Method Article

Charakterystyka zmian konformacyjnych pojedynczych cząsteczek pod wpływem przepływu ścinającego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

DOI:

10.3791/60784

⸱

January 25th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Lehigh University, 2Department of Materials Science and Engineering, Lehigh University, 3Department of Chemistry, Lehigh University, 4Department of Mechanical Engineering and Mechanics, Lehigh University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół do unieruchamiania pojedynczych makrocząsteczek w urządzeniach mikroprzepływowych i ilościowego określania zmian w ich konformacji pod wpływem przepływu ścinającego. Protokół ten jest przydatny do charakteryzowania właściwości biomechanicznych i funkcjonalnych biomolekuł, takich jak białka i DNA, w środowisku przepływu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zachowanie pojedynczej cząsteczki pod wpływem zakłóceń mechanicznych zostało szeroko scharakteryzowane, aby zrozumieć wiele procesów biologicznych. Jednak metody takie jak mikroskopia sił atomowych mają ograniczoną rozdzielczość czasową, podczas gdy rezonansowy transfer energii Förstera (FRET) pozwala jedynie na wnioskowanie o konformacjach. Z drugiej strony mikroskopia fluorescencyjna umożliwia wizualizację in situ pojedynczych cząsteczek w czasie rzeczywistym w różnych warunkach przepływu. Nasz protokół opisuje kroki w celu uchwycenia zmian konformacyjnych pojedynczych biomolekuł w różnych środowiskach przepływu ścinającego za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Przepływ ścinający jest wytwarzany w kanałach mikroprzepływowych i kontrolowany przez pompę strzykawkową. Jako demonstracja metody, czynnik von Willebranda (VWF) i DNA lambda są znakowane biotyną i fluoroforem, a następnie unieruchamiane na powierzchni kanału. Ich konformacje są stale monitorowane przy zmiennym przepływie ścinającym przy użyciu całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Odwracalna dynamika rozplątywania VWF jest przydatna do zrozumienia, w jaki sposób jego funkcja jest regulowana w ludzkiej krwi, podczas gdy konformacja DNA lambda oferuje wgląd w biofizykę makrocząsteczek. Protokół może być również szeroko stosowany do badania zachowania polimerów, zwłaszcza biopolimerów, w różnych warunkach przepływu oraz do badania reologii złożonych płynów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mechanizmy reakcji biomolekuł na bodźce środowiskowe były szeroko badane. W szczególności w środowisku przepływowym siły ścinające i wydłużające regulują zmiany konformacyjne i potencjalnie funkcję biomolekuł. Typowymi przykładami są indukowane ścinaniem rozplątywanie DNA lambda i czynnika von Willebranda (VWF). Lambda DNA została wykorzystana jako narzędzie do zrozumienia dynamiki konformacyjnej pojedynczych, elastycznych łańcuchów polimerowych oraz reologii roztworów polimerowych1,2,3,4. VWF to czujnik naturalnego przepływu, który agreguje płytki krwi w miejscach ran naczyń krwionośnych o nieprawidłowym tempie ścinania i wzorcach przepływu. Rozwikłanie VWF jest niezbędne do aktywacji wiązania płytek krwi z domeną A1 i wiązania kolagenu z domeną A3. Ponadto, rozwijanie domeny A2 wywołane wysokim ścinaniem umożliwia rozszczepienie VWF, które reguluje jego rozkład masy cząsteczkowej w krążeniu5,6. W związku z tym bezpośrednia wizualizacja tego, jak te cząsteczki zachowują się pod wpływem przepływu, może znacznie poszerzyć naszą podstawową wiedzę na temat ich biomechaniki i funkcji, co z kolei może umożliwić nowe zastosowania diagnostyczne i terapeutyczne.

Typowe metodologie do charakteryzowania konformacji pojedynczych cząsteczek obejmują pęsetę optyczną/magnetyczną, mikroskopię sił atomowych (AFM) i transfer energii rezonansu Förstera (FRET)7. Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek jest potężnym narzędziem do badania siły i ruchu związanych ze zmianami konformacyjnymi biomolekuł. Brakuje mu jednak możliwości mapowania ogólnych konformacji molekularnych8. AFM jest zdolny do obrazowania z wysoką rozdzielczością przestrzenną, ale ma ograniczoną rozdzielczość czasową9,10. Ponadto kontakt między końcówką a próbką może zakłócić reakcję wywołaną przepływem. Inne metody, takie jak analiza FRET i nanoporów, określają stany fałdowania i rozwijania białek pojedynczych cząsteczek na podstawie wykrywania odległości wewnątrzcząsteczkowej i objętości wykluczonych. Jednak metody te są wciąż w powijakach i ograniczone w bezpośredniej obserwacji konformacji pojedynczych cząsteczek11,12,13,14.

Z drugiej strony, bezpośrednia obserwacja makromolekuł z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną pod mikroskopią fluorescencyjną poprawiła nasze zrozumienie dynamiki pojedynczych cząsteczek w wielu procesach biologicznych15,16. Na przykład Fu i wsp. po raz pierwszy osiągnęli jednoczesną wizualizację wydłużenia VWF i wiązania receptorów płytkowych. W swojej pracy cząsteczki VWF zostały unieruchomione na powierzchni kanału mikroprzepływowego poprzez interakcje biotyna-streptawidyna i zobrazowane pod mikroskopią fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) w różnych środowiskach przepływu ścinającego17. Stosując podobną metodę jak Fu, wykazaliśmy tutaj, że konformacje VWF i lambda DNA można bezpośrednio zaobserwować zarówno w TIRF, jak i konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Jak pokazano na rysunku Rysunek 1, urządzenia mikroprzepływowe są używane do tworzenia i kontrolowania przepływu ścinającego, a biomolekuły są unieruchomione na powierzchni kanału. Po zastosowaniu różnych szybkości ścinania, konformacje tej samej cząsteczki są rejestrowane w celu zmierzenia długości rozciągnięcia, pokazanej również na Rysunek 1. Metoda ta może być szeroko stosowana do badania innych zachowań polimerów w złożonych środowiskach przepływu, zarówno w badaniach reologicznych, jak i biologicznych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie VWF

  1. Należy rozpuścić VWF w ludzkim osoczu, aby przygotować je do reakcji znakowania. Dodać 100 μl wody dejonizowanej (DI) do 100 μg liofilizowanego VWF, aby uzyskać roztwór podstawowy VWF o stężeniu 1 mg/mL.
  2. Dializować roztwór podstawowy VWF w celu usunięcia nadmiaru glicyny, zwiększając w ten sposób skuteczność znakowania biotyny i fluoroforu.
    1. Przenieść 50 μl roztworu podstawowego VWF do jednostki dializacyjnej o pojemności 0,1 ml z odcięciem 10 000 mas cząsteczkowych i zamknąć nakrętką. Pozostały roztwór podstawowy należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Zapas VWF będzie stabilny przez okres do 1 roku w temperaturze -20 °C.
    2. Przeprowadzić dializę w 500 ml 1x sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) (0,01 M fosforanu disodowego, 0,0018 fosforanu monopotasowego, 0,0027 M chlorku potasu, 0,137 M chlorku sodu, pH 7,4 w 25 °C) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, powoli mieszając. Powtarzaj dializę przez dodatkową godzinę, używając 500 ml świeżego PBS.
  3. Rozpocznij reakcję znakowania biotyny. Przygotować 2 mM roztwór NHS-PEG 4-biotyny, rozpuszczając ciało stałe w wodzie DI bezpośrednio przed reakcją. Pozostawienie 4-biotyny NHS-PEG w wodzie przez dłuższy czas spowoduje hydrolizę grupy estrów NHS, zmniejszając w ten sposób skuteczność etykietowania.
    1. Dodać 2,5 μl2 mM NHS-PEG 4-biotyny do jednostki dializacyjnej zawierającej roztwór podstawowy VWF. Spowoduje to 20-krotny molowy nadmiar biotyny w porównaniu z monomerami VWF. Pierwszorzędowe aminy VWF będą reagować z grupami estrowymi NHS, wiążąc się w ten sposób kowalencyjnie z grupami PEG 4-biotyny poprzez wiązania amidowe.
    2. Umieść jednostkę dializacyjną w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Uszczelnić jednostkę dializacyjną odpowiednią nasadką. Zabezpiecz zestaw do dializy przez rurkę za pomocą Parafilm. Trzymaj w pozycji pionowej i pozostaw w temperaturze pokojowej na 40 minut.
  4. Rozpocznij reakcję znakowania fluoroforem. Przygotować 2,8 mM roztwór barwnika fluorescencyjnego Alexa 488 tetrafluorofenylowego estru (ester TFP) (maks. wzbudzenia = 498 nm,maksimum emisji = 519 nm) przez rozpuszczenie stałego fluoroforu w wodzie DI. Zrób to bezpośrednio przed reakcją, aby zapobiec hydrolizie grupy estrowej TFP.
    1. Dodać 2,9 μl fluoroforu 2,8 mM 488 do jednostki dializy. Spowoduje to 34-krotny molowy nadmiar fluoroforu w porównaniu z monomerami VWF. Pozostałe pierwszorzędowe aminy VWF będą reagować z grupami estrowymi TFP, wiążąc się w ten sposób kowalencyjnie z fluoroforami poprzez wiązania amidowe.
    2. Dodać 2,0 μl 1 M wodorowęglanu sodu (rozpuszczonego w wodzie demineralizowanej) do jednostki dializy. To dostosowuje pH reakcji bliżej 8,0, co zwiększa wydajność reakcji estru TFP i pierwszorzędowej aminy.
    3. Zabezpieczyć jednostkę dializy w probówce mikrowirówkowej, tak jak w kroku 1.3.2. Przechowywać w ciemności, aby zapobiec fotowybielaniu i pozostawić w temperaturze pokojowej na 1 h i 30 min.
  5. Umieścić jednostkę dializy w 900 ml 1x sterylnego PBS i dializować przez noc w temperaturze 4 °C. W ten sposób uzyska się około 70 μl znakowanego VWF o stężeniu 0,71 mg/ml lub 2,84 μM (stężenie monomeru).
  6. Przenieść oznakowany VWF do probówki mikrowirówkowej. Przykryj rurkę folią aluminiową i chroń przed światłem. Przechowywać w temperaturze 4 °C. W przypadku długotrwałego przechowywania należy dodać środek przeciwdrobnoustrojowy azydek sodu do końcowego stężenia 0,02% (w/v).
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

2. Przygotowanie DNA Lambda

  1. Biotynyluj liniowe lambda DNA, wypełniając jego spójne miejsca końcowe (miejsca cos) nukleotydami biotyny-14-dCTP zgodnie ze standardowymi protokołami, powtórzonymi tutaj w kroku 2.118. Wypełnij pozostałe miejsca cos nukleotydami dATP, dTTP i dGTP.
    1. Przygotować 1 mM roztwory dATP, dTTP, dGTP i biotyny-14-dCTP w 10x buforze reakcyjnym (500 mM chlorek sodu, 100 mM chlorowodorek tris, 100 mM chlorek magnezu, 10 mM ditiotreitol, pH 7,9 w 25 °C).
    2. Umieścić 48 μl 500 ng/μl lambda DNA w probówce do PCR i podgrzewać przez 5 minut w temperaturze 65 °C. Miejsca cos okrągłego DNA lambda rozdzielą się pod wpływem ciepła, linearyzując cząsteczkę i sprawiając, że jednoniciowe zwisy będą gotowe do biotynylacji. Natychmiast po tym umieść na lodzie, aby zapobiec ponownemu wyżarzaniu witryn cos.
    3. Dodać 5 μl 1 mM dATP, dTTP i dGTP oraz 4 μl 1 mM biotyny-14-dCTP do DNA lambda. Dodaj również 2,5 μl 5 U/μL fragmentu Klenowa (3'à5' egzo-), aby katalizować syntezę DNA.
    4. Mieszaninę reakcyjną inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    5. Dodać 1,2 μl 0,5 M EDTA. Następnie podgrzewać mieszaninę reakcyjną przez 5 minut w temperaturze 70 °C. Spowoduje to dezaktywację fragmentu Klenowa i reakcję biotynylacji.
  2. Usuń nadmiar nukleotydów z DNA lambda za pomocą kolumny wirowej, która może pomieścić 10-70 μl i ma granicę masy cząsteczkowej 6,000.
    1. Umieść kolumnę w probówce do mikrowirówek o pojemności 2 ml. Odwirować kolumnę i probówkę o stężeniu 1000 x g przez 2 minuty. Usunąć przepływ, który zbiera się w probówce.
    2. Zastąp bufor kolumnowy roztworem 1x tego samego buforu reakcyjnego z kroku 2.1.1. W tym celu należy dodać do kolumny 500 μl buforu 1x. Wirować przez 1 minutę przy 1000 x g. Usunąć przepływ. Powtórz te czynności jeszcze 2 razy, aby do kolumny dodano łącznie 1500 μl.
    3. Umieść kolumnę w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Ostrożnie dodaj roztwór z kroku 2.1.5 do górnej warstwy kolumny. Wirować przez 4 minuty przy 1000 x g.
    4. Zebrać płyn przepływowy (40-70 μl) z probówki do mikrowirówki i umieścić w probówce do PCR. Zawiera on oczyszczone, biotynylowane DNA lambda.
  3. Oznacz DNA lambda barwnikiem fluorescencyjnym YOYO-1 (maksimum wzbudzenia = 490 nm,maksimum emisji = 509 nm) zgodnie ze standardowymi protokołami, powtórzonymi tutaj w kroku 2.3.120.
    1. Przygotuj roztwór barwnika YOYO-1 i lambda DNA o stosunku molowym barwnika do pary zasad 1:10. Załóżmy, że żadne DNA nie zostało utracone na etapie oczyszczania, aby obliczyć stężenie par zasad DNA lambda. DNA lambda na całej długości ma 48 502 par zasad.
      UWAGA: Na przykład, jeśli 50 μl roztworu zostało odzyskane z kroku 2.2.4, dodaj 7,4 μl 500 μM barwnika YOYO-1.
    2. Podgrzewać roztwór przez 2 godziny w temperaturze 50 °C w ciemności, aby zakończyć reakcję.
    3. Przykryj rurkę folią aluminiową i chroń przed światłem. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Roztwór jest teraz gotowy do wstrzyknięcia do urządzeń mikroprzepływowych.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

3. Tworzenie mikroprzepływowych form kanałowych w płytce krzemowej

  1. Użyj fotolitografii, aby stworzyć kanały mikroprzepływowe o odpowiednich wymiarach (Rysunek 2) na głównej płytce krzemowej zgodnie ze standardowymi protokołami19.

4. Przygotowanie urządzenia mikroprzepływowego z polidimetylosiloksanu (PDMS)

  1. Dodaj 5 części bazy z elastomeru silikonowego do 1 części utwardzacza (masowo) w łódce wagowej. Dokładnie mieszaj zawartość przez 1 minutę, aby uzyskać wstępnie utwardzony roztwór PDMS.
  2. Umieść główną płytkę krzemową na plastikowej szalce Petriego. Wlej roztwór PDMS na wafel, aby utworzyć warstwę o grubości 5 mm. Przykryj naczynie i pozostaw w eksykatorze pod próżnią na 1 godzinę w celu usunięcia pęcherzyków powietrza.
  3. Inkubować przykrytą szalkę Petriego w temperaturze 60 °C przez noc, aby utwardzić PDMS do postaci elastycznego ciała stałego. Utwardzanie spowoduje uformowanie kanałów mikroprzepływowych w PDMS na granicy faz PDMS.
  4. Wytnij prostokąty o wymiarach 20 x 10 mm w PDMS, wokół każdego kanału mikroprzepływowego, za pomocą brzytwy. Usuń prostokątne bloki PDMS za pomocą pęsety.
  5. Użyj igły o końcu 25 G z zaostrzonymi krawędziami, aby wybić otwór o średnicy 0,5 mm na jednym końcu kanału, upewniając się, że otwór przechodzi całkowicie przez blok PDMS (Rysunek 2). Użyj cienkiej igły, aby wyciąć PDMS z otworu. Powtórz to na drugim końcu kanału. Stworzy to wlot i wylot dla przepływu przez kanał.
  6. Oczyść powierzchnię bloku PDMS za pomocą winylowej taśmy do pomieszczeń czystych. Przedmuchaj sprężony azot na szkiełko nakrywkowe nr 1 1/2 22 x 50 mm, aby usunąć zanieczyszczenia.
  7. Umieść blok PDMS kanałem do góry i szkiełkiem nakrywkowym w komorze spawarki plazmowej. Rozpocznij kurację.
  8. Po zakończeniu leczenia szybko umieść blok PDMS na szkiełku nakrywkowym, tak aby kanał stykał się z szkiełkiem. Zastosuj nacisk wzdłuż krawędzi bloku. Umieść zestaw Coverslip-PDMS na płycie grzejnej w temperaturze 115 °C na 15 minut, aby wzmocnić trwałe połączenie.
  9. Włóż rurkę o długości 10 cm i średnicy wewnętrznej 0.25 mm do otworu wylotowego w górnej części bloku PDMS. Pozwala to na łatwy wypływ płynu z kanału. Urządzenie jest teraz kompletne.

5. Obróbka powierzchni urządzenia mikroprzepływowego

  1. Wstrzyknąć <10 μl biotynylowanej albuminy surowicy bydlęcej (BSA-biotyny) rozpuszczonej w sterylnym 1x PBS do wlotu urządzenia mikroprzepływowego do eksperymentów VWF. Wstrzyknąć <10 μl 1 mg/ml biotyny BSA do eksperymentów z lambda DNA. Po wstrzyknięciu należy wstrzymać kilka mikrolitrów biotyny BSA w końcówce pipety i pozostawić końcówkę do osadzenia we wlocie.
    1. Zawsze utrzymuj kroplę wody DI wokół końcówki. Zapobiegnie to przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do kanału. Tę technikę należy stosować za każdym razem, gdy nowy roztwór jest wstrzykiwany do kanału.
    2. Pozostawić biotynę BSA do inkubacji w urządzeniu przez 2 godziny. BSA niespecyficznie wiąże się z powierzchnią szkiełka nakrywkowego (Rysunek 3A).
  2. Zdejmij końcówkę pipety. Wstrzyknąć <10 μl roztworu blokującego kazeinę do kanału i pozostawić do inkubacji przez 30 minut. Kazeina zablokuje wszelkie wolne miejsca, redukując niespecyficzne wiązanie biomolekuł z powierzchnią (Rysunek 3B).
  3. Zdjąć końcówkę i wstrzyknąć <10 μl 10 μg/ml streptawidyny rozpuszczonej w sterylnym 1x PBS do kanału do eksperymentów VWF. Użyj 100 μg/ml streptawidyny do eksperymentów z lambda DNA. Inkubować przez 10 minut. Streptawidyna wiąże się z grupami biotyny biotyny BSA-biotyny (Rysunek 3C).
  4. Zdejmij końcówkę i wstrzyknij <10 μl 1x roztworu detergentu (0,05% Tween 20 w PBS) do kanału, aby zmyć nadmiar streptawidyny.
  5. Zdjąć końcówkę i wstrzyknąć <10 μl VWF o stężeniu 28,4 nM rozcieńczonego w roztworze kazeiny lub DNA lambda z kroku 2.3.3. Inkubować VWF przez 3 minuty. Inkubuj DNA lambda przez 45 minut (Rysunek 3D).
  6. Zdjąć końcówkę i wstrzyknąć <10 μl 5 mM wolnej biotyny rozcieńczonej w roztworze kazeiny. Wolna biotyna blokuje nadmiar miejsc wiązania streptawidyny na powierzchni kanału (Rysunek 3E).

6. Wizualizacja VWF i DNA Lambda pod mikroskopią fluorescencyjną

  1. Przygotować 1 ml roztworu blokującego kazeinę z 2,2 mM kwasu protokatechowego i 37 nM protokatechuiano-3,4-dioksygenazy (w celu zminimalizowania fotowybielania). Załadować do strzykawki i zamocować w pompie strzykawkowej. Weź rurkę o długości 30 cm i średnicy wewnętrznej 0,25 mm i przymocuj jeden koniec do igły strzykawki. Wlej roztwór, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Podłącz drugi koniec rurki do wlotu urządzenia mikroprzepływowego. Zaleca się to zrobić 3 minuty po kroku 5.6.
  2. Wybierz obiektyw o największym powiększeniu (tj. 60-100X) mikroskopu całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) lub konfokalnego mikroskopu fluorescencyjnego. W razie potrzeby dodaj kroplę olejku immersyjnego na jego cel. Umieść urządzenie mikroprzepływowe na stoliku mikroskopu tak, aby szkiełko nakrywkowe zlicowało się z obiektywem.
  3. Rozpocznij mikroskopię jasnego pola. Dostosuj ostrość tak, aby wszystkie obiekty, takie jak zanieczyszczenia i bąbelki, były widoczne. Następnie wyreguluj stolik w kierunku X i Y, aż krawędź kanału mikroprzepływowego będzie widoczna i przetnie ramkę na pół.
  4. Przełącz na kanał 488 (FITC). Dostosuj poziom Z i kąt TIRF zgodnie z potrzebami, aż będzie można rozróżnić poszczególne zielone, kuliste cząsteczki. Są to cząsteczki VWF lub lambda DNA.
  5. Dostosuj czas ekspozycji i intensywność lasera, aby uwidocznić cząsteczki fluorescencyjne bez ich zbyt szybkiego fotowybielania. Dostosuj kontrast, aby wyraźniej uwidocznić cząsteczki.
  6. Rozpocząć przepływ z pompy strzykawkowej tak, aby roztwór blokujący kazeinę spływał do kanału i wychodził z wylotu. Zrób to dokładnie 5 minut po kroku 5.6. Zatrzymaj i rozpocznij przepływ, aby obserwować zmiany w konformacji cząsteczek. Przy stosowaniu przepływu należy stosować dawki od 5 000 do 30 000 μl/h. Powtórz to w różnych obszarach urządzenia mikroprzepływowego. Kontynuuj ten proces, aby zlokalizować cząsteczki, które mogą rozszerzać się i rozluźniać po wielu cyklach zatrzymywania i rozpoczynania przepływu.
  7. Zwróć uwagę, ile czasu potrzeba, aby cząsteczki osiągnęły maksymalną rozciągłość i całkowicie zrelaksowały się w kuleczkach. Nagrywaj filmy przedstawiające ciągłe zachowanie cząsteczek pod wpływem przepływu ścinającego, wybierając najlepszy czas ekspozycji, częstotliwość ekspozycji i czas trwania wideo, które uchwycą pełny zakres zachowania rozciągającego i zminimalizują fotowybielanie.
  8. Zapisz filmy jako pliki .AVI za pomocą scalebar.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

7. Analiza obrazu zmian konformacyjnych

  1. Oblicz szybkość ścinania ścianek (figure-protocol-1) zastosowana do makrocząsteczek za pomocą natężenia przepływu (Q) oraz wysokości (h) i szerokości (w) prostokątnego kanału mikroprzepływowego. Aby to zrobić, użyj następującego równania:
    figure-protocol-2
  2. Określ długość dowolnej biomolekuły przy różnych szybkościach ścinania za pomocą dostosowanego kodu MATLAB (patrz Pliki uzupełniające). Utwórz folder zatytułowany analiza wideo, który zawiera następujące kody MATLAB: main.m, save_each_frame.m, get_length.m i get_length.fig. Utwórz podfolder w analizie filmów zatytułowany filmy i dodaj do niego .AVI pliki do analizy.
  3. Otwórz main.m przy użyciu programu MATLAB 2019a i uruchom kod. Wpisz nazwę pliku wideo, który ma zostać przeanalizowany, w oknie poleceń w obszarze Wprowadź plik danych do analizy:.
  4. W otwartym graficznym interfejsie użytkownika (GUI) ustaw próg (tekst w polu w prawym górnym rogu okna) na 20 i kliknij przycisk Ustaw próg, aby potwierdzić.
  5. Użyj kursora danych na górnym pasku narzędzi okna, aby wybrać jeden piksel w dowolnym miejscu na pasku skali. Kliknij przycisk Punkt początkowy w sekcji Pasek skali po prawej stronie okna. Pozycja (x,y) wybranego piksela pojawi się po prawej stronie przycisku. Kliknij przycisk Rozmiar piksela (μm). Rozmiar piksela musi być mierzony tylko raz w każdym filmie.
  6. Wybierz dowolny piksel na interesującej Cię cząsteczce. Kliknij Punkt początkowy w sekcji VWF. Po wyświetleniu pozycji wybranego piksela w polu tekstowym po prawej stronie, kliknij Lewy koniec, Prawy koniec i Długość ciągu, aby uzyskać długość cząsteczki na obrazie.
    UWAGA: Ten krok można wykorzystać do analizy zmian konformacyjnych dowolnej biocząsteczki, mimo że kod ma określoną sekcję o nazwie VWF.
  7. Dokładnie sprawdź lewy i prawy koniec cząsteczki. Powiększ i użyj kursora danych, aby sprawdzić pozycję pikseli, które Cię interesują. Ręcznie wybierz piksel jako koniec i ponownie oblicz długość (w pikselach), jeśli to konieczne.
  8. Zapisz rozmiar piksela w μm i długość ciągu w liczbie pikseli w arkuszu Excela i oblicz długość ciągu w μm.
  9. Powtórz powyższe kroki dla każdego obrazu. Użyj przycisku Ostatni, Następny w prawym dolnym rogu graficznego interfejsu użytkownika, aby przełączać się między obrazami w tym samym pliku wideo. Kliknij Zamknij, aby zamknąć okno GUI.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obserwacja dynamicznego zachowania biomolekuł, takich jak VWF i lambda DNA, jest wysoce zależna od optymalizacji ich wiązania z powierzchnią urządzenia. Inkubacja obróbki powierzchni przez zalecany czas w urządzeniu mikroprzepływowym ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wiązania z kilkoma punktami zakotwiczenia, tak aby cząsteczki mogły swobodnie rozciągać się i rozluźniać przy zmianie przepływu. Jeśli białka lub DNA są zbyt silnie związane wieloma wiązaniami, będą albo rozciągać się na ograniczoną długość, albo w ogóle s...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby uzyskać wysokiej jakości dane dotyczące zmian konformacyjnych pojedynczej cząsteczki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, jak opisano w tej metodzie, kluczowe znaczenie ma inkubacja cząsteczki przez odpowiedni czas, zminimalizowanie jej niespecyficznych interakcji z powierzchnią i ustalenie ustawień mikroskopu, które zmniejszają fotowybielanie. Zdolność cząsteczki do swobodnej zmiany konformacji jest związana z liczbą oddziaływań biotyna-streptawidyna powstałych między cząsteczką a powierzchnią. Jak wspomniano wcz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez grant Narodowej Fundacji Nauki DMS-1463234, granty National Institutes of Health HL082808 i AI133634 oraz wewnętrzne fundusze Lehigh University.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Zestaw do etykietowania Alexa Fluor 488InvitrogenA30006
Bio-Spin P-6 Kolumny żeloweBio-Rad7326221
BiotynaSigma-AldrichB4501Stosować jako wolną biotynę w kroku 5.6
Biotyna-14-dCTPAAT Bioquest17019
BSA-BiotynaSigma-AldrichA8549
Szkiełka nakrywkoweVWR48393-195No. 1 ½, 22 x 50 mm
dNTP ZestawInvitrogen10297018
Boje pływakowe do mini urządzenia do dializyThermo Scientific69588
Fragment Klenowa (3'→ 5' egzo-)New England BioLabsM0212SUżyj do 10-krotnego buforu reakcyjnego w kroku 2.1.1 i 1-krotnego bufora reakcyjnego w kroku 2.2.2
Lambda DNANew England BioLabsN3011S
Mini urządzenie do dializyThermo Scientific6957010K MWCO, objętość 0,1 ml
NEBuffer 4New England BioLabsB7004S
NHS-PEG4-BiotinThermo Scientific21330
Protokatechuat 3,4-dioksygenazySigma-AldrichP8279
Kwas protokatechowySanta Cruz Biotechnologysc-205818
Zestaw elastomerów silikonowych do produkcji PDMSFirma chemiczna Dow4019862
StreptawidynaSigma-Aldrich85878
Roztwór blokującyCANDOR Bioscience110 050Stosować jako roztwór blokujący kazeinę w całym protokole
Taśma winylowa do pomieszczeń czystychFisher Scientific19-120-3217
Czynnik von Willebranda, ludzkie osoczeMillipore Sigma681300
YOYO-1 BarwnikAAT Bioquest17580
Rurka o średnicy wewnętrznej 0,25 mmCole-ParmerEW-06419-00
Igła o rozmiarze 25Thomas ScientificJG2505X

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
  2. Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
  3. LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow. Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).
  4. Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kröger, M., Bausch, A. R. Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime. ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).
  5. Springer, T. A. Biology and physics of von Willebrand factor concatamers. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).
  6. Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
  7. Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).
  8. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  9. Siedlecki, C. A., et al. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).
  10. Roiter, Y., Minko, S. AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains. Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).
  11. Aznauryan, M., et al. Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).
  12. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  13. Howorka, S., Siwy, Z. Nanopore analytics: sensing of single molecules. Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).
  14. Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).
  15. Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
  16. Xia, T., Li, N., Fang, X. H. Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).
  17. Fu, H., et al. Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation. Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).
  18. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules. Science. 271 (5250), 795-799 (1996).
  19. Wang, Y., et al. Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor. Biophysical Journal. 116 (11), 29092(2019).
  20. Carlsson, C., Johnsson, M., Åkerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).
  21. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: Novel tools for imaging protein–nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  22. Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopyShear FlowSingle MoleculeMicrofluidic ChannelsTotal Internal ReflectionConfocal MicroscopyVon Willebrand FactorLambda DNABiotin StreptavidinSyringe Pump

Related Articles