Identyfikacja receptorów na powierzchni komórki za pomocą genetycznych badań przesiewowych CRISPR/Cas9 w skali genomu

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje metodę badań przesiewowych na skalę genomu opartą na komórkach w celu identyfikacji interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy.

Streszczenie

Komunikacja międzykomórkowa, w której pośredniczą bezpośrednie interakcje między receptorami na powierzchni komórki osadzonej w błonie, jest kluczowa dla prawidłowego rozwoju i funkcjonowania organizmów wielokomórkowych. Wykrywanie tych interakcji pozostaje jednak wyzwaniem technicznym. Niniejszy manuskrypt opisuje systematyczne podejście do genetycznego nokautowania CRISPR/Cas9 w skali genomu, które ujawnia szlaki komórkowe wymagane dla określonych zdarzeń rozpoznawania powierzchni komórki. Test ten wykorzystuje rekombinowane białka wytwarzane w systemie ekspresji białek ssaków jako zapalone sondy wiążące do identyfikacji partnerów interakcji w genetycznym badaniu przesiewowym opartym na komórkach. Metoda ta może być wykorzystana do identyfikacji genów niezbędnych do interakcji na powierzchni komórki wykrywanych przez rekombinowane sondy wiążące odpowiadające ektodomenom receptorów osadzonych w błonie. Co ważne, biorąc pod uwagę charakter tego podejścia w skali genomu, ma ono również tę zaletę, że nie tylko identyfikuje bezpośredni receptor, ale także komponenty komórkowe, które są wymagane do prezentacji receptora na powierzchni komórki, dostarczając w ten sposób cennych informacji na temat biologii receptora.

Wprowadzenie

Zewnętrzne interakcje białek receptorowych na powierzchni komórki kierują ważnymi procesami biologicznymi, takimi jak organizacja tkanek, rozpoznawanie gospodarza-patogenu i regulacja immunologiczna. Badanie tych interakcji jest interesujące dla szerszej społeczności biomedycznej, ponieważ receptory błonowe są celami systematycznie dostarczanych środków terapeutycznych, takich jak przeciwciała monoklonalne. Pomimo ich znaczenia, badanie tych interakcji pozostaje wyzwaniem technicznym. Dzieje się tak głównie dlatego, że receptory osadzone w błonie są amfipatyczne, co utrudnia ich wyizolowanie od błon biologicznych w celu manipulacji biochemicznej, a ich interakcje charakteryzują się słabym powinowactwem do interakcji (K_Ds w zakresie μM-mM)¹. W związku z tym wiele powszechnie stosowanych metod nie nadaje się do wykrywania tej klasy interakcji białkowych^1,2.

Opracowano szereg metod w celu szczegółowego badania interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy, które uwzględniają ich unikalne właściwości biochemiczne³. Wiele z tych podejść obejmuje ekspresję całej ektodomeny receptora jako rozpuszczalnego białka rekombinowanego w systemach opartych na komórkach ssaków lub owadów, aby zapewnić, że białka te zawierają modyfikacje potranslacyjne, które są ważne strukturalnie, takie jak glikany i wiązania dwusiarczkowe. Aby przezwyciężyć wiązanie o niskim powinowactwie, ektodomeny są często oligomeryzowane, aby zwiększyć ich awidność wiązania. Ektodomeny białkowe Avid zostały z powodzeniem wykorzystane jako sondy wiążące do identyfikacji partnerów interakcji w bezpośrednich rekombinowanych ekranach interakcji białko-białko^4,5,6,7. Chociaż metody oparte na białkach rekombinowanych są szeroko skuteczne, wymagają, aby ektodomena receptora błonowego była wytwarzana jako białko rozpuszczalne. W związku z tym ma ogólne zastosowanie tylko do białek, które zawierają ciągły region zewnątrzkomórkowy (np. jednoprzebiegowe typu I, typu II lub zakotwiczone w GPI) i nie jest ogólnie odpowiedni dla kompleksów receptorowych i białek błonowych, które wielokrotnie obejmują błonę.

Techniki klonowania wyrażeń, w których biblioteka komplementarnych DNA (cDNA) jest transfekowana do komórek i testowana pod kątem fenotypu wzmocnienia wiązania, zostały również wykorzystane do identyfikacji zewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko⁸. Dostępność dużych zbiorów sklonowanych i zsekwencjonowanych plazmidów ekspresji cDNA w ostatnich latach ułatwiła metody, w których linie komórkowe z nadekspresją cDNA kodujące receptory na powierzchni komórki są badane pod kątem wiązania białek rekombinowanych w celu identyfikacji interakcji^9,10. Podejścia oparte na nadekspresji cDNA, w przeciwieństwie do metod opartych na rekombinacji białek, dają możliwość identyfikacji interakcji w kontekście błony komórkowej. Jednak sukces stosowania konstruktów ekspresji cDNA zależy od zdolności komórek do nadekspresji białka w prawidłowo sfałdowanej formie, ale często wymaga to komórkowych czynników dodatkowych, takich jak transportery, białka opiekuńcze i prawidłowe składanie oligomeryczne. Transfekcja pojedynczego cDNA może zatem nie wystarczyć do osiągnięcia ekspresji na powierzchni komórki.

Techniki przesiewowe wykorzystujące konstrukty cDNA lub rekombinowane sondy białkowe są zasobożerne i wymagają dużych zbiorów cDNA lub bibliotek białek rekombinowanych. Specjalnie zaprojektowane metody oparte na spektrometrii mas zostały ostatnio wykorzystane do identyfikacji oddziaływań zewnątrzkomórkowych, które nie wymagają składania dużych bibliotek. Techniki te wymagają jednak chemicznej manipulacji powierzchnią komórki, która może zmienić biochemiczny charakter cząsteczek obecnych na powierzchni komórek i obecnie ma zastosowanie tylko w przypadku interakcji, w których pośredniczą białka glikozylowane^11,12. Większość obecnie dostępnych metod również w dużym stopniu koncentruje się na interakcjach między białkami, w dużej mierze ignorując wkład mikrośrodowiska błonowego, w tym cząsteczek takich jak glikany, lipidy i cholesterol.

Niedawny rozwój wysoce efektywnego celowania bialleleicznego przy użyciu metod opartych na CRISPR umożliwił biblioteki w skali genomu komórek pozbawionych zdefiniowanych genów w jednej puli, które mogą być badane w systematyczny i bezstronny sposób w celu identyfikacji komponentów komórkowych zaangażowanych w różne konteksty, w tym analizowanie procesów sygnalizacji komórkowej, identyfikacja zaburzeń nadających odporność na leki, toksyny, i patogenów oraz określanie swoistości przeciwciał^13,14,15,16. W tym miejscu opisujemy test przesiewowy komórek nokautujących oparty na CRISPR w skali genomu, który stanowi alternatywę dla obecnych podejść biochemicznych do identyfikacji interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy. To podejście polegające na identyfikowaniu interakcji, w których pośredniczą receptory błonowe, za pomocą genetycznych badań przesiewowych jest szczególnie odpowiednie dla badaczy, którzy koncentrują się na pojedynczych ligandach, ponieważ pozwala uniknąć konieczności kompilowania dużych bibliotek cDNA lub rekombinowanych białek.

Ten test składa się z trzech głównych etapów: 1) Wysoce zapalone sondy wiążące białka rekombinowane, składające się z zewnątrzkomórkowych regionów receptora będącego przedmiotem zainteresowania, są produkowane i używane w testach wiązania opartych na cytometrii przepływowej opartej na fluorescencji; 2) Testy wiązania służą do identyfikacji linii komórkowej, która wyraża partnera interakcji rekombinowanej sondy białkowej; 3) Wytwarzana jest wersja linii komórkowej z ekspresją Cas9, która oddziałuje z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, a następnie przeprowadza się badanie przesiewowe nokautu oparte na CRISPR / Cas9 w skali genomu (Figura 1). W tym genetycznym badaniu przesiewowym wiązanie rekombinowanego białka z liniami komórkowymi jest wykorzystywane jako mierzalny fenotyp, w którym komórki w bibliotece nokautu, które utraciły zdolność wiązania sondy, są sortowane za pomocą opartego na fluorescencji aktywnego sortowania komórek (FACS) i genów, które spowodowały utratę fenotypu wiązania zidentyfikowanego przez sekwencjonowanie. W zasadzie identyfikowane są geny kodujące receptor odpowiedzialny za wiązanie sondy Avid oraz te, które są niezbędne do wyświetlania jej powierzchni komórki.

Pierwszy krok tego protokołu polega na produkcji rekombinowanych sond białkowych reprezentujących ektodomenę receptorów związanych z błoną. Wiadomo, że receptory te często zachowują swoje zewnątrzkomórkowe funkcje wiązania, gdy ich ektodomeny są wyrażane jako rekombinowane rozpuszczalne białko¹. W przypadku białka będącego przedmiotem zainteresowania, rozpuszczalne białka rekombinowane mogą być wytwarzane w dowolnym odpowiednim systemie ekspresji białek eukariotycznych w dowolnym formacie, pod warunkiem, że mogą być oligomeryzowane w celu zwiększenia awidności wiązania i zawierają znaczniki, które można stosować w testach wiązania opartych na cytometrii przepływowej opartej na fluorescencji (np. znacznik FLAG, znacznik biotyny). Szczegółowe protokoły wytwarzania rozpuszczalnych ektodomen receptorów błonowych z wykorzystaniem systemu ekspresji białek HEK293, a także różne techniki multimeryzacji i konstrukty ekspresji białek do produkcji zarówno białek pentamerycznych, jak i białek monomerycznych zostały wcześniej opisane1^,17. Protokół tutaj opisze etapy generowania fluorescencyjnych sond avid z monomerycznych biotynylowanych białek poprzez sprzężenie ich ze streptawidyną sprzężoną z fluorochromem (np. fikoerytryną lub PE), która może być stosowana bezpośrednio w testach wiązania opartych na komórkach i ma tę zaletę, że nie wymaga wtórnego przeciwciała do wykrywania. Ogólne protokoły wykonywania badań przesiewowych w skali genomu zostały już opisane^20,21, dlatego protokół koncentruje się głównie na specyfice wykonywania badań przesiewowych wiązania białek rekombinowanych opartych na cytometrii przepływowej przy użyciu systemu badań przesiewowych CRISPR/Cas9 knockout przy użyciu 18.

Protokół

1. Produkcja i oczyszczanie biotynylowanych białek znakowanych Hisem

1. Stosować system ekspresji białek oparty na komórkach ssaków lub owadów do produkcji rozpuszczalnych, rekombinowanych, znakowanych His, biotynylowanych białek (patrz konstrukcje plazmidowe w Tabeli 1).
   UWAGA: Szczegółowy protokół produkcji monomerycznej biotyny i białek znakowanych Hisem przy użyciu systemu ekspresji komórkowej HEK293 jest opisany przez Kerr et al.¹⁷. Ektodomeny białkowe ulegające ekspresji za pomocą systemu ekspresji HEK293 są wydzielane do pożywki hodowlanej.
2. Zebrać rozpuszczalne białka przez granulowanie komórek przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 20 minut.
3. Przefiltrować supernatant przez filtr 0,22 μm i dodać kulki agarozy Ni²⁺-NTA do przefiltrowanego supernatantu białkowego w stosunku 1:1,000 (tj. 50 μl 50% zawiesiny agarozy w 50 ml supernatantu). Inkubować przez noc lub co najmniej 4-5 godzin w temperaturze 4 °C na platformie obrotowej.
4. Przemyć kolumnę polipropylenową, dodając 5 ml buforu do płukania His-purification. Patrz tabela 2, aby zapoznać się ze wszystkimi składami.
5. Wlej całą mieszaninę supernatantu z białkiem perełkowym do kolumny. Koraliki będą gromadzić się u podstawy.
6. Umyj koraliki 2x 15 ml buforu do mycia. Aby uniknąć rozcieńczenia białka, ostrożnie pobrać resztki buforu do płukania z kolumny za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml i wyrzucić.
7. Ostrożnie dodać 300-500 μl buforu elucyjnego do oczyszczania His bezpośrednio do kulek i inkubować przez co najmniej 1 godzinę. Zebrać wymyte białko, ponownie ostrożnie wyciągając płyn za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Wymienić bufor elucyjny na żądany bufor (np. zwykle PBS lub HBS) za pomocą kolumn odsalających. Przechowywać wszystkie białka w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.

2. Kwantyfikacja i oligomeryzacja monomerycznego białka biotynylowanego

UWAGA: Aby zwiększyć awidność wiązania, oligomeryzuj biotynylowane białka monomeryczne na tetramerycznej streptawidynie-PE przed użyciem ich w testach wiązania. Osiągnąć optymalne współczynniki koniugacji białek monomerycznych i tetramerycznej streptawidyny-PE poprzez badanie serii rozcieńczeń biotynylowanych monomerów w stosunku do ustalonego stężenia streptawidyny i empiryczne ustalenie minimalnego rozcieńczenia, przy którym nie można wykryć nadmiaru biotynylowanych monomerów.

1. Wykonać co najmniej osiem seryjnych rozcieńczeń biotynylowanych próbek białka przy użyciu odpowiedniego buforu rozcieńczającego (PBS lub HBS z 1% albuminą surowicy bydlęcej [BSA]) na płytce 96-dołkowej. Upewnij się, że końcowa objętość każdego rozcieńczenia wynosi co najmniej 200 μl.
2. Wykonać duplikat płytki z próbek, usuwając 100 μl z każdej studzienki i przenosząc do nowej płytki 96-dołkowej. Zawsze dołączaj kontrolkę. W tym przypadku kontrole są białkami tylko znacznikowymi (tj. biotynylowanym białkiem domeny Cd4 3 + 4 znakowanym Hisem). Będzie to używane jako sonda kontrolna we wszystkich testach wiązania.
3. Rozcieńczyć streptawidynę-PE do 0,1 μg/ml w buforze rozcieńczającym.
4. Tylko na jedną z płytek dodać 100 μl rozcieńczonej streptawidyny-PE. Zduplikowana tabliczka będzie służyć jako kontrolka. Dodać 100 μl buforu rozcieńczającego do płytki kontrolnej w celu wyrównania objętości.
5. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT). W międzyczasie należy zatkać studzienki płytki pokrytej streptawidyną buforem rozcieńczającym na 15 minut.
6. Przenieść całkowitą objętość próbki z obu płytek do poszczególnych studzienek płytek pokrytych streptawidyną i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
7. Przemyć płytkę 3x 200 μl buforu do przemywania (tj. PBS lub HBS z 0,1% Tween-20, 2% BSA). Dodać 100 μl mysiego anty-szczura Cd4d3+4 IgG (OX68) o stężeniu 2 μg/ml i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
8. Umyj płytkę 3x buforem do mycia. Dodać 100 μl koniugatu fosfatazy alkalicznej przeciw myszom w stężeniu 0,2 μg/ml przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
9. Przemyć płytkę 3x buforem do przemywania i 1x w buforze rozcieńczającym.
10. Przygotować fosforan p-nitrofenylu w stężeniu 1 mg/ml w buforze dietanoloaminy. Dodać 100 μl do każdej studzienki i inkubować przez 15 minut.
11. Wykonaj odczyty absorbancji przy 405 nm. Użyj minimalnego rozcieńczenia, przy którym nie ma sygnału na płytce, jako odpowiedniego współczynnika rozcieńczenia do wytworzenia tetramerów (Rysunek 2).
12. Sporządzić 10-krotny roztwór do barwienia tetramerów dla wszystkich próbek i kontroli, inkubując 4 μg/ml streptawidyny-PE i odpowiednie rozcieńczenie biotynylowanego białka przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przechowywać sprzężone białka w probówce zabezpieczonej przed światłem w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.

3. Testy wiązania komórek oparte na cytometrii przepływowej

1. W przypadku komórek przylegających usuń pożywkę hodowlaną i przemyj 1x PBS bez kationów dwuwartościowych. Następnie dodaj roztwory odłączające komórki (np. EDTA). Pozwól komórkom oderwać się na 5-10 minut. Delikatnie postukać w kolbę, aby uwolnić komórki.
   UWAGA: Unikaj stosowania produktów na bazie trypsyny, ponieważ mogą one rozszczepiać białka powierzchniowe komórek.
2. Zbierz oderwane komórki do probówki. W przypadku komórek rosnących w zawiesinie (np. komórek HEK293) należy bezpośrednio pobrać komórki z kolb hodowlanych do probówki.
3. Komórki osadu w ilości 200 x g przez 5 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w buforze do przemywania (tj. PBS/1% BSA).
4. Policz komórki za pomocą hemocytometru i dostosuj stężenie do 2,5 x 10^5-1 x 10⁶ komórek/ml. Podwielokrotność 100 μl przygotowanej mieszanki komórek na 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U lub V. Wirować płytkę przez 5 minut przy 400 x g. Usunąć supernatant za pomocą pipety wielokanałowej.
5. Dodać 100 μl znormalizowanych, znakowanych fluorescencyjnie, wysoce avid sond białkowych i kontroli do wcześniej przygotowanych płytek z komórkami i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Po związaniu przez 1 godzinę obracać płytkę o gramaturze 400 x g przez 5 min.
6. Usunąć supernatant i dodać 200 μl buforu do przemywania (tj. PBS/1% BSA). Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół.
7. Granulować komórki przez odwirowanie przy 400 x g przez 5 min. Powtórzyć etap mycia 1x. Po dwóch płukaniach całkowicie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl PBS.
8. Analizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Użyj żółto-zielonego lasera (tj. 561 nm), aby wykryć fluorescencję PE.
   1. Najpierw przeanalizuj komórki, które zostały zabarwione sondą kontrolną. Opierając się na rozkładzie fluorescencji PE, narysuj bramkę do wiązania populacji tak, aby nie więcej niż 1% komórki kontrolnej wpadło do tej bramki.
   2. Przeanalizuj próbkę i określ frakcję komórek, która wpada do bramki wiążącej.
      UWAGA: Linie komórkowe, które wykazują wyższą populację wiązań, są pożądane w badaniach genetycznych, ponieważ mają wyższy stosunek sygnału do szumu. Idealnie byłoby, gdyby ponad 80% komórek mieściło się w tej bramce.

4. Określanie wkładu wiązania epitopów termolabilnych i łańcuchów bocznych siarczanu heparanu

UWAGA: Aktywność wielu białek jest niewymierna, więc utrata aktywności wiązania po obróbce cieplnej jest zachęcająca. Zaleca się określenie udziału ujemnie naładowanych glikozaminoglikanów, głównie siarczanu heparanu (HS), w pośredniczeniu w wiązaniu rekombinowanych białek. Dzieje się tak dlatego, że wiązanie przez HS w opisanym tutaj teście wiązania komórkowego może być addytywne, a nie współzależne od innych receptorów¹⁹. Oznacza to, że obserwowane wiązanie może być całkowicie pośredniczone przez łańcuchy boczne HS proteoglikanów na powierzchni komórki, a nie przez specyficzny receptor. Wiązanie z HS na powierzchni komórki niekoniecznie jest niespecyficzne, ale raczej jest właściwością białka, którą warto znać przed wykonaniem pełnego badania genetycznego.

1. Przygotuj próbki białek poddane obróbce cieplnej do wykorzystania w testach wiązania.
   1. Podgrzewać znormalizowane, ale niesprzężone białko monomeryczne w temperaturze 80 °C przez 10 minut.
   2. Sprzężyć białko poddane obróbce cieplnej ze streptawidyną-PE, przyjmując taki sam współczynnik koniugacji, jak jego niepoddane działaniu odpowiednika, jak określono za pomocą testu ELISA (patrz sekcja 2).
2. Przygotuj próbki białek z zablokowaną heparyną.
   1. Przygotować osiem rozcieńczeń rozpuszczalnej heparyny w PBS w stosunku 1:3 o stężeniu początkowym 2 mg/ml i objętości końcowej 100 μl.
   2. Inkubować 100 μl przygotowanych sond wiążących w rozcieńczeniach heparyny przez co najmniej 30 minut.
3. Użyć białka poddanego obróbce termicznej i pełnych 200 μl mieszaniny heparyny i białka w testach wiązania opisanych w punkcie 3. Reprezentatywne wyniki są pokazane w Rysunek 3A,B.

5. Wybór linii komórkowych stabilnie wyrażających Cas9

UWAGA: Zanim linia komórkowa wiążąca sondę będzie mogła zostać wykorzystana w badaniach przesiewowych CRISPR, musi najpierw zostać zaprojektowana tak, aby wyrażała nukleazę Cas9 i wysoce aktywny klon selected¹⁹.

1. Do wytworzenia lentiwirusa przy użyciu konstruktu lentiwirusa należy zastosować następujący ogólny protokół produkcji lentiwirusa przy użyciu konstruktu lentiwirusowego dla ekspresji Cas9 (patrz Tabela 1).
   1. Hodowla komórek HEK293-FT w pożywce DMEM/10% FBS w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Wysiewaj komórki HEK293-FT 1 dzień przed transfekcją, tak aby w dniu transfekcji zlewały się w ~80%.
      UWAGA: HEK293FT komórki są luźno przylegające; Dlatego, gdy są one używane do produkcji lentiwirusów, należy rozważyć umieszczenie ich na kolbach hodowlanych pokrytych 0,1% (w/v) żelatyną, aby zwiększyć ich przyczepność.
   2. Wykonuj transfekcje rano. Dodaj wektor transferu, mieszankę opakowaniową i odczynnik do transfekcji do wstępnie podgrzanych pożywek kompatybilnych z transfekcją (np. Opti-MEM). Wymieszaj, odwracając rurkę 10-15x. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dokładne objętości znajdują się w Tabeli 3.
   3. Dodać odczynnik do transfekcji zgodnie z zaleceniami producenta. Wymieszaj przez szybkie wirowanie. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Bardzo ostrożnie odessać zużyte podłoże. Dodaj nośnik zgodny z transfekcją do płyty.
   5. Dodaj odczynnik do transfekcji/kompleksy DNA kroplami na bok płytki i powoli rozprowadź po płytce, bardzo delikatnie mieszając.
   6. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3-5 godzin i zastąpić pożywkę pożywką D10. Inkubować przez noc.
   7. Następnego dnia rano zastąp pożywkę świeżą pożywką D10. Inkubować przez noc.
   8. Następnego dnia późnym popołudniem zbierz supernatant wirusa. Filtr z filtrem 0,45 μm o niskim wiązaniu z białkami. Opcjonalnie dodać świeżą pożywkę D10, inkubować przez noc i zebrać supernatant następnego dnia.
   9. Supernatanty wirusa utrzymują się w stabilnej temperaturze 4 °C tylko przez kilka dni. Przechowywać w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.
      UWAGA: Aby wytworzyć wysoce skoncentrowany preparat lentiwirusowy, który może być pożądany do transdukcji trudnych do transdukcji komórek, supernatanty można również zagęścić przez odwirowanie w temperaturze 6 000 x g przez noc w temperaturze 4 °C. Oznaczyć półprzezroczysty osad wirusa za pomocą wstrzykiwacza odpornego na etanol i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad w 1/100 pierwotnej objętości, aby uzyskać 100-krotny wzrost stężenia.
2. Transdukuj komórki za pomocą lentiwirusów.
   1. Płytka 1 x 10⁶ komórek na studzienkę na płytce 6-dołkowej z 3 ml odpowiedniej pożywki hodowlanej. Niektóre komórki są łatwiej transdukowane niż inne. W przypadku łatwych do transdukcji komórek (np. komórek HEK) należy bezpośrednio dodać lentiwirusa do komórek. W przypadku komórek trudnych do transdukcji może być konieczne przestrzeganie protokołu spinokulacji, jak opisano poniżej.
      1. Podwielokrotność 2 ml 2-5 x 10⁶ komórek/ml w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
      2. Dodać lentiwirusa razem z 8 μg/ml bromku heksadimetryny i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
      3. Wirować przez 100 minut przy 800 x g w temperaturze 32 °C. Następnie ponownie zawiesić komórki w tej samej pożywce i dodać zawiesinę komórek do odpowiednich kolb hodowlanych z odpowiednią pożywką.
   2. Pozwól na transdukcję przez co najmniej 24 godziny. Następnie usuń pożywkę zawierającą wirusa i dodaj nową pożywkę.
   3. Po kolejnych 24 godzinach należy zmienić podłoże na takie, które jest uzupełnione odpowiednimi antybiotykami. Konstrukcja Cas9 zawiera kasetę odporną na blasticydynę do wyboru.
      UWAGA: Ilość blastycydyny musi być zoptymalizowana dla każdej linii komórkowej poprzez wykonanie krzywej zabijania odpowiedzi na dawkę. Stężenie blasticydyny między 2,5-50 μg/ml powinno zabić większość nietransdukowanych linii komórkowych w ciągu 10 dni od transdukcji.
3. Przeprowadzaj selekcję, aż wszystkie komórki na płytce kontrolnej (tj. komórki nietransdukowane, które były leczone tym samym stężeniem antybiotyków selekcyjnych) zostaną zabite.

6. Wybieranie klonów o wysokiej aktywności Cas9

UWAGA: Poliklonalny Cas9 może być używany do skutecznego przeprowadzania badań genetycznych; jednak wybór klonu o wysokiej aktywności Cas9 poprawia wyniki badań przesiewowych¹⁸.

1. Stosować rozcieńczenie ograniczające lub sortować pojedyncze komórki oporne na blasticydynę do studzienek składających się z trzech 96-dołkowych płytek zawierających pożywki hodowlane uzupełnione blasticydyną. Klony zaczną pojawiać się między 2-4 tygodniami. Wybierz 10-20 klonów i rozwiń się w 6 dołkach.
2. Oznacz klony pod kątem aktywności Cas9 za pomocą szybkiego do oceny systemu GFP-BFP (zielone białko fluorescencyjne-niebieskie białko fluorescencyjne), który wykorzystuje egzogenny system nokautowania genów, w którym komórki są transdukowane albo za pomocą konstruktu wyrażającego GFP z GFP ukierunkowanym na gRNA, albo pustego gRNA jako kontrola¹⁸.
   1. Zamów plazmidy reporterowe: plazmid GFP-BFP, plazmid Control-BFP (Tabela 1).
   2. Wytwarzać lentiwirusa zarówno dla plazmidu GFP-BFP, jak i plazmidu Control-BFP, stosując protokół produkcji lentiwirusa opisany w sekcji 5.1.
   3. Transdukuj każdy klon linii komórkowej z ekspresją Cas9 z lentiwirusem kodującym system GFP-BFP i Control-BFP oddzielnie. Postępuj zgodnie z protokołem w sekcji 5.2.
   4. Po 3 dniach transdukcji zbadaj fluorescencję GFP-BFP każdego klonu za pomocą cytometrii przepływowej. Użyj lasera 488 nm i lasera 405 nm do wykrywania odpowiednio GFP i BFP.
   5. Określ ilościowo aktywność Cas9 w każdym klonie, badając stosunek tylko BFP do podwójnie dodatnich komórek GFP-BFP. Ogniwa Cas9 o wysokiej aktywności powinny mieć >95% skuteczność nokautowania GFP (Rysunek 4).

7. Generowanie biblioteki nokautów przesiewowych CRISPR-Cas9 dla całego genomu

1. W przypadku badań przesiewowych całego genomu przy użyciu biblioteki Human V1¹⁸ należy zamówić bibliotekę obejmującą cały genom (patrz Tabela 1) i przygotować bibliotekę plazmidów z ukłucia bakteryjnego, korzystając z protokołu podanego w sekcji "Protokoły replikacji biblioteki" w instrukcji producenta.
2. Preparat plazmidu z biblioteki całego genomu należy wykorzystać do wytworzenia biblioteki lentiwirusowej kodującej gRNA w celu ukierunkowanego zakłócenia genów ludzkich przy użyciu protokołu produkcji lentiwirusa opisanego w sekcji 5.1.
   UWAGA: Dobrą praktyką jest wyprodukowanie pojedynczej partii preparatu lentiwirusowego, który jest zoptymalizowany pod kątem transdukcji w celu poprawy konsystencji eksperymentalnej.
3. Protokół transdukcji w sekcji 5.2 należy wykorzystać do przeprowadzenia próbnych transdukcji na małą skalę w celu określenia wymaganej ilości wirusa dla każdej linii komórkowej, aby osiągnąć 30% transdukcji. Użyj cytometrii przepływowej do oceny fluorescencji BFP jako wskaźnika zastępczego dla wydajności transdukcji.
4. Aby transdukować komórki HEK293, wystarczy dodać wcześniej określony preparat lentiwirusowy do 30-50 x 10⁶ komórek hodowanych w normalnych pożywkach wzrostowych przez ~ 4 godziny. Następnie usuń pożywkę z lentiwirusem i zastąp ją świeżą pożywką wzrostową.
5. W przypadku innych linii komórkowych należy zastosować protokół spinokulacji opisany w sekcji 5.2.1, ale na większą skalę, tak aby w sumie transdukować 30-50 x 10⁶ komórek. W tym celu należy podać 2 ml 5 x 10⁶ komórek/ml w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i postępować zgodnie ze wskazaniami.
6. W przypadku przylegających linii komórkowych wybierz transdukowane komórki, dodając puromycynę 24 godziny po transdukcji.
   UWAGA: Zoptymalizuj stężenia puromycyny, wykonując krzywą zabijania odpowiedzi na dawkę. Zwykle stężenia od 1 do 10 μg/ml powinny zabić nietransdukowane komórki w ciągu 3-5 dni. Unikaj stosowania wyższych stężeń puromycyny, ponieważ może to zwiększyć szanse na wybór komórek, które zostały transdukowane przez więcej niż jeden przewodnik RNA (sgRNA).
7. W przypadku komórek zawiesinowych należy zebrać komórki transdukowane (tj. BFP dodatnie) 3 dni po transdukcji za pomocą sortera komórek i wygenerować biblioteki zawierające co najmniej 10 x 10⁶ komórek. Po wybraniu za pomocą BFP hoduj komórki w pożywce uzupełnionej odpowiednią ilością puromycyny.
   UWAGA: Unikaj selekcji tylko z puromycyną dla zawiesinowych linii komórkowych, ponieważ trudno jest usunąć martwe komórki i zanieczyszczenia z zawiesinowych hodowli komórkowych, które mogą zakłócać sortowanie komórek.
8. Biblioteka mutantów kultur przez 9-16 dni po transdukcji z regularnym pasażem co 2-3 dni.

8. Genetyczne badania przesiewowe pod kątem wiązania powierzchni komórek

1. Zagnieżdżać bibliotekę zmutowanych komórek o masie 200 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić komórki w PBS.
2. Podziel komórki na dwie stożkowe probówki o pojemności 15 ml z co najmniej 50 x 10⁶ komórek w każdej probówce.
3. Wirować jedną stożkową probówkę o masie 200 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i zamrozić osad komórkowy w temperaturze -20 °C. Jest to populacja kontrolna i zostanie przetworzona później.
4. Zawiesić osad w drugiej probówce w 10 ml PBS/1% BSA. Odłóż 100 μl komórek jako kontrolę ujemną na 96-dołkowej płytce.
5. Dodać odpowiednie wstępnie sprzężone białko rekombinowane do zawiesiny komórkowej w stożkowej probówce i ujemne białka kontrolne do płytki 96-dołkowej.
6. Barwienie komórek należy wykonywać przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 4 °C na wirniku stołowym z delikatnymi obrotami (6 obr./min).
7. Osadzać komórki w masie 200 x g przez 5 minut, usunąć supernatant. Wykonaj dwa etapy mycia, a następnie ponownie zawieś komórki w 5 ml PBS.
8. Przecedź komórki przez sitko o średnicy 30 μm, aby usunąć skupiska komórek. Analizuj za pomocą sortera przepływowego.
9. Użyj próbki kontroli ujemnej do bramki dla komórek BFP+/PE-.
10. Posortuj próbkę i zbierz komórki BFP+/PE-. Bramki sortowania będą zależeć od wiązania komórek z białkiem, ale zwykle pobiera się 1-5% próbek PE ujemnych. Przykład bramki sortującej przedstawiono na rysunku uzupełniającym 1.
11. Zbierz 500 000-1 000 000 komórek z wybranej bramy. Biorąc pod uwagę małą liczbę komórek, rozważ zebranie próbek w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml, aby zminimalizować straty.
12. Posortowane komórki osadzać przez odwirowywanie przy 500 x g przez 5 minut. Ostrożnie usunąć supernatant i wyrzucić. Możliwe jest przechowywanie granulatu w temperaturze -20 °C do 6 miesięcy.

9. Ekstrakcja genomowego DNA i pierwszy PCR do wzbogacenia gRNA

1. Wyodrębnij genomowe DNA z populacji kontrolnej o wysokiej złożoności.
   1. Jeżeli populacja kontrolna została zamrożona w temperaturze -20 °C, wyjąć stożkową rurkę i dodać PBS. Trzymaj na lodzie, aby rozmrozić granulkę.
   2. Użyj zestawu komercyjnego (patrz tabela materiałów), korzystając z zaleceń producenta, aby wyodrębnić genomowe DNA z komórek 50 x 10⁶. Dostosuj stężenie DNA do 1 mg/ml.
   3. Dla każdej próbki należy przygotować mieszankę wzorcową do PCR odpowiadającą 72 μg DNA. Podwielokrotność 50 μl na basenik w 36 dołkach 96-dołkowej płytki PCR. Niezbędne sekwencje starterów są wymienione w tabeli 4. Skorzystaj z przewodnika w tabeli 5 i 6.
   4. Rozpuścić 5 μl PCR z 6-12 reprezentatywnych próbek na 2% (w/v) żelu agarozowym. Należy zaobserwować pojedynczą wyraźną wstęgę przy ~250 pz. Jeśli prążki są słabe, powtórz PCR przez dodatkowe 2-3 cykle.
   5. Za pomocą pipety wielokanałowej zebrać 5 μl produktów PCR z każdej studzienki (łącznie 180 μl) i umieścić je w zbiorniku z 900 μl buforu wiążącego z dostępnego w handlu zestawu (patrz Tabela materiałów).
   6. Oczyść produkty PCR za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania PCR. Odeluj DNA do 50 μl buforu elucyjnego z dostępnego w handlu zestawu (patrz tabela materiałów) i zmierz stężenie DNA.
2. Jest mało prawdopodobne, aby próbki, które zostały posortowane pod kątem utraty fenotypu wiązania, składały się z dużej liczby niezależnych klonów. W związku z tym nie jest konieczne wykonywanie PCR z 72 μg DNA. Wyizolować DNA za pomocą odpowiedniego zestawu dostępnego w handlu (patrz Tabela Materiałów). Przeprowadzić 3-4 reakcje PCR zgodnie z protokołem opisanym wcześniej (sekcja 9.1.3) z 100 ng/μl DNA. Jeśli posortowana liczba komórek jest mniejsza niż 100 000, użyj lizatów komórkowych zamiast preparatów genomowego DNA.
   1. Podwielokrotność około 10 000 komórek/basenik w 96-dołkowej płytce PCR.
   2. Zebrać komórki w płytce i ostrożnie usunąć większość supernatantu. Pellet nie będzie widoczny.
   3. Dodać 25 μl wody do każdej studzienki i podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
   4. Dodać 5 μl 2 mg/ml świeżo rozcieńczonej proteinazy K do każdego dołka przez 1 godzinę i inkubować w temperaturze 56 °C. Następnie podgrzewać próbkę przez 10 minut w temperaturze 95 °C w celu dezaktywacji proteinazy K.
   5. Użyj 10 μl mieszaniny lizatu komórkowego na reakcję PCR. Lizaty należy zużyć w ciągu 24 godzin.

10. Druga runda PCR do indeksowania i sekwencjonowania

1. Rozcieńczyć produkty z pierwszej rundy PCR do 40 pg/μl.
2. Ustawić jeden PCR na próbkę (skorzystaj z przewodnika zamieszczonego w tabelach 7 i 8). Zastosowanie polimerazy o wysokiej wierności jest ważne, aby zminimalizować błędy wprowadzane przez polimerazę podczas amplifikacji sgRNA.
3. Rozpuść 5 μl produktów PCR na 2% (w/v) żelu agarozowym. Należy obserwować pojedyncze czyste pasmo o wartości ~330 bps.
4. Oczyść produkty PCR za pomocą kulek paramagnetycznych, dodając 31,5 μl (0,7x całkowita objętość) ponownie zawieszonych kulek do produktów PCR, dobrze mieszając i inkubując przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
5. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 3 minuty. Koraliki powinny być uchwycone z boku płytki, a roztwór powinien być klarowny. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant.
6. Do probówki dodać 150 μl 80% świeżo przygotowanego etanolu. Inkubować przez 30 s, a następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant.
7. Powtórz krok 13.6, tym razem z 180 μl. Następnie suszyć koraliki na powietrzu przez 5 minut.
8. Wyjmij rurkę z magnesu. Eluować cel DNA z kulek do 35 μl sterylnego buforu EB. Inkubuj przez 3 minuty, a następnie włóż probówkę z powrotem do stojaka magnetycznego na 3 minuty.
9. Przenieść około 30 μl supernatantu zawierającego eluowane produkty PCR do czystej probówki.
10. Sekwencjonuj próbki na platformie sekwencjonowania nowej generacji. W przypadku biblioteki gRNA HumanV1 użyj niestandardowego startera wymienionego w tabeli 4, aby zsekwencjonować 19 pz.

11. Analiza bioinformatyczna w celu identyfikacji receptora i powiązanych szlaków

1. Mapowanie sekwencji z posortowanej i nieposortowanej populacji do biblioteki referencyjnej przy użyciu funkcji count programu MAGeCK. Funkcja zwróci nieprzetworzony plik zliczania (tabela uzupełniająca 1).
   UWAGA: Szczegółowe instrukcje dotyczące instalacji MAGeCK i korzystania z różnych funkcji w MAGeCK są opisane we wcześniej opublikowanym protokole autorstwa Wang et al.²⁰.
2. Sprawdź standard techniczny biblioteki kontrolek używanej na ekranie.
   1. Mediana normalizuje surowe liczby i używa pakietu ggplot2 w R²¹ lub równoważnym oprogramowaniu, aby wykreślić empiryczny wykres funkcji skumulowanej gęstości zliczeń w plazmidzie i kontrolować nieposortowane próbki (Rysunek 5A).
   2. Uruchom funkcję -test MAGeCK, używając zliczeń z populacji plazmidu jako "kontroli" i zliczeń z nieposortowanych próbek kontrolnych jako próbki "testowej". Funkcja ta spowoduje wygenerowanie pliku podsumowania genów (tabela uzupełniająca 1).
   3. Otwórz plik podsumowania genów i narysuj rozkład zmian logarytmiczno-krotnych (kolumna neg|lfc) dla wcześniej skategoryzowanych genów niezbędnych i nieistotnych²² (Rysunek 5B).
   4. Wybierz znacznie zubożone geny (neg|fdr < 0,05) i przeprowadź analizę wzbogacania szlaku za pomocą pakietu enrichr²³ lub dowolnego równoważnego pakietu wzbogacania szlaku w R (Rysunek 5C).
3. Uruchom funkcję -test programu MAGeCK z ustawieniem domyślnym. Podczas wykonywania analizy należy użyć surowych zliczeń z nieposortowanej próbki kontrolnej jako "kontroli" i zliczeń z posortowanej próbki jako "traktowania".
4. Otwórz plik podsumowania genów wygenerowany przez MAGeCK i uszereguj kolumnę pos|rank w kolejności rosnącej. Użyj FDR (kolumna pos|fdr) < 0,05 jako punktu odcięcia do identyfikacji trafień. Receptor jest zwykle wysoko oceniany, często na pierwszej pozycji.
5. Wykreśl wyniki algorytmu Robust-Ranking-Algorithm (RRA) dla pozytywnej selekcji (pos|score) w R lub równoważnym oprogramowaniu (Rysunek 5D).
6. Wybierz trafienia genów i przeprowadź analizę wzbogacania szlaku przy użyciu pakietu wzbogacającego lub dowolnego równoważnego pakietu wzbogacania szlaku w R, aby zidentyfikować wzbogacone szlaki.

Wyniki

Dostarczono dane sekwencjonowania z dwóch reprezentatywnych ekranów nokautowania skali genomu w celu identyfikacji partnera wiążącego ludzkiego TNFSF9 i P. falciparum RH5 przeprowadzone odpowiednio w komórkach NCI-SNU-1 i HEK293 (Tabela uzupełniająca 1). Na wiązanie RH5 miał wpływ zarówno siarczan heparanu, jak i jego znany receptor BSG²⁴ (Figura 3C), podczas gdy TNFRSF9 specyficznie związany ze znanym receptorem TNFSF9 i nie tracił wiązania po preinkubacji z rozpuszczalną heparyną. Białko 3 w klasie Rysunek 3B reprezentuje TNFRSF9.

Dla obu linii komórkowych podano również rozkład gRNA w bibliotece mutantów kontrolnych po 3 dniach (9, 14 i 16 dniach po transdukcji) (Tabela uzupełniająca 1). Rozkład gRNA ujawnił, że złożoność biblioteki utrzymywała się przez cały czas trwania eksperymentu (Rysunek 5A). Genetyczne badanie przesiewowe w celu identyfikacji liganda TNFSF9 przeprowadzono w 14 dniu po transdukcji, natomiast w przypadku RH5 przeprowadzono 9 dzień po transdukcji. Jakość techniczną badań przesiewowych oceniono, badając rozkład obserwowanych zmian fałdowania gRNA ukierunkowanych na referencyjny zestaw nieistotnych genów w porównaniu z rozkładem dla referencyjnego zestawu niezbędnych genów²² (Rysunek 5B). Ponadto wzbogacenie na poziomie szlaku ujawniło również, że oczekiwane niezbędne szlaki zostały zidentyfikowane i znacznie wzbogacone w populacji "porzuconej" podczas porównywania próbki kontrolnej z oryginalną biblioteką plazmidów. Przykład z próbką NCI-SNU-1 z dnia 14 przedstawiono w Rysunek 5C.

Rozkład gRNA w populacji kontrolnej w porównaniu z posortowaną za pomocą funkcji -test MAGeCK (patrz Tabela Uzupełniająca 1 dla podsumowania danych wyjściowych genu z MAGeCK) został wykorzystany do identyfikacji receptora na podstawie badań przesiewowych fenotypowych. Zmodyfikowany wynik RRA zgłoszony przez MAGeCK w analizie na poziomie genu jest wykreślany w stosunku do genów uszeregowanych według wartości p. Wynik RRA w MAGeCK stanowi miarę, w której gRNA są konsekwentnie klasyfikowane wyżej niż oczekiwano. Na ekranie dla TNFRSF9 największym trafieniem był TNFSF9, który jest znanym partnerem wiązania TNFRSF9 (Rysunek 5D). Ponadto zidentyfikowano również szereg genów związanych ze szlakiem TP53. W przypadku RH5, oprócz znanego receptora (BSG) i genu wymaganego do produkcji siarczanowych GAG (SLC35B2), zidentyfikowano również dodatkowy gen (SLC16A1) (Rysunek 5E). SLC16A1 jest opiekunem niezbędnym do transportu BSG na powierzchnię komórek²⁵. Łącznie wyniki te pokazują zdolność ekranu do identyfikowania bezpośrednio oddziałujących receptorów i składników komórkowych wymaganych do ekspresji tego receptora na powierzchni komórek w funkcjonalnej formie.

Rycina 1: Przegląd podejścia do genetycznych badań przesiewowych w celu identyfikacji receptorów na powierzchni komórki. Test ten składa się z trzech głównych etapów: Po pierwsze, rekombinowane białka reprezentujące ektodomenę receptorów na powierzchni komórki ulegają ekspresji w linii komórkowej, która może dodawać strukturalnie krytyczne modyfikacje potranslacyjne, takie jak komórki HEK293. Ektodomeny białek monomerycznych są oligomeryzowane przez koniugację ze streptawidyną-PE w celu zwiększenia ich awidności wiązania. Po drugie, te zapalone sondy są używane w testach wiązania komórkowego, w których jasne barwienie na liniach komórkowych wskazuje na wyraźne przesunięcie fluorescencji PE (na zielono) w porównaniu z białkiem kontroli ujemnej (na czarno) wskazuje na obecność partnera wiążącego powierzchnię komórki. Po trzecie, wybierane są linie komórkowe z dodatnim receptorem Cas9 i przeprowadzane są badania przesiewowe w skali genomu przy użyciu gRNA ukierunkowanych na zdecydowaną większość genów kodujących białka. Podczas generowania zmutowanych bibliotek często stosuje się 30% wydajność transdukcji, która opiera się na prawdopodobieństwie rozkładu Poissona, który zapewnia, że każda komórka otrzymuje pojedyncze gRNA, tak że wynikowy fenotyp jest przypisywany do określonego nokautu. Marker BFP wyrażany przez transdukowane komórki służy do selekcji komórek zawierających gRNA za pomocą FACS. Badania fenotypowe wykonuje się między 9-16 dniem po transdukcji. W dniu badania przesiewowego całkowita populacja zmutowanych komórek jest dzielona na dwie części. Jedna połowa jest utrzymywana jako populacja kontrolna, a druga połowa jest wybierana do wiązania rekombinowanych białek. Komórki z biblioteki mutantów, które nie są już w stanie wiązać rekombinowanego białka, są sortowane za pomocą FACS, a wzbogacanie gRNA w populacji posortowanej w porównaniu z kontrolną wykorzystuje się do identyfikacji genów wymaganych do wiązania powierzchni komórki znakowanej sondy avid. Wskazane są kroki w protokole, które wymagają dużo czasu. Ten rysunek został zmodyfikowany z Sharma et al.¹⁹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Ustalanie proporcji biotynylowanego białka do streptawidyny-PE przy użyciu metody opartej na teście ELISA. Przykład strategii koniugacji streptawidyny-PE zastosowanej do wygenerowania sondy z biotynylowanego białka monomerycznego. Serię rozcieńczeń biotynylowanych monomerów inkubowano przy ustalonym stężeniu streptawidyny. Minimalne rozcieńczenie, przy którym nie można wykryć nadmiaru biotynylowanych monomerów, określono metodą ELISA. Test ELISA przeprowadzono z lub bez preinkubacji szeregu rozcieńczeń białek z 10 ng streptawidyny-PE. W obecności streptawidyny-PE obliczono minimalne rozcieńczenie, przy którym nie zidentyfikowano żadnego sygnału (czarne zakreślenie) oraz ilość białka potrzebną do nasycenia, aby wytworzyć 10-krotny roztwór podstawowy z 4 μg/ml streptawidyny-PE. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 3: Reprezentatywne wiązanie białek z liniami komórkowymi. (A) Wiązanie białek z liniami komórkowymi miało wyraźny wzrost fluorescencji związanej z komórką w porównaniu z próbką kontrolną. Obróbka cieplna (80 °C przez 10 min) rekombinowanego białka zniosła wszystkie wiązania z powrotem do kontroli ujemnej, wykazując, że zachowanie wiązania było zależne od prawidłowo sfałdowanego białka. (B) Różne klasy zachowania wiązania białek z powierzchnią komórki; uzależnienie od GAG. Od lewej do prawej, białka można podzielić na trzy typy: Białko typu 1 adsorbuje się tylko do HS. Białka te tracą wiązanie po preinkubacji z heparyną o stężeniu powyżej 0,2 mg/ml. Białko typu 2 wiąże się z HS oprócz specyficznego receptora. Białka te tracą częściowe wiązanie w eksperymentach przed blokowaniem. Białko typu 3 nie wiąże HS. Białka te nie tracą wiązania w porównaniu z liniami rodzicielskimi. (C) Przykład białka (tj. RH5), które wiąże się z HS i specyficznym receptorem w sposób addytywny. Celowanie w receptor (tj. BSG) lub enzymy wymagane do syntezy HS (np. SLC35B2, EXTL3) tylko częściowo zmniejsza wiązanie RH5 z komórkami w porównaniu z kontrolami. Transdukowane linie poliklonalne mogą być używane w takich eksperymentach w celu ustalenia zachowania wiązania. Ten rysunek został zmodyfikowany z Sharma et al.¹⁹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wybór klonalnych linii komórkowych o wysokiej aktywności Cas9. Skuteczność edycji genomu zarówno poliklonalnych, jak i sklonowanych linii komórkowych NCI-SNU-1 oceniano za pomocą systemu reporterowego GFP-BFP, w którym linie komórkowe transdukowano wirusami z plazmidem ukierunkowanym na gRNA kodowanym GFP lub bez (tj. "pustym"). Przedstawiony jest schemat. Cytometrię przepływową zastosowano do zbadania ekspresji zarówno BFP, jak i GFP po transdukcji i porównano z kontrolą niezakażoną. Ekspresję GFP wykorzystano jako wskaźnik zastępczy dla aktywności Cas9, podczas gdy ekspresja BFP oznaczała transdukowane komórki. Profil dla niezainfekowanych i pustych zainfekowanych komórek wyglądał podobnie dla wszystkich klonów. Profile przedstawicieli są przedstawione w lewym panelu. Wszystkie pięć klonów linii komórkowej NCI-SNU-1 wykazało większą utratę GFP w porównaniu z linią poliklonalną (prawy panel), przy czym klon 4 wykazał najwyższą wydajność przy najniższej populacji opornej na leczenie. Ten rysunek został zmodyfikowany z Sharma et al.¹⁹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Reprezentatywne wyniki genetycznych badań przesiewowych w celu identyfikacji partnerów wiążących powierzchnię komórki. (A) Wykresy funkcji rozkładu skumulowanego porównujące obfitość gRNA w bibliotece plazmidów z zmutowanymi bibliotekami komórek HEK-293-E i NCI-SNU-1 w dniu 9, 14 i 16 dni po transdukcji. Dla dowolnej liczby funkcja skumulowanej gęstości zgłasza procent punktów danych, które były poniżej tego progu. Niewielkie przesunięcie populacji zmutowanych komórek w porównaniu z pierwotną populacją plazmidów oznacza zubożenie podzbioru gRNA w porównaniu z biblioteką plazmidów. (B) Rozkład zmian logarytmicznie w genach, które zostały wcześniej sklasyfikowane jako niezbędne (czerwony) lub nieistotny () w liniach komórkowych HEK293 i NCI-SNU-1. Rozkład zmian fałdowania dla genów nieistotnych koncentrował się na poziomie ~0, podczas gdy dla genów niezbędnych przesunął się w lewo w kierunku ujemnych zmian fałdowania. (C) Znacząco wzbogacone szlaki w genach zubożonych w populacji kontrolnej z mutacją NCI-SNU-1 14 dni po transdukcji. Zidentyfikowano oczekiwane znane szlaki niezbędne dla komórek. (D) Solidny wynik algorytmu rangi (RRA) dla genów, które zostały wzbogacone w posortowane komórki, które utraciły zdolność wiązania sondy TNFRSF9. Geny zostały uszeregowane zgodnie z wynikiem RRA. Znany partner interakcji TNFSF9 i geny związane ze szlakiem TP53 (oznaczone na czerwono) zostały zidentyfikowane na ekranie przesiewowym. (E) Uporządkowane rangowo wyniki RRA dla genów zidentyfikowanych na podstawie analizy wzbogacenia gRNA wymaganej do wiązania RH5 z komórkami HEK293 (lewy panel). SLC35B2 i SLC16A1 zostały zidentyfikowane w ramach progu wskaźnika fałszywych wykryć (FDR) wynoszącego 5%. Dwa dodatkowe geny w szlaku biosyntezy HS (tj. EXTL3 i NDST1) zostały zidentyfikowane w FDR wynoszącym 25%. Schemat przedstawiający ogólny szlak biosyntezy GAG z odpowiednimi genami zmapowanymi do odpowiednich etapów (panel 2). Geny wymagane do zaangażowania w biogenezę siarczanu chondroityny (tj. CSGALNACT1/2) nie zostały zidentyfikowane w badaniu przesiewowym. Ten rysunek został zmodyfikowany z Sharma et al.¹⁹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

)

Nazwa plazmidu	Plazmid #	używać
Konstrukt ekspresji białka: CD200RCD4d3+4-bio-linker-his	Dodano: 36153	Produkcja rekombinowanego białka z CD4d3+4, biotyną i znacznikami 6-his.
pMD2.G	Dodano: 12259	Otoczka VSV-G eksprymująca plazmid; produkcja lentiwirusa
psPAX2 (psPAX2	Dodano: 12260	Plazmid do pakowania lentiwirusowego, produkcja lentiwirusa
Konstrukcja Cas9: pKLV2-EF1a-Cas9Bsd-W	Dodano: 68343	Produkcja konstytutywnie wyrażającej linii Cas9
Konstrukt ekspresji gRNA: pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W	Dodano: 67974	Wektor ekspresyjny gRNA CRISPR z ulepszonym rusztowaniem i markerami puro/BFP
Biblioteka CRISPR z ulepszonym nokautem całego genomu człowieka	Numer: 67989	Biblioteka gRNA na podstawie 18 010 ludzkich genów, zaprojektowana do stosowania w lentiwirusie.
Konstrukt GFP-BFP: pKLV2-U6gRNA5(gGFP)-PGKBFP2AGFP-W	Numer: 67980	Raportowanie aktywności Cas9 z BFP i GFP.
Pusty konstrukt: pKLV2-U6gRNA5(pusty)-PGKBFP2AGFP-W	Numer: 67979	Moduł raportowania aktywności Cas9 (kontrola) z BFP i GFP.

Tabela 1: Plazmidy używane w tym podejściu.

Nazwa buforu	Składniki
HBS (10-krotnie)	1,5 M NaCl i 200 mM HEPES w wodzie MiliQ, dostosuj do pH 7,4
PBS (10x)	80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na2HPO4 i 2,4 g KH2PO4 w wodzie MiliQ, dostosuj do pH 7,4
Bufor fosforanu sodu (zapas 80 mM)	7,1 g Na2HPO4,2H 2O, 5,55 g NaH2PO4, dostosować do pH 7,4
Bufor wiążący jego oczyszczanie	20 mM bufor fosforanu sodu, 0,5 M NaCl i 20 mM Imidazol, dostosować do pH 7,4
Bufor elucyjny do oczyszczania	20 mM bufor fosforanu sodu, 0,5 M NaCl i 400 mM Imidazolu, dostosuj do pH 7,4
Bufor dietanoloaminy	10% dietanoloaminy i 0,5 mM MgCl2 w wodzie MiliQ, dostosować do pH 9,2:
Zobacz materiał D10	DMEM, 1% penicylina-streptomycyna (100 jednostek/ml) i 10% inaktywowany termicznie FBS

Tabela 2: wymagane do tego badania.

się się

Składniki	Naczynie 10 cm	Płytka 6-dołkowa
Ogniwa 293FT	70–80% zlewające	70–80% zlewające
Nośniki kompatybilne z transfekcją (Opti-MEM) (krok 5.1.2)	3 ml	500 μL
Nośniki kompatybilne z transfekcją (Opti-MEM) (krok 5.1.4)	5 ml	2 ml
Wektor transferu lentiwirusowego	3 μg	0,5 μg
psPax2 (patrz tabela 1)	7,4 μg	1,2 μg
pMD2.G (patrz tabela 1)	1,6 μg	0,25 μg
Odczynnik PLUS	12 μL	2 μl
Lipofektamina LTX	36 μL	6 μL
D10 (krok 7.1.7)	5 ml	1,5 ml
D10 (kroki 7.1.8 i 7.1.10)	8 ml	2 ml

Tabela 3: Ilości i objętości odczynników do pakowania lentiwirusów.

Tabela 4: Sekwencje starterów do amplifikacji gRNA i NGS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Odczynnik	Objętość na reakcję	Miks główny (x38)
Q5 Gorący start High-Fidelity 2x	25 μL	950 μL
Mieszanka podkładów (L1/U1) (po 10 μM)	1 μL	38 μL
Genomowe DNA (1 mg/ml)	2 μl	72 μL
H2O	22 μL	1100 μL
łączny	50 μL	1900 μL

Tabela 5: PCR do amplifikacji gRNA z próbek o wysokiej złożoności.

Rozdział

Numer cyklu	Deturat	Wyżarzanie	rozszerzenie
1	98 °C, 30 sekund
2-24	98 °C, 10s	61 °C, 15s	72 °C, 20s
25			72 °C, 2 min

Tabela 6: Warunki PCR dla pierwszego PCR.

Odczynnik	Objętość na reakcję
KAPA HiFi HotStart ReadyMix	25 μL
Mieszanka gruntów (PE1,0/grunt indeksowy) (po 5 μM)	2μL
Pierwszy produkt PCR (40 pg/μL)	5 μL
H2O	18 μL
łączny	50 μL

Tabela 7: PCR do znakowania indeksowego sgRNA z badań genetycznych.

Rozdział

Numer cyklu	Deturat	Wyżarzanie	rozszerzenie
1	98 °C, 30 sekund
2-15	98 °C, 10s	66 °C, 15s	72 °C, 20s
16			72 °C, 5 min

Tabela 8: Warunki PCR dla drugiego PCR.

Rysunek uzupełniający S1: Przewodnik po rysowaniu bramek do sortowania populacji niewiążącej. (A) Idealny kandydat na białko do badań przesiewowych powinien charakteryzować się wyraźnym przesunięciem populacji wiążącej w porównaniu z populacją kontrolną, a wiązanie powinno być utrzymane na komórkach pozbawionych mechanizmów biosyntezy HS. Eksperyment z blokowaniem heparyny może być stosowany zamiast testowania na SLC35B2 docelowych liniach komórkowych. (B) Zebrano komórki pozbawione barwienia powierzchniowego z ektodomeny białka, ale wykazujące ekspresję fluorescencji BFP z transdukcji lentiwirusowej. Wyświetlane komórki pochodzą z ekranu służącego do identyfikacji receptora dla GABBR2²². Ten rysunek został zmodyfikowany z Sharma et al.¹⁹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający S2: Wykres PCA oparty na transkryptomice glikoproteiny na powierzchni komórki przy użyciu danych sekwencyjnych RNA z ponad 1,000 linii komórek rakowych. Linie komórkowe z Cell Model Passport²⁷ zostały zgrupowane przy użyciu grupowania K-średnich zgodnie z wartościami FPKM ~1,500 glikoprotein na powierzchni komórki. Reprezentatywne linie komórkowe z każdego klastra są oznaczone. Klaster 5 składał się w całości z linii komórkowych pochodzenia krwiotwórczego (patrz również Tabela uzupełniająca 2). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający S3: Wyniki niezbędności dla eksportu białek z adnotacją KEGG i genów glikozylacji sprzężonej z N na podstawie wyników projektu. Skorygowane wyniki istotności Bayesa dla ~ 330 linii komórkowych (kolumn, nieoznakowanych) są wykreślane dla genów eksportu białek i szlaku glikozylacji sprzężonego z N (oś X). Wyniki wyższe niż 0 oznaczają znaczne zubożenie populacji mutantów w porównaniu z oryginalną biblioteką plazmidów. Geny można podzielić na trzy odrębne klastry, które reprezentują różne poziomy niezbędności w liniach komórkowych. To grupowanie może być używane do decydowania o dniu sortowania. Jeśli badanie przesiewowe zostanie przeprowadzone w późnym punkcie czasowym (16 dzień), możliwe jest, że geny, o których wiadomo, że są niezbędne dla komórek (klastry 1 i 3), nie zostaną zidentyfikowane. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Surowe pliki zliczania dla oprogramowania MAGeCK wygenerowane gene_summary pliki związane z reprezentatywnymi badaniami genetycznymi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Tabela uzupełniająca 2: Grupowanie linii komórkowych zgodnie z ekspresją receptorów na powierzchni komórki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Dyskusja

Opisano strategię badań przesiewowych opartą na CRISPR w celu identyfikacji genów kodujących komponenty komórkowe zaangażowane w rozpoznawanie komórek. Podobne podejście wykorzystujące aktywację CRISPR zapewnia również genetyczną alternatywę do identyfikacji bezpośrednio oddziałujących receptorów rekombinowanych białek bez konieczności generowania dużych bibliotek białek²⁶. Jednak jedną z głównych zalet tego podejścia jest to, że ma ono zastosowanie do interakcji, w których pośredniczą cząsteczki powierzchniowe natywnie wyświetlane na komórce i nie zależy od nadekspresji receptorów, co może wpływać na awidność wiązania receptora. W przeciwieństwie do innych metod, technika ta nie przyjmuje żadnych założeń dotyczących biochemicznej natury lub biologii komórki receptorów i daje możliwość badania interakcji, w których pośredniczą białka, które zwykle są trudne do zbadania przy użyciu podejść biochemicznych, takich jak bardzo duże białka lub te, które wielokrotnie przechodzą przez błonę lub tworzą kompleksy z innymi białkami. oraz cząsteczki inne niż białka, takie jak glikany, glikolipidy i fosfolipidy. Biorąc pod uwagę charakter metody w skali genomu, podejście to ma również tę zaletę, że nie tylko identyfikuje receptor, ale także dodatkowe składniki komórkowe, które są wymagane do zdarzenia wiązania, zapewniając w ten sposób wgląd w biologię komórki receptora.

Jednym z głównych ograniczeń tej metody przy użyciu jej do identyfikacji receptora białka sierocego jest początkowy wymóg, aby najpierw zidentyfikować linię komórkową, która wiąże się z białkiem. Nie zawsze jest to łatwe, a identyfikacja linii komórkowej, która wykazuje fenotyp wiązania, który jest również dopuszczalny dla genetycznych badań przesiewowych, może być krokiem ograniczającym czas wdrożenia tego testu. Niektóre linie komórkowe mają tendencję do wiązania się z większą liczbą białek niż inne. Jest to szczególnie istotne w przypadku białek, które wiążą HS, ponieważ białka te mają tendencję do wiązania się z dowolną linią komórkową, która wykazuje łańcuchy boczne HS, niezależnie od natywnego kontekstu wiązania. Dodatkowo zaobserwowaliśmy, że regulacja w górę syndekanów (tj. proteoglikanów zawierających HS) w liniach komórkowych prowadzi do zwiększonego wiązania białek wiążących HS²⁶. Może to być czynnik, który należy wziąć pod uwagę przy wyborze linii komórkowej do badań przesiewowych. Jednak ważne jest również, aby pamiętać, że addytywne wiązanie HS nie zakłóca wiązania z określonym receptorem. Oznacza to, że jeśli zaobserwuje się wiązanie, możliwe jest, że jest ono pośredniczone wyłącznie przez HS, ponieważ wiązanie, w którym pośredniczy HS w tym teście, jest addytywne, a nie współzależne¹⁹. W takim scenariuszu opisane podejście do blokowania heparyny może zidentyfikować takie zachowania bez konieczności przeprowadzania pełnego badania genetycznego.

Przydatnym źródłem do wyboru linii komórkowych jest Paszport Modelu Komórki, który zawiera informacje o genomice, transkryptomice i warunkach hodowli dla ~1,000 linii komórek rakowych²⁷. W zależności od kontekstu biologicznego komórki można wybierać na podstawie ich profili ekspresji. Aby pomóc w selekcji linii komórkowych, zgrupowaliśmy ~ 1,000 linii komórkowych w paszporcie modelu komórki zgodnie z ekspresją ~ 1,500 wstępnie opisanych glikoprotein powierzchniowych komórek ludzkich²⁸ (rysunek uzupełniający 2; informacje o klastrach dla każdej linii komórkowej wraz z warunkami wzrostu znajdują się w Tabeli Uzupełniającej 2). Podczas testowania wiązania białka o nieznanej funkcji przydatne jest wybranie panelu reprezentatywnych linii komórkowych z każdego klastra, aby zwiększyć szansę na pokrycie szerokiego zakresu receptorów. Mając wybór, zaleca się wybór linii komórkowych, które są łatwe do hodowli i łatwe do transdukcji. Ponieważ te linie komórkowe będą wykorzystywane w badaniach przesiewowych w skali genomu, preferowane jest, aby można je było łatwo hodować w dużych ilościach i były podatne na transdukcję lentiwirusową, ponieważ jest to najpowszechniej dostępna metoda dostarczania sgRNA do genetycznych badań przesiewowych opartych na CRISPR na późniejszych etapach.

Ogólnie rzecz biorąc, selekcja fenotypów jest przeprowadzana w jednym sortowaniu. Decyduje o tym jednak jasność wybarwionej populacji komórek w porównaniu z kontrolą. Iteracyjne rundy selekcji mogą być stosowane w scenariuszach, w których stosunek sygnału do szumu pożądanego fenotypu jest niski lub gdy celem badania przesiewowego jest identyfikacja mutantów o silnych fenotypach. W przypadku stosowania podejścia do selekcji iteracyjnej dla badań przesiewowych opartych na FACS ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że proces sortowania może spowodować śmierć komórki, głównie ze względu na samą siłę sortera. W związku z tym nie wszystkie zebrane komórki będą reprezentowane w następnej rundzie sortowania.

Złożoność biblioteki jest bardzo ważnym czynnikiem w przeprowadzaniu udanych badań genetycznych, zwłaszcza w przypadku badań przesiewowych selekcji negatywnej, ponieważ zakres ich uszczuplenia można określić tylko poprzez porównanie wyników z tym, co było obecne w bibliotece wyjściowej. W przypadku ekranów selekcji negatywnej często utrzymuje się biblioteki o złożoności 500-1,000x. Ekrany selekcji pozytywnej są jednak bardziej odporne na rozmiary bibliotek, ponieważ w takich ekranach oczekuje się, że tylko niewielka liczba mutantów zostanie wybrana dla określonego fenotypu. W związku z tym, na opisanym tutaj ekranie wyboru pozytywnego, rozmiar biblioteki może zostać zmniejszony do złożoności 50-100x bez uszczerbku dla jakości ekranu. Na dodatek, w badaniach tych możliwe jest również użycie biblioteki kontrolnej dla danej linii komórkowej w danym dniu jako "kontroli ogólnej" dla wszystkich próbek posortowanych w danym dniu dla tej danej linii komórkowej. Zmniejszy to liczbę bibliotek kontrolnych, które muszą być tworzone i sekwencjonowane.

Inną ważną kwestią przy stosowaniu tego podejścia są ograniczenia badań przesiewowych utraty funkcji w identyfikacji genów, które są niezbędne do wzrostu komórek in vitro. Czas badań przesiewowych ma w tym względzie kluczowe znaczenie, ponieważ im dłużej zmutowane komórki są trzymane w hodowli, tym większe prawdopodobieństwo, że komórki z mutacjami w podstawowych genach staną się niezdolne do życia i nie będą już reprezentowane w bibliotece mutantów. Niedawne badania genetyczne przeprowadzone w ramach inicjatywy Project Score na ponad 300 liniach komórkowych pokazują, że wiele genów w szlaku wydzielania białek i N-glikozylacji z adnotacją KEGG jest często identyfikowanych jako niezbędne dla wielu linii komórkowych (rysunek uzupełniający 3)²⁹. Można to wziąć pod uwagę przy projektowaniu badań przesiewowych, jeśli wpływ genów niezbędnych do proliferacji i żywotności ma być badany w kontekście procesu rozpoznawania komórkowego. W takim przypadku przeprowadzenie badań przesiewowych we wczesnym punkcie czasowym (np. 9 dnia po transdukcji) byłoby ogólnie właściwe. Jeśli jednak podejście to jest stosowane do identyfikacji kilku celów o silnym wpływie na wielkość, a nie ogólnych szlaków komórkowych, właściwe może być przeprowadzenie badań przesiewowych w późniejszym czasie (np. 15-16 dnia po transdukcji).

Wyniki badań przesiewowych są bardzo solidne; W ośmiu badaniach przesiewowych wiązania rekombinacji białek przeprowadzonych w przeszłości, receptor powierzchniowy komórki był największym hitem w każdym przypadku¹⁹. Stosując to podejście do identyfikacji partnera interakcji, należy się zatem spodziewać, że receptor i czynniki przyczyniające się do jego prezentacji na powierzchni będą identyfikowane z dużą pewnością statystyczną. Po przeprowadzeniu badania przesiewowego i walidacji trafienia za pomocą pojedynczego nokautu gRNA, można przeprowadzić dalsze obserwacje przy użyciu istniejących metod biochemicznych, takich jak AVEXIS⁴ i bezpośrednie saturywalne wiązanie oczyszczonych białek za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Opisane tutaj podejście ma zastosowanie do wszystkich białek, dla których możliwe jest wygenerowanie rozpuszczalnej rekombinowanej sondy wiążącej.

Podsumowując, jest to podejście oparte na nokaucie CRISPR w skali genomu w celu identyfikacji interakcji, w których pośredniczą białka powierzchniowe komórki. Metoda ta ma ogólne zastosowanie do identyfikacji szlaków komórkowych wymaganych do rozpoznawania powierzchni komórki w szerokim zakresie różnych kontekstów biologicznych, w tym między własnymi komórkami organizmu (np. rozpoznawanie neuronalne i immunologiczne), a także między komórkami gospodarza a białkami patogenu. Metoda ta stanowi genetyczną alternatywę dla podejść biochemicznych przeznaczonych do identyfikacji receptorów, a ponieważ nie wymaga żadnych wcześniejszych założeń dotyczących biochemicznej natury lub biologii komórki receptorów, ma ogromny potencjał do dokonywania zupełnie nieoczekiwanych odkryć.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciw-mysia fosfataza alkaliczna	Sigma	A4656
Blasticidin	Chem-Cruz	SC-204655
Krew i Cell Culture DNA Maxi Kit	Qiagen	13362
BSA	Sigma	A9647-100G
Dietanoloamina	Sigma	398179
DMEM	Gibco	31966-021
Zestaw do krwi i tkanek Dneasy	Qiagen	69504
DynaMag-96 Magnes boczny	Invitrogen	12331D
HEK293T opakowanie komórki	ATCC	CRL-3216
Heparyna	Sigma	H4784-1G
KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Kapa	KK2602
Lipofectamina LTX z odczynnikiem PLUS	Invitrogen	15338100
Sortownik komórek MoFlo XDP	BD
Ni2+-NTA koraliki agarozowe	Jena Bioscience	AC-501-25
OPTI-MEM	Life Technologies	31985-070
OX-68 przeciwciało	AbD Serotec	MCA1022R
fosforan p-nitrofenylu	Sigma	1040-506
PD-10 kolumny odsalające	GE healthcare	17085101
Polybrene	Millipore	TR-1003-G
Probówki polipropylenowe o objętości łoża 5 ml	Qiagen	34964
Proteinaza K, rekombinowana, klasa PCR	Roche	3115879001
Puromycin	Gibco	A11138-03
Q5 Hot Start High-Fidelity 2 razy;
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR	Qiagen	28104
Filtr SCFA	Nalgene	190-2545
Sony Sortownik komórek	Koraliki Sony
SPRI (koraliki Agencourt AMPure XP)	Beckman	A63881
Płytki do mikromiareczkowania pokryte streptawidyną	Nalgene	734-1284
Streptawidyna-PE	Biolegend	405204