Artykuł metodologiczny

Wizualizacja i analiza tętnic łukowych gardła z wykorzystaniem immunohistochemii całego montażu i rekonstrukcji 3D

DOI:

10.3791/60797

⸱

31 marca 2020

 , 
1Department of Cell Biology and Molecular Medicine, New Jersey Medical School, Rutgers Biomedical and Health Sciences, 2Multidisciplinary PhD Program in Biomedical Sciences: Cell Biology, Neuroscience and Physiology Track, New Jersey Medical School, Rutgers Biomedical and Health Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji i analizy tętnic łuku gardłowego 3, 4 i 6 zarodków myszy za pomocą immunofluorescencji całego montażu, oczyszczania tkanek, mikroskopii konfokalnej i rekonstrukcji 3D.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niewłaściwe tworzenie lub przebudowa tętnic łuku gardłowego (PAA) 3, 4 i 6 przyczyniają się do niektórych z najcięższych form wrodzonych wad serca. Aby zbadać powstawanie PAA, opracowaliśmy protokół wykorzystujący immunofluorescencję całej góry w połączeniu z oczyszczaniem tkanek alkoholu benzylowego / benzoesanu benzylu (BABB) i mikroskopią konfokalną. Pozwala to na wizualizację śródbłonka łuku gardłowego w drobnej rozdzielczości komórkowej, a także łączność 3D naczyń krwionośnych. Korzystając z oprogramowania, opracowaliśmy protokół ilościowego określania liczby komórek śródbłonka (EC) w PAA, a także liczby EC w splocie naczyniowym otaczającym PAA w łukach gardłowych 3, 4 i 6. Metodologia ta, zastosowana do całego zarodka, zapewnia kompleksową wizualizację i analizę ilościową unaczynienia zarodka.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas embriogenezy myszy, tętnice łukowate gardła (PAA) powstają jako symetryczne, obustronne pary tętnic, które łączą serce z aortą grzbietową1. W miarę rozwoju zarodka pierwsza i druga para PAA ulegają regresji, podczas gdy 3., 4. i 6. PAA przechodzą serię asymetrycznych zdarzeń przebudowy, tworząc tętnice łuku aorty2.

PAA 3, 4 i 6 rozwijają się poprzez waskulogenezę, która jest tworzeniem naczyń krwionośnych de novo3. Wady w tworzeniu lub przebudowie tych tętnic łukowych powodują różne wrodzone wady serca, takie jak te obserwowane u pacjentów z zespołem DiGeorge'a4,5. Dlatego zrozumienie mechanizmów regulujących rozwój PAA może prowadzić do lepszego zrozumienia etiologii wrodzonych wad serca (CHD).

Obecne podejścia do wizualizacji i analizy rozwoju PAA obejmują immunofluorescencję skrawków tkanek, odlewy naczyniowe, wstrzykiwanie tuszu indyjskiego, mikroskopię episkopową o wysokiej rozdzielczości i/lub immunohistochemię całej góry1,4,5,6,7. W tym artykule opisujemy protokół łączący immunofluorescencję z całą mocą, mikroskopię konfokalną i renderowanie obrazów 3D w celu gromadzenia, analizy i ilościowego określania danych wolumetrycznych, połączeń naczyniowych i tożsamości komórek. Ponadto szczegółowo opisujemy metodę podziału i ilościowego określania liczby EC w każdym łuku gardłowym jako sposób na badanie powstawania splotu naczyniowego łuku gardłowego i jego przebudowy w PAA. Chociaż protokół ten jest przeznaczony do analizy rozwoju PAA, może być używany do analizy innych rozwijających się sieci naczyniowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie zwierząt i procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Rutgers.

1. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotować 1 l soli fizjologicznej buforowanej fosforanami z 0,1% Triton-X-100 (PBST) i wysterylizować filtrem. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) przez co najmniej rok.
  2. Przygotować 600 μl buforu blokującego składającego się z 10% normalnej surowicy osła w PBST. Spraw, aby to rozwiązanie było świeże za każdym razem.
  3. Przygotować 50 ml następujących rozcieńczeń metanolu (MeOH) w okapie przepływowym: 25% MeOH w wodzie dejonizowanej (dH2O), 50% MeOH w dH2O i 75% MeOH w dH2O. Wir do wymieszania. Sklep w RT.
  4. Przygotować 50 ml następujących roztworów alkoholu benzylowego i benzoesanu benzylu (BABB) w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml.
    1. Aby uzyskać 100% BABB, dodaj 32 ml benzoesanu benzylu do 16 ml alkoholu benzylowego (stosunek 2:1 objętość do objętości).
    2. Aby uzyskać 50% BABB, dodaj 16 ml benzoesanu benzylu i 8 ml alkoholu benzylowego do 24 ml MeOH.
    3. Przykryj stożkowe rurki folią aluminiową, aby chronić przed światłem. Roztwory te mogą być przechowywane w RT przez okres do roku.
      ostrożność: BABB jest toksyczny i. Należy się z nim obchodzić i utylizować zgodnie z kartą charakterystyki.

2. Sekcja i utrwalenie zarodka

UWAGA: Ten protokół jest odpowiedni dla zarodków myszy E9.5 i E10.5 (męskich lub żeńskich) wyizolowanych z dowolnego szczepu myszy. W przypadku młodszych i starszych zarodków czas inkubacji powinien być określony doświadczalnie, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu sygnału fluorescencji.

  1. Napełnij jedną szalkę Petriego o średnicy 35 mm i jedną szalkę Petriego o średnicy 60 mm 1x PBS i umieść na lodzie, aż będzie potrzebna.
  2. Poddaj eutanazji ciężarną mysz poprzez wdychanie CO2 . Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy jako drugorzędny środek eutanazji.
  3. Oczyść okolice brzucha zapory 70% etanolem. Uszczypnij obszar brzucha za pomocą kleszczy i wykonaj nacięcie w kształcie litery V za pomocą nożyczek chirurgicznych, zaczynając od podstawy ściany brzucha w linii środkowej; Kontynuuj otwieranie jamy klatki piersiowej. Podnieś tkankę brzuszną i przesuń jelita na bok, aby odsłonić rogi macicy.
  4. Wykonaj nacięcie u podstawy kanału pochwy i za pomocą kleszczy odciągnij macicę od tamy. Wykonaj dodatkowe nacięcie przy każdym jajniku, aby uwolnić macicę. Przenieść macicę na jedną z 60-milimetrowych szalek Petriego zawierających zimny 1x PBS.
  5. Za pomocą prostych nożyczek przetnij ścianę macicy między każdym miejscem implantacji. Pobrać decidua za pomocą szklanej pipety i przenieść na szalkę Petriego o średnicy 35 mm z 1x PBS. Pod mikroskopem preparacyjnym włóż proste nożyczki w przestrzeń między decidua a ścianą macicy. Wytnij i usuń ścianę macicy.
  6. Za pomocą cienkich kleszczy usuń błony decidua i Reicherta z zarodka, ostrożnie wykonując poprzeczne nacięcia wzdłuż tkanki i odciągając tkankę od woreczka żółtkowego. Usunąć woreczek żółtkowy i woreczek owodniowy, ostrożnie odciągając tkankę od zarodka i wykonując nacięcia w miejscu oliganty i żyły pępowinowej.
    UWAGA: Woreczki żółtkowe mogą być używane do genotypowania zarodków.
  7. Przenieś każdy zarodek za pomocą szklanej pipety do oddzielnych probówek o pojemności 2 ml wypełnionych 1 ml 1x PBS. Oznacz każdą probówkę unikalnym identyfikatorem.
  8. Aby utrwalić zarodki, ostrożnie usuń 1x PBS i dodaj 4% roztwór paraformaldehydu (PFA) do 1x PBS. Inkubować w temperaturze 4 °C z delikatnym mieszaniem przez noc.
    UWAGA: Wiązanie 4% PFA jest odpowiednie dla przeciwciał wymienionych w tym protokole. Jednak procedury utrwalania powinny być zoptymalizowane pod kątem dodatkowych przeciwciał.

3. Barwienie zarodków

UWAGA: W tej sekcji zarodki są przenikane i barwione pierwotnymi i drugorzędowymi przeciwciałami. Ponieważ rozwój PAA postępuje szybko, różnice w stadium embrionalnym będą miały duży wpływ na dalszą analizę. Dlatego zarodki muszą być dopasowane pod względem wieku poprzez staranne liczenie somitów, aby dopasować je do par kontrolnych i zmutowanych przed dalszymi manipulacjami.

  1. Aby umyć zarodek(i), ostrożnie usuń 4% PFA i dodaj 1x PBS. Delikatnie odwróć rurkę (rurki) kilka razy. Umieść probówkę (probówki) prawą stroną do góry i pozwól zarodkowi (zarodkom) zatonąć. Powtórz pranie 3 razy. Umieścić probówkę (rurki) z zarodkiem (zarodkami) na lodzie.
    UWAGA: (Opcjonalny punkt zatrzymania) Po przemyciu zarodki mogą być odwadniane w stopniowanych seriach MeOH przez 30 minut na rozcieńczenie, jak w sekcji 1.3, i przechowywane w temperaturze -20 °C w 100% MeOH do późniejszego wykorzystania przez okres do 6 miesięcy.
  2. W przypadku zarodków E10,5 należy użyć szklanej pipety, aby przenieść jeden zarodek na szalkę Petriego o średnicy 35 mm wypełnioną schłodzonym 1x PBS. Ostrożnie uszczypnij zarodek tuż nad tylną kończyną drobnymi kleszczami i wykonaj poprzeczne cięcie, aby usunąć tylną połowę zarodka. Dzięki temu zarodek może leżeć płasko w pozycji strzałkowej dla kroku 4.2. Umieść zarodek z powrotem w probówce o pojemności 2 ml ze świeżym 1x PBS.
    UWAGA: Zarodek kontrolny i zmutowany może być sparowany i wybarwiony tym samym roztworem przeciwciała w jednej probówce, dla kroków od 3.3 do 3.8.
    1. W przypadku barwienia dwóch zarodków razem, odetnij głowę jednego zarodka powyżej pierwszego łuku gardłowego, ściskając cienkimi kleszczami, aby wykonać poprzeczne cięcie. W ten sposób w każdej probówce zostaną rozróżnione zarodki o dwóch różnych genotypach.
  3. Aby przeniknąć zarodek (zarodki), należy wypipetować 1x PBS z probówki, uważając, aby nie dotknąć zarodka (zarodków). Dodać 1 ml PBST. Umieścić probówkę w temperaturze 4 °C z delikatnym mieszaniem przez noc.
    UWAGA: (Opcjonalny punkt zatrzymania) Zarodki można przechowywać w roztworze PBST w temperaturze 4 °C przez kilka dni.
  4. Aby zapobiec nieswoistemu wiązaniu przeciwciał, najpierw usuń PBST z probówki, uważając, aby nie dotknąć zarodka (zarodków). Dodać 600 μl blokującego roztworu buforowego do zarodka(ów). Zablokować zarodek(i) w temperaturze 4 °C z delikatnym mieszaniem przez noc.
    UWAGA: Roztwór blokujący należy odwirować z maksymalną prędkością na wirówce stołowej bezpośrednio przed użyciem w celu usunięcia zanieczyszczeń.
  5. Aby wybarwić i określić ilościowo EC, należy użyć przeciwciał przeciwko VEGFR2 i ERG. Roztwory przeciwciał są wytwarzane w buforze blokującym. Przeciwciało anty-VEGFR2 rozcieńcza się w stosunku 1:200, a przeciwciało ERG rozcieńcza się w stosunku 1:1000,
    UWAGA: Roztwory przeciwciał należy wirować z maksymalną prędkością na wirówce stołowej bezpośrednio przed użyciem w celu usunięcia cząstek stałych.
    1. Aby inkubować zarodek (zarodki) z przeciwciałami pierwszorzędowymi, należy usunąć blokujący roztwór buforowy z probówki, uważając, aby nie dotknąć zarodka (zarodków). Dodać 600 μl roztworu przeciwciał pierwszorzędowych do każdej probówki. Inkubować zarodek(i) w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając przez 4-5 dni.
  6. Aby przemyć zarodek (zarodki) roztworu przeciwciała, należy najpierw wyjąć pierwszorzędowy roztwór przeciwciała z probówki. Płucz zarodek (zarodki) co godzinę 1 ml PBST w temperaturze pokojowej (RT) z delikatnym mieszaniem. Umyć zarodek(i) 4-5 razy w ciągu dnia, a następnie inkubować w temperaturze 4 °C z delikatnym mieszaniem przez noc. Powtórz pranie następnego dnia.
  7. Przygotuj wtórne roztwory przeciwciał, rozcieńczając anty-kozę Alexa Fluor 488 i anty-mysz Alexa Fluor 555 1:300 w buforze blokującym. Rozcieńczyć zapas DAPI w stosunku 1:1000 w buforze blokującym.
    UWAGA: Roztwory przeciwciał muszą być wirowane z maksymalną prędkością na wirówce stołowej bezpośrednio przed użyciem w celu usunięcia cząstek stałych. Ponadto zamiast 488 lub 555 można użyć innych barwników Alexa Fluor.
    1. Aby inkubować zarodek (zarodki) z przeciwciałami drugorzędowymi, należy usunąć PBST z probówki. Do każdej probówki dodać 600 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych. Inkubować zarodek(i) w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając przez 4-5 dni.
  8. Aby przepłukać zarodek (zarodki) roztworu przeciwciała, należy najpierw wyjąć wtórny roztwór przeciwciała z probówki. Płucz zarodek (zarodki) co godzinę 1 ml PBST w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Umyć zarodek(i) 4-5 razy w ciągu dnia, a następnie inkubować w temperaturze 4 °C z delikatnym mieszaniem przez noc. Powtórz pranie następnego dnia.

4. Osadzanie zarodków w agarozie

UWAGA: W sekcji 4, zarodek (zarodki) zostanie osadzony w agarozie. Ten proces osadzania służy dwóm celom: prawidłowej orientacji zarodka przed obrazowaniem oraz pomocy w zlokalizowaniu zarodka po jego oczyszczeniu w BABB (kroki 5.2.2 - 5.3.2).

  1. Przygotuj 200 ml 1% roztworu agarozy, dodając 2 g agarozy do 200 ml dH2O. Kuchenkę mikrofalową, aż cała agaroza się rozpuści.
    UWAGA: Pozostałą agarozę można przechowywać w temperaturze 4 °C i ponownie podgrzać do późniejszego wykorzystania.
  2. Za pomocą plastikowej formy parafinowej i szklanej pipety delikatnie przenieś jeden zarodek do formy. Ostrożnie usuń PBST z zarodka. Umieść zarodek w pozycji strzałkowej. Szybko dodaj do formy około 0,5 ml gorącej agarozy - tylko tyle, aby przykryć zarodek i wypełnić formę. Upewnij się, że zarodek nie jest otoczony pęcherzykami powietrza.
  3. Umieść formę na lodzie i przykryj folią aluminiową, aż agaroza zastygnie.
    UWAGA: Nie dopuścić do wyschnięcia zarodka po usunięciu PBST. Roztwór agarozy musi być wystarczająco ciepły, aby pozostał płynny podczas dodawania do zarodka. Dodaj tylko tyle agarozy, aby pokryć zarodek, ale nie za dużo, w przeciwnym razie będzie to trudne do zobrazowania. Głębia obrazu zależy częściowo od odległości roboczej obiektywu.

5. Odwodnienie i oczyszczanie tkanek

UWAGA: W tej sekcji, zarodek (zarodki) są odwadniane za pomocą serii metanolu, a następnie oczyszczane w rozpuszczalniku organicznym, BABB, i montowane między dwoma szkiełkami nakrywkowymi oddzielonymi gumową przekładką; w tym protokole stosowane są gumowe przekładki Fast Well. Zderzak Fast Well posiada dwustronną powierzchnię klejącą. Przekładka jest potrzebna do stworzenia dołka, w którym zarodek zostanie umieszczony i trzymany między dwoma szkiełkami nakrywkowymi.

  1. Odwodnienie metanolu
    1. Oznaczyć nowe probówki o pojemności 2 ml, po jednej na zarodek. Dodaj 1 ml 25% MeOH na probówkę.
    2. Za pomocą czystego skalpela delikatnie przetnij agarozę wokół zarodka, pozostawiając wokół zarodka tyle, aby można go było podnieść kleszczami. Użyj cienkich kleszczyków, aby delikatnie chwycić agarozę z osadzonym zarodkiem i umieść ją w oznakowanej probówce z 25% MeOH. Nie pozwól, aby kleszcze dotykały zarodka.
    3. Inkubować zarodek (zarodki) w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem przez 1 godzinę w ciemności.
    4. Usuń 25% MeOH z probówki, uważając, aby nie dotknąć zarodka. Dodaj 1 ml 50% MeOH na probówkę. Inkubować w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem przez 1 godzinę w ciemności.
    5. Usuń 50% MeOH z probówki, uważając, aby nie dotknąć zarodka. Dodaj 1 ml 75% MeOH na probówkę. Inkubować w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem przez 1 godzinę w ciemności.
    6. Usuń 75% MeOH z probówki, uważając, aby nie dotknąć zarodka (zarodków). Dodaj 1 ml 100% MeOH na probówkę. Inkubować w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem przez 1 godzinę w ciemności. Powtórz pranie 100% MeOH dwa razy.
  2. Rozliczanie za pomocą BABB
    1. Usuń 100% MeOH z probówki, uważając, aby nie dotknąć zarodka. Dodaj 1 ml 50% BABB na probówkę. Inkubować w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem przez 1 godzinę w ciemności.
    2. Usuń 50% BABB z probówki, uważając, aby nie dotknąć zarodka. Dodaj 1 ml 100% BABB na probówkę. Inkubować w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem przez 1 godzinę w ciemności. Powtórz pranie 100% BABB dwa razy.
      UWAGA: (Opcjonalny punkt zatrzymania) Zarodki mogą pozostawać w 100% BABB w probówkach przez około tydzień. Dłuższe przechowywanie spowoduje, że BABB rozpuści plastik rurek.
  3. Montowanie zarodków do obrazowania
    1. Umieść zderzak Fast Well na szklanym szkiełku nakrywkowym o wymiarach 24 mm x 60 mm #1.5, odklejając plastikowy klej z jednej strony. Upewnij się, że między szkiełkiem nakrywkowym a zderzakiem nie ma pęcherzyków powietrza, delikatnie naciskając plastikowy klej na gumowym zderzaku. Oznacz szkiełko nakrywkowe zgodnie z numerem zarodka, genotypem i przeciwciałami używanymi do barwienia.
      UWAGA: Między szkiełkami nakrywkowymi można umieścić dowolną przekładkę, o ile jest wystarczająco gruba, aby zapobiec zgnieceniu lub zgnieceniu zarodka. Ze względu na ich grubość i wygodę stosujemy przekładki Fast Well, które obejmują powierzchnie klejące po obu stronach przekładki do mocowania jej do szkiełek nakrywkowych.
    2. Ostrożnie odpipetować i wyrzucić 100% BABB z probówki. Po wizualizacji zarodka zanurzonego w agarozie w probówce, użyj cienkich kleszczyków, aby podnieść agarozę i ostrożnie przenieś zarodek na szkiełko nakrywkowe wewnątrz Fast Well - nie pozwól, aby kleszcze dotykały zarodka.
    3. Usuń drugi plastikowy klej ze zderzaka i umieść drugie szkiełko nakrywkowe na wierzchu. Usuń pęcherzyki powietrza, delikatnie naciskając szkiełko nakrywkowe. Uważaj, aby nie stłuc szkła.
      UWAGA: Próbki można przechowywać płasko w uchwycie na szkiełko w ciemności w temperaturze pokojowej przez okres do roku, jeśli zgrzew jest szczelny.

6. Pozyskiwanie danych

UWAGA: W kolejnych krokach, śródbłonek łuków gardłowych 3, 4 i 6 zostanie zobrazowany za pomocą mikroskopii konfokalnej.

  1. Ustawianie szkiełek na stoliku mikroskopu
    1. Do obrazowania zarodków należy użyć mikroskopu konfokalnego wyposażonego w obiektyw z 20-krotnym zanurzeniem w wodzie, aperturę numeryczną 0,95, odległość roboczą 0,95 mm oraz 64-bitowe oprogramowanie NIS-Elements AR 5.11.01.
    2. Korzystając z fluorescencji szerokokątnej, wizualnie zlokalizuj łuki gardłowe. Wyśrodkuj widok pola wokół 4. PAA.
    3. Jeśli pole widzenia obiektywu nie obejmuje całego obszaru łuku gardłowego, zrób i zszyj duży panel obrazów z 1% zachodzeniem na siebie. Aby zapobiec przemieszczaniu się próbki podczas pozyskiwania dużego obrazu, delikatnie przymocuj zespół szkiełek nakrywkowych do stolika za pomocą gliny formierskiej.
  2. Ustawianie parametrów akwizycji
    1. Ustaw rozmiar otworu na 1.0.
    2. Na karcie Akwizycja ND ustaw górną i dolną granicę obrazowania za pomocą korekty zgrubnej. Ustaw rozmiar kroku Z zgodnie ze specyfikacją oprogramowania. Określ grubość, którą można zobrazować, na podstawie odległości roboczej obiektywu i przejrzystości próbki.
    3. Ze względu na grubość zarodka, dostosuj wzmocnienie w całym stosie Z. Ustaw intensywność i wzmocnienie lasera w środku stosu Z dla każdego kanału (405, 488 i 555) i przypisz wartości na karcie Korekcja intensywności Z. Ustaw te same wartości dla dolnego wycinka.
    4. Przewiń zarodek, aż sygnały fluorescencyjne zaczną wydawać się ciemniejsze. Zwiększaj wzmocnienie każdego kanału, aż intensywność sygnału stanie się podobna do poprzedniego segmentu. Przypisz nową wartość na karcie Korekcja intensywności Z. Powtarzaj, aż z-stack zostanie zakończony. Zaimportuj ustawienia z powrotem do akwizycji ND.
    5. Uruchom skanowanie przy użyciu opcji Uruchom korekcję Z.

7. Analiza za pomocą oprogramowania Imaris

UWAGA: W tych krokach, obrazy konfokalne będą analizowane za pomocą oprogramowania do analizy obrazów mikroskopowych, Imaris wersja 9.2.0. Podczas tej analizy najpierw wybierzemy obszary zainteresowania, które mają zostać przeanalizowane poprzez utworzenie powierzchni. Następnie użyjemy funkcji Maska, aby wizualnie oddzielić te regiony. Na koniec użyjemy funkcji Spot, aby określić ilościowo liczbę EC w każdym regionie zainteresowania.

  1. W zależności od oprogramowania do obrazowania użytego w kroku 6 przekonwertuj obrazy do formatu .ims za pomocą Imaris File Converter.
  2. Otwórz pliki .ims. Ustaw obraz na ortogonalny w obszarze Kamera/Etykiety | panel Typ kamery.
  3. Zlokalizuj PAA i zorientuj obraz do surfacing.
    UWAGA: Gdy pliki zostaną otwarte po raz pierwszy, pojawią się jako kompilacja 3D wszystkich obrazowanych plasterków. W tym kroku PAA zostaną zlokalizowane poprzez przekształcenie obrazu 3D w obraz 2D. Obraz 2D pozwala następnie na odpowiednią orientację PAA do analizy.
    1. W panelu Właściwości wyłącz opcję Wolumin. W panelu Właściwości kliknij opcję Dodaj nowy fragmentator ortofotokątny. Ustaw orientację plasterka na płaszczyznę XY. Użyj opcji Pozycja plasterka, aby przewijać obraz, aż znajdziesz PAA.
    2. Jeśli PAA nie są równoległe do górnej i dolnej krawędzi obrazu, swobodnie obracaj obraz za pomocą kursora myszy, tak aby PAA przebiegały od lewej do prawej po ekranie. W menu rozwijanym Przetwarzanie obrazu wybierz opcję Swobodny obrót i kliknij przycisk OK.
  4. Powierzchnia 3 łuku gardłowego (Rysunek 2A, B - B")
    UWAGA: W tych krokach łuki gardłowe i PAA zostaną prześledzone za pomocą narzędzia Powierzchnia, aby wygenerować "powierzchniowy" obszar zainteresowania. Pozwoli to na wizualne odizolowanie każdego obszaru zainteresowania od otaczającej tkanki. W tym miejscu opisujemy kroki, które należy wykonać, aby wynurzyć i przeanalizować elementy śródbłonka 3łuku gardłowego. Podobnie analizowane są łuki gardłowe 4 i 6.
    1. Aby wytworzyć śródbłonek w całym 3 łuku gardłowym, kliknij przycisk Dodaj nową powierzchnię znajdujący się w panelu Właściwości. Kliknij dwukrotnie powierzchnię 1 i zmień nazwę nowej powierzchni na "3rd Pharyngeal Arch".
    2. Wybierz opcję Pomiń automatyczne tworzenie, edytuj ręcznie. Ustaw orientację powierzchni na płaszczyznę YZ (orientacja koronalna). Użyj pozycji przekroju, aby umieścić 3. płaszczyznę powierzchni łuku gardłowego do miejsca, w którym łączą się 3. PAA i aorta grzbietowa.
    3. Obróć obraz tak, aby widoczna była 3. płaszczyzna powierzchni łuku gardłowego. Wyłącz narzędzie Ortho Slicer 1.
    4. W ramach losowania | Kontur | Tryb wybierz funkcję Tryb rysowania odległości. W razie potrzeby dostosuj ustawienia parametrów. Utrzymuj stałe parametry napawania między próbkami. W tym przykładzie odstęp między wierzchołkami wynosi 10 μm.
    5. Aby rozpocząć wyświetlanie, naciśnij Esc, a następnie kliknij przycisk Rysuj. Obrysuj obwód 3. łukugardłowego za pomocą kursora myszy. Użyj opcji Położenie plasterka, aby przesunąć o 10–25 plasterków. Obrysuj obwód łuku gardłowego. Powtarzaj, aż łuk gardłowy zostanie w pełni prześledzony.
    6. Aby wygenerować powierzchnię obrysowanego obszaru, wybierz przycisk Utwórz powierzchnię w panelu Właściwości.
  5. Napawanie 3. PAA (Rysunek 2C - C")
    1. Aby wyeksponować śródbłonek 3.PAA, najpierw wyłącz obszar wypukły z kroku 7.4, usuwając zaznaczenie pola 3. powierzchni łuku gardłowego. Następnie ponownie kliknij przycisk Dodaj nową powierzchnię. Kliknij dwukrotnie powierzchnię 1 i zmień nazwę nowej powierzchni na "3rd PAA".
    2. Wybierz opcję Pomiń automatyczne tworzenie, edytuj ręcznie. Ustaw orientację powierzchni na płaszczyznę YZ (orientacja koronalna). Użyj opcji Pozycja przekroju, aby umieścić trzecią płaszczyznę powierzchni PAA w miejscu, w którym łączą się 3. PAA i aorta grzbietowa, a następnie powtórz kroki 7.4.
  6. Maskowanie powierzchni konstrukcji
    UWAGA: W kolejnych krokach każdy obszar zainteresowania zostanie zamaskowany. Maskowanie pozwala obszarowi zainteresowania na wizualne odróżnienie się od reszty obrazowanej tkanki i pozwala na ilościowe określenie tych odrębnych struktur będących przedmiotem zainteresowania. Poniżej opisujemy kroki w Imaris w celu wizualizacji i analizy śródbłonka PAA, a także splotu - mniejszego naczynia krwionośnego otaczającego PAA w obrębie łuków gardłowych. W tych krokach 3.powierzchnia PAA zostanie zamaskowana w celu wizualizacji i przeprowadzenia analizy tylko na PAA przy użyciu funkcji Spot opisanej w sekcji 7.7.
    1. Wybierz opcję Głośność, aby wyświetlić wizualizację wszystkich zamaskowanych kanałów. Naciśnij Esc, aby obrócić obraz i ustawić go w pozycji XY.
    2. Na karcie Edit (Edycja) wybierz opcję Mask Selection (Wybór maski) dla 3. PAA. Wybierz kanał DAPI i kliknij przycisk OK. Powtórz te czynności dla pozostałych kanałów.
    3. Na klawiaturze naciśnij Ctrl + D, aby wyświetlić panel Dopasowania wyświetlania. Wybierz każdy nowy kanał i zmień ich nazwy, aby było jasne, co każdy kanał pokazuje. Na przykład doprowadzi to do powstania trzech nowych kanałów: "3rd PAA DAPI", "3rd PAA ERG" i "3rd PAA VEGFR2".
      UWAGA: W krokach 7.6.4-7.6.7 utworzymy kanały tylko dla splotu łuku gardłowego.
    4. Aby uwidocznić splot śródbłonkowy oddzielnie od PAA, najpierw wybierzemy Wybór maski dla 3. powierzchni PAA. Wybierz kanał DAPI. Usuń zaznaczenie opcji Wybierz woksele na zewnątrz powierzchni do i zaznacz opcję Wybierz woksele wewnątrz powierzchni do przycisków, ustaw opcję Wybierz woksele wewnątrz powierzchni na zero. Kliknij przycisk OK.
    5. Powtórz te czynności dla pozostałych kanałów. Ta operacja wykluczy region, w którym znajduje się PAA, z nowych zamaskowanych kanałów. Zmień nazwy kanałów, aby było jasne, co jest wyświetlane na każdym kanale. Na przykład doprowadzi to do powstania trzech nowych kanałów: "Non-PAA DAPI", "Non-PAA ERG" i "Non-PAA VEGFR2".
    6. Aby uwidocznić splot śródbłonkowy w obrębie 3. łuku gardłowego, wybierz opcję Wybór maski na karcie Edycja dla powierzchni 3. łuku gardłowego. Wybierz kanał DAPI inny niż PAA. Kliknij przycisk OK.
    7. Powtórz te czynności dla pozostałych kanałów innych niż PAA. Zmień nazwy kanałów, aby było jasne, co jest wyświetlane na każdym kanale. Na przykład doprowadzi to do powstania trzech nowych kanałów: "Plexus DAPI", "Plexus ERG" i "Plexus VEGFR2".
  7. Kwantyfikacja numerów EC
    UWAGA: Wyrażenie ERG oznacza jądra śródbłonka, co ułatwia ilościowe określenie liczb EC. W tych krokach liczba EC zostanie określona ilościowo za pomocą funkcji Spot w celu wygenerowania plamki dla każdego EC oznaczonego wyrażeniem ERG w PAA i splocie. W sekcji 7.7 zostaną wygenerowane plamki dla każdej komórki ERG-dodatniej w zamaskowanym PAA, a następnie odznaczenie plamek w komórkach ERG-dodatnich, VEGFR2-ujemnych.
    1. Na klawiaturze naciśnij Ctrl + D, aby wyświetlić panel Dopasowania wyświetlania. Wyłącz wszystkie kanały z wyjątkiem PAA ERG.
    2. W zakładce właściwości kliknij przycisk Dodaj nowe miejsca. Kliknij na Miejsca 1 i zmień jego nazwę na "PAA Total Number of ECs". Kliknij przycisk z niebieską strzałką. W polu Source Channel (Kanał źródłowy) wybierz kanał PAA ERG. Skorygować szacowaną średnicę XY do 4 μm. Przejdź do następnego panelu, klikając przycisk z niebieską strzałką.
    3. Dostosuj liczbę widocznych plamek za pomocą ruchomej skali, aby upewnić się, że każde jądro EC (oznaczone wyrażeniem ERG) jest reprezentowane przez jedną plamkę. Kliknij zielony przycisk podwójnej strzałki.
    4. Wyłącz kanał PAA ERG w regulacji wyświetlania. Włącz kanał PAA VEGFR2, aby uwidocznić śródbłonek PAA.
    5. Aby dokładnie określić ilościowo liczbę EC, upewniamy się, że każda plamka wyraża oba markery EC, ERG i VEGFR2. W tym celu wybierz opcję Powierzchnia obiektu na karcie Edycja | Panel Dodaj/Usuń. Naciśnij Esc i usuń wszystkie miejsca, które nie są dodatnie dla VEGFR2, przytrzymując Shift i wybierając miejsce.
      UWAGA: W następnym kroku zostaną wygenerowane plamki dla każdej komórki ERG-dodatniej w zamaskowanym splocie, a następnie nastąpi odznaczenie plamek w komórkach ERG-dodatnich, VEGFR2-ujemnych.
    6. W zakładce właściwości kliknij przycisk Dodaj nowe miejsca. Wybierz Miejsca 1 i zmień nazwę na "Plexus Total Number of ECs". Kliknij przycisk z niebieską strzałką. W polu Source Channel (Kanał źródłowy) wybierz kanał Plexus ERG. Skorygować szacowaną średnicę XY do 4 μm. Powtórz kroki 7.7.1 - 7.7.5 dla całkowitej liczby EC splotu.
    7. Kliknij zakładkę Statystyki każdej funkcji punktowej, aby określić całkowitą liczbę EC w 3. PAA i splocie łuku gardłowego.
    8. Powtórz kroki 7.7.1 - 7.7.6 dla pozostałych PAA i splotu łuku gardłowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiony tutaj protokół immunofluorescencji z pełnym wierzchowaniem daje jasne i czyste wyniki, pozwalając na rekonstrukcję 3D śródbłonka łuku gardłowego, jak widać na Rysunek 1A. Ważne jest, aby inkubować zarodki przez wystarczającą ilość czasu w każdym roztworze przeciwciał, aby zapewnić pełną penetrację przez próbkę, a także dokładne mycie zarodków po inkubacji przeciwciał. W Rysunek 1B, duże, ja...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Możliwość wizualizacji śródbłonka w zarodkach myszy w 3D dostarczyła nowych informacji na temat ich rozwoju3. Poniżej przedstawiamy protokół, który pozwala na obrazowanie 3D zarodków w wysokiej rozdzielczości, wizualizację połączeń naczyniowych oraz analizy ilościowe powstawania PAA. Protokół ten można zastosować, aby zobaczyć, jak zmiany genetyczne lub zniewagi środowiskowe wpływają na rozwój PAA. Opisana tutaj procedura wykorzystuje przeciwciała przeciwko VEGFR2 i ERG do wizualizacji tworzenia P...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Briannie Alexander, Caolanowi O'Donnellowi i Michaelowi Warkala za uważne przeczytanie i zredagowanie tego rękopisu. Praca ta była wspierana przez finansowanie z Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi NIH R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 do SA; AJR jest wspierany przez NHLBI HL103920-08S1 oraz grant szkoleniowy Narodowego Instytutu Zapalenia Stawów i Chorób Układu Mięśniowo-Szkieletowego i Skóry T32052283-11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10x PBSMP BiomedicalsPBS10X02
20x obiektyw do zanurzenia w wodzieNikonMRD77200
AgaroseBio-Rad Laboratories1613101
Alexa Fluor 488 antykoziołInvitrogenA-11055
Alexa Fluor 555 anty-mysie
Imaris 9.2.0
Alkohol benzylowySigma-Aldrich305197
Benzoesan benzyluSigma-Aldrich8.18701.0100
Szkiełka nakrywkoweVWR16004-312
DAPI (zapas 5 mg/mL)Fisher ScientificD3571
Probówki Eppendorf (2.0 mL)Fisher Scientific05-408-138
EtanolVWR89370-084
Probówki Falcon (50 ml)Corning352098
Szybkie studnieGrace Bio Labs664113
KleszczeRobozRS-5015
Koza anty-VEGFR2R& D Systems, Inc.AF644
MetanolVWRBDH1135-4LP
MikroskopNikonA1HD25
Mysz anty-ERGAbcamab214341
Normalna surowica osłaSigma-AldrichD9663
Paraformaldehydowamikroskopia elektronowa Sciences15710
Pipety PasteuraFisher Scientific13-678-20D
Szalki Petriego (35 mm)Genesee Scientific32-103
Szalki Petriego (60 mm)Genesee Scientific32-105
Formy plastikoweVWR18000-128
ScapelsExelint International Co.29552
Triton-X-100Fisher ScientificBP 151-500
oprogramowanie analityczne Invitrogen A-31570

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hiruma, T., Nakajima, Y., Nakamura, H. Development of pharyngeal arch arteries in early mouse embryo. Journal of Anatomy. 201 (1), 15-29 (2002).
  2. Hutson, M. R., Kirby, M. L. Model systems for the study of heart development and disease Cardiac neural crest and conotruncal malformations. Seminars in Cell & Developmental Biology. 18 (1), 101-110 (2007).
  3. Wang, X., et al. Endothelium in the pharyngeal arches 3, 4 and 6 is derived from the second heart field. Developmental Biology. 421 (2), 108-117 (2017).
  4. Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1. Nature Genetics. 27 (3), 286-291 (2001).
  5. Lindsay, E. A., et al. Tbx1 haploinsufficieny in the DiGeorge syndrome region causes aortic arch defects in mice. Nature. 410 (6824), 97-101 (2001).
  6. Weninger, W., et al. Visualising the Cardiovascular System of Embryos of Biomedical Model Organisms with High Resolution Episcopic Microscopy (HREM). Journal of Cardiovascular Development and Disease. 5 (4), 58(2018).
  7. Phillips, H. M., et al. Pax9 is required for cardiovascular development and interacts with Tbx1 in the pharyngeal endoderm to control 4th pharyngeal arch artery morphogenesis. Development. 146 (18), (2019).
  8. Vlaeminck-Guillem, V., et al. The Ets family member Erg gene is expressed in mesodermal tissues and neural crests at fundamental steps during mouse embryogenesis. Mechanisms of Development. 91 (1-2), 331-335 (2000).
  9. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nature Medicine. 18 (1), 166-217 (2012).
  10. Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
  11. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  12. Becker, K., Jährling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. Chemical Clearing and Dehydration of GFP Expressing Mouse Brains. PLoS One. 7 (3), e33916(2012).
  13. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  14. Kuwajima, T., et al. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

3D ReconstructionConfocal MicroscopyEndothelial Cell QuantificationBABB Tissue ClearingPharyngeal Arch EndotheliumVascular Plexus AnalysisERG VEGFR2 ChannelsMouse Embryo Imaging

Powiązane artykuły