Method Article

Kwantyfikacja parametrów czasoprzestrzennych egzocytozy komórkowej w komórkach z mikrowzorami

DOI:

10.3791/60801

⸱

September 16th, 2020

 ,  ,  , 
1Unité Mixte de Recherche 144 CNRS, Molecular Mechanisms of Intracellular Transport group, Institut Curie, 75005 Paris, France, 2PSL Research University, Paris, France, 3Sorbonne Université, Paris, France, 4INRIA, Université Paris-Sud, PSL

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie na żywo lizosomalnej egzocytozy na mikrowzorcach komórek pozwala na przestrzenną kwantyfikację tego procesu. Normalizacja morfologii za pomocą mikrowzorców jest znakomitym narzędziem do odkrywania ogólnych zasad dotyczących przestrzennego rozkładu procesów komórkowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie na żywo pHluorin oznaczone jako rozpuszczalny N-etylomaleimid-wrażliwy-czynnik białka przyczepiającego REceptor (v-SNARE) Pęcherzykowe białko błonowe 7 (VAMP7) za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) to prosty sposób na zbadanie wydzielania z przedziału lizosomalnego. Wykorzystując hodowlę komórkową na powierzchniach z mikrowzorami w celu normalizacji kształtu komórki, wykorzystano szereg narzędzi statystycznych do przeprowadzenia analizy przestrzennej wzorców wydzielniczych. Korzystając z funkcji K Ripleya i testu statystycznego opartego na odległości najbliższego sąsiada (NND), potwierdziliśmy, że wydzielanie z lizosomów nie jest procesem losowym, ale wykazuje znaczne grupowanie. Warto zauważyć, że nasza analiza wykazała, że zdarzenia egzocytozy są również skupione w obszarach niezrostowych, co wskazuje, że cząsteczki adhezyjne nie są jedynymi strukturami, które mogą indukować gorące punkty wydzielnicze na błonie plazmatycznej. Mimo to odkryliśmy, że adhezja komórek zwiększa grupowanie. Oprócz precyzyjnie zdefiniowanych obszarów adhezyjnych i nieadhezyjnych, kołowa geometria tych mikrowzorów pozwala na użycie współrzędnych biegunowych, co upraszcza analizy. Użyliśmy estymacji gęstości jądra (KDE) i funkcji skumulowanego rozkładu na współrzędnych biegunowych zdarzeń egzocytozy, aby zidentyfikować wzbogacone obszary egzocytozy. W komórkach mikrowzorcowych w kształcie pierścienia grupowanie występowało na granicy między obszarami adhezyjnymi i nieadhezyjnymi. Nasza analiza pokazuje, w jaki sposób można wykorzystać narzędzia statystyczne do badania rozkładów przestrzennych różnych procesów biologicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Egzocytoza to uniwersalny proces komórkowy, w którym pęcherzyk łączy się z błoną plazmatyczną i uwalnia swoją zawartość. Pęcherzyk może albo całkowicie połączyć się z błoną plazmatyczną (pełna fuzja), albo utworzyć por fuzyjny, który pozostaje otwarty przez ograniczony czas (kiss-and-run)1. Na przykład nowo zsyntetyzowane białka są uwalniane do podłoża zewnątrzkomórkowego z pęcherzyków pochodzących z kompleksu Golgiego. Ten biosyntetyczny, następczy szlak jest pierwotny, zwłaszcza w organizmach wielokomórkowych, do wydzielania peptydów sygnałowych (np. hormonów, neuroprzekaźników) i składników macierzy zewnątrzkomórkowej (np. kolagenu), a także do transportu białek transbłonowych do błony komórkowej. Dodatkowo wydzieliny mogą występować z różnych endosomów: 1) recykling endosomów w celu ponownego wykorzystania białek transbłonowych; 2) ciała wielopęcherzykowe (MVB) do uwalniania egzosomów; i 3) lizosomy do uwalniania enzymów proteolitycznych. Wykazano, że wydzielanie endosomalne jest ważne dla wzrostu neurytów, tworzenia pseudopodiów, naprawy błony plazmatycznej i sygnalizacji zależnej od ATP2.

Aby zbadać egzocytozę na poziomie pojedynczej komórki, zastosowano kilka technik. Patch-clamp pozwala na wykrywanie pojedynczych zdarzeń egzocytozy z wysoką rozdzielczością czasową w szerokiej gamie żywych komórek3. Jednak metoda ta nie dostarcza informacji na temat lokalizacji zdarzeń egzocytozy, ani z jakiego przedziału ona występuje. Mikroskopia elektronowa umożliwia bezpośrednią wizualizację zdarzeń egzocytarnych z wysoką rozdzielczością przestrzenną, a w połączeniu z immunoznakowaniem dostarcza informacji o specyficzności zaangażowanych przedziałów i cząsteczek. Wadą tego podejścia jest brak informacji na temat dynamiki procesu, a także brak możliwości wykonywania badań wysokoprzepustowych. Metody mikroskopii świetlnej, takie jak mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM), która wykorzystuje ulotne pole do oświetlania fluoroforów w pobliżu szkiełka nakrywkowego (100 nm), zapewniają dobrą rozdzielczość czasową i przestrzenną do badania zdarzeń egzocytozy. Jednak ta metoda jest kompatybilna tylko z komórkami przylegającymi i może być stosowana tylko do brzusznej/dolnej części komórek.

Warto zauważyć, że błona plazmatyczna wykazuje znaczną niejednorodność opartą na kompleksach adhezyjnych, które są obecne tylko w ograniczonych obszarach. Ta niejednorodność ogranicza na przykład pobieranie różnych ligandów4. Podobnie, niedawno doniesiono, że wydzielina z kompleksu Golgiego jest skoncentrowana w "gorących punktach" w błonie plazmatycznej5. Ponadto wiadomo, że niektóre ładunki są wydzielane przez egzocytozę związaną z adhezją ogniskową6. W związku z tym należy zwrócić szczególną uwagę na pytanie, czy zdarzenia egzocytozy są losowo rozmieszczone w przestrzeni, czy też są skoncentrowane w określonych obszarach błony plazmatycznej. Zaproponowano kilka narzędzi statystycznych opartych na funkcji K Ripleya w celu zbadania tych pytań7,8,9. Nasze podejście łączy te narzędzia z mikrowzorcami w celu kontrolowania kształtu komórki i niejednorodności błony plazmatycznej. Technika ta nie tylko umożliwia rozróżnienie obszarów adhezyjnych i nieadhezyjnych, ale także umożliwia porównywanie różnych komórek i warunków oraz zwiększa moc analiz statystycznych.

Tutaj używamy różnych narzędzi statystycznych do badania przestrzennego rozkładu zdarzeń egzocytozy z przedziału lizosomalnego, monitorowanego przez obrazowanie żywych komórek VAMP7-pHluorin metodą TIRFM w mikrowzorcach znormalizowanych w kształcie pierścienia komórek hTert-RPE1. Potwierdzono, że wydzielanie z lizosomów nie jest procesem losowym8,9 i że zdarzenia egzocytozy wykazują grupowanie. Warto zauważyć, że zdarzenia egzocytozy są również skupione w obszarach nieadhezyjnych, co wskazuje, że cząsteczki adhezyjne nie są jedynymi strukturami, które mogą indukować gorące punkty wydzielnicze na błonie plazmatycznej. Niemniej jednak adhezja komórek poprawiła grupowanie. Konsekwentnie, nasza analiza zidentyfikowała wzbogacone obszary egzocytozy, które znajdowały się na granicy między obszarami adhezyjnymi i nieadhezyjnymi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie komórek z mikrowzorem

  1. Transfekcja komórek
    1. Na dzień przed transfekcją wysiewać 2,5 x 106 komórek hTERT-RPE1 do jednego dołka 12-dołkowej płytki (2 x 2 cm) w 1 ml pożywki.
    2. W dniu transfekcji należy przygotować mieszaninę transfekcji z plazmidem VAMP7-pHluorin (100 μl buforu, 0,8 μg DNA, 3 μl mieszaniny do transfekcji). Inkubować przez 10 min.
      UWAGA: VAMP7 to lizosomalny v-SNARE, połączony ze znacznikiem luminal pHluorin. Sonda pHluorin jest wygaszana przez niskie pH, ale podczas egzocytozy protony są uwalniane i pHluorin zaczyna emitować sygnał10,11.
    3. Dodaj mieszankę transfekcyjną do komórek w ich pożywce.
    4. Zmień pożywkę 4 godziny po dodaniu mieszanki transfekcyjnej na komórki.
    5. Wykorzystaj komórki do eksperymentów w ciągu najbliższych 24–48 godzin.
  2. Przygotowanie mikrowzorów (metoda fotolitografia)
    1. Umyj szkiełka nakrywkowe (o średnicy 25 mm) w etanolu i pozostaw do wyschnięcia na 5 minut.
    2. Aktywuj szkiełka nakrywkowe poprzez oświetlenie w głębokim promieniowaniu UV przez 5 minut.
    3. Stwórz wilgotną komorę, dokładnie nawilżając ręcznik papierowy, na którym umieszcza się folię parafinową. Dodać krople (30 μl na szkiełko nakrywkowe 22 mm) roztworu glikolu polietylenowego poli-L-lizyny (PLL-g-PEG) (0,1 mg/ml, 10 mM HEPES, pH = 7,4) i umieścić na nich szkiełka nakrywkowe z aktywowaną powierzchnią. Zamknąć wilgotną komorę górną częścią i inkubować szkiełka nakrywkowe przez 1 godzinę.
    4. Umyj szkiełka nakrywkowe 2x w PBS i 1x w wodzie destylowanej i pozostaw do wyschnięcia.
    5. Umyj fotomaskę kwarcową wodą destylowaną, a następnie etanolem lub propanolem. Osusz fotomaskę za pomocą przefiltrowanego przepływu powietrza.
      UWAGA: Fotomaska kwarcowa jest pokryta z jednej strony antyrefleksyjnym chromem, który zawiera otwory w postaci mikrowzorów. W protokole tym stosowana jest fotomaska zawierająca mikrowzory w kształcie pierścienia o wielkości 37 μm. Gdy na fotomaskę pada głębokie promieniowanie UV, światło może przechodzić tylko przez te otwory12.
    6. Wystaw fotomaskę (strona chromowana) na działanie głębokiego promieniowania UV przez 5 minut, aby oczyścić powierzchnię.
    7. Dodaj małe krople wody (10 μl dla szkiełka nakrywkowego 20 mm) na chromowaną stronę fotomaski. Umieść szkiełko nakrywkowe stroną nasączoną PLL-g-PEG na kropli i wysusz nadmiar wody. Upewnij się, że między maską a szkiełkami nakrywkowymi nie tworzą się pęcherzyki powietrza.
      UWAGA: Siła kapilarna wody unieruchomi szkiełka nakrywkowe.
    8. Wystaw fotomaskę na działanie głębokiego promieniowania UV przez 5 minut niechromowaną stroną do góry (szkiełka nakrywkowe są przymocowane do dolnej powierzchni).
      UWAGA: Światło może przechodzić przez otwory i modyfikować powierzchnię szkiełek nakrywkowych pokrytą PLL-g-PEG poniżej fotomaski.
    9. Usuń szkiełka nakrywkowe z fotomaski, dodając nadmiar wody.
      UWAGA: Szkiełka nakrywkowe powinny szybko odpłynąć.
    10. Szkiełka nakrywkowe inkubować w roztworze białek macierzy zewnątrzkomórkowej (50 μg/ml fibronektyny, 5 μg/ml fibrynogenu fluorescencyjnego rozcieńczonego w wodzie) na folii parafinowej w wilgotnej komorze (jak w kroku 1.2.3) przez 1 godzinę pod okapem z przepływem laminarnym><, aby uniknąć zanieczyszczenia. UWAGA: W tym momencie eksperyment można przerwać, przechowując szkiełka nakrywkowe w PBS w temperaturze 4 °C.
  3. Wysiew komórek na powierzchniach z mikrowzorami
    1. Do montażu szkiełek nakrywkowych należy użyć magnetycznego uchwytu na szkiełka nakrywkowe, który pasuje do rozmiaru szkiełek nakrywkowych z mikrowzorem. W dniu pobrania należy podgrzać uchwyt szkiełka nakrywkowego do temperatury 37 °C, aby uniknąć szoku termicznego dla komórek podczas kolejnych etapów.
    2. Przygotować pożywkę wzorcową, uzupełniając pożywkę DMEM/F12 o 20 mM HEPES i 2% penicyliny/streptomycyny.
    3. Umieść szkiełka nakrywkowe w uchwycie stroną z mikrowzorem do góry i dodaj podłoże do wzoru, gdy tylko szkiełko nakrywkowe znajdzie się na podstawie uchwytu. Dodaj uszczelkę i unieruchom za pomocą urządzenia magnetycznego. Napełnij uchwyt szkiełka nakrywkowego podłożem wzorcowym i zamknij go szklaną pokrywką.
      UWAGA: Bądź szybki, aby nie dopuścić do wyschnięcia szkiełka nakrywkowego. Nie myj uchwytu szkiełka nakrywkowego etanolem między eksperymentami, ponieważ uszczelka może zatrzymać trochę etanolu, który może reagować z PLL-g-PEG i powodować stres komórkowy. Uchwyt szkiełka nakrywkowego należy myć wyłącznie wodą z mydłem. Ponadto spoiwo można inkubować w pożywce wzorcowej w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w celu rozcieńczenia pozostałego produktu.
    4. Zebrać transfekowane komórki hTERT-RPE1 przez trypsynizację (0,5 ml na jedną płytkę 12-dołkową) i dodać 1 ml 10% pożywki FBS DMEM/F12.
    5. Dodaj 0,5 x 106 transfekowanych komórek hTERT-RPE1 do uchwytu szkiełka nakrywkowego i ponownie go zamknij. Inkubować przez 10 minut w inkubatorze.
    6. Umyj uchwyt szkiełka nakrywkowego 5x pożywką wzorcową, aby usunąć nieprzyłączone komórki i resztki FBS, dodając pożywkę wzorcową jedną pipetą i zasysając pożywkę inną pipetą, aby uzyskać przepływ mycia. Zawsze trzymaj małą objętość podłoża z wzorem w uchwycie szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć wysuszenia komórek na szkiełku nakrywkowym z mikrowzorami, co doprowadzi do śmierci komórki.
    7. Inkubować w inkubatorze przez 3 godziny, aby umożliwić pełne rozłożenie komórek.

2. Akwizycja danych o egzocytozie

  1. Obrazowanie zdarzeń egzocytozy
    1. Umieść uchwyt szkiełka nakrywkowego pod TIRM. Sygnał musi zostać wykryty przez czułą kamerę skonfigurowaną z najlepszym dostępnym formatem obrazowania.
      UWAGA: W tym eksperymencie użyto obiektywu z obiektywem 100x i kamery EMCCD z obszarem wykrywania pikseli 512 x 512, co dało rozmiar piksela 160 nm.
    2. Wyszukaj komórkę wykazującą ekspresję VAMP7-pHluorin, która jest w pełni rozprowadzona (Rysunek 1A).
      UWAGA: Komórki wykazujące ekspresję VAMP7 są łatwo identyfikowalne, ponieważ wysyłają zielony sygnał.
    3. Zmieniaj kąt lasera, aż do osiągnięcia kąta TIRF, który umożliwia wizualizację zdarzeń egzocytozy VAMP7-pHluorin. Wykonaj 5-minutową akwizycję z częstotliwością zgodną z częstością egzocytozy i skalą czasową (zwykle 3 Hz, Rysunek 1D) za pomocą oprogramowania mikroskopu.
      UWAGA: komórki hTERT-RPE1 mają wskaźnik wydzielania lizosomów około 0,3 Hz na mikrowzorcach. Egzocytoza lizosomalna trwa typowo 1 s. Charakteryzuje się szczytową intensywnością, po której następuje wykładniczy rozpad. Dyfuzja sondy powinna być w tym momencie widoczna (Rysunek 1B, C).
    4. Dla każdej komórki wykonaj również akwizycję mikrowzoru za pomocą oprogramowania mikroskopowego (Rysunek 1A).
  2. Pozyskiwanie współrzędnych egzocytozy
    1. Otwórz uzyskany film za pomocą ImageJ/FIJI. Użyj punktu menu Plik | Import | Sekwencja obrazów. Znajdź zdarzenia egzocytozy na oko. Zdarzenie egzocytozy charakteryzuje się pojawieniem się jasnego sygnału, który rozchodzi się na zewnątrz (Rysunek 1).
    2. Użyj narzędzia punktowego, aby zaznaczyć środek zdarzenia egzocytarnego. Korzystanie z aplikacji Analizuj | Zmierz, aby zmierzyć współrzędne X i Y, a także współrzędną czasową (numer przekroju). Wykonaj te pomiary dla wszystkich zdarzeń egzocytozy w filmie.
    3. Zapisz wyniki (punkt menu Wyniki | Plik | Zapisz jako). Przygotuj plik tekstowy dla każdej analizowanej komórki o nazwie "Wyniki(cell_name).txt", który zawiera wycinek, współrzędne X i współrzędne Y dla wszystkich zdarzeń egzocytozy w tej kolejności.

      Plik tekstowy powinien wyglądać tak:
      ID X Y Średnica Fereta Promień
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115

      UWAGA: Uważaj, aby zastąpić wszystkie przecinki kropkami.
    4. Zmierz środek i średnicę każdej komórki za pomocą "Narzędzia Owal". Dopasuj idealny okrąg (nie używaj owalu) i użyj "Zmierz", aby uzyskać współrzędne X i Y oraz średnicę Fereta. Zapisz tożsamość (ID) każdej komórki, współrzędne X i Y, średnicę i promień Fereta (średnica/2) w pliku tekstowym o nazwie "Spherical parameter.txt".

      Plik tekstowy powinien wyglądać tak:
      ID X Y Średnica Fereta Promień
      RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
      RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115

      UWAGA: Uważaj, aby zastąpić wszystkie przecinki kropkami.
    5. Zmierz grubość pierścienia mikrowzoru (długość przylegania) za pomocą narzędzia prostego i zapisz identyfikator komórki, promień komórki (z pliku: "Sferyczne parameter.txt") i długość przylegania w pliku tekstowym o nazwie "Wzór parameter.txt". Oblicz znormalizowaną długość przylegania, dzieląc długość przylegania przez promień komórki.
      UWAGA: Uważaj, aby zastąpić wszystkie przecinki punktami.

      Plik powinien wyglądać następująco:
      ID Promień komórki Długość adhezji Znormalizowana długość adhezji
      RPE1_WT_Cell1 115 34 0.295652174
      RPE1_WT_Cell2 115 35 0.304347826

3. Analiza przestrzenna pojedynczej komórki

  1. Pakiet R i instalacja
    UWAGA: Pakiet R do tej analizy korzysta z pakietu Spatstat 13 do obliczenia gęstości dwuwymiarowej (2D) i funkcji K Ripleya. Kod jest open-source i wykorzystuje pliki tekstowe, które zostały wcześniej opisane.
    1. Pobierz i zainstaluj język R z https://www.r-project.org/ (w tej analizie użyto wersji 3.5.2).
    2. Pobierz pakiet (i zestaw danych demonstracyjnych) ze strony: https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
    3. Zainstaluj pakiet w programie R Studio przy użyciu polecenia "Narzędzia" przy użyciu polecenia "Zainstaluj pakiety". Wybierz "Spakuj plik archiwum (.zip; .tar.gz)" dla kategorii "Zainstaluj z:" i wybierz plik pakietu. Naciśnij "Zainstaluj".
    4. Załaduj pakiet za pomocą funkcji "library("ExocytosisSpatialAnalysis")", wpisując to polecenie w R studio i naciskając "Enter".
    5. Uruchom pakiet z funkcją "ESA()", wpisując to polecenie w R studio i naciskając "Enter".
      UWAGA: Otworzy się interfejs użytkownika.
    6. Wybierz katalog dla zestawu danych (.txt plików) i katalog dla wykresów wyjściowych.
      UWAGA: Parametry analizy (patrz tekst poniżej) można zmieniać za pomocą interfejsu użytkownika.
    7. Ten skrypt automatycznie uruchomi się i przeprowadzi analizę. Udostępnia .pdf plików z odpowiednimi wykresami oraz .txt plików zawierających wyniki numeryczne.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Czasoprzestrzenne charakterystyki zdarzeń egzocytozy zostały przeanalizowane z lizosomów uwidocznionych przez VAMP7-pHluorin10,11 w komórkach hTert-RPE1. Komórki hTert-RPE1 to nietransformowane komórki, które dobrze adaptują się do mikrowzorców i były szeroko stosowane w poprzednich badaniach opartych na mikrowzorcach4,14. VAMP7 to lizosomalny v-SNARE15, który został oznaczony supe...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monitorowaliśmy zdarzenia egzocytozy z przedziału lizosomalnego za pomocą obrazowania żywych komórek TIRFM VAMP7-pHluorin w komórkach znormalizowanych mikrowzorem w kształcie pierścienia i przeprowadziliśmy rygorystyczną analizę statystyczną parametrów przestrzennych zdarzeń egzocytozy. Wykorzystując przekształconą funkcję K Ripleya i test statystyczny oparty na odległości najbliższego sąsiada, potwierdziliśmy, że wydzielanie z lizosomów nie jest procesem przypadkowym 8,9

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bardzo dziękujemy Thierry'emu Galli (Centrum Psychiatrii i Neuronauk INSERM) za dostarczenie plazmidu VAMP7-pHluorin. Dziękujemy Tarn Duong za porady dotyczące analizy statystycznej oraz członkom laboratorium GOUD za owocne dyskusje. Autorzy z dużym uznaniem należą się Zakładowi Obrazowania Komórek i Tkanek (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg i PICT-IBiSA @Pasteur) oraz Centrum Obrazowania firmy Nikon, Instytut Curie (Paryż), członek francuskiej Narodowej Infrastruktury Badawczej France-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. była wspierana przez Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC), a P.M. otrzymała dofinansowanie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach umowy o udzielenie dotacji nr 666003 w ramach działania "Maria Skłodowska-Curie". Prace te były wspierane przez granty z INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) i Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), a także Centre National de la Recherche Scientifique i Institut Curie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Komora magnetyczna ChamlideChamlide
DMEM/F12Gibco21041-025
Sondy molekularnefibrynogenuF35200
Osocze bydlęce fibronektynySigmaF1141
HEPES (1M)Gibco15630-056
hTert RPE1 linia komórkowahttps://www.atcc.org
ImageJhttp://rsbweb.nih.gov/ij/n/aAutor: W. Rasband, NIH/NIMH
Odczynnik do transfekcji JetPRIMEPolyplus114-07
Penicilin/StreptomycynaGibco15140-122
PhotomaskDelta Mask
Roztwór PLL-g-PEGRozwiązania powierzchniowePLL(20)-g[3.5]- PEG(2)
R Softwarehttps://www.r-project.org/n/a
Trypsin (TrypLE Express 1X)Gibco12605-010
Piec ozonowy UVJelight Company Inc342-220
VAMP7-pHFluorinplazmid n/an/dReferencje papieru: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis.
J Biol Chem. 2008 5 grudnia; 283(49):34365-73. DOI: 10.1074/JBC. M804587200.
Rola HRB w endocytozie zależnej od klatryny.
Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T.
, Invitrogen

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
  2. Samie, M. A., Xu, H. Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders. Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).
  3. Neher, E., Marty, A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).
  4. Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling. The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).
  5. Fourriere, L., et al. RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions. Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).
  6. Wang, Y., McNiven, M. A. Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex. Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).
  7. Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics. PLoS One. 12, 80914(2013).
  8. Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion "Hotspots" Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells. Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).
  9. Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).
  10. Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth. Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).
  11. Alberts, P., et al. Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane. Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).
  12. Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).
  13. Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , CRC Press. Indianapolis, IN. (2015).
  14. Schauer, K., et al. Probabilistic density maps to study global endomembrane organization. Nature Methods. 7, 560-566 (2010).
  15. Advani, R. J., et al. Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments. Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).
  16. North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures. American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).
  17. Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy. eLife. 7, 32311(2018).
  18. Chen, S. X. Beta kernel estimators for density functions. Computational Statistics & Data Analysis. 31, 131-145 (1999).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Exocytosis AnalysisTIRF MicroscopyMicropatterned CellsRipley K FunctionKernel Density EstimationVAMP7 pHluorinSpatial StatisticsCell AdhesionLysosomal SecretionStatistical Analysis

Related Articles