Method Article

Charakterystyka zmian konformacyjnych pojedynczych cząsteczek pod wpływem przepływu ścinającego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

DOI:

10.3791/60784

⸱

January 25th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Lehigh University, 2Department of Materials Science and Engineering, Lehigh University, 3Department of Chemistry, Lehigh University, 4Department of Mechanical Engineering and Mechanics, Lehigh University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół do unieruchamiania pojedynczych makrocząsteczek w urządzeniach mikroprzepływowych i ilościowego określania zmian w ich konformacji pod wpływem przepływu ścinającego. Protokół ten jest przydatny do charakteryzowania właściwości biomechanicznych i funkcjonalnych biomolekuł, takich jak białka i DNA, w środowisku przepływu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zachowanie pojedynczej cząsteczki pod wpływem zakłóceń mechanicznych zostało szeroko scharakteryzowane, aby zrozumieć wiele procesów biologicznych. Jednak metody takie jak mikroskopia sił atomowych mają ograniczoną rozdzielczość czasową, podczas gdy rezonansowy transfer energii Förstera (FRET) pozwala jedynie na wnioskowanie o konformacjach. Z drugiej strony mikroskopia fluorescencyjna umożliwia wizualizację in situ pojedynczych cząsteczek w czasie rzeczywistym w różnych warunkach przepływu. Nasz protokół opisuje kroki w celu uchwycenia zmian konformacyjnych pojedynczych biomolekuł w różnych środowiskach przepływu ścinającego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Przepływ ścinający jest wytwarzany w kanałach mikroprzepływowych i kontrolowany przez pompę strzykawkową. Jako demonstracja metody, czynnik von Willebranda (VWF) i DNA lambda są znakowane biotyną i fluoroforem, a następnie unieruchamiane na powierzchni kanału. Ich konformacje są stale monitorowane przy zmiennym przepływie ścinającym przy użyciu całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Odwracalna dynamika rozplątywania VWF jest przydatna do zrozumienia, w jaki sposób jego funkcja jest regulowana w ludzkiej krwi, podczas gdy konformacja DNA lambda oferuje wgląd w biofizykę makrocząsteczek. Protokół może być również szeroko stosowany do badania zachowania polimerów, zwłaszcza biopolimerów, w różnych warunkach przepływu oraz do badania reologii złożonych płynów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mechanizmy reakcji biomolekuł na bodźce środowiskowe były szeroko badane. W szczególności w środowisku przepływowym siły ścinające i wydłużające regulują zmiany konformacyjne i potencjalnie funkcję biomolekuł. Typowymi przykładami są indukowane ścinaniem rozplątywanie DNA lambda i czynnika von Willebranda (VWF). Lambda DNA została wykorzystana jako narzędzie do zrozumienia dynamiki konformacyjnej pojedynczych, elastycznych łańcuchów polimerowych oraz reologii roztworów polimerowych1,2,3,4. VWF to czujnik naturalnego przepływu, który agreguje....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie VWF

  1. Należy rozpuścić VWF w ludzkim osoczu, aby przygotować je do reakcji znakowania. Dodać 100 μl wody dejonizowanej (DI) do 100 μg liofilizowanego VWF, aby uzyskać roztwór podstawowy VWF o stężeniu 1 mg/mL.
  2. Dializować roztwór podstawowy VWF w celu usunięcia nadmiaru glicyny, zwiększając w ten sposób skuteczność znakowania biotyny i fluoroforu.
    1. Przenieść 50 μl roztworu podstawowego VWF do jednostki dializacyjnej o pojemności 0,1 ml z odcięciem 10 000 mas cząsteczkowych i zamknąć nakrętką. Pozostały roztwór podstawowy należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Zapas VWF będzie stabilny przez okres do 1 roku w temperatu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obserwacja dynamicznego zachowania biomolekuł, takich jak VWF i lambda DNA, jest wysoce zależna od optymalizacji ich wiązania z powierzchnią urządzenia. Inkubacja obróbki powierzchni przez zalecany czas w urządzeniu mikroprzepływowym ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiązania z kilkoma punktami zakotwiczenia, tak aby cząsteczki mogły swobodnie rozciągać się i rozluźniać przy zmianie przepływu. Jeśli białka lub DNA są zbyt silnie związane wieloma wiązaniami, będą albo rozciągać się na ograniczoną długość, albo w ogóle s.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby uzyskać wysokiej jakości dane dotyczące zmian konformacyjnych pojedynczej cząsteczki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, jak opisano w tej metodzie, kluczowe znaczenie ma inkubacja cząsteczki przez odpowiedni czas, zminimalizowanie jej niespecyficznych interakcji z powierzchnią i ustalenie ustawień mikroskopu, które zmniejszają fotowybielanie. Zdolność cząsteczki do swobodnej zmiany konformacji jest związana z liczbą oddziaływań biotyna-streptawidyna powstałych między cząsteczką a powierzchnią. Jak wspomniano wcz.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez grant Narodowej Fundacji Nauki DMS-1463234, granty National Institutes of Health HL082808 i AI133634 oraz wewnętrzne fundusze Lehigh University.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Zestaw do etykietowania Alexa Fluor 488InvitrogenA30006
Bio-Spin P-6 Kolumny żeloweBio-Rad7326221
BiotynaSigma-AldrichB4501Stosować jako wolną biotynę w kroku 5.6
Biotyna-14-dCTPAAT Bioquest17019
BSA-BiotynaSigma-AldrichA8549
Szkiełka nakrywkoweVWR48393-195No. 1 ½, 22 x 50 mm
dNTP ZestawInvitrogen10297018
Boje pływakowe do mini urządzenia do dializyThermo Scientific69588
Fragment Klenowa (3'→ 5' egzo-)New England BioLabsM0212SUżyj do 10-krotnego buforu reakcyjnego w kroku 2.1.1 i 1-krotnego bufora reakcyjnego w kroku 2.2.2
Lambda DNANew England BioLabsN3011S
Mini urządzenie do dializyThermo Scientific6957010K MWCO, objętość 0,1 ml
NEBuffer 4New England BioLabsB7004S
NHS-PEG4-BiotinThermo Scientific21330
Protokatechuat 3,4-dioksygenazySigma-AldrichP8279
Kwas protokatechowySanta Cruz Biotechnologysc-205818
Zestaw elastomerów silikonowych do produkcji PDMSFirma chemiczna Dow4019862
StreptawidynaSigma-Aldrich85878
Roztwór blokującyCANDOR Bioscience110 050Stosować jako roztwór blokujący kazeinę w całym protokole
Taśma winylowa do pomieszczeń czystychFisher Scientific19-120-3217
Czynnik von Willebranda, ludzkie osoczeMillipore Sigma681300
YOYO-1 BarwnikAAT Bioquest17580
Rurka o średnicy wewnętrznej 0,25 mmCole-ParmerEW-06419-00
Igła o rozmiarze 25Thomas ScientificJG2505X

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
  2. Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
  3. LeDuc, P., Haber, C.,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopyShear FlowSingle MoleculeMicrofluidic ChannelsTotal Internal ReflectionConfocal MicroscopyVon Willebrand FactorLambda DNABiotin StreptavidinSyringe Pump

Related Articles