Połączony test warunkowego knockdownu i dostosowanego tworzenia kuli w celu zbadania genu związanego z łodygą komórek macierzystych raka żołądka pochodzących od pacjenta

Podsumowanie

W tym protokole prezentujemy eksperymentalny projekt wykorzystujący system warunkowego knockdown i dostosowany test tworzenia kuli w celu zbadania wpływu klastryny na macierzystość GCSC pochodzących od pacjenta. Protokół można łatwo dostosować do badania zarówno in vitro, jak i in vivo funkcji genów związanych z macierzystą naturą w różnych typach CSC.

Streszczenie

Nowotworowe komórki macierzyste (CSC) są zaangażowane w inicjację, rozwój i nawrót nowotworu po leczeniu i stały się przedmiotem zainteresowania wielu badań w ostatnich dziesięcioleciach. Dlatego ważne jest opracowanie metod badania roli kluczowych genów zaangażowanych w macierzystość komórek nowotworowych. Rak żołądka (GC) jest jednym z najczęstszych i najbardziej śmiertelnych rodzajów nowotworów. Uważa się, że komórki macierzyste raka żołądka (GCSC) są przyczyną nawrotu raka żołądka, przerzutów i oporności na leki. Zrozumienie biologii GCSC jest konieczne, aby przyspieszyć rozwój terapii celowanych i ostatecznie zmniejszyć śmiertelność wśród pacjentów. W tym protokole przedstawiamy projekt eksperymentalny wykorzystujący system warunkowego knockdown i dostosowany test tworzenia kuli w celu zbadania wpływu klastryny na macierzystość GCSC pochodzących od pacjenta. Protokół można łatwo dostosować do badania zarówno in vitro, jak i in vivo funkcji genów związanych z macierzystą naturą w różnych typach CSC.

Wprowadzenie

Rak żołądka (GC) jest jednym z najczęstszych i najbardziej śmiertelnych rodzajów nowotworów¹. Pomimo postępów w chirurgii skojarzonej, chemioterapii i radioterapii w terapii GC, rokowanie pozostaje złe, a pięcioletni wskaźnik przeżycia jest nadal bardzo niski². Nawrót i przerzuty są głównymi przyczynami zgonów po leczeniu.

Rakowe komórki macierzyste (CSC) to podzbiór komórek nowotworowych, które posiadają zdolność do samoodnawiania się i generowania różnych linii komórkowych, które rekonstytuują nowotwór³. Uważa się, że CSC są odpowiedzialne za nawroty raka i przerzuty ze względu na ich zdolność do samoodnawiania się i wysiewania nowych nowotworów, a także ich odporność na tradycyjne chemo- i radioterapie⁴. W związku z tym ukierunkowanie na CSC i eliminacja CSC stanowią ekscytujący potencjał w zakresie poprawy leczenia i zmniejszenia śmiertelności pacjentów onkologicznych.

CSC zostały wyizolowane z wielu typów guzów litych⁵. W 2009 roku komórki macierzyste raka żołądka (GCSC) wyizolowane z linii komórkowych ludzkiego raka żołądka zostały pierwotnie opisane przez Takaishi et al.⁶. Chen i jego koledzy najpierw zidentyfikowali i oczyścili GCSC z tkanek nowotworowych ludzkiego gruczolakoraka żołądka (GAC)⁷. Odkrycia te nie tylko dają możliwość zbadania biologii GCSCs, ale mają również ogromne znaczenie kliniczne.

Szczególną cechą CSC jest ich zdolność do tworzenia sfery⁸. Pojedyncze komórki są siane w nieprzylegających warunkach o niskiej gęstości i tylko komórki posiadające zdolność do samoodnawiania się mogą wyrosnąć w stałe, kuliste skupisko zwane kulą. W związku z tym test tworzenia się kuli został uznany za złoty standard testu i jest szeroko stosowany do oceny potencjału samoodnawiania się komórek macierzystych in vitro.

Interferencja RNA (RNAi) to potężne narzędzie badawcze do badania funkcji genów poprzez knockdown określonego genu⁹. Jednak technologie długotrwałego stabilnego knockdownu genów mają pewne ograniczenia, takie jak wyzwanie związane z badaniem funkcji genu, który jest niezbędny do przetrwania komórki. Warunkowe systemy RNAi mogą być przydatne do obniżania poziomu pożądanych genów w sposób czasowy i/lub specjalnie kontrolowany przez podanie czynnika indukującego. Układy indukowane tetracykliną (Tet) są jednym z najczęściej używanych warunkowych systemów RNAi¹⁰. Systemy indukowane Tet mogą indukować wyciszanie genów docelowych poprzez kontrolowanie ekspresji shRNA po dodaniu induktora egzogennego (preferencyjnie doksycykliny, Dox). Systemy indukowane przez Tet można podzielić na dwa typy: systemy Tet-On lub Tet-Off. Ekspresja shRNA może być włączona (Tet-On) lub wyłączona (Tet-Off) w obecności induktora. W układzie Tet-ON bez induktora, konstytutywnie wyrażany represor Tet (TetR) wiąże się z sekwencją elementu reagującego na Tet (TRE) zawierającą reagujący na Tet zależny od Pol III promotor ekspresji shRNA, hamując w ten sposób ekspresję shRNA. Podczas gdy po dodaniu Dox, TetR jest odizolowany od reagującego na Tet promotora zależnego od Pol III. Ułatwia to ekspresję shRNA i prowadzi do knockdownu genu.

Opisany tutaj protokół wykorzystuje funkcjonalny system shRNA indukowany tetracykliną oraz dostosowany test tworzenia sfery do badania funkcji klastryny w GCSC pochodzących od pacjentów. Kasteryna została zidentyfikowana jako nowa kluczowa cząsteczka dla utrzymania macierzystki i przeżywalności GCSC w poprzednim badaniu¹¹. Używamy opisanego protokołu do badania wpływu klastryny na samoodnawianie GCSC. Metodologia ta ma również zastosowanie do innych typów nowotworowych komórek macierzystych.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj eksperymenty z wykorzystaniem komórek macierzystych raka żołądka pochodzących od pacjentów zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną⁷.

1. Hodowla komórek macierzystych raka żołądka

1. Przygotowanie kompletnej pożywki hodowlanej GCSC
   1. Przygotuj kompletną pożywkę hodowlaną GCSCs, dodając świeżą pożywkę DME/F12 z następującymi niezbędnymi składnikami: 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml bFGF, 1% insuliny/transferyny/seleninu sodu, 0,2% glukozy, 0,5% B27, 1% Glutamax, 1% aminokwasów endogennych, 10 μM 2-merkaptoetanolu, 0,75 mg/ml_NaHCO3, 10 μM tioglicerolu, 100 IU/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Filtruj i sterylizuj za pomocą filtra 0,22 μm.
      UWAGA: Zaleca się przechowywanie kompletnej pożywki GCSC najlepiej nie dłużej niż dwa tygodnie w temperaturze 4 °C.
2. Odzyskiwanie GCSC i hodowli
   UWAGA: GCSC uzyskano w następujący sposób: Próbki guza poddano dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej. Zawiesiny jednokomórkowe uzyskano przez filtrowanie siatką nylonową z dobrze rozsypanej zawiesiny. Powstałe w ten sposób komórki rakowe hodowano w pożywce GCSC Complete Culture Balance, a niektóre komórki rosły, tworząc kule. Kule te zostały następnie poddane dysocjacji enzymatycznej, a GCSC można uzyskać przez cytofluorometryczne sortowanie populacji komórek wybarwionych markerami CD44/CD54. Szczegółowy protokół i testy funkcjonalne GCSC zostały zgłoszone⁷.
   1. Wstępnie podgrzane GCSC wypełniają pożywkę hodowlaną w temperaturze 37 °C nie dłużej niż 30 minut.
   2. Rozmrozić GCSC z magazynu ciekłego azotu i szybko rozmrozić kriowiale w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Mieszaj fiolki, aż cała zawartość całkowicie się rozpuści.
      UWAGA: Zamrożone komórki rozmrozić szybko (<1 min) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
   3. Przenieść całą zawartość kriowiów do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml kompletnej pożywki hodowlanej GCSC. Wirować przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Ostrożnie odessać supernatant i zawiesić osad komórkowy w 10 ml świeżej kompletnej pożywki GCSC. Zawiesinę komórek umieścić na płytce Petriego o średnicy 100 mm. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 i} dodać 5 ml świeżej, kompletnej pożywki trzeciego dnia.
3. Subkultura guzów GCSCs
   UWAGA: GCSC w centrum guza mają wystarczającą ilość składników odżywczych tylko przed rozmiarem kulek dorastających do 80-100 μm średnicy. Po pojawieniu się ciemnych i nisko załamujących się sfer (około 6 dni hodowli) konieczne jest subkulturowanie guzów.
   1. Delikatnie wstrząśnij naczyniem i przenieś pożywkę do hodowli guzów GCSC (pożywkę i nieprzylegające guzy) do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. W przypadku większych, średnich objętości mogą być potrzebne większe probówki wirówkowe.
   2. Wirować przy 600 x g przez 5 minut i ostrożnie usunąć supernatant. Po odwirowaniu widoczne będą białawe osady.
   3. Dodać 2 ml roztworu do dysocjacji komórek, aby ponownie zawiesić osad do dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej w temperaturze 37 °C. Delikatnie pipetować w górę i w dół 10 razy co 2-3 minuty w procedurze trawienia, aby rozbić kulki, aż guzy zostaną rozproszone w zawiesinę jednokomórkową. Zaleca się, aby ten całkowity proces dysocjacji był krótszy niż 15 min.
      UWAGA: Wykonaj kontrolę wzrokową pod mikroskopem, aby upewnić się, że nie pozostały żadne duże kule ani agregaty komórek.
   4. Dodać 10 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki GCSC (5 razy więcej niż objętość roztworu oddzielającego komórki), aby zakończyć procedurę trawienia i odwirować przy 800 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
   5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 ml świeżej, wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki hodowlanej GCSC. Umieścić odpowiednią liczbę komórek na nowej szalce Petriego o średnicy 100 mm z 10 ml świeżej, wstępnie ogrzanej pożywki hodowlanej GCSC i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
   6. Po 3 dniach należy ponownie nakarmić kultury nowotworów, dodając 5 ml świeżej, wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki. Po 6 dniach pasażują komórki, gdy guzy dorastają do 80-100 μm średnicy.
4. Kriokonserwacja GCSC
   UWAGA: Nie należy kriokonserwować komórek GCSC poprzez bezpośrednie dodawanie pożywki do guzów. Guzosfery GCSC powinny być trawione do pojedynczych komórek, aby środek ochronny mógł dostać się do każdej komórki, aby zapewnić długotrwałe stabilne przechowywanie komórek. Upewnij się, że komórki są w dobrym stanie i nie są zanieczyszczone.
   1. Zbierz guzy GCSCs. Wirować przy 600 x g przez 5 min.
   2. Odrzucić supernatant i dodać 2 ml roztworu dysocjacji komórek w celu dysocjacji guzów GCSC w temperaturze 37 °C. Zakończyć procedurę trawienia przez dodanie 10 ml kompletnej pożywki hodowlanej GCSC.
   3. Wirować przy 800 x g przez 5 minut i zbierać pojedyncze GCSC.
   4. Delikatnie zawiesić GCSC za pomocą kriokonserwantu bez surowicy. Zalecane stężenie końcowe to 5 x 10⁵ - 5 x 10⁶ komórek/ml.
   5. Dozować zawiesinę komórkową w podwielokrotnościach o objętości 1 ml do oznaczonych fiolek kriogenicznych.
   6. Natychmiast umieścić kriowiale zawierające komórki w komorze izopropanolowej i przechowywać je w temperaturze -80 °C. Następnego dnia przenieść fiolki do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.

2. Generowanie indukowalnych linii GCSC knockdown

UWAGA: Rekombinowane lentiwirusy zostały oznaczone jako organizmy poziomu 2 przez Narodowy Instytut Zdrowia i Centrum Kontroli Chorób. Prace związane z lentiwirusem wymagają utrzymania zakładu o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2, biorąc pod uwagę, że supernatanty wirusowe wytwarzane przez te systemy lentiwirusowe mogą zawierać potencjalnie niebezpieczny rekombinowany wirus.

1. Wytwarzanie cząstek lentiwirusa
   1. Zsyntetyzuj 2 wektory lentiwirusowe przenoszące indukowalne shRNA ukierunkowane na ludzką klasterynę i niecelujący kontrolny wektor lentiwirusowy (GV307) z GeneChem w oparciu o projekt tabeli 1 (wektor GV307 zawiera: TetIIP-TurboRFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Puromycyna).
   2. Wysiew 4 x 10⁶ komórek pakujących wirusa lenti-293T na 100 mm szalki Petriego z 10 ml DMEM uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą.
   3. Inkubować komórki 293T przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . Upewnij się, że gęstość komórek 293T wynosi około 50-80% zlewania w dniu transfekcji.
   4. Doprowadzić zredukowaną pożywkę surowicy do temperatury pokojowej i przygotować probówkę A i probówkę B zgodnie z opisem w Tabeli 2.
   5. Przenieś probówkę A do probówki B, dobrze wymieszaj i inkubuj kompleksy przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu przygotowania kompleksów lipidowo-DNA.
   6. Usuń 5 ml pożywki przed dodaniem kompleksu lipid-DNA, pozostawiając w sumie 5 ml.
   7. Kroplami dodać 5 ml kompleksu lipid-DNA do szalki hodowlanej i delikatnie zawirować szalkę, aby rozprowadzić kompleks.
      UWAGA: Ostrożnie dozuj płyn do ścianki naczynia, aby nie przeszkadzać komórkom 293T.
   8. Inkubować naczynie hodowlane przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
   9. Po 24 godzinach od transfekcji ostrożnie usuń pożywkę do transfekcji i delikatnie zastąp ją 10 ml wstępnie podgrzanego DMEM uzupełnionego 10% FBS. Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO₂,
      UWAGA: Cały supernatant i końcówki należy przed usunięciem potraktować 10% wybielaczem.
   10. Około 48 godzin po transfekcji zebrać 10 ml supernatantów zawierających lentiwirusa.
       UWAGA: Wszystkie naczynia i końcówki kultur komórkowych należy przed usunięciem potraktować 10% wybielaczem.
   11. Przefiltruj supernatant lentiwirusa za pomocą filtra porowego 0,45 μm, aby usunąć zanieczyszczenia komórkowe.
       UWAGA: Wszystkie filtry i strzykawki należy przed wyrzuceniem potraktować 10% wybielaczem.
   12. Przenieść oczyszczony supernatant do sterylnego pojemnika, dodać koncentrator Lenti-X (1/3 objętości oczyszczonego supernatantu) do wymieszania przez delikatne odwrócenie.
   13. Inkubować mieszaninę w temperaturze 4 °C przez noc.
   14. Odwirować próbki o masie 1 500 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu i białawy osad będzie widoczny. Ostrożnie usunąć sklarowany sklarant, uważając, aby nie naruszyć osadu.
       UWAGA: Cały supernatant i końcówki należy przed usunięciem potraktować 10% wybielaczem.
   15. Delikatnie zawiesić osad w 1 ml DMEM uzupełnionym 10% FBS jako zapas wirusa, przechowywać w temperaturze -80 °C.
2. Wytwarzanie stabilnych transfekowanych linii komórkowych
   1. Wysiewaj 6 x 10⁶ GCSC na 100 mm szalkę Petriego z 10 ml DMEM uzupełnionym 10% FBS przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ (70-80% konfluencji przed infekcją).
   2. Odessać pożywkę w naczyniu, dodać do naczynia skoncentrowane cząstki lentiwirusa rozcieńczone 4 ml kompletnej pożywki DMEM zawierającej odczynnik polibrenowy (5 μg/ml). Inkubować przez 18 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO₂,
      UWAGA: Optymalne stężenie polibrenu zależy od typu ogniwa i może wymagać przetestowania w różnych stężeniach, aby określić skuteczne stężenia. W przeciwnym razie można ją określić empirycznie, zwykle w zakresie 2-10 μg/ml. Wszystkie tubki i końcówki należy przed wyrzuceniem potraktować 10% wybielaczem.
   3. Zmienić pożywkę, zastąpić 10 ml DMEM 10% pożywką FBS i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO₂,
      UWAGA: Całe podłoże i końcówki należy przed wyrzuceniem potraktować 10% wybielaczem.
   4. Odessać supernatant ze szczątkami komórkowymi, zastąpić świeżym DMEM uzupełnionym 10% pożywką FBS zawierającą puromycynę (2,5 μg/ml) i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ . Następnie zastąp świeży DMEM uzupełniony 10% pożywką FBS zawierającą puromycynę (5 μg/ml) i inkubuj w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez dodatkowe 24 godziny.
   5. Przepłucz przylegające GCSC dwukrotnie 5 ml DPBS bez wapnia i magnezu.
   6. Dysocjować GCSC za pomocą 1 ml wstępnie podgrzanego roztworu do dysocjacji komórek i inkubować 2-3 minuty w temperaturze 37 °C.
   7. Dodać 5 ml świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki GCSC do zawiesiny komórkowej.
   8. Dozować 3 ml do 15 ml probówki odśrodkowej (probówka A) w celu kriokonserwacji komórek, a pozostałe 3 ml do 15 ml probówki odśrodkowej (probówka B) w celu indukcji przez doksycyklinę.
   9. Odwirować probówkę A i probówkę B o masie 800 x g przez 5 min.
   10. Zawiesić osad z probówki A z 1 ml niezawierającego surowicy pożywki kriokonserwującej, przenieść fiolkę do temperatury -80 °C na noc i przenieść ją do ciekłego azotu.
   11. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki probówki B w 1 ml świeżej, wstępnie ogrzanej, kompletnej pożywki hodowlanej GCSC. Wysiać odpowiednią liczbę komórek na nową, 100 mm szalkę Petriego zawierającą 10 ml świeżej, wstępnie ogrzanej pożywki GCSC z doksycykliną (Dox) (2,5 μg/ml) i inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO₂,
       UWAGA: Optymalne stężenie Dox może się różnić w zależności od linii komórkowych. Każda linia komórkowa powinna być badana w różnych stężeniach Dox, aby zdecydować o skutecznych stężeniach KD i toksyczności dla komórek.
   12. Potwierdź stabilną represję klastryny w GCSC przez western blot.

3. Test formowania kuli

1. Rozmrozić zamrożone, indukowane linie GCSC (patrz krok 1.2).
2. Określ żywotną gęstość komórek w próbce o objętości 10 μl za pomocą automatycznego licznika komórek.
3. Dostosuj objętość za pomocą wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki hodowlanej GCSC, aby uzyskać stężenie 2 x 10⁴ żywotnych komórek/ml.
4. Dozuj do 3 nowych 96-dołkowych dołków na płytki hodowlane o bardzo niskim stopniu przylegania (0,1 ml / dołek) w każdej grupie.
5. Inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ . Formowanie się kuli powinno nastąpić w ciągu 3-10 dni. Monitoruj i rejestruj wizualizację powstawania guzów co 2 dni.
   UWAGA: Nie zaleca się wymiany pożywki w przypadku jakichkolwiek zaburzeń tworzenia się guzów. Guzy te powinny być łatwe do odróżnienia od komórek pojedynczych i zagregowanych.
6. Określ wyniki tworzenia guza, oceniając rozmiary uformowanych guzów za pomocą oprogramowania do obrazowania.

Wyniki

Komórki macierzyste raka żołądka z pierwotnego ludzkiego gruczolakoraka żołądka były hodowane w pożywce hodowlanej bez surowicy. Po 6 dniach komórki rozrosły się z fenotypu podobnego do pojedynczej komórki (Rysunek 1A) do dużych kul (Figura 1B).

Aby ocenić funkcję klastryny w GCSC, sekwencje shRNA przeciwko klasterynie i zakodowane zostały ...

Dyskusja

GC jest trzecią najczęstszą przyczyną zgonów związanych z rakiem na świecie. GCSC mają kluczowe znaczenie w nawrocie raka żołądka, przerzutach i oporności na leki. Wykorzystanie GCSC od pacjentów z rakiem żołądka pozwoli nam zbadać ich słaby punkt i opracować leki celowane do leczenia pacjentów z GC.

Test tworzenia kuli jest przydatną metodą do badania potencjału samoodnawiania się nowotworowych komórek macierzystych in vitro. Wyniki można przedstawić jako procent utworzonych kulek podzielony ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,22 &m; m filtr	Millipore	SLGP033RB
1-tioglicerol	Sigma-Aldrich	M6145
2-merkaptoetanol	Gibco	2068586
Bezzwierzęcy rekombinowany ludzki suplement	EGF Peprotech	AF-100-15
B-27 (50X), bez surowicy	Gibco	17504044
Corning Costar Ultra-Low Attachment Płytka wielodołkowa	Sigma-Aldrich	CLS3474
Countess Szkiełka komory do liczenia komórek	Invitrogen	C10228
Countess II Automatyczny licznik komórek	Invitrogen	AMQAX1000
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G6152
DMEM/F-12, HEPES	Gibco	11330032
DMEM, Wysoki poziom glukozy, GlutaMAX, Pirogronian	Gibco
Hyklanów doksycykliny	Sigma-Aldrich	D9891
DPBS, bez wapnia, bez magnezu	Gibco	14190250
Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, Australia	Gibco	10099141
GlutaMAX Suplement	Gibco	35050061
Insulina, Transferyna, Roztwór Selenu (ITS -G), 100X	Gibco
wektor lentiwirusowy	GeneChem	GV307
Koncentrator Lenti-X	Takara	631232
odczynnik do transfekcji Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000015
Roztwór aminokwasów endogennych MEM, 100X	Gibco	11140050
Filtr strzykawkowy Millex-HV, 0,45 i mikro; m, PVDF, 33 mm, sterylizowane promieniami gamma	Millipore	SLHV033RB
Nalgene Ogólne rurki kriogeniczne do długoterminowego przechowywania	Thermo Scientific	5000-1020
Hodowla komórek Nunc/szalki Petriego	Thermo Scientific 171099
Opti-MEM I Zredukowane podłoże w surowicy	Gibco	31985070
Penicylina-Streptomycyna, płyn	Gibco	15140122
pHelper 1.0 (składnik gag/pol)	GeneChem	pHelper 1.0
pHelper 2.0 (komponent VSVG)	GeneChem	pHelper 2.0
Polybrene	Sigma-Aldrich	H9268
Rekombinowany ludzki FGF-basic	Peprotech	100-18B
Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich	S5761
STEM-CELLBANKER Pożywka do kriokonserwacji	ZENOAQ	11890
StemPro Accutase Roztwór do dysocjacji komórek	Gibco	A1110501
UltraPure 1 M Bufor Tris-HCI, pH 7,5	Invitrogen	15567027
Mikroskop odwrócony ZEISS	Axio	Vert.A1