Artykuł metodologiczny

Identyfikacja receptorów na powierzchni komórki za pomocą genetycznych badań przesiewowych CRISPR/Cas9 w skali genomu

15.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60803

⸱

6 czerwca 2020

 , 
1Cell Surface Signalling Laboratory, Wellcome Trust Sanger Institute, 2EMBL-EBI, Wellcome Genome Campus

W tym artykule

Podsumowanie

Ten manuskrypt opisuje metodę badań przesiewowych na skalę genomu opartą na komórkach w celu identyfikacji interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy.

Streszczenie

Komunikacja międzykomórkowa, w której pośredniczą bezpośrednie interakcje między receptorami na powierzchni komórki osadzonej w błonie, jest kluczowa dla prawidłowego rozwoju i funkcjonowania organizmów wielokomórkowych. Wykrywanie tych interakcji pozostaje jednak wyzwaniem technicznym. Niniejszy manuskrypt opisuje systematyczne podejście do genetycznego nokautowania CRISPR/Cas9 w skali genomu, które ujawnia szlaki komórkowe wymagane dla określonych zdarzeń rozpoznawania powierzchni komórki. Test ten wykorzystuje rekombinowane białka wytwarzane w systemie ekspresji białek ssaków jako zapalone sondy wiążące do identyfikacji partnerów interakcji w genetycznym badaniu przesiewowym opartym na komórkach. Metoda ta może być wykorzystana do identyfikacji genów niezbędnych do interakcji na powierzchni komórki wykrywanych przez rekombinowane sondy wiążące odpowiadające ektodomenom receptorów osadzonych w błonie. Co ważne, biorąc pod uwagę charakter tego podejścia w skali genomu, ma ono również tę zaletę, że nie tylko identyfikuje bezpośredni receptor, ale także komponenty komórkowe, które są wymagane do prezentacji receptora na powierzchni komórki, dostarczając w ten sposób cennych informacji na temat biologii receptora.

Wprowadzenie

Zewnętrzne interakcje białek receptorowych na powierzchni komórki kierują ważnymi procesami biologicznymi, takimi jak organizacja tkanek, rozpoznawanie gospodarza-patogenu i regulacja immunologiczna. Badanie tych interakcji jest interesujące dla szerszej społeczności biomedycznej, ponieważ receptory błonowe są celami systematycznie dostarczanych środków terapeutycznych, takich jak przeciwciała monoklonalne. Pomimo ich znaczenia, badanie tych interakcji pozostaje wyzwaniem technicznym. Dzieje się tak głównie dlatego, że receptory osadzone w błonie są amfipatyczne, co utrudnia ich wyizolowanie od błon biologicznych w celu manipulacji biochemicznej, a ich interakcje charakteryzują się słabym powinowactwem do interakcji (KDs w zakresie μM-mM)1. W związku z tym wiele powszechnie stosowanych metod nie nadaje się do wykrywania tej klasy interakcji białkowych1,2.

Opracowano szereg metod w celu szczegółowego badania interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy, które uwzględniają ich unikalne właściwości biochemiczne3. Wiele z tych podejść obejmuje ekspresję całej ektodomeny receptora jako rozpuszczalnego białka rekombinowanego w systemach opartych na komórkach ssaków lub owadów, aby zapewnić, że białka te zawierają modyfikacje potranslacyjne, które są ważne strukturalnie, takie jak glikany i wiązania dwusiarczkowe. Aby przezwyciężyć wiązanie o niskim powinowactwie, ektodomeny są często oligomeryzowane, aby zwiększyć ich awidność wiązania. Ektodomeny białkowe Avid zostały z powodzeniem wykorzystane jako sondy wiążące do identyfikacji partnerów interakcji w bezpośrednich rekombinowanych ekranach interakcji białko-białko4,5,6,7. Chociaż metody oparte na białkach rekombinowanych są szeroko skuteczne, wymagają, aby ektodomena receptora błonowego była wytwarzana jako białko rozpuszczalne. W związku z tym ma ogólne zastosowanie tylko do białek, które zawierają ciągły region zewnątrzkomórkowy (np. jednoprzebiegowe typu I, typu II lub zakotwiczone w GPI) i nie jest ogólnie odpowiedni dla kompleksów receptorowych i białek błonowych, które wielokrotnie obejmują błonę.

Techniki klonowania wyrażeń, w których biblioteka komplementarnych DNA (cDNA) jest transfekowana do komórek i testowana pod kątem fenotypu wzmocnienia wiązania, zostały również wykorzystane do identyfikacji zewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko8. Dostępność dużych zbiorów sklonowanych i zsekwencjonowanych plazmidów ekspresji cDNA w ostatnich latach ułatwiła metody, w których linie komórkowe z nadekspresją cDNA kodujące receptory na powierzchni komórki są badane pod kątem wiązania białek rekombinowanych w celu identyfikacji interakcji9,10. Podejścia oparte na nadekspresji cDNA, w przeciwieństwie do metod opartych na rekombinacji białek, dają możliwość identyfikacji interakcji w kontekście błony komórkowej. Jednak sukces stosowania konstruktów ekspresji cDNA zależy od zdolności komórek do nadekspresji białka w prawidłowo sfałdowanej formie, ale często wymaga to komórkowych czynników dodatkowych, takich jak transportery, białka opiekuńcze i prawidłowe składanie oligomeryczne. Transfekcja pojedynczego cDNA może zatem nie wystarczyć do osiągnięcia ekspresji na powierzchni komórki.

Techniki przesiewowe wykorzystujące konstrukty cDNA lub rekombinowane sondy białkowe są zasobożerne i wymagają dużych zbiorów cDNA lub bibliotek białek rekombinowanych. Specjalnie zaprojektowane metody oparte na spektrometrii mas zostały ostatnio wykorzystane do identyfikacji oddziaływań zewnątrzkomórkowych, które nie wymagają składania dużych bibliotek. Techniki te wymagają jednak chemicznej manipulacji powierzchnią komórki, która może zmienić biochemiczny charakter cząsteczek obecnych na powierzchni komórek i obecnie ma zastosowanie tylko w przypadku interakcji, w których pośredniczą białka glikozylowane11,12. Większość obecnie dostępnych metod również w dużym stopniu koncentruje się na interakcjach między białkami, w dużej mierze ignorując wkład mikrośrodowiska błonowego, w tym cząsteczek takich jak glikany, lipidy i cholesterol.

Niedawny rozwój wysoce efektywnego celowania bialleleicznego przy użyciu metod opartych na CRISPR umożliwił biblioteki w skali genomu komórek pozbawionych zdefiniowanych genów w jednej puli, które mogą być badane w systematyczny i bezstronny sposób w celu identyfikacji komponentów komórkowych zaangażowanych w różne konteksty, w tym analizowanie procesów sygnalizacji komórkowej, identyfikacja zaburzeń nadających odporność na leki, toksyny, i patogenów oraz określanie swoistości przeciwciał13,14,15,16. W tym miejscu opisujemy test przesiewowy komórek nokautujących oparty na CRISPR w skali genomu, który stanowi alternatywę dla obecnych podejść biochemicznych do identyfikacji interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy. To podejście polegające na identyfikowaniu interakcji, w których pośredniczą receptory błonowe, za pomocą genetycznych badań przesiewowych jest szczególnie odpowiednie dla badaczy, którzy koncentrują się na pojedynczych ligandach, ponieważ pozwala uniknąć konieczności kompilowania dużych bibliotek cDNA lub rekombinowanych białek.

Ten test składa się z trzech głównych etapów: 1) Wysoce zapalone sondy wiążące białka rekombinowane, składające się z zewnątrzkomórkowych regionów receptora będącego przedmiotem zainteresowania, są produkowane i używane w testach wiązania opartych na cytometrii przepływowej opartej na fluorescencji; 2) Testy wiązania służą do identyfikacji linii komórkowej, która wyraża partnera interakcji rekombinowanej sondy białkowej; 3) Wytwarzana jest wersja linii komórkowej z ekspresją Cas9, która oddziałuje z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania, a następnie przeprowadza się badanie przesiewowe nokautu oparte na CRISPR / Cas9 w skali genomu (Figura 1). W tym genetycznym badaniu przesiewowym wiązanie rekombinowanego białka z liniami komórkowymi jest wykorzystywane jako mierzalny fenotyp, w którym komórki w bibliotece nokautu, które utraciły zdolność wiązania sondy, są sortowane za pomocą opartego na fluorescencji aktywnego sortowania komórek (FACS) i genów, które spowodowały utratę fenotypu wiązania zidentyfikowanego przez sekwencjonowanie. W zasadzie identyfikowane są geny kodujące receptor odpowiedzialny za wiązanie sondy Avid oraz te, które są niezbędne do wyświetlania jej powierzchni komórki.

Pierwszy krok tego protokołu polega na produkcji rekombinowanych sond białkowych reprezentujących ektodomenę receptorów związanych z błoną. Wiadomo, że receptory te często zachowują swoje zewnątrzkomórkowe funkcje wiązania, gdy ich ektodomeny są wyrażane jako rekombinowane rozpuszczalne białko1. W przypadku białka będącego przedmiotem zainteresowania, rozpuszczalne białka rekombinowane mogą być wytwarzane w dowolnym odpowiednim systemie ekspresji białek eukariotycznych w dowolnym formacie, pod warunkiem, że mogą być oligomeryzowane w celu zwiększenia awidności wiązania i zawierają znaczniki, które można stosować w testach wiązania opartych na cytometrii przepływowej opartej na fluorescencji (np. znacznik FLAG, znacznik biotyny). Szczegółowe protokoły wytwarzania rozpuszczalnych ektodomen receptorów błonowych z wykorzystaniem systemu ekspresji białek HEK293, a także różne techniki multimeryzacji i konstrukty ekspresji białek do produkcji zarówno białek pentamerycznych, jak i białek monomerycznych zostały wcześniej opisane1,17. Protokół tutaj opisze etapy generowania fluorescencyjnych sond avid z monomerycznych biotynylowanych białek poprzez sprzężenie ich ze streptawidyną sprzężoną z fluorochromem (np. fikoerytryną lub PE), która może być stosowana bezpośrednio w testach wiązania opartych na komórkach i ma tę zaletę, że nie wymaga wtórnego przeciwciała do wykrywania. Ogólne protokoły wykonywania badań przesiewowych w skali genomu zostały już opisane20,21, dlatego protokół koncentruje się głównie na specyfice wykonywania badań przesiewowych wiązania białek rekombinowanych opartych na cytometrii przepływowej przy użyciu systemu badań przesiewowych CRISPR/Cas9 knockout przy użyciu 18.

Protokół

1. Produkcja i oczyszczanie biotynylowanych białek znakowanych Hisem

  1. Stosować system ekspresji białek oparty na komórkach ssaków lub owadów do produkcji rozpuszczalnych, rekombinowanych, znakowanych His, biotynylowanych białek (patrz konstrukcje plazmidowe w Tabeli 1).
    UWAGA: Szczegółowy protokół produkcji monomerycznej biotyny i białek znakowanych Hisem przy użyciu systemu ekspresji komórkowej HEK293 jest opisany przez Kerr et al.17. Ektodomeny białkowe ulegające ekspresji za pomocą systemu ekspresji HEK293 są wydzielane do pożywki hodowlanej.
  2. Zebrać rozpuszczalne białka przez granulowanie komórek przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 20 minut.
  3. Przefiltrować supernatant przez filtr 0,22 μm i dodać kulki agarozy Ni2+-NTA do przefiltrowanego supernatantu białkowego w stosunku 1:1,000 (tj. 50 μl 50% zawiesiny agarozy w 50 ml supernatantu). Inkubować przez noc lub co najmniej 4-5 godzin w temperaturze 4 °C na platformie obrotowej.
  4. Przemyć kolumnę polipropylenową, dodając 5 ml buforu do płukania His-purification. Patrz tabela 2, aby zapoznać się ze wszystkimi składami.
  5. Wlej całą mieszaninę supernatantu z białkiem perełkowym do kolumny. Koraliki będą gromadzić się u podstawy.
  6. Umyj koraliki 2x 15 ml buforu do mycia. Aby uniknąć rozcieńczenia białka, ostrożnie pobrać resztki buforu do płukania z kolumny za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml i wyrzucić.
  7. Ostrożnie dodać 300-500 μl buforu elucyjnego do oczyszczania His bezpośrednio do kulek i inkubować przez co najmniej 1 godzinę. Zebrać wymyte białko, ponownie ostrożnie wyciągając płyn za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Wymienić bufor elucyjny na żądany bufor (np. zwykle PBS lub HBS) za pomocą kolumn odsalających. Przechowywać wszystkie białka w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.

2. Kwantyfikacja i oligomeryzacja monomerycznego białka biotynylowanego

UWAGA: Aby zwiększyć awidność wiązania, oligomeryzuj biotynylowane białka monomeryczne na tetramerycznej streptawidynie-PE przed użyciem ich w testach wiązania. Osiągnąć optymalne współczynniki koniugacji białek monomerycznych i tetramerycznej streptawidyny-PE poprzez badanie serii rozcieńczeń biotynylowanych monomerów w stosunku do ustalonego stężenia streptawidyny i empiryczne ustalenie minimalnego rozcieńczenia, przy którym nie można wykryć nadmiaru biotynylowanych monomerów.

  1. Wykonać co najmniej osiem seryjnych rozcieńczeń biotynylowanych próbek białka przy użyciu odpowiedniego buforu rozcieńczającego (PBS lub HBS z 1% albuminą surowicy bydlęcej [BSA]) na płytce 96-dołkowej. Upewnij się, że końcowa objętość każdego rozcieńczenia wynosi co najmniej 200 μl.
  2. Wykonać duplikat płytki z próbek, usuwając 100 μl z każdej studzienki i przenosząc do nowej płytki 96-dołkowej. Zawsze dołączaj kontrolkę. W tym przypadku kontrole są białkami tylko znacznikowymi (tj. biotynylowanym białkiem domeny Cd4 3 + 4 znakowanym Hisem). Będzie to używane jako sonda kontrolna we wszystkich testach wiązania.
  3. Rozcieńczyć streptawidynę-PE do 0,1 μg/ml w buforze rozcieńczającym.
  4. Tylko na jedną z płytek dodać 100 μl rozcieńczonej streptawidyny-PE. Zduplikowana tabliczka będzie służyć jako kontrolka. Dodać 100 μl buforu rozcieńczającego do płytki kontrolnej w celu wyrównania objętości.
  5. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej (RT). W międzyczasie należy zatkać studzienki płytki pokrytej streptawidyną buforem rozcieńczającym na 15 minut.
  6. Przenieść całkowitą objętość próbki z obu płytek do poszczególnych studzienek płytek pokrytych streptawidyną i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  7. Przemyć płytkę 3x 200 μl buforu do przemywania (tj. PBS lub HBS z 0,1% Tween-20, 2% BSA). Dodać 100 μl mysiego anty-szczura Cd4d3+4 IgG (OX68) o stężeniu 2 μg/ml i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  8. Umyj płytkę 3x buforem do mycia. Dodać 100 μl koniugatu fosfatazy alkalicznej przeciw myszom w stężeniu 0,2 μg/ml przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  9. Przemyć płytkę 3x buforem do przemywania i 1x w buforze rozcieńczającym.
  10. Przygotować fosforan p-nitrofenylu w stężeniu 1 mg/ml w buforze dietanoloaminy. Dodać 100 μl do każdej studzienki i inkubować przez 15 minut.
  11. Wykonaj odczyty absorbancji przy 405 nm. Użyj minimalnego rozcieńczenia, przy którym nie ma sygnału na płytce, jako odpowiedniego współczynnika rozcieńczenia do wytworzenia tetramerów (Rysunek 2).
  12. Sporządzić 10-krotny roztwór do barwienia tetramerów dla wszystkich próbek i kontroli, inkubując 4 μg/ml streptawidyny-PE i odpowiednie rozcieńczenie biotynylowanego białka przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przechowywać sprzężone białka w probówce zabezpieczonej przed światłem w temperaturze 4 °C do czasu dalszego użycia.

3. Testy wiązania komórek oparte na cytometrii przepływowej

  1. W przypadku komórek przylegających usuń pożywkę hodowlaną i przemyj 1x PBS bez kationów dwuwartościowych. Następnie dodaj roztwory odłączające komórki (np. EDTA). Pozwól komórkom oderwać się na 5-10 minut. Delikatnie postukać w kolbę, aby uwolnić komórki.
    UWAGA: Unikaj stosowania produktów na bazie trypsyny, ponieważ mogą one rozszczepiać białka powierzchniowe komórek.
  2. Zbierz oderwane komórki do probówki. W przypadku komórek rosnących w zawiesinie (np. komórek HEK293) należy bezpośrednio pobrać komórki z kolb hodowlanych do probówki.
  3. Komórki osadu w ilości 200 x g przez 5 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w buforze do przemywania (tj. PBS/1% BSA).
  4. Policz komórki za pomocą hemocytometru i dostosuj stężenie do 2,5 x 105-1 x 106 komórek/ml. Podwielokrotność 100 μl przygotowanej mieszanki komórek na 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U lub V. Wirować płytkę przez 5 minut przy 400 x g. Usunąć supernatant za pomocą pipety wielokanałowej.
  5. Dodać 100 μl znormalizowanych, znakowanych fluorescencyjnie, wysoce avid sond białkowych i kontroli do wcześniej przygotowanych płytek z komórkami i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Po związaniu przez 1 godzinę obracać płytkę o gramaturze 400 x g przez 5 min.
  6. Usunąć supernatant i dodać 200 μl buforu do przemywania (tj. PBS/1% BSA). Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół.
  7. Granulować komórki przez odwirowanie przy 400 x g przez 5 min. Powtórzyć etap mycia 1x. Po dwóch płukaniach całkowicie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl PBS.
  8. Analizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Użyj żółto-zielonego lasera (tj. 561 nm), aby wykryć fluorescencję PE.
    1. Najpierw przeanalizuj komórki, które zostały zabarwione sondą kontrolną. Opierając się na rozkładzie fluorescencji PE, narysuj bramkę do wiązania populacji tak, aby nie więcej niż 1% komórki kontrolnej wpadło do tej bramki.
    2. Przeanalizuj próbkę i określ frakcję komórek, która wpada do bramki wiążącej.
      UWAGA: Linie komórkowe, które wykazują wyższą populację wiązań, są pożądane w badaniach genetycznych, ponieważ mają wyższy stosunek sygnału do szumu. Idealnie byłoby, gdyby ponad 80% komórek mieściło się w tej bramce.

4. Określanie wkładu wiązania epitopów termolabilnych i łańcuchów bocznych siarczanu heparanu

UWAGA: Aktywność wielu białek jest niewymierna, więc utrata aktywności wiązania po obróbce cieplnej jest zachęcająca. Zaleca się określenie udziału ujemnie naładowanych glikozaminoglikanów, głównie siarczanu heparanu (HS), w pośredniczeniu w wiązaniu rekombinowanych białek. Dzieje się tak dlatego, że wiązanie przez HS w opisanym tutaj teście wiązania komórkowego może być addytywne, a nie współzależne od innych receptorów19. Oznacza to, że obserwowane wiązanie może być całkowicie pośredniczone przez łańcuchy boczne HS proteoglikanów na powierzchni komórki, a nie przez specyficzny receptor. Wiązanie z HS na powierzchni komórki niekoniecznie jest niespecyficzne, ale raczej jest właściwością białka, którą warto znać przed wykonaniem pełnego badania genetycznego.

  1. Przygotuj próbki białek poddane obróbce cieplnej do wykorzystania w testach wiązania.
    1. Podgrzewać znormalizowane, ale niesprzężone białko monomeryczne w temperaturze 80 °C przez 10 minut.
    2. Sprzężyć białko poddane obróbce cieplnej ze streptawidyną-PE, przyjmując taki sam współczynnik koniugacji, jak jego niepoddane działaniu odpowiednika, jak określono za pomocą testu ELISA (patrz sekcja 2).
  2. Przygotuj próbki białek z zablokowaną heparyną.
    1. Przygotować osiem rozcieńczeń rozpuszczalnej heparyny w PBS w stosunku 1:3 o stężeniu początkowym 2 mg/ml i objętości końcowej 100 μl.
    2. Inkubować 100 μl przygotowanych sond wiążących w rozcieńczeniach heparyny przez co najmniej 30 minut.
  3. Użyć białka poddanego obróbce termicznej i pełnych 200 μl mieszaniny heparyny i białka w testach wiązania opisanych w punkcie 3. Reprezentatywne wyniki są pokazane w Rysunek 3A,B.

5. Wybór linii komórkowych stabilnie wyrażających Cas9

UWAGA: Zanim linia komórkowa wiążąca sondę będzie mogła zostać wykorzystana w badaniach przesiewowych CRISPR, musi najpierw zostać zaprojektowana tak, aby wyrażała nukleazę Cas9 i wysoce aktywny klon selected19.

  1. Do wytworzenia lentiwirusa przy użyciu konstruktu lentiwirusa należy zastosować następujący ogólny protokół produkcji lentiwirusa przy użyciu konstruktu lentiwirusowego dla ekspresji Cas9 (patrz Tabela 1).
    1. Hodowla komórek HEK293-FT w pożywce DMEM/10% FBS w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Wysiewaj komórki HEK293-FT 1 dzień przed transfekcją, tak aby w dniu transfekcji zlewały się w ~80%.
      UWAGA: HEK293FT komórki są luźno przylegające; Dlatego, gdy są one używane do produkcji lentiwirusów, należy rozważyć umieszczenie ich na kolbach hodowlanych pokrytych 0,1% (w/v) żelatyną, aby zwiększyć ich przyczepność.
    2. Wykonuj transfekcje rano. Dodaj wektor transferu, mieszankę opakowaniową i odczynnik do transfekcji do wstępnie podgrzanych pożywek kompatybilnych z transfekcją (np. Opti-MEM). Wymieszaj, odwracając rurkę 10-15x. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dokładne objętości znajdują się w Tabeli 3.
    3. Dodać odczynnik do transfekcji zgodnie z zaleceniami producenta. Wymieszaj przez szybkie wirowanie. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Bardzo ostrożnie odessać zużyte podłoże. Dodaj nośnik zgodny z transfekcją do płyty.
    5. Dodaj odczynnik do transfekcji/kompleksy DNA kroplami na bok płytki i powoli rozprowadź po płytce, bardzo delikatnie mieszając.
    6. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3-5 godzin i zastąpić pożywkę pożywką D10. Inkubować przez noc.
    7. Następnego dnia rano zastąp pożywkę świeżą pożywką D10. Inkubować przez noc.
    8. Następnego dnia późnym popołudniem zbierz supernatant wirusa. Filtr z filtrem 0,45 μm o niskim wiązaniu z białkami. Opcjonalnie dodać świeżą pożywkę D10, inkubować przez noc i zebrać supernatant następnego dnia.
    9. Supernatanty wirusa utrzymują się w stabilnej temperaturze 4 °C tylko przez kilka dni. Przechowywać w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania.
      UWAGA: Aby wytworzyć wysoce skoncentrowany preparat lentiwirusowy, który może być pożądany do transdukcji trudnych do transdukcji komórek, supernatanty można również zagęścić przez odwirowanie w temperaturze 6 000 x g przez noc w temperaturze 4 °C. Oznaczyć półprzezroczysty osad wirusa za pomocą wstrzykiwacza odpornego na etanol i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad w 1/100 pierwotnej objętości, aby uzyskać 100-krotny wzrost stężenia.
  2. Transdukuj komórki za pomocą lentiwirusów.
    1. Płytka 1 x 106 komórek na studzienkę na płytce 6-dołkowej z 3 ml odpowiedniej pożywki hodowlanej. Niektóre komórki są łatwiej transdukowane niż inne. W przypadku łatwych do transdukcji komórek (np. komórek HEK) należy bezpośrednio dodać lentiwirusa do komórek. W przypadku komórek trudnych do transdukcji może być konieczne przestrzeganie protokołu spinokulacji, jak opisano poniżej.
      1. Podwielokrotność 2 ml 2-5 x 106 komórek/ml w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
      2. Dodać lentiwirusa razem z 8 μg/ml bromku heksadimetryny i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
      3. Wirować przez 100 minut przy 800 x g w temperaturze 32 °C. Następnie ponownie zawiesić komórki w tej samej pożywce i dodać zawiesinę komórek do odpowiednich kolb hodowlanych z odpowiednią pożywką.
    2. Pozwól na transdukcję przez co najmniej 24 godziny. Następnie usuń pożywkę zawierającą wirusa i dodaj nową pożywkę.
    3. Po kolejnych 24 godzinach należy zmienić podłoże na takie, które jest uzupełnione odpowiednimi antybiotykami. Konstrukcja Cas9 zawiera kasetę odporną na blasticydynę do wyboru.
      UWAGA: Ilość blastycydyny musi być zoptymalizowana dla każdej linii komórkowej poprzez wykonanie krzywej zabijania odpowiedzi na dawkę. Stężenie blasticydyny między 2,5-50 μg/ml powinno zabić większość nietransdukowanych linii komórkowych w ciągu 10 dni od transdukcji.
  3. Przeprowadzaj selekcję, aż wszystkie komórki na płytce kontrolnej (tj. komórki nietransdukowane, które były leczone tym samym stężeniem antybiotyków selekcyjnych) zostaną zabite.

6. Wybieranie klonów o wysokiej aktywności Cas9

UWAGA: Poliklonalny Cas9 może być używany do skutecznego przeprowadzania badań genetycznych; jednak wybór klonu o wysokiej aktywności Cas9 poprawia wyniki badań przesiewowych18.

  1. Stosować rozcieńczenie ograniczające lub sortować pojedyncze komórki oporne na blasticydynę do studzienek składających się z trzech 96-dołkowych płytek zawierających pożywki hodowlane uzupełnione blasticydyną. Klony zaczną pojawiać się między 2-4 tygodniami. Wybierz 10-20 klonów i rozwiń się w 6 dołkach.
  2. Oznacz klony pod kątem aktywności Cas9 za pomocą szybkiego do oceny systemu GFP-BFP (zielone białko fluorescencyjne-niebieskie białko fluorescencyjne), który wykorzystuje egzogenny system nokautowania genów, w którym komórki są transdukowane albo za pomocą konstruktu wyrażającego GFP z GFP ukierunkowanym na gRNA, albo pustego gRNA jako kontrola18.
    1. Zamów plazmidy reporterowe: plazmid GFP-BFP, plazmid Control-BFP (Tabela 1).
    2. Wytwarzać lentiwirusa zarówno dla plazmidu GFP-BFP, jak i plazmidu Control-BFP, stosując protokół produkcji lentiwirusa opisany w sekcji 5.1.
    3. Transdukuj każdy klon linii komórkowej z ekspresją Cas9 z lentiwirusem kodującym system GFP-BFP i Control-BFP oddzielnie. Postępuj zgodnie z protokołem w sekcji 5.2.
    4. Po 3 dniach transdukcji zbadaj fluorescencję GFP-BFP każdego klonu za pomocą cytometrii przepływowej. Użyj lasera 488 nm i lasera 405 nm do wykrywania odpowiednio GFP i BFP.
    5. Określ ilościowo aktywność Cas9 w każdym klonie, badając stosunek tylko BFP do podwójnie dodatnich komórek GFP-BFP. Ogniwa Cas9 o wysokiej aktywności powinny mieć >95% skuteczność nokautowania GFP (Rysunek 4).

7. Generowanie biblioteki nokautów przesiewowych CRISPR-Cas9 dla całego genomu

  1. W przypadku badań przesiewowych całego genomu przy użyciu biblioteki Human V118 należy zamówić bibliotekę obejmującą cały genom (patrz Tabela 1) i przygotować bibliotekę plazmidów z ukłucia bakteryjnego, korzystając z protokołu podanego w sekcji "Protokoły replikacji biblioteki" w instrukcji producenta.
  2. Preparat plazmidu z biblioteki całego genomu należy wykorzystać do wytworzenia biblioteki lentiwirusowej kodującej gRNA w celu ukierunkowanego zakłócenia genów ludzkich przy użyciu protokołu produkcji lentiwirusa opisanego w sekcji 5.1.
    UWAGA: Dobrą praktyką jest wyprodukowanie pojedynczej partii preparatu lentiwirusowego, który jest zoptymalizowany pod kątem transdukcji w celu poprawy konsystencji eksperymentalnej.
  3. Protokół transdukcji w sekcji 5.2 należy wykorzystać do przeprowadzenia próbnych transdukcji na małą skalę w celu określenia wymaganej ilości wirusa dla każdej linii komórkowej, aby osiągnąć 30% transdukcji. Użyj cytometrii przepływowej do oceny fluorescencji BFP jako wskaźnika zastępczego dla wydajności transdukcji.
  4. Aby transdukować komórki HEK293, wystarczy dodać wcześniej określony preparat lentiwirusowy do 30-50 x 106 komórek hodowanych w normalnych pożywkach wzrostowych przez ~ 4 godziny. Następnie usuń pożywkę z lentiwirusem i zastąp ją świeżą pożywką wzrostową.
  5. W przypadku innych linii komórkowych należy zastosować protokół spinokulacji opisany w sekcji 5.2.1, ale na większą skalę, tak aby w sumie transdukować 30-50 x 106 komórek. W tym celu należy podać 2 ml 5 x 106 komórek/ml w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i postępować zgodnie ze wskazaniami.
  6. W przypadku przylegających linii komórkowych wybierz transdukowane komórki, dodając puromycynę 24 godziny po transdukcji.
    UWAGA: Zoptymalizuj stężenia puromycyny, wykonując krzywą zabijania odpowiedzi na dawkę. Zwykle stężenia od 1 do 10 μg/ml powinny zabić nietransdukowane komórki w ciągu 3-5 dni. Unikaj stosowania wyższych stężeń puromycyny, ponieważ może to zwiększyć szanse na wybór komórek, które zostały transdukowane przez więcej niż jeden przewodnik RNA (sgRNA).
  7. W przypadku komórek zawiesinowych należy zebrać komórki transdukowane (tj. BFP dodatnie) 3 dni po transdukcji za pomocą sortera komórek i wygenerować biblioteki zawierające co najmniej 10 x 106 komórek. Po wybraniu za pomocą BFP hoduj komórki w pożywce uzupełnionej odpowiednią ilością puromycyny.
    UWAGA: Unikaj selekcji tylko z puromycyną dla zawiesinowych linii komórkowych, ponieważ trudno jest usunąć martwe komórki i zanieczyszczenia z zawiesinowych hodowli komórkowych, które mogą zakłócać sortowanie komórek.
  8. Biblioteka mutantów kultur przez 9-16 dni po transdukcji z regularnym pasażem co 2-3 dni.

8. Genetyczne badania przesiewowe pod kątem wiązania powierzchni komórek

  1. Zagnieżdżać bibliotekę zmutowanych komórek o masie 200 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić komórki w PBS.
  2. Podziel komórki na dwie stożkowe probówki o pojemności 15 ml z co najmniej 50 x 106 komórek w każdej probówce.
  3. Wirować jedną stożkową probówkę o masie 200 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i zamrozić osad komórkowy w temperaturze -20 °C. Jest to populacja kontrolna i zostanie przetworzona później.
  4. Zawiesić osad w drugiej probówce w 10 ml PBS/1% BSA. Odłóż 100 μl komórek jako kontrolę ujemną na 96-dołkowej płytce.
  5. Dodać odpowiednie wstępnie sprzężone białko rekombinowane do zawiesiny komórkowej w stożkowej probówce i ujemne białka kontrolne do płytki 96-dołkowej.
  6. Barwienie komórek należy wykonywać przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 4 °C na wirniku stołowym z delikatnymi obrotami (6 obr./min).
  7. Osadzać komórki w masie 200 x g przez 5 minut, usunąć supernatant. Wykonaj dwa etapy mycia, a następnie ponownie zawieś komórki w 5 ml PBS.
  8. Przecedź komórki przez sitko o średnicy 30 μm, aby usunąć skupiska komórek. Analizuj za pomocą sortera przepływowego.
  9. Użyj próbki kontroli ujemnej do bramki dla komórek BFP+/PE-.
  10. Posortuj próbkę i zbierz komórki BFP+/PE-. Bramki sortowania będą zależeć od wiązania komórek z białkiem, ale zwykle pobiera się 1-5% próbek PE ujemnych. Przykład bramki sortującej przedstawiono na rysunku uzupełniającym 1.
  11. Zbierz 500 000-1 000 000 komórek z wybranej bramy. Biorąc pod uwagę małą liczbę komórek, rozważ zebranie próbek w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml, aby zminimalizować straty.
  12. Posortowane komórki osadzać przez odwirowywanie przy 500 x g przez 5 minut. Ostrożnie usunąć supernatant i wyrzucić. Możliwe jest przechowywanie granulatu w temperaturze -20 °C do 6 miesięcy.

9. Ekstrakcja genomowego DNA i pierwszy PCR do wzbogacenia gRNA

  1. Wyodrębnij genomowe DNA z populacji kontrolnej o wysokiej złożoności.
    1. Jeżeli populacja kontrolna została zamrożona w temperaturze -20 °C, wyjąć stożkową rurkę i dodać PBS. Trzymaj na lodzie, aby rozmrozić granulkę.
    2. Użyj zestawu komercyjnego (patrz tabela materiałów), korzystając z zaleceń producenta, aby wyodrębnić genomowe DNA z komórek 50 x 106. Dostosuj stężenie DNA do 1 mg/ml.
    3. Dla każdej próbki należy przygotować mieszankę wzorcową do PCR odpowiadającą 72 μg DNA. Podwielokrotność 50 μl na basenik w 36 dołkach 96-dołkowej płytki PCR. Niezbędne sekwencje starterów są wymienione w tabeli 4. Skorzystaj z przewodnika w tabeli 5 i 6.
    4. Rozpuścić 5 μl PCR z 6-12 reprezentatywnych próbek na 2% (w/v) żelu agarozowym. Należy zaobserwować pojedynczą wyraźną wstęgę przy ~250 pz. Jeśli prążki są słabe, powtórz PCR przez dodatkowe 2-3 cykle.
    5. Za pomocą pipety wielokanałowej zebrać 5 μl produktów PCR z każdej studzienki (łącznie 180 μl) i umieścić je w zbiorniku z 900 μl buforu wiążącego z dostępnego w handlu zestawu (patrz Tabela materiałów).
    6. Oczyść produkty PCR za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania PCR. Odeluj DNA do 50 μl buforu elucyjnego z dostępnego w handlu zestawu (patrz tabela materiałów) i zmierz stężenie DNA.
  2. Jest mało prawdopodobne, aby próbki, które zostały posortowane pod kątem utraty fenotypu wiązania, składały się z dużej liczby niezależnych klonów. W związku z tym nie jest konieczne wykonywanie PCR z 72 μg DNA. Wyizolować DNA za pomocą odpowiedniego zestawu dostępnego w handlu (patrz Tabela Materiałów). Przeprowadzić 3-4 reakcje PCR zgodnie z protokołem opisanym wcześniej (sekcja 9.1.3) z 100 ng/μl DNA. Jeśli posortowana liczba komórek jest mniejsza niż 100 000, użyj lizatów komórkowych zamiast preparatów genomowego DNA.
    1. Podwielokrotność około 10 000 komórek/basenik w 96-dołkowej płytce PCR.
    2. Zebrać komórki w płytce i ostrożnie usunąć większość supernatantu. Pellet nie będzie widoczny.
    3. Dodać 25 μl wody do każdej studzienki i podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 10 minut.
    4. Dodać 5 μl 2 mg/ml świeżo rozcieńczonej proteinazy K do każdego dołka przez 1 godzinę i inkubować w temperaturze 56 °C. Następnie podgrzewać próbkę przez 10 minut w temperaturze 95 °C w celu dezaktywacji proteinazy K.
    5. Użyj 10 μl mieszaniny lizatu komórkowego na reakcję PCR. Lizaty należy zużyć w ciągu 24 godzin.

10. Druga runda PCR do indeksowania i sekwencjonowania

  1. Rozcieńczyć produkty z pierwszej rundy PCR do 40 pg/μl.
  2. Ustawić jeden PCR na próbkę (skorzystaj z przewodnika zamieszczonego w tabelach 7 i 8). Zastosowanie polimerazy o wysokiej wierności jest ważne, aby zminimalizować błędy wprowadzane przez polimerazę podczas amplifikacji sgRNA.
  3. Rozpuść 5 μl produktów PCR na 2% (w/v) żelu agarozowym. Należy obserwować pojedyncze czyste pasmo o wartości ~330 bps.
  4. Oczyść produkty PCR za pomocą kulek paramagnetycznych, dodając 31,5 μl (0,7x całkowita objętość) ponownie zawieszonych kulek do produktów PCR, dobrze mieszając i inkubując przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym na 3 minuty. Koraliki powinny być uchwycone z boku płytki, a roztwór powinien być klarowny. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant.
  6. Do probówki dodać 150 μl 80% świeżo przygotowanego etanolu. Inkubować przez 30 s, a następnie ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant.
  7. Powtórz krok 13.6, tym razem z 180 μl. Następnie suszyć koraliki na powietrzu przez 5 minut.
  8. Wyjmij rurkę z magnesu. Eluować cel DNA z kulek do 35 μl sterylnego buforu EB. Inkubuj przez 3 minuty, a następnie włóż probówkę z powrotem do stojaka magnetycznego na 3 minuty.
  9. Przenieść około 30 μl supernatantu zawierającego eluowane produkty PCR do czystej probówki.
  10. Sekwencjonuj próbki na platformie sekwencjonowania nowej generacji. W przypadku biblioteki gRNA HumanV1 użyj niestandardowego startera wymienionego w tabeli 4, aby zsekwencjonować 19 pz.

11. Analiza bioinformatyczna w celu identyfikacji receptora i powiązanych szlaków

  1. Mapowanie sekwencji z posortowanej i nieposortowanej populacji do biblioteki referencyjnej przy użyciu funkcji count programu MAGeCK. Funkcja zwróci nieprzetworzony plik zliczania (tabela uzupełniająca 1).
    UWAGA: Szczegółowe instrukcje dotyczące instalacji MAGeCK i korzystania z różnych funkcji w MAGeCK są opisane we wcześniej opublikowanym protokole autorstwa Wang et al.20.
  2. Sprawdź standard techniczny biblioteki kontrolek używanej na ekranie.
    1. Mediana normalizuje surowe liczby i używa pakietu ggplot2 w R21 lub równoważnym oprogramowaniu, aby wykreślić empiryczny wykres funkcji skumulowanej gęstości zliczeń w plazmidzie i kontrolować nieposortowane próbki (Rysunek 5A).
    2. Uruchom funkcję -test MAGeCK, używając zliczeń z populacji plazmidu jako "kontroli" i zliczeń z nieposortowanych próbek kontrolnych jako próbki "testowej". Funkcja ta spowoduje wygenerowanie pliku podsumowania genów (tabela uzupełniająca 1).
    3. Otwórz plik podsumowania genów i narysuj rozkład zmian logarytmiczno-krotnych (kolumna neg|lfc) dla wcześniej skategoryzowanych genów niezbędnych i nieistotnych22 (Rysunek 5B).
    4. Wybierz znacznie zubożone geny (neg|fdr < 0,05) i przeprowadź analizę wzbogacania szlaku za pomocą pakietu enrichr23 lub dowolnego równoważnego pakietu wzbogacania szlaku w R (Rysunek 5C).
  3. Uruchom funkcję -test programu MAGeCK z ustawieniem domyślnym. Podczas wykonywania analizy należy użyć surowych zliczeń z nieposortowanej próbki kontrolnej jako "kontroli" i zliczeń z posortowanej próbki jako "traktowania".
  4. Otwórz plik podsumowania genów wygenerowany przez MAGeCK i uszereguj kolumnę pos|rank w kolejności rosnącej. Użyj FDR (kolumna pos|fdr) < 0,05 jako punktu odcięcia do identyfikacji trafień. Receptor jest zwykle wysoko oceniany, często na pierwszej pozycji.
  5. Wykreśl wyniki algorytmu Robust-Ranking-Algorithm (RRA) dla pozytywnej selekcji (pos|score) w R lub równoważnym oprogramowaniu (Rysunek 5D).
  6. Wybierz trafienia genów i przeprowadź analizę wzbogacania szlaku przy użyciu pakietu wzbogacającego lub dowolnego równoważnego pakietu wzbogacania szlaku w R, aby zidentyfikować wzbogacone szlaki.

Wyniki

Dane z sekwencjonowania pochodzące z dwóch reprezentatywnych przesiewów knockout w skali genomu, przeprowadzonych odpowiednio w komórkach NCI-SNU-1 i HEK293 w celu identyfikacji partnera wiązania ludzkiego TNFSF9 oraz P. falciparum RH5, zostały udostępnione (Tabela uzupełniająca 1). Zachowanie wiązania RH5 było zależne zarówno od siarczanu heparanu, jak i jego znanego receptora BSG24 (Rysunek 3C), natomiast TNFRSF9 wiązał się specyficznie ze swoim znanym receptorem TNFSF9 i nie utracił zdolności wiązania po preinkubacji z rozpuszczalną heparyną. Białko 3 na Rysunku 3B reprezentuje TNFRSF9.

Dla obu linii komórkowych przedstawiono również rozkład gRNA w kontrolnej bibliotece mutantów po 3 dniach (oraz 9, 14 i 16 dniach po transdukcji) (Tabela uzupełniająca 1). Rozkład gRNA wykazał, że złożoność biblioteki została zachowana przez cały czas trwania eksperymentu (Rysunek 5A). Przesiew genetyczny w celu identyfikacji liganda dla TNFSF9 przeprowadzono w 14. dniu po transdukcji, natomiast dla RH5 w 9. dniu po transdukcji. Jakość techniczną przesiewów oceniono poprzez analizę rozkładu obserwowanych zmian krotności (fold-change) gRNA celujących w referencyjny zestaw genów nieessentialnych w porównaniu z rozkładem dla referencyjnego zestawu genów essentialnych22 (Rysunek 5B). Ponadto analiza wzbogacenia na poziomie szlaków wykazała, że oczekiwane szlaki essentialne zostały zidentyfikowane i uległy znacznemu wzbogaceniu w populacji „drop-out” podczas porównywania próbki kontrolnej z oryginalną biblioteką plazmidową. Przykład dla próbki NCI-SNU-1 z 14. dnia przedstawiono na Rysunku 5C.

Do identyfikacji receptora z przesiewów fenotypowych wykorzystano rozkład gRNA w populacji kontrolnej w porównaniu z populacją posegregowaną, stosując funkcję -test programu MAGeCK (zob. tabelę uzupełniającą 1 w celu uzyskania podsumowania genów z MAGeCK).Zmodyfikowany wynik RRA raportowany przez MAGeCK w analizie na poziomie genów został naniesiony na wykres w odniesieniu do genów uszeregowanych według wartości p. Wynik RRA w MAGeCK stanowi miarę, w której gRNA są szeregowane konsekwentnie wyżej, niż oczekiwano. W przesiewie dla TNFRSF9 najlepszym wynikiem był TNFSF9, który jest znanym partnerem wiążącym dla TNFRSF9 (rycina 5D). Ponadto zidentyfikowano szereg genów związanych ze szlakiem TP53. W przypadku RH5, poza znanym receptorem (BSG) i genem niezbędnym do produkcji siarkowanych GAG (SLC35B2), zidentyfikowano również dodatkowy gen (SLC16A1) (rycina 5E). SLC16A1 jest chaperonem niezbędnym do transportu BSG na powierzchnię komórek25. Wspólnie wyniki te demonstrują zdolność przesiewu do identyfikacji bezpośrednio oddziałujących receptorów oraz komponentów komórkowych niezbędnych do ekspresji tego receptora na powierzchni komórek w formie funkcjonalnej.

Schemat syntezy białek rekombinowanych, testów wiązania i przesiewu genetycznego CRISPR-Cas9 w badaniach biochemicznych.
Rycina 1: Przegląd podejścia do przesiewu genetycznego w celu identyfikacji receptorów powierzchniowych komórek. Test ten składa się z trzech głównych etapów: Po pierwsze, białka rekombinowane reprezentujące ektodomenę receptorów powierzchniowych komórek są ekspresowane w linii komórkowej zdolnej do wprowadzania krytycznych strukturalnie modyfikacji potranslacyjnych, takich jak komórki HEK293. Monomeryczne ektodomeny białek są oligomeryzowane poprzez koniugację ze streptawidyną-PE, aby zwiększyć ich awidność wiązania. Po drugie, te awidne sondy są wykorzystywane w testach wiązania komórkowego, w których silne barwienie linii komórkowych, wskazane przez wyraźne przesunięcie fluorescencji PE (na zielono) w porównaniu z białkiem kontrolnym negatywnym (na czarno), wykazuje obecność partnera wiążącego na powierzchni komórki. Po trzecie, wybierane są linie komórkowe wykazujące obecność receptora i ekspresujące Cas9, a następnie przeprowadzany jest przesiew w skali genomu z użyciem gRNA celujących w zdecydowaną większość genów kodujących białka. Podczas generowania bibliotek mutantów powszechnie stosuje się 30% wydajność transdukcji, co opiera się na prawdopodobieństwie rozkładu Poissona, które zapewnia, że każda komórka otrzyma pojedynczy gRNA, dzięki czemu wynikający fenotyp można przypisać do konkretnego nokautu. Marker BFP ekspresowany przez transdukowane komórki jest wykorzystywany do selekcji komórek zawierających gRNA za pomocą FACS. Przesiewy fenotypowe są przeprowadzane od 9 do 16 dni po transdukcji. W dniu przesiewu całkowita populacja komórek mutantów jest dzielona na dwie części. Jedna połowa jest zachowywana jako populacja kontrolna, a druga jest selekcjonowana pod kątem wiązania białka rekombinowanego. Komórki z biblioteki mutantów, które nie są już w stanie wiązać białka rekombinowanego, są sortowane za pomocą FACS, a wzbogacenie gRNA w populacji sortowanej w stosunku do populacji kontrolnej jest wykorzystywane do identyfikacji genów niezbędnych do wiązania znakowanej awidnej sondy na powierzchni komórki. Wskazano etapy protokołu wymagające znacznej ilości czasu. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Sharma i wsp.19. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres absorbancji w funkcji rozcieńczenia pokazujący wpływ streptawidyny-PE; absorbancja przy 405 nm, porównanie buforów.
Rycina 2: Ustalanie stosunków biotynilowanego białka do streptawidyny-PE przy użyciu metody opartej na teście ELISA. Przykład strategii koniugacji streptawidyny-PE wykorzystanej do wytworzenia sondy awidnej z biotynilowanego białka monomerycznego. Serię rozcieńczeń biotynilowanych monomerów inkubowano z ustalonym stężeniem streptawidyny. Minimalne rozcieńczenie, przy którym nie można było wykryć nadmiaru biotynilowanych monomerów, określono za pomocą testu ELISA. Test ELISA przeprowadzono z wstępną inkubacją różnych rozcieńczeń białka z 10 ng streptawidyny-PE lub bez niej. W obecności streptawidyny-PE wyznaczono minimalne rozcieńczenie, przy którym nie zidentyfikowano sygnału (określone czarnym kółkiem), a następnie obliczono ilość białka wymaganą do nasycenia w celu przygotowania 10-krotnego roztworu zapasowego zawierającego 4 µg/mL streptawidyny-PE. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Histogramy cytometrii przepływowej wiązania białek, z warunkami kontrolnymi i po preinkubacji, trzy białka.
Rycina 3: Reprezentatywne wiązanie białek z liniami komórkowymi. (A) Wiązanie białek z liniami komórkowymi wykazało wyraźny wzrost fluorescencji związanej z komórkami w porównaniu z próbką kontrolną. Obróbka termiczna (80 °C przez 10 min) białka rekombinowanego zniosła całe wiązanie, sprowadzając je do poziomu kontroli negatywnej, co dowodzi, że zdolność wiązania była zależna od prawidłowego sfałdowania białka. (B) Różne klasy zachowania wiązania białek z powierzchniami komórkowymi; zależność od GAG. Od lewej do prawej białka można podzielić na trzy typy: Białka typu 1 adsorbują wyłącznie do HS. Białka te tracą zdolność wiązania po preinkubacji z heparyną w stężeniach powyżej 0.2 mg/mL. Białka typu 2 wiążą się z HS oraz ze specyficznym receptorem. Białka te wykazują częściową utratę wiązania w eksperymentach z preblokowaniem. Białka typu 3 nie wiążą się z HS. Białka te nie tracą zdolności wiązania w porównaniu z liniami rodzicielskimi. (C) Przykład białka (tj. RH5), które wiąże się z HS i specyficznym receptorem w sposób addytywny. Celowanie w receptor (tj. BSG) lub enzymy niezbędne do syntezy HS (np. SLC35B2, EXTL3) powoduje jedynie częściową redukcję wiązania RH5 z komórkami w stosunku do kontroli. W takich eksperymentach w celu ustalenia zachowania wiązania można wykorzystać transdukowane linie poliklonalne. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Sharma et al.19. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres cytometrii przepływowej; targetowanie GFP poprzez gRNA; fluorescencja BFP vs. GFP; analiza edycji genów.
Rycina 4: Wybór klonalnych linii komórkowych o wysokiej aktywności Cas9. Wydajność edycji genomu w liniach poliklonalnych i klonowanych linii komórkowych NCI-SNU-1 oceniono przy użyciu systemu reporterowego GFP-BFP, w którym linie komórkowe transdukowano wirusami z plazmidem targetującym gRNA kodującym GFP lub bez niego (tj. „pustym”). Przedstawiono schemat. Cytometrię przepływową wykorzystano do badania ekspresji BFP i GFP po transdukcji w porównaniu z nieinfekowaną kontrolą. Ekspresję GFP wykorzystano jako wskaźnik aktywności Cas9, natomiast ekspresję BFP do oznaczenia komórek transdukowanych. Profil dla komórek nieinfekowanych i zainfekowanych pustym plazmidem był podobny dla wszystkich klonów. Reprezentatywne profile przedstawiono na lewym panelu. Wszystkie pięć klonów linii komórkowej NCI-SNU-1 wykazało większą utratę GFP w porównaniu z linią poliklonalną (prawy panel), przy czym klon 4 wykazał najwyższą wydajność z najmniejszą populacją refrakterną. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Sharma et al.19. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza edycji genów; wykres, tabela i schemat; znormalizowana liczba, ekspresja genów, szlaki biosyntezy.
Rycina 5: Reprezentatywne wyniki przesiewów genetycznych w celu identyfikacji partnerów wiążących się z powierzchnią komórki. (A) Wykresy funkcji rozkładu skumulowanego porównujące liczebność gRNA w bibliotece plazmidowej z bibliotekami mutantów komórek HEK-293-E i NCI-SNU-1 w 9., 14. i 16. dniu po transdukcji. Dla dowolnej liczby funkcja gęstości skumulowanej podaje procent punktów danych znajdujących się poniżej tego progu. Niewielkie przesunięcie populacji komórek mutantów w porównaniu z pierwotną populacją plazmidową reprezentuje ubytek w podzbiorze gRNA w porównaniu z biblioteką plazmidową. (B) Rozkład logarytmicznych zmian krotności (log-fold changes) w genach, które zostały wcześniej skategoryzowane jako niezbędne (czerwony) lub nieistotne (czarny) w liniach komórkowych HEK293 i NCI-SNU-1. Rozkład zmian krotności dla genów nieistotnych był skupiony wokół ~0, podczas gdy rozkład dla genów niezbędnych przesunął się w lewo w stronę ujemnych zmian krotności. (C) Istotnie wzbogacone szlaki w genach wyczerpanych w populacji kontrolnej mutantów NCI-SNU-1 14 dni po transdukcji. Zidentyfikowano przewidywane, znane szlaki niezbędne dla komórek. (D) Wynik Robust Rank Algorithm (RRA) dla genów wzbogaconych w posortowanych komórkach, które utraciły zdolność wiązania sondy TNFRSF9. Geny zostały uszeregowane zgodnie z wynikiem RRA. W przesiewie zidentyfikowano znany partner interakcji TNFSF9 oraz geny związane ze szlakiem TP53 (oznaczone na czerwono). (E) Uszeregowane wyniki RRA dla genów zidentyfikowanych w analizie wzbogacenia gRNA wymaganych do wiązania RH5 z komórkami HEK293 (lewy panel). SLC35B2 oraz SLC16A1 zostały zidentyfikowane w ramach progu fałszywych odkryć (FDR) wynoszącego 5%. Dwa dodatkowe geny w szlaku biosyntezy HS (tj. EXTL3 i NDST1) zostały zidentyfikowane w ramach FDR wynoszącego 25%. Schemat przedstawiający ogólny szlak biosyntezy GAG z naniesionymi odpowiednimi genami na odpowiadające im etapy (panel 2). W przesiewie nie zidentyfikowano genów wymaganych do przejścia w biogenezę siarczanu chondroityny (tj. CSGALNACT1/2). Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Sharma i wsp.19. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Nazwa plazmiduPlazmid nrZastosowanie
Konstrukt ekspresji białka: CD200RCD4d3+4-bio-linker-hisAddgene: 36153Produkcja rekombinowanego białka z sekwencjami CD4d3+4, biotyną i znacznikami 6-his.
pMD2.GAddgene: 12259Plazmid wykazujący ekspresję białka otoczki VSV-G; produkcja lentiwirusa
psPAX2Addgene: 12260Plazmid pakujący lentiwirusowy, produkcja lentiwirusa
Konstrukt Cas9: pKLV2-EF1a-Cas9Bsd-WAddgene: 68343Produkcja linii konstytutywnie eksponującej Cas9
konstrukt ekspresyjny gRNA: pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-WAddgene: 67974Wektor ekspresyjny gRNA CRISPR z ulepszonym rusztowaniem oraz markerami puro/BFP
Udoskonalona ludzka biblioteka CRISPR do knockoutu w całym genomieAddgene: 67989Biblioteka gRNA skierowana przeciwko 18 010 ludzkim genom, zaprojektowana do zastosowania w lentiwirusach.
Konstrukt GFP-BFP: pKLV2-U6gRNA5(gGFP)-PGKBFP2AGFP-WAddgene: 67980Reporter aktywności Cas9 z BFP i GFP.
Konstrukt pusty: pKLV2-U6gRNA5(empty)-PGKBFP2AGFP-WAddgene: 67979Reporter aktywności Cas9 (kontrola) z BFP i GFP.

Tabela 1: Plazmidy wykorzystane w tym podejściu.

Nazwa buforuSkładniki
HBS (10X)1.5 M NaCl oraz 200 mM HEPES w wodzie MiliQ, doprowadzić do pH 7.4
PBS (10X)80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4 g Na2HPO4 oraz 2.4 g KH2PO4 w wodzie MiliQ, doprowadzić do pH 7.4
Bufor fosforanowy sodu (roztwór stokowy 80mM)7.1 g Na2HPO4.2H2O, 5.55 g NaH2PO4, doprowadzić do pH 7.4
Bufor wiążący do oczyszczania białek His20 mM bufor fosforanowy sodu, 0.5 M NaCl oraz 20 mM imidazolu, doprowadzić do pH 7.4
Bufor elucyjny do oczyszczania białek His20 mM bufor fosforanowy sodu, 0.5 M NaCl oraz 400 mM imidazolu, doprowadzić do pH 7.4
Bufor dietanoloaminowy10% dietanoloaminy i 0.5 mM MgCl2 w wodzie MiliQ, doprowadzić do pH 9.2:
D10DMEM, 1% penicyliny-streptomycyny (100 units/mL) oraz 10% inaktywowanego ciepłem FBS

Tabela 2: Bufory wymagane do niniejszego badania.

Komponentyszalka 10-cmpłytka 6-dołkowa
komórki 293FT70–80% konfluencji70–80% konfluencji
Pośrodki kompatybilne z transfekcją (Opti-MEM) (Krok 5.1.2)3 mL500 µL
Pośrodki kompatybilne z transfekcją (Opti-MEM) (Krok 5.1.4)5 mL2 ml
Lentiwirusowy wektor transferowy3 µg0.5 µg
psPax2 (patrz tabela 1)7.4 µg1.2 µg
pMD2.G (patrz tabela 1)1.6 µg0.25 µg
odczynnik PLUS12 µL2 µL
Lipofectamine LTX36 µL6 µL
D10 (Krok 7.1.7)5 mL1,5 mL
D10 (Krok 7.1.8 i 7.1.10)8 ml2 mL

Tabela 3: Ilości i objętości odczynników dla mieszaniny do pakowania lentiwirusów.

Tabela 4: Sekwencje starterów do amplifikacji gRNA i NGS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

OdczynnikObjętość na reakcjęMieszanina Master mix (x38)
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x25 μL950 μL
mieszanina starterów (L1/U1) (10 μM każdy)1 μL38 μL
DNA genomiczne (1 mg/ml)2 μL72 μL
H2O22 μL1100 μL
Suma50 μL1900 μL

Tabela 5: PCR w celu amplifikacji gRNA z próbek o wysokiej złożoności.

Numer cykluDenaturacjaPrzyłączanieEkstensja
198 °C, 30s
2-2498 °C, 10s61 °C, 15s72 °C, 20s
2572 °C, 2 min

Tabela 6: Warunki PCR dla pierwszej reakcji PCR.

OdczynnikObjętość na reakcję
KAPA HiFi HotStart ReadyMix25 μL
Mieszanina starterów (starter PE1.0/starter indeksujący) (5 μM każdy)2μL
Pierwszy produkt PCR (40 pg/μL)5 μL
H2O18 μL
Suma50 μL

Tabela 7: PCR do znakowania indeksowego sgRNA z przesiewów genetycznych.

Numer cykluDenaturacjaPrzyłączanieElongacja
198 °C, 30s
2-1598 °C, 10s66 °C, 15s72 °C, 20s
1672 °C, 5 min

Tabela 8: Warunki PCR dla drugiej reakcji PCR.

Analiza cytometrii przepływowej wiązania białka w stosunku do fluorescencji; histogramy i wykres rozrzutu porównują ekspresję SLC35B2 w komórkach docelowych i kontrolnych, wyróżniając wyselekcjonowaną populację.
Rysunek uzupełniający S1: Przewodnik po wyznaczaniu bramek do sortowania populacji niewiążącej. (A) Idealny kandydat białkowy do screeningu powinien wykazywać wyraźne przesunięcie populacji wiążącej w porównaniu z populacją kontrolną, a wiązanie powinno zostać zachowane w komórkach pozbawionych aparatu do biosyntezy HS. Zamiast testowania na liniach komórkowych z nokautem SLC35B2 można przeprowadzić eksperyment z blokowaniem heparyną. (B) Zebrano komórki pozbawione barwienia powierzchniowego z ektodomeny białka, ale wykazujące fluorescencję BFP po transdukcji lentiwirusem. Przedstawione komórki pochodzą ze screeningu w celu identyfikacji receptora dla GABBR222. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Sharma et al.19. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wykres analizy głównych składowych (PCA) porównujący linie komórkowe, wizualna analiza danych klastrowania.
Rysunek uzupełniający S2: Wykres PCA oparty na transkryptomice glikoprotein powierzchni komórki z wykorzystaniem danych RNA-seq z ponad 1 000 linii komórkowych nowotworów. Linie komórkowe z bazy Cell Model Passport27 zostały zgrupowane metodą klastrowania K-średnich na podstawie wartości FPKM dla około 1 500 glikoprotein powierzchni komórki. Oznaczono reprezentatywne linie komórkowe z każdego klastra. Klaster 5 składał się w całości z linii komórkowych pochodzenia hematopoetycznego (patrz również Tabela uzupełniająca 2). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Mapa cieplna klastrowania hierarchicznego pokazująca różnice w ekspresji genów w klastrach; analiza danych z wyników BF.
Rycina uzupełniająca S3: Wyniki istotności dla genów eksportu białek i glikozylacji N-łączeniowej z adnotacji KEGG uzyskane z wyników projektu. Skorygowane wyniki istotności Bayesa dla ~330 linii komórkowych (kolumny, nieoznaczone) przedstawiono dla genów szlaku eksportu białek i glikozylacji N-łączeniowej (oś X). Wyniki wyższe niż 0 oznaczają istotne wyczerpanie w populacji mutantów w porównaniu do oryginalnej biblioteki plazmidowej. Geny można podzielić na trzy odrębne klastry reprezentujące różne poziomy istotności w liniach komórkowych. Klastrowanie to może być wykorzystane do wyznaczenia dnia sortowania. Jeśli przesiew zostanie przeprowadzony w późniejszym punkcie czasowym (dzień 16), istnieje możliwość, że geny znane jako istotne dla komórek (klastry 1 i 3) nie zostaną zidentyfikowane. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Tabela uzupełniająca 1: Pliki z surową liczbą odczytów oraz pliki gene_summary wygenerowane przez oprogramowanie MAGeCK powiązane z reprezentatywnymi badaniami przesiewowymi genetycznymi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Tabela uzupełniająca 2: Grupowanie linii komórkowych według ekspresji receptorów powierzchniowych komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten plik (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Dyskusja

Opisano strategię badań przesiewowych opartą na CRISPR w celu identyfikacji genów kodujących komponenty komórkowe zaangażowane w rozpoznawanie komórek. Podobne podejście wykorzystujące aktywację CRISPR zapewnia również genetyczną alternatywę do identyfikacji bezpośrednio oddziałujących receptorów rekombinowanych białek bez konieczności generowania dużych bibliotek białek26. Jednak jedną z głównych zalet tego podejścia jest to, że ma ono zastosowanie do interakcji, w których pośredniczą cząsteczki powierzchniowe natywnie wyświetlane na komórce i nie zależy od nadekspresji receptorów, co może wpływać na awidność wiązania receptora. W przeciwieństwie do innych metod, technika ta nie przyjmuje żadnych założeń dotyczących biochemicznej natury lub biologii komórki receptorów i daje możliwość badania interakcji, w których pośredniczą białka, które zwykle są trudne do zbadania przy użyciu podejść biochemicznych, takich jak bardzo duże białka lub te, które wielokrotnie przechodzą przez błonę lub tworzą kompleksy z innymi białkami. oraz cząsteczki inne niż białka, takie jak glikany, glikolipidy i fosfolipidy. Biorąc pod uwagę charakter metody w skali genomu, podejście to ma również tę zaletę, że nie tylko identyfikuje receptor, ale także dodatkowe składniki komórkowe, które są wymagane do zdarzenia wiązania, zapewniając w ten sposób wgląd w biologię komórki receptora.

Jednym z głównych ograniczeń tej metody przy użyciu jej do identyfikacji receptora białka sierocego jest początkowy wymóg, aby najpierw zidentyfikować linię komórkową, która wiąże się z białkiem. Nie zawsze jest to łatwe, a identyfikacja linii komórkowej, która wykazuje fenotyp wiązania, który jest również dopuszczalny dla genetycznych badań przesiewowych, może być krokiem ograniczającym czas wdrożenia tego testu. Niektóre linie komórkowe mają tendencję do wiązania się z większą liczbą białek niż inne. Jest to szczególnie istotne w przypadku białek, które wiążą HS, ponieważ białka te mają tendencję do wiązania się z dowolną linią komórkową, która wykazuje łańcuchy boczne HS, niezależnie od natywnego kontekstu wiązania. Dodatkowo zaobserwowaliśmy, że regulacja w górę syndekanów (tj. proteoglikanów zawierających HS) w liniach komórkowych prowadzi do zwiększonego wiązania białek wiążących HS26. Może to być czynnik, który należy wziąć pod uwagę przy wyborze linii komórkowej do badań przesiewowych. Jednak ważne jest również, aby pamiętać, że addytywne wiązanie HS nie zakłóca wiązania z określonym receptorem. Oznacza to, że jeśli zaobserwuje się wiązanie, możliwe jest, że jest ono pośredniczone wyłącznie przez HS, ponieważ wiązanie, w którym pośredniczy HS w tym teście, jest addytywne, a nie współzależne19. W takim scenariuszu opisane podejście do blokowania heparyny może zidentyfikować takie zachowania bez konieczności przeprowadzania pełnego badania genetycznego.

Przydatnym źródłem do wyboru linii komórkowych jest Paszport Modelu Komórki, który zawiera informacje o genomice, transkryptomice i warunkach hodowli dla ~1,000 linii komórek rakowych27. W zależności od kontekstu biologicznego komórki można wybierać na podstawie ich profili ekspresji. Aby pomóc w selekcji linii komórkowych, zgrupowaliśmy ~ 1,000 linii komórkowych w paszporcie modelu komórki zgodnie z ekspresją ~ 1,500 wstępnie opisanych glikoprotein powierzchniowych komórek ludzkich28 (rysunek uzupełniający 2; informacje o klastrach dla każdej linii komórkowej wraz z warunkami wzrostu znajdują się w Tabeli Uzupełniającej 2). Podczas testowania wiązania białka o nieznanej funkcji przydatne jest wybranie panelu reprezentatywnych linii komórkowych z każdego klastra, aby zwiększyć szansę na pokrycie szerokiego zakresu receptorów. Mając wybór, zaleca się wybór linii komórkowych, które są łatwe do hodowli i łatwe do transdukcji. Ponieważ te linie komórkowe będą wykorzystywane w badaniach przesiewowych w skali genomu, preferowane jest, aby można je było łatwo hodować w dużych ilościach i były podatne na transdukcję lentiwirusową, ponieważ jest to najpowszechniej dostępna metoda dostarczania sgRNA do genetycznych badań przesiewowych opartych na CRISPR na późniejszych etapach.

Ogólnie rzecz biorąc, selekcja fenotypów jest przeprowadzana w jednym sortowaniu. Decyduje o tym jednak jasność wybarwionej populacji komórek w porównaniu z kontrolą. Iteracyjne rundy selekcji mogą być stosowane w scenariuszach, w których stosunek sygnału do szumu pożądanego fenotypu jest niski lub gdy celem badania przesiewowego jest identyfikacja mutantów o silnych fenotypach. W przypadku stosowania podejścia do selekcji iteracyjnej dla badań przesiewowych opartych na FACS ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że proces sortowania może spowodować śmierć komórki, głównie ze względu na samą siłę sortera. W związku z tym nie wszystkie zebrane komórki będą reprezentowane w następnej rundzie sortowania.

Złożoność biblioteki jest bardzo ważnym czynnikiem w przeprowadzaniu udanych badań genetycznych, zwłaszcza w przypadku badań przesiewowych selekcji negatywnej, ponieważ zakres ich uszczuplenia można określić tylko poprzez porównanie wyników z tym, co było obecne w bibliotece wyjściowej. W przypadku ekranów selekcji negatywnej często utrzymuje się biblioteki o złożoności 500-1,000x. Ekrany selekcji pozytywnej są jednak bardziej odporne na rozmiary bibliotek, ponieważ w takich ekranach oczekuje się, że tylko niewielka liczba mutantów zostanie wybrana dla określonego fenotypu. W związku z tym, na opisanym tutaj ekranie wyboru pozytywnego, rozmiar biblioteki może zostać zmniejszony do złożoności 50-100x bez uszczerbku dla jakości ekranu. Na dodatek, w badaniach tych możliwe jest również użycie biblioteki kontrolnej dla danej linii komórkowej w danym dniu jako "kontroli ogólnej" dla wszystkich próbek posortowanych w danym dniu dla tej danej linii komórkowej. Zmniejszy to liczbę bibliotek kontrolnych, które muszą być tworzone i sekwencjonowane.

Inną ważną kwestią przy stosowaniu tego podejścia są ograniczenia badań przesiewowych utraty funkcji w identyfikacji genów, które są niezbędne do wzrostu komórek in vitro. Czas badań przesiewowych ma w tym względzie kluczowe znaczenie, ponieważ im dłużej zmutowane komórki są trzymane w hodowli, tym większe prawdopodobieństwo, że komórki z mutacjami w podstawowych genach staną się niezdolne do życia i nie będą już reprezentowane w bibliotece mutantów. Niedawne badania genetyczne przeprowadzone w ramach inicjatywy Project Score na ponad 300 liniach komórkowych pokazują, że wiele genów w szlaku wydzielania białek i N-glikozylacji z adnotacją KEGG jest często identyfikowanych jako niezbędne dla wielu linii komórkowych (rysunek uzupełniający 3)29. Można to wziąć pod uwagę przy projektowaniu badań przesiewowych, jeśli wpływ genów niezbędnych do proliferacji i żywotności ma być badany w kontekście procesu rozpoznawania komórkowego. W takim przypadku przeprowadzenie badań przesiewowych we wczesnym punkcie czasowym (np. 9 dnia po transdukcji) byłoby ogólnie właściwe. Jeśli jednak podejście to jest stosowane do identyfikacji kilku celów o silnym wpływie na wielkość, a nie ogólnych szlaków komórkowych, właściwe może być przeprowadzenie badań przesiewowych w późniejszym czasie (np. 15-16 dnia po transdukcji).

Wyniki badań przesiewowych są bardzo solidne; W ośmiu badaniach przesiewowych wiązania rekombinacji białek przeprowadzonych w przeszłości, receptor powierzchniowy komórki był największym hitem w każdym przypadku19. Stosując to podejście do identyfikacji partnera interakcji, należy się zatem spodziewać, że receptor i czynniki przyczyniające się do jego prezentacji na powierzchni będą identyfikowane z dużą pewnością statystyczną. Po przeprowadzeniu badania przesiewowego i walidacji trafienia za pomocą pojedynczego nokautu gRNA, można przeprowadzić dalsze obserwacje przy użyciu istniejących metod biochemicznych, takich jak AVEXIS4 i bezpośrednie saturywalne wiązanie oczyszczonych białek za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Opisane tutaj podejście ma zastosowanie do wszystkich białek, dla których możliwe jest wygenerowanie rozpuszczalnej rekombinowanej sondy wiążącej.

Podsumowując, jest to podejście oparte na nokaucie CRISPR w skali genomu w celu identyfikacji interakcji, w których pośredniczą białka powierzchniowe komórki. Metoda ta ma ogólne zastosowanie do identyfikacji szlaków komórkowych wymaganych do rozpoznawania powierzchni komórki w szerokim zakresie różnych kontekstów biologicznych, w tym między własnymi komórkami organizmu (np. rozpoznawanie neuronalne i immunologiczne), a także między komórkami gospodarza a białkami patogenu. Metoda ta stanowi genetyczną alternatywę dla podejść biochemicznych przeznaczonych do identyfikacji receptorów, a ponieważ nie wymaga żadnych wcześniejszych założeń dotyczących biochemicznej natury lub biologii komórki receptorów, ma ogromny potencjał do dokonywania zupełnie nieoczekiwanych odkryć.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta przez grant Wellcome Trust numer 206194 przyznany GJW. Dziękujemy placówce Cytometry Core: Bee Ling Ng, Jennifer Graham, Sam Thompson i Christopher Hall za pomoc w FACS.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciw-mysia fosfataza alkalicznaSigmaA4656
BlasticidinChem-CruzSC-204655
Krew i Cell Culture DNA Maxi KitQiagen13362
BSASigmaA9647-100G
DietanoloaminaSigma398179
DMEMGibco31966-021
Zestaw do krwi i tkanek DneasyQiagen69504
DynaMag-96 Magnes bocznyInvitrogen12331D
HEK293T opakowanie komórkiATCCCRL-3216
HeparynaSigmaH4784-1G
KAPA HiFi HotStart ReadyMixKapaKK2602
Lipofectamina LTX z odczynnikiem PLUSInvitrogen15338100
Sortownik komórek MoFlo XDPBD
Ni2+-NTA koraliki agarozoweJena BioscienceAC-501-25
OPTI-MEMLife Technologies31985-070
OX-68 przeciwciałoAbD SerotecMCA1022R
fosforan p-nitrofenyluSigma1040-506
PD-10 kolumny odsalająceGE healthcare17085101
PolybreneMilliporeTR-1003-G
Probówki polipropylenowe o objętości łoża 5 mlQiagen34964
Proteinaza K, rekombinowana, klasa PCRRoche3115879001
PuromycinGibcoA11138-03
Q5 Hot Start High-Fidelity 2 razy;
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCRQiagen28104
Filtr SCFANalgene190-2545
Sony Sortownik komórekKoraliki Sony
SPRI (koraliki Agencourt AMPure XP)BeckmanA63881
Płytki do mikromiareczkowania pokryte streptawidynąNalgene734-1284
Streptawidyna-PEBiolegend405204

Bibliografia

  1. Wright, G. J. Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions. Molecular bioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).
  2. van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. Transient intercellular adhesion: the importance of weak protein-protein interactions. Trends in Biochemical Sciences. 19 (9), 354-358 (1994).
  3. Wood, L., Wright, G. J. Approaches to identify extracellular receptor-ligand interactions. Current Opinion in Structural Biology. 56, 28-36 (2019).
  4. Bushell, K. M., Söllner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions. Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).
  5. Visser, J. J., et al. An extracellular biochemical screen reveals that FLRTs and Unc5s mediate neuronal subtype recognition in the retina. eLife. 4, e08149(2015).
  6. Özkan, E., et al. An extracellular interactome of immunoglobulin and LRR proteins reveals receptor-ligand networks. Cell. 154 (1), 228-239 (2013).
  7. Martinez-Martin, N., et al. An Unbiased Screen for Human Cytomegalovirus Identifies Neuropilin-2 as a Central Viral Receptor. Cell. 174 (5), 1158-1171 (2018).
  8. Bianchi, E., Doe, B., Goulding, D., Wright, G. J. Juno is the egg Izumo receptor and is essential for mammalian fertilization. Nature. 508 (7497), 483-487 (2014).
  9. Mullican, S. E., et al. GFRAL is the receptor for GDF15 and the ligand promotes weight loss in mice and nonhuman primates. Nature Medicine. 23 (10), 1150-1157 (2017).
  10. Turner, L., et al. Severe malaria is associated with parasite binding to endothelial protein C receptor. Nature. 498 (7455), 502-505 (2013).
  11. Frei, A. P., et al. Direct identification of ligand-receptor interactions on living cells and tissues. Nature Biotechnology. 30 (10), 997-1001 (2012).
  12. Sobotzki, N., et al. HATRIC-based identification of receptors for orphan ligands. Nature Communications. 9 (1), 1519(2018).
  13. Sharma, S., Petsalaki, E. Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).
  14. Gebre, M., Nomburg, J. L., Gewurz, B. E. CRISPR-Cas9 Genetic Analysis of Virus-Host Interactions. Viruses. 10 (2), (2018).
  15. Zotova, A., Zotov, I., Filatov, A., Mazurov, D. Determining antigen specificity of a monoclonal antibody using genome-scale CRISPR-Cas9 knockout library. Journal of Immunological Methods. 439, 8-14 (2016).
  16. Puschnik, A. S., Majzoub, K., Ooi, Y. S., Carette, J. E. A CRISPR toolbox to study virus-host interactions. Nature Reviews. Microbiology. 15 (6), 351-364 (2017).
  17. Kerr, J. S., Wright, G. J. Avidity-based extracellular interaction screening (AVEXIS) for the scalable detection of low-affinity extracellular receptor-ligand interactions. Journal of Visualized Experiments. (61), e3881(2012).
  18. Tzelepis, K., et al. A CRISPR Dropout Screen Identifies Genetic Vulnerabilities and Therapeutic Targets in Acute Myeloid Leukemia. Cell Reports. 17 (4), 1193-1205 (2016).
  19. Sharma, S., Bartholdson, S. J., Couch, A. C. M., Yusa, K., Wright, G. J. Genome-scale identification of cellular pathways required for cell surface recognition. Genome Research. 28 (9), 1372-1382 (2018).
  20. Wang, B., et al. Integrative analysis of pooled CRISPR genetic screens using MAGeCKFlute. Nature Protocols. 14 (3), 756-780 (2019).
  21. R Core team. A language and environment for statistical computing. , http://www.R-project.org (2013).
  22. Hart, T., et al. Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens. G3. 7 (8), 2719-2727 (2017).
  23. Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44 (W1), W90-W97 (2016).
  24. Crosnier, C., et al. Basigin is a receptor essential for erythrocyte invasion by Plasmodium falciparum. Nature. 480 (7378), 534-537 (2011).
  25. Kirk, P., et al. CD147 is tightly associated with lactate transporters MCT1 and MCT4 and facilitates their cell surface expression. The EMBO Journal. 19 (15), 3896-3904 (2000).
  26. Chong, Z. S., Ohnishi, S., Yusa, K., Wright, G. J. Pooled extracellular receptor-ligand interaction screening using CRISPR activation. Genome Biology. 19 (1), 205(2018).
  27. van der Meer, D., et al. Cell Model Passports-a hub for clinical, genetic and functional datasets of preclinical cancer models. Nucleic Acids Research. 47 (D1), D923-D929 (2019).
  28. Bausch-Fluck, D., et al. A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas. PloS One. 10 (3), e0121314(2015).
  29. Behan, F. M., et al. Prioritization of cancer therapeutic targets using CRISPR-Cas9 screens. Nature. 568 (7753), 511-516 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przesiew genetycznywiązanie białek rekombinowanychanaliza cytometrycznasekwencjonowanie nowej generacjiwysokoprzepustowe sortowanie komórekkoniugacja streptawidyny z PEkomórki BFP-dodatniealgorytm Robust Rank
Identyfikacja receptorów na powierzchni komórki za pomocą genetycznych badań przesiewowych CRISPR/Cas9 w skali genomu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.