Jest to jednak narażone na dużą zmienność przy otrzymywaniu próbek z ośrodków klinicznych, które nie zostały optymalnie przygotowane, choroba pacjenta i obecność hemoglobiny z zanieczyszczenia krwinek czerwonych. Na przykład bardzo małe granulki muszą być ponownie zawieszone w objętości buforu do lizy większej niż objętość osadu komórkowego, aby umożliwić zarówno pomiar stężenia białka, jak i dalszą analizę biomarkerów, co skutkuje bardziej rozcieńczonymi próbkami. W takim przypadku, jeśli stężenie próbki jest niższe niż 1 mg/ml, może to stanowić wyzwanie dla wykonania testów takich jak western blot ze względu na wysoki współczynnik rozcieńczenia. Natomiast w wcześniej wspomnianych próbkach PBL objętość buforu do lizy dodanego w celu ponownego zawieszenia osadów komórkowych wahała się od 50 do 500 μl, a stężenie białka wahało się od 1,62 do 19,77 mg/ml (tabela 1).

Gdy próbki wykazują zanieczyszczenie krwinkami czerwonymi lub hemolizę (Rysunek 3C), stężenie białka w lizacie PBMC staje się zawyżone z powodu włączenia hemoglobiny z erytrocytów. Z tego powodu należy przeprowadzić oględziny i adnotację takich próbek, jak opisano w kroku 6.7 protokołu. Nadmierne obciążenie próbki może skompensować obecność hemoglobiny podczas przeprowadzania analizy biomarkerów, o ile kontrola obciążenia jest uwzględniona w teście. Można zastosować inne, bardziej ilościowe metody pomiaru hemolizy, takie jak pomiar absorbancji przy 414 nm³².

DDR został przeanalizowany w PBMC uzyskanych zgodnie z tym protokołem klinicznym. Aby zilustrować sytuację, która naśladuje szkodliwe dla DNA leczenie kliniczne, takie jak radioterapia lub chemioterapia, pełna krew od zdrowych ochotników została ex vivo poddana promieniowaniu rentgenowskiemu (Rysunek 4A). Promieniowanie jonizujące (IR), takie jak promieniowanie rentgenowskie, indukuje różne rodzaje uszkodzeń DNA, w tym pęknięcia podwójnej nici DNA (DSB). Wykrywanie uszkodzeń DNA tych zmian aktywuje PIKK, takie jak mutacja ataksji i teleangiektazji (ATM), ATM i związane z Rad3 (ATR) oraz kinaza białkowa zależna od DNA (DNA-PK), które angażują mechanizmy naprawy DNA, takie jak rekombinacja homologiczna (HR) lub niehomologiczne łączenie końców (NHEJ). Aktywacja ATM przez obecność DSB zachodzi poprzez jego rekrutację do miejsc uszkodzenia przez kompleks MRN (MRE11-RAD50-NBS1), powodując autofosforylację ATM w kilku pozostałościach, w tym Ser1981. Z kolei aktywowany ATM fosforyluje składniki kompleksu MRN i innych białek, takich jak wariant histonu H2AX na Ser139 (gdzie pSer139-H2AX jest również znany jako γH2AX), aby promować zmianę strukturalną chromatyny rozciągającej się od DSB, co ułatwia rekrutację innych czynników DDR³³. PBMC reagują na promieniowanie jonizujące pomimo niskiego tempa proliferacji, a metody spektrometrii mas pozwoliły na ilościowe określenie regulacji w górę fosforylowanego Ser635 na RAD50 przez ATM. Ta fosforylacja jest zmniejszona w obecności inhibitorów ATM, a RAD50 pS635 został następnie zwalidowany jako biomarker farmakodynamiczny do klinicznego leczenia inhibitorami ATM w nowotworach przez immunohistochemię⁸. Aby ocenić reakcję PBMC na promieniowanie, krew od zdrowych ochotników poddano różnym dawkom podczerwieni, a próbki pobrano po 1 godzinie inkubacji w temperaturze 37 °C (Ryc. 4A). W tym celu krew przeniesiono do plastikowych probówek, aby uniknąć zmniejszenia wydajności izolacji PBMC z powodu wysokiej temperatury (krok 6.2). Przeanalizowaliśmy, w jaki sposób ATM został aktywowany, nie tylko patrząc na wcześniej zgłoszony RAD50 pS635, ale także ATM pS1981 i γH2AX. W trzech badanych przypadkach zaobserwowano wzrost tych modyfikacji potranslacyjnych przy wyższych dawkach IR (Ryc. 4B). Co ciekawe, fosforylacja ATM i RAD50 była znaczna przy niskiej dawce 0,2 Gy, co sugeruje, że te potranslacyjne modyfikacje mogą być realnie badane jako biomarkery PD w leczeniu obejmującym generowanie DNA DSB o dobrym zakresie dynamicznym, nie tylko w próbkach guza, ale także we krwi obwodowej. Pozwala to na monitorowanie odpowiedzi PD na leczenie poprzez pobieranie próbek podłużnych w trakcie leczenia. Czas od pobrania krwi do przetworzenia próbek ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że te kaskady sygnałowe są nadal aktywne, ponieważ opóźnienia w przetwarzaniu wpłyną na kinetykę takich kaskad i można przegapić zdarzenia fosforylacji stosowane jako fosfomarkery.

Rycina 4: PBMC wyizolowane z krwi napromieniowanej ex vivo zgodnie z niniejszym protokołem klinicznym wyświetlają biomarkery informujące o zakresie uszkodzeń DNA spowodowanych leczeniem. (A) Schematyczny przegląd protokołu przygotowania PBMC i analizy DDR po napromienianiu krwi pełnej. *2 dodatkowe etapy wirowania wymagane do analizy ctDNA/metabolomiki. (B) Western blot wykazujący zależne od dawki zwiększenie biomarkerów fosfo DDR w PBMC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozdział szt. szt. pkt. szt. szt. szt. szt. pkt. powiedział: szt. szt. Rozdział pkt. powiedział: Rozdział czasu Rozdział szt. Rozdział szt. szt. szt. Rozdział powiedział: szt. szt. pkt. Rozdział powiedział: Rozdział szt. Rozdział pkt. szt. szt. szt. szt. powiedział: szt. szt. szt. szt. Rozdział pkt. Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział Rozdział pkt. powiedział: szt. pkt. Rozdział szt. szt. szt. szt.

próbka	Liczba PBMC/8 ml krwi	Uzupełniona objętość bufora RIPA (μl)	Stężenie końcowe (mg/ml)
A.1	39100000	70	Godzina 12.16
A.2	Numer katalogowy 97400000	100	Z godziny 4,54
A.3	233000000	150	7,63
A.4	316000000	150	godz. 16.87
A.5	387000000	150	godz. 12.60
A.6	Numer telefonu 459000000	150	Godzina 12.71
A.7	Numer telefonu 414000000	200	15,67
A.8	253000000	150	godz. 14.56
A.9	Numer katalogowy: 509000000	300	Godzina 10,67
B.1	Numer katalogowy: 15200000	70	Z dnia 2,96
B.2	10500000	50	Z dnia 4,59
B.3	Numer katalogowy: 13200000	50	Pytanie 3,99
B.4	Numer telefonu 34800000	100	Godzina 10.41
B.5	Numer katalogowy: 1620000	70	7,11
B.6	70200000	100	Godzina 9,26
B.7	Numer katalogowy: 65400000	100	Godzina 12.10
B.8	Numer katalogowy 91100000	150	Godzina 11,82
C.1	Numer katalogowy: 6330000	70	Norma 4.04
C.2	4400000	150	godz. 19.77
C.3	68000000	100	8,96
C.4	35100000	50	godz. 9.30
C.5	35400000	70	godz. 10.55
C.6	Numer katalogowy: 99200000	100	Godzina 16.19
D.1	Numer telefonu 402000000	70	7,23
D.2	826000000	300	godz. 16.95
D.3	1990000000	300	godz. 14,87
D.4	1000000000	300	godz. 18.34
D.5	Numer katalogowy: 1160000000	400	Godzina 16,13
D.6	806000000	400	godz. 19.40
E.1	302000000	300	Godzina 13,86
E.2	990000000	500	Godzina 19.04
E.3	1200000000	400	Godzina 17.13
Formuła F.1	Numer katalogowy: 4010000	50	1,62
Wizualna formuła F.2	Numer katalogowy: 5170000	50	Wynik 2,84
Formuła F.3	Numer katalogowy: 2810000	50	Rejon 3,69
Formuła F.4	Numer katalogowy: 3700000	75	Pytanie 3,62
F.5	Numer telefonu 3460000	70	Rozdział 4.03
F.6	7060000	50	Klasa 3,32
G.1	Numer katalogowy: 60700000	70	6,57
G.2	82100000	150	7,78
G.3	30500000	70	Godzina 8,28
G.4	Numer katalogowy: 134000000	100	Godzina 15.14
G.5	Numer katalogowy 91900000	100	Godzina 8,61
G.6	372000000	150	godz. 15,88
G.7	574000000	200	Godzina 15.01
Podłużne próbki PBMC odpowiadające 7 pacjentom

Tabela 1: Liczba komórek i stężenie białka w granulkach PBMC od pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (CLL). Dane przedstawione w powyższej tabeli odpowiadają 45 próbkom PBMC pobranym od 7 pacjentów z PBL biorącym udział w badaniu NCT03328273 pobranych w probówkach do przygotowania komórek jednojądrzastych. Są to oryginalne dane wygenerowane przy użyciu próbek z cytowanego badania³¹.

Plik uzupełniający: Alternatywne opcje protokołu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Wysokiej jakości preparaty PBMC i osocza, które można przygotować w sposób solidny i powtarzalny w ośrodkach badań klinicznych, są nieocenione w informowaniu o peryferyjnych punktach końcowych predykcyjnych i farmakodynamicznych biomarkerów translacyjnych badań klinicznych. W tym miejscu przedstawiliśmy krótki, przejrzysty protokół, który odnosi się do typowo problematycznych kroków, które do tej pory były podatne na błędy wykonawcze w warunkach badania klinicznego. Protokół można jednak dodatkowo zoptymalizować, aby spełnić określone wymagania, takie jak ograniczenia czasowe w ośrodku klinicznym lub rodzaj dalszych analiz (patrz plik uzupełniający).

W tym celu pokazaliśmy, jak wyizolować zarówno PBMC, jak i osocze z krwi pełnej za pomocą probówek do przygotowania komórek jednojądrzastych do produkcji zamrożonych granulek PBMC i zamrożonego osocza nadających się do różnych dalszych analiz. Zwróciliśmy uwagę na szczególnie krytyczne kroki protokołu obejmujące wirowanie i identyfikację warstwy PBMC w kroku 2.5 oraz granulek PBMC w krokach 3.3 i 3.6. Historycznie rzecz biorąc, miejsca, w których ośrodki kliniczne często popełniały błędy, polegały na ustawianiu wirówki na właściwe jednostki (mylenie wartości RCF lub x g z wartością RPM), opóźnianie przetwarzania próbek krwi, temperatury i obecności dużych objętości PBS nad zamrożonym osadem komórkowym. W większości wirników wirówek błędne wprowadzenie wartości x g jako ustawienia prędkości obrotowej spowoduje znaczne niedowirowanie, co w rezultacie spowoduje słabo zdefiniowaną warstwę PBMC lub jej brak, a także potencjalne niezamierzone odrzucenie PBMC podczas etapów mycia z powodu nieefektywnego granulowania komórek. Istnieje jednak możliwość, że warstwa PBMC nie jest widoczna pomimo zastosowania odpowiednich ustawień wirowania i adaptera rotora, jeśli u pacjenta rozwinęła się leukopenia. Stan ten może wystąpić u pacjentów włączonych do badań onkologicznych z powodu chemioterapii lub radioterapii i powinien być brany pod uwagę. Innym krytycznym punktem, który został jasno określony w protokole, jest to, że próbki muszą być przetwarzane w ciągu 1-2 godzin od pobrania krwi, aby zmniejszyć możliwość negatywnego wpływu hemolizy na protokół. Co więcej, dążenie do przetworzenia próbek w ciągu pierwszej godziny pobierania krwi zmniejsza zmienność ex vivo, co może mieć ogromny wpływ na odczyty farmakokinetyki i na biomarkery, na które wpływa zachowanie krwi lub aktywne szlaki sygnałowe, takie jak przypadek pokazany na rycinie 4. Opóźnienia w przetwarzaniu próbek mogą mieć również szkodliwy wpływ na żywotność komórek, jeśli komórki mają być kriokonserwowane³⁴. Innym czynnikiem, który może wpływać zarówno na plon, jak i zanieczyszczenie krwinek czerwonych, jest temperatura przechowywania i wirowania, która powinna być utrzymywana w temperaturze pokojowej (18-25 °C). Niższe temperatury zwiększają gęstość ośrodka gradientu gęstości, co powoduje wyższy stopień zanieczyszczenia krwinek czerwonych i granulocytów, ponieważ komórki te nie agregują się tak dobrze. Z drugiej strony, wyższe temperatury prowadzą do uwięzienia PBMC między zagregowanymi erytrocytami, zmniejszając w ten sposób wydajność preparatu 15,27,28. I wreszcie, ważne jest, aby w osadzie komórkowym w kriowiale nie było więcej niż 50-100 μl płynu, ponieważ wpływa to negatywnie na stężenie wszelkich lizatów białkowych uzyskanych w dalszym przetwarzaniu tych preparatów PBMC. Nadmiar cieczy spowoduje nadmierne rozcieńczenie próbek, co doprowadzi do powstania lizatów o bardzo niskim stężeniu białka, które nie nadają się do analizy biomarkerów. Ponadto zachowanie wszelkich modyfikacji potranslacyjnych zostanie osłabione, a wydajność lizy również zostanie znacznie zmniejszona.

Wybrano probówki do przygotowywania komórek jednojądrzastych, ponieważ oferują one najprostszy sposób izolowania zarówno PBMC, jak i osocza w jednym pobraniu krwi do badań klinicznych, z doskonałym doświadczeniem, z doskonałą odtwarzalnością. Przetwarzanie krwi nie wymaga wysoko wykwalifikowanych operatorów, a użycie pojedynczej probówki eliminuje potrzebę rozcieńczania krwi i przenoszenia jej do innej probówki, zmniejszając ryzyko zagrożenia; skraca protokół ze względu na wykonywanie etapów wirowania przy włączonych hamulcach; a wszystkie odczynniki znajdują się w probówce, co zmniejsza zmienność. Z naszego doświadczenia wynika, że korzyści te przewyższają wyższy koszt tych probówek w porównaniu z innymi klasycznymi metodami, polegającymi jedynie na użyciu pożywki do separacji w gradiacji gęstości^27,28 (410 GBP za 60 jednostek, podczas gdy pożywka limfatyczna dla 66 preparatów o pojemności 50 ml wynosi 215 GBP). Są one dostępne w dwóch rodzajach antykoagulantów, heparynie i cytrynianu, z których oba są porównywalne pod względem utrzymania funkcjonalności izolowanych PBMC³⁵, dlatego wybór jednego antykoagulantu zamiast drugiego będzie oparty na możliwym wpływie heparyny lub cytrynianu w dalszych badaniach biomarkerów. Chociaż wykazano, że probówki EDTA zapewniają najwyższą wydajność izolacji PBMC w porównaniu z heparyną lub cytrynianem¹³, korzyści płynące z łatwości użycia manipulacji tylko jedną probówką równoważą to rozważanie. Jeśli cytokiny mają być analizowane, antykoagulanty mogą mieć wpływ na poziomy wykryte w osoczu, dlatego oba antykoagulanty powinny zostać przetestowane przed wyborem jednego do badania klinicznego³⁶. Jeśli osocze ma być wykorzystane do badań metabolomicznych, preferowane byłoby użycie heparyny jako antykoagulantu³⁷. W związku z tym jedyną kwestią, która pozostaje użytkownikowi końcowemu lub naukowcowi zajmującemu się translacją badania klinicznego, jest to, czy cytrynian czy heparyna będą bardziej odpowiednie do ich celów po ocenie kosztów.

Chociaż korzyści płynące ze stosowania probówek do przygotowywania komórek są liczne w porównaniu z ograniczeniami, jakie stwarzają (wyższy koszt i dostępność ograniczonego zakresu antykoagulantów), główne ograniczenie stosowania PBMC lub osocza do uzyskiwania biomarkerów PD w badaniach klinicznych, zwłaszcza w onkologii, może być niezwiązane z metodą izolacji. Z wyjątkiem nowotworów hematologicznych, w których guz jest pobierany bezpośrednio z krwi obwodowej, w innych wskazaniach nowotworowych osocze i PBMC są tkankami zastępczymi, które niekoniecznie naśladują guz pierwotny. Tkanka obwodowa może nie dzielić genomu i epigenomu z guzem pierwotnym, dlatego obwodowa analiza biomarkerów zależnych od określonej mutacji nowotworu ogranicza się głównie do analizy ctDNA (z osocza) lub CTC (poprzez późniejsze sortowanie warstwy PBMC). Ponadto kaskady sygnalizacyjne napędzające lub przyczyniające się do proliferacji guza mogą nie być tak aktywne we krwi obwodowej. Wyzwanie to można przezwyciężyć poprzez zastosowanie metod odkrywania biomarkerów ukierunkowanych na krew⁸ w celu zidentyfikowania alternatywnych biomarkerów lub sprzężenie leczenia ex vivo z izolacją osocza³⁸ i preparatów PBMC²⁶.

W obecnym protokole zamrożone granulki PBMC mogą być łatwo przetworzone poza miejscem klinicznym w celu uzyskania lizatów białkowych, które można ocenić za pomocą technik western blotting lub ELISA. Przedstawiono również alternatywne metody wykorzystania PBMC do włączenia metod IHC (Plik Uzupełniający). Ponadto szczegółowo opisaliśmy również możliwość kriokonserwacji PBMC (patrz plik uzupełniający) do monitorowania komórek odpornościowych, co jest istotnym zastosowaniem w onkologii, z inhibitorami immunologicznych punktów kontrolnych i ADC coraz częściej testowanymi w badaniach klinicznych. Ocena funkcji immunologicznych, takich jak ADCC¹⁶ i immunofenotypowanie, są zastosowaniami kompatybilnymi z kriokonserwowanymi PBMC wyizolowanymi z probówek do przygotowania komórek jednojądrzastych¹⁵. Istnieje zastrzeżenie dotyczące krioprezerwacji, ponieważ może ona sprzyjać regulacji w dół niektórych markerów powierzchniowych i wewnętrznych oraz może upośledzać niektóre funkcje komórek, jednak kriokonserwacja PBMC jest jedynym możliwym sposobem wykonywania tych testów ze względu na ograniczenia czasowe podczas przenoszenia próbek z wielu miejsc klinicznych do przetwarzania w laboratoriach zewnętrznych^14,15, a te szkodliwe skutki można znacznie przezwyciężyć dzięki dobrym metodom rozmrażania i okresom spoczynku³⁹.

Podsumowując, przedstawiony tutaj protokół pozwoli na niezawodne przygotowanie PBMC i próbek osocza w każdej instytucji klinicznej dysponującej powszechnym sprzętem i materiałami, tak aby translacyjne punkty końcowe z krwi obwodowej mogły być solidnie włączone w globalnych badaniach klinicznych.

Na koniec pokazujemy, w jaki sposób analiza lizatów PBMC może mechanicznie informować o odpowiedzi na czynniki uszkadzające DNA, pokazując zależną od dawki modyfikację potranslacyjną kluczowych czynników DDR, które można wykorzystać do kształtowania rozwoju klinicznego. Perspektywiczne, wdrożenie metod, które są bardziej ilościowe niż western blotting (np. spektrometria mas⁴⁰) i wymagają mniejszej ilości materiału wejściowego (takich jak kapilarne western blotting i ELISA) pomogłoby przesunąć te wyniki przedkliniczne w kierunku bardziej solidnej, systematycznej oceny próbek pacjentów PBMC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,5 ml kriowialnego	Nalgene, ThermoFisher	5000-1020	Do przechowywania granulek PBMC i ponownie zawieszonych PBMC
1,5 ml probówek do mikrowirówek	VWR	525-0990	To jest przykład, skorzystaj z preferowanego dostawcy
15 ml stożkowa sterylna probówka wirówkowa propylenowa	Nunc, ThermoFisher	339651	Inne marki mogą być używane
2 ml probówka z zakrętką, sterylna, z dołączoną nakrętką	ThermoFisher	3463	Do rozdzielania plazmy
20X TBS Bufor	ThermoFisher Scientific	28358	Final to 25 mM Tris, 0,15 M NaCl; pH 7,5. To jest przykład, możesz przygotować własny zapas lub skorzystać z innego dostawcy
20X TBS Tween 20 Bufor	ThermoFisher Scientific	28360	Lub uzupełnij TBS o 0,05%, aby przygotować bufor TBST
Automatyczny licznik komórek lub hemocytometr	ThermoScientific	AMQAX1000	Używamy urządzenia Countess i szkiełek, ale mogą to być inne metody.
Regulowana mikropipeta pozwalająca na 50 &mikro; Pomiary			Aby poradzić sobie z małymi objętościami (np. western blot, przenieś granulki PBMC do probówek o pojemności 1,5 ml)
BD Vacutainer CPT probówka do przygotowania komórek jednojądrzastych (cytrynian na-cytrynianu lub na-heparyna) 8 ml	BD	362761, 362753	Istnieją probówki 4 ml, ale jeśli to możliwe, zaleca się probówki 8 ml, aby uzyskać więcej PBMC z jednego pobrania krwi
Pudełko do zamrażania komórek	ThermoFisher Scientific	5100-0001	To jest przykład, skorzystaj z preferowanego dostawcy.
Konwerter agregatów wirówkowych	LabTools		http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/
DMSO	Sigma-Aldrich, MERK	D2438	Użyj preferowanego dostawcy. Używany do kriokonserwacji PBMC
Podłoże peroksydazy chrzanowej ECL	ThermoFisher	34075	Użyj preferowanego odczynnika zgodnie z czułością wymaganą do wykrycia biomarkera za pomocą western blot. Można stosować inne systemy, takie jak przeciwciała drugorzędowe IRDye z systemami obrazowania.
Szafa rentgenowska Faxitron MultiFocus	Faxitron Bioptics		Do naświetlania krwi. Dostępne są inne modele/producenci
Płodowa surowica bydlęca (FBS), inaktywowany termicznie	ThermoScientific	102706	Użyj preferowanego dostawcy. Ued do kriokonserwacji PBMC
Drobna końcówka, sterylna 1,5 ml Pipety Pasteura	VWR	414004-018	Opcjonalnie
Wirówka			Opcjonalnie do przygotowania osocza do ctDNA/metabolomiki
System obrazowania żelowego doc	SYNGENE		Do obrazowania Membrany opracowane przez HRP
Blok			grzewczyAby denaturować lizaty przed uruchomieniem ich w western blot, każdy producent wyposażony w odpowiednie adaptery rurek
Wirówka z poziomym wirnikiem (głowica odchylana)	Thermoscientific	Heraeus Megafuge 40R	To jest przykład
Ciekły azot/suchy lód			Do błyskawicznego zamrażania próbek
Cudowne mleko odtłuszczone w proszku	Premier Foods		To jest przykład, skorzystaj z preferowanego dostawcy
Końcówki do mikropipet o rozmiarach 1-200 i mikro; L			Aby poradzić sobie z małymi objętościami (np. Western blot, przenieś granulki PBMC do probówek 1,5 ml)
NuPAGE 4-12% żel białkowy Bis-Tris, 1 mm, 10 dołków	ThermoFisher Scientific	NP0321BOX	To jest przykład, oddaj własny lub użyj preferowanego dostawcy
Bufor próbki NuPAGE LDS (4X)	ThermoFisher Scientific	NP0007	Do obrazowania membran opracowanych przez HRP
Środek redukujący próbki NuPAGE (10X)	ThermoFisher Scientific	NP0009	To jest przykład.
PBS, bez wapnia, bez magnezu	Gibco, ThermoFisher	14190-144	Jest to zwykle dostarczane w zestawie klinicznym.
Koktajl inhibitorów fosfatazy 2	Sigma-Aldrich, MERK	P5726-1ML	Opcjonalnie dla kroku 3.7
Koktajl inhibitorów fosfatazy 3	Sigma-Aldrich, MERK	P0044-1ML	Opcjonalnie dla kroku 3.7
Technologia sygnalizacji komórkowej	królika anty GAPDH	CST 2128	1:1000 rozcieńczenie w 5% mleku TBST
Królik anty γ H2AX	Cell Signaling Technology	CST 2577, lot 11	1:2000 rozcieńczenie w 5 % mleku TBST
Królik anty pS1981 ATM	Abcam	ab81292	1:2000 rozcieńczenie w 5 % mleku TBST
Królik anty pS635 RAD50	Technologia sygnalizacji komórkowej	CST 14223	1:1000 rozcieńczenie w 5 % mleka TBST
Królik anty total ATM	Abcam	ab32420	1:1000 rozcieńczenie w 5 % mleku TBST
Królik anty całkowita technologia	sygnalizacji komórkowej	CST 3427, partia 2	1:1000 rozcieńczenie w 5 % mleku TBST
bufor RIPA	Sigma-Aldrich, MERK	R0278-50ML	Do lizy komórek. To jest przykład, skorzystaj z preferowanego dostawcy
Sonicator	Diagenode	B01060010	Używany przez 3 cykle przy 30 s włączeniu / 30 s wyłączeniu, 4 oC. Jeśli używasz innego instrumentu, dostosuj liczbę cykli i intensywność do swojego sonikatora.
Sterylne pipety Pasteura 1,7 ml	VWR	414004-030	To jest przykład, użyj preferowanego dostawcy
Sterylne pipety serologiczne (objętość 5 i 10 ml)	Costar	4101, 4051	To jest przykład, użyj preferowanego dostawcy
Błękit trypanowy	ThermoScientific	T10282	Dotyczy to automatycznego licznika komórek wymienionego powyżej.
Mokry lód			Aby utrzymać próbki osocza i lizaty w niskiej temperaturze