Artykuł metodologiczny

Szybka metoda wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamrożonych skrawków tkanek

DOI:

10.3791/60806

⸱

30 marca 2020

 ,  ,  , 
1Robert Lurie Comprehensive Cancer Center and Department of Dermatology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, 3Department of Microbiology and Immunology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę szybkiego barwienia do wykonywania obrazowania wielospektralnego na zamrożonych tkankach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wielospektralne obrazowanie fluorescencyjne na tkankach zatopionych w parafinie (FFPE) w formalinie umożliwia wykrycie wielu markerów w pojedynczej próbce tkanki, które mogą dostarczyć informacji o koekspresji antygenu i przestrzennym rozkładzie markerów. Jednak brak odpowiednich przeciwciał dla tkanek utrwalonych w formalinie może ograniczyć charakter markerów, które można wykryć. Ponadto metoda barwienia jest czasochłonna. W tym miejscu opisujemy szybką metodę wykonywania wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego na zamrożonych tkankach. Metoda obejmuje zastosowane kombinacje fluoroforów, szczegółowe etapy barwienia zamrożonych tkanek myszy i człowieka oraz procedury skanowania, akwizycji i analizy. Do analizy barwienia stosuje się dostępny na rynku półautomatyczny wielospektralny system obrazowania fluorescencyjnego. Dzięki tej metodzie wybarwiono do sześciu różnych markerów i wykryto je w jednym zamrożonym skrawku tkanki. Oprogramowanie do analizy uczenia maszynowego może fenotypować komórki, które można wykorzystać do analizy ilościowej. Opisana tutaj metoda dla tkanek zamrożonych jest przydatna do wykrywania markerów, których nie można wykryć w tkankach FFPE lub dla których przeciwciała nie są dostępne dla tkanek FFPE.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie postępy w technikach obrazowania mikroskopowego znacznie poszerzyły naszą wiedzę i zrozumienie procesów biologicznych i stanów chorobowych. Wykrywanie in situ białek w tkankach za pomocą immunohistochemii chromogennej (IHC) jest rutynowo wykonywane w patologii. Jednak wykrywanie wielu markerów za pomocą chromogennego barwienia IHC jest wyzwaniem1 i opracowywane są nowsze metody barwienia multipleksowego immunofluorescencji (mIF), w których wiele markerów biologicznych jest znakowanych na jednej próbce tkanki. Wykrywanie wielu markerów biologicznych jest przydatne, ponieważ informacje związane z architekturą tkanki, dystrybucją przestrzenną komórek i koekspresją antygenu są przechwytywane w jednej próbce tkanki2. Zastosowanie technologii wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego umożliwiło wykrywanie wielu markerów biologicznych. W tej technologii, przy użyciu specyficznej optyki, widma fluorescencyjne każdego pojedynczego fluoroforu mogą być rozdzielone lub "niezmiksowane", co umożliwia wykrywanie wielu markerów bez żadnych przesłuchów spektralnych3. Wielospektralne obrazowanie fluorescencyjne staje się kluczowym podejściem w biologii komórki, przedklinicznym opracowywaniu leków, patologii klinicznej i profilowaniu immunologicznym nowotworów4,5,6. Co ważne, rozmieszczenie przestrzenne komórek odpornościowych (w szczególności limfocytów T CD8) może służyć jako czynnik prognostyczny dla pacjentów z istniejącymi nowotworami7.

Rozwinięto różne podejścia do barwienia fluorescencyjnego multipleksowego, które mogą być wykonywane równolegle lub sekwencyjnie. W metodzie barwienia symultanicznego wszystkie przeciwciała są dodawane do siebie jako koktajl w jednym kroku w celu oznaczenia tkanki. Technologia UltraPlex wykorzystuje koktajl przeciwciał pierwotnych sprzężonych z haptenem, a następnie koktajl przeciwciał drugorzędowych antyhaptenowych sprzężonych z fluoroforem. Technologia InSituPlex8 wykorzystuje koktajl unikalnych przeciwciał pierwotnych sprzężonych z DNA, które są jednocześnie dodawane do tkanki, a następnie etap amplifikacji, a na końcu sondy sprzężone z fluoroforem, które są komplementarne do każdej unikalnej sekwencji DNA na przeciwciałie pierwotnym. Obie te technologie umożliwiają wykrycie czterech markerów oraz 4',6-diamino-2-fenyloindolu (DAPI) do barwienia jądrowego. Dwa inne podejścia do jednoczesnego barwienia multipleksowego opierają się na spektrometrii mas jonów wtórnych9. System obrazowania Hyperion wykorzystuje obrazowanie cytometrii masowej10 do wykrywania do 37 markerów. Technologia ta wykorzystuje koktajl przeciwciał sprzężonych z metalami do barwienia tkanek, a określone obszary tkanek są ablowane za pomocą lasera i przenoszone do cytometru masowego, w którym wykrywane są jony metali. Inną podobną technologią jest IONPath, która wykorzystuje technologię obrazowania wiązką jonów w multipleksie11. Technologia ta wykorzystuje zmodyfikowany instrument do spektrometrii mas i źródło jonów tlenu zamiast lasera do ablacji przeciwciał sprzężonych z metalami. Podczas gdy wszystkie te równoczesne metody barwienia multipleksowego umożliwiają wykrycie wielu markerów, nie można lekceważyć kosztów związanych z koniugacją DNA, haptenów lub metali z przeciwciałami, utratą tkanki w wyniku ablacji oraz rozległym przetwarzaniem obrazu w celu rozmieszania. Co więcej, zestawy i protokoły barwienia są obecnie dostępne tylko dla tkanek FFPE, a opracowanie niestandardowych paneli wiąże się z dodatkowym czasem i wydatkami.

Metoda sekwencyjnego barwienia multipleksowego, w przeciwieństwie do tego, obejmuje znakowanie tkanki przeciwciałem do jednego markera, usuwanie przeciwciała, a następnie sekwencyjne powtórzenia tego procesu w celu oznaczenia wielu markerów12. Wzmocnienie sygnału tyramidu (TSA) jest najczęściej stosowaną metodą multipleksowania sekwencyjnego. Dwie inne technologie multipleksowania wykorzystują kombinację metod barwienia symultanicznego i sekwencyjnego. Platforma CODEX13 wykorzystuje koktajl przeciwciał sprzężonych z unikalnymi sekwencjami oligonukleotydów DNA, które są ostatecznie znakowane fluoroforem przy użyciu indeksowanego etapu polimeryzacji, po którym następuje obrazowanie, usuwanie i powtarzanie procesu w celu wykrycia do 50 markerów. Metoda barwienia MultiOmyx multiplex class<="xref">14 to iteracja barwienia koktajlem trzech do czterech przeciwciał sprzężonych z fluoroforem, obrazowania, wygaszania fluoroforów i powtarzania tego cyklu w celu wykrycia do 60 markerów na jednej sekcji. Podobnie jak w przypadku metody jednoczesnego barwienia multipleksowego, chociaż można wykryć szeroki zakres markerów, czas potrzebny na barwienie, akwizycję, przetwarzanie i analizę obrazu jest długi. Etap strippingu/hartowania polega na podgrzaniu i/lub wybielaniu próbki tkanki, a zatem sekwencyjne barwienie multipleksowe jest powszechnie wykonywane na tkankach FFPE, które zachowują integralność tkanki po podgrzaniu lub wybielaniu.

Utrwalanie formaliny i późniejsze osadzanie parafiny jest łatwo wykonywane w warunkach klinicznych, bloki tkanek są łatwe do przechowywania i dostępnych jest kilka protokołów barwienia multipleksowego. Jednak przetwarzanie, osadzanie i deparafinowanie tkanek FFPE, a także pobieranie antygenu15, proces, w którym przeciwciała mogą lepiej uzyskać dostęp do epitopów, jest czasochłonne. Co więcej, przetwarzanie zachodzące w tkankach FFPE przyczynia się do autofluorescencji16 i maskuje docelowe epitopy, co skutkuje zmiennością i brakiem klonu przeciwciała dostępnego do wykrywania antygenów w tkankach FFPE17,18,19. Przykładem są allele ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA) klasy I20. W przeciwieństwie do tego, szybkie zamrażanie tkanek nie obejmuje rozległych etapów przetwarzania przed lub po utrwaleniu, co pozwala obejść potrzebę pobierania antygenu21,22 i czyni go korzystnym dla wykrywania szerszego zakresu celów. Dlatego wykorzystanie zamrożonych tkanek do wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego może być cenne w wykrywaniu celów w badaniach przedklinicznych i klinicznych.

Biorąc pod uwagę wyżej wymienione ograniczenia podczas korzystania z tkanek FFPE, zapytaliśmy, czy można przeprowadzić wielospektralne obrazowanie fluorescencyjne na zamrożonych tkankach. Aby odpowiedzieć na to pytanie, przetestowaliśmy metodę jednoczesnego barwienia multipleksowego przy użyciu panelu przeciwciał sprzężonych z fluoroforem w celu wykrycia wielu antygenów i przeanalizowaliśmy barwienie za pomocą półautomatycznego systemu obrazowania wielospektralnego. Byliśmy w stanie wybarwić jednocześnie do sześciu markerów w jednym fragmencie tkanki w ciągu 90 minut.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mysia śledziona i mysie tkanki nowotworowe HLF1623 zostały uzyskane z naszego laboratorium. Ludzka tkanka migdałków została zakupiona od komercyjnego sprzedawcy. Szczegóły znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Osadzanie tkanek

  1. Zanurz świeżą tkankę w roztworze OCT (optymalna temperatura cięcia) i zamroź błyskawicznie przy użyciu suchego lodu lub ciekłego azotu.
  2. Przechowywać tkanki w temperaturze -80 °C.

2. Kriosekcja

  1. Wyciąć odcinki o grubości 8 μm w kriostacie o temperaturze -25 °C.
    nuta: Preferowaną grubość przekroju można dostosować, aby generować wyraźniejsze obrazy.
  2. Umieść sekcje na naładowanych szkiełkach.
  3. Suszyć skrawki na powietrzu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT) przed utrwaleniem w lodowatym acetonie klasy histologicznej przez 10 min.
    nuta: Aceton powoduje koagulację białek rozpuszczalnych w wodzie i ekstrahuje lipidy, ale nie wpływa na składniki zawierające węglowodany. W przeciwieństwie do tego, formalina zachowuje większość lipidów i ma niewielki wpływ na węglowodany24. Wybór utrwalacza jest ważny w zależności od wyboru wykrywanego markera.
  4. Przechowywać szkiełka w temperaturze -20 °C.

3. Wybór przeciwciał i fluoroforów

UWAGA: Przed barwieniem tkanek muszą zostać sprawdzone klony przeciwciał, które będą solidnie i specyficznie barwić swoje interesujące antygeny w sekwencyjnych sekcjach z tkanki utrwalonej acetonem. Niektóre przeciwciała mogą wymagać innego utrwalacza, a ich zgodność z innymi przeciwciałami w panelu również będzie musiała zostać empirycznie określona. Celem jest również zidentyfikowanie fluoroforów o minimalnym nakładaniu się, które można wykryć za pomocą filtrów epifluorescencyjnych dla DAPI, FITC, Cy3, Texas Red i Cy5.

  1. Potwierdzić barwienie za pomocą konwencjonalnego wykrywania IHC lub immunofluorescencji (IF) w skrawkach tkanek ze znanym antygenem docelowym ekspresji.
  2. Korzystając z zestawów filtrów wzbudzenia i emisji dostępnych w półautomatycznym systemie obrazowania i po przetestowaniu różnych kombinacji przeciwciał pierwszorzędowych sprzężonych z fluoroforem, należy przygotować fluorofory do użycia, które mają minimalne nakładanie się widma (np. patrz tabela 1).

4. Barwienie

UWAGA: Nawadnianie tkanek i płukanie preparatów zostało przeprowadzone w słoiku z Coplinu. Etapy blokowania i inkubacji przeciwciał przeprowadzono w nawilżonym pudełku na szkiełka.

  1. Pozwól szkiełkom rozgrzać się do RT przez 5–10 minut.
  2. Ponownie hydratenować w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez 5 minut.
  3. Wykonaj etap blokowania przed barwieniem tkanek przeciwciałami. W przypadku sekcji myszy użyj specjalistycznego rozwiązania blokującego (patrz tabela materiałów) przez 10 minut przy RT. W przypadku badań na ludziach należy użyć 10% normalnej puli surowicy ludzkiej (NHS) rozcieńczonej w PBS przez 15 minut w temperaturze RT.
    nuta: W razie potrzeby można badać różne blokujące w celu zachowania określonych właściwości sekcji, w zależności od procedur następczych, które mają być zastosowane.
  4. Myj szkiełka przez 5 minut w PBS po zablokowaniu.
  5. Do barwienia multipleksowego przygotuj koktajl przeciwciał z kompatybilnymi fluoroforami w ustalonych optymalnych rozcieńczeniach.
  6. Dodaj koktajl przeciwciał sprzężonych z fluoroforem do szkiełek. W przypadku barwienia pojedynczym markerem należy dodać do szkiełka tylko pierwszorzędowe przeciwciało sprzężone.
  7. Dołączyć kontrolny niebarwiony szkiełko, które poddawane jest tej samej procedurze barwienia bez dodawania jakiegokolwiek pierwszorzędowego przeciwciała sprzężonego.
  8. Inkubuj szkiełka przez 1 godzinę w RT w ciemności, a następnie myj szkiełka 2x PBS przez 5 minut każde. Od tego momentu powstały slajd jest określany jako barwiony multipleksem.
  9. Aby przeciw barwieniu, dodaj DAPI do szkiełka barwionego multipleksem, inkubuj przez 7 minut w ciemności w temperaturze RT i myj szkiełka 2x PBS przez 5 minut każde. Nie należy przeciwbarwić szkiełek pojedynczo i niepoplamionych.
  10. Aby nakryć szkiełko nakrywkowe, dodaj kroplę podłoża mocującego i delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na chusteczce.

5. Przygotowanie biblioteki spektralnej

  1. Akwizycja obrazu
    1. Ustaw moc lampy na 100%. Zwykle moc jest ustawiona na 10%, ponieważ detekcja fluorescencji na tkankach FFPE obejmuje etap wzmocnienia sygnału.
    2. Zacznij od otwarcia oprogramowania sterującego mikroskopu (patrz tabela materiałów).
    3. Wybierz pozycję Edytuj protokół, a następnie pozycję Nowy protokół.
    4. Podaj "Nazwę protokołu" i wybierz Fluorescencja w trybie obrazowania, a następnie podaj "Nazwę badania".
    5. Umieść pojedynczo barwione szkiełka na stoliku i zbadaj każdy marker w odpowiadającym mu kanale fluorescencyjnym, aby upewnić się, że są zabarwione. Wybierz region na tkance, w którym wyrażany jest najsilniejszy sygnał dla markera.
    6. Dostosuj czasy ekspozycji za pomocą opcji Autofokus i Automatyczna ekspozycja.
    7. Uzyskaj migawki dla pojedynczo barwionych i niebarwionych slajdów i zapisz protokół.
      UWAGA: Poniższe kroki są wykonywane w oprogramowaniu do uczenia maszynowego (patrz Tabela materiałów), przy użyciu pojedynczych barwionych i niebarwionych szkiełek w celu sprawdzenia specyficznego barwienia, a także w celu określenia przesłuchu przeciwciał.
    8. Na karcie Build Libraries (Biblioteki kompilacji) w oprogramowaniu załaduj każdy pojedynczo zabarwiony obraz slajdu, wybierz odpowiedni Fluor i kliknij przycisk Extract (Wyodrębnij). Oprogramowanie automatycznie wyodrębni sygnał fluorescencji wybrany w Fluorze.
    9. Aby zapisać wyodrębniony kolor, kliknij Zapisz w sklepie. Można utworzyć "nową grupę" lub wyodrębniony kolor można zapisać w istniejącej grupie.
  2. Weryfikacja biblioteki spektralnej
    1. Sprawdź okno krzywej widmowej emisji, znajdujące się po prawej stronie wyodrębnionego obrazu, dla każdego zestawu filtrów.
      nuta: Wyekstrahowany sygnał jest prawidłowy, jeśli krzywa widmowa jest obserwowana tylko w zestawach filtrów, w których wykrywany jest fluorofor. Jeśli krzywa widmowa zostanie zaobserwowana w niewłaściwym zestawie filtrów, może to oznaczać, że albo sygnał pierwotny oczekiwany w zestawie filtrów nie jest wystarczająco silny, albo oprogramowanie wykrywa inny sygnał, który jest zbyt wysoki, prawdopodobnie z powodu nakładania się widma. W takim przypadku należy najpierw spróbować użyć narzędzia Rysuj regiony przetwarzania, aby narysować regiony wokół obszarów wyrażających znacznik fluorescencyjny i autofluorescencję na obrazie. To szkoli oprogramowanie w wykrywaniu prawdziwego sygnału i usuwaniu wszelkich sygnałów zakłócających. Jeśli to nie zadziała, powtórz proces barwienia dla pojedynczo barwionego szkiełka, aby przetestować różne miareczkowania przeciwciał.

6. Obrazowanie wielospektralne

UWAGA: Po utworzeniu i zweryfikowaniu biblioteki spektralnej, wykonaj następujące kroki dla szkiełka barwionego multipleksem.

  1. Skan całego slajdu
    1. Dostosuj czasy ostrości i ekspozycji na szkiełku barwionym multipleksem, jak wspomniano w sekcji 5.1.
    2. W obszarze Skanuj slajdy utwórz nowe zadanie i wybierz protokół zapisany powyżej.
    3. Wykonaj skanowanie całego slajdu na szkiełku barwionym multipleksem.
    4. Korzystając z oprogramowania do skanowania całego slajdu, otwórz cały obraz skanu slajdu. Obraz ten nie został spektralnie niezmiksowany.
    5. Wybierz obszary zainteresowania (ROI) na całym obrazie skanowania slajdu za pomocą narzędzia Stempel lub ROI. Te ROI zostaną zeskanowane przy użyciu czasów ekspozycji ustawionych w 6.1.1, które mają być wykorzystane do rozmieszania i analizy spektralnej.
    6. Kliknij przycisk Process Slide (Slajd procesu), aby uzyskać zwrot z inwestycji przy 20-krotnym powiększeniu
  2. Mieszanie spektralne
    1. Po uzyskaniu zwrotu z inwestycji, w oprogramowaniu do uczenia maszynowego, na karcie Analiza ręczna, załaduj obrazy barwione multipleksem, klikając Otwórz w obszarze Plik.
    2. W menu rozwijanym Spectral Library Source (Źródło biblioteki spektralnej) kliknij opcję Select Fluors (Wybierz fluory).
    3. Otworzy się nowe okno. Tutaj wybierz bibliotekę spektralną lub grupę utworzoną powyżej.
    4. Załaduj niepoplamiony obraz slajdu. Kliknij ikonę markera atramentowego AF znajdującą się nad wybraną biblioteką spektralną i narysuj linię lub obszar na niezabarwionym szkiełku, aby zidentyfikować autofluorescencję w tkance.
    5. Na karcie Edytowanie znaczników i kolorów przypisz nazwy dla każdego znacznika. Na tym etapie można przypisać pseudo kolory.
      nuta: Domyślnym kolorem obrazu Autofluorescencji jest DarkSlateGray. Zmień to na.
    6. Kliknij przycisk Przygotuj wszystko.
  3. Weryfikacja obrazów niezmiksowanych spektralnie
    UWAGA:     Po zakończeniu etapu rozmieszania widmowego tworzony jest obraz kompozytowy składający się ze wszystkich kolorów.
    1. Kliknij ikonę Edytuj oko widoku. W tym miejscu każdy kolor w "Wyświetlaczu komponentów" można wyłączyć lub włączyć, aby wyświetlić zabarwienie każdego pojedynczego znacznika.
    2. Sprawdź wzrokowo barwienie i morfologię komórek, aby upewnić się, że marker nie nakłada się na siebie, chyba że jest to biologicznie istotne. Patolog może również pomóc w zweryfikowaniu zabarwienia.
      nuta: Barwienie na szkiełku multipleksowym powinno być zweryfikowane poprzez pominięcie jednego fluoroforu na raz i przejrzenie wzoru barwienia. Ponadto walidacja pomoże również zidentyfikować silne fluorofory, które pojawiają się w sąsiednich widmach w wyniku przesłuchu przeciwciał lub krwawienia.
    3. W przypadku widoków patologicznych, które symulują obrazy w jasnym polu dla każdego znacznika fluorescencyjnego, kliknij przycisk Wybierz obraz komponentu. Tutaj wybierz znacznik, aby wyświetlić symulowany obraz w jasnym polu.

7. Analiza obrazów wielospektralnych za pomocą segmentacji komórek i fenotypowania

UWAGA: Po zweryfikowaniu spektralnie niezmieszanego obrazu, segmentacja komórek może być przeprowadzona za pomocą oprogramowania do uczenia maszynowego, które dostarczy instrukcje krok po kroku. Segmentacja tkanek nie została tu wykonana. Jeśli panel zawiera jeden lub więcej markerów specyficznych dla tkanki, a zwłaszcza jeśli tkanka jest niechlujna, należy przeprowadzić segmentację tkanki.

  1. Wybierz "Cytoplazma" i "Membrana" w opcji "Segment".
    UWAGA: Opcja "Jądra" jest wybrana domyślnie.
  2. Wybierz znacznik z panelu. Skonfiguruj marker do wykrywania jąder, cytoplazmy lub błony. Na przykład DAPI można wybrać do wykrywania jąder i CD3 do błony.
  3. Kliknij przycisk wielokropka ("... '), aby wybrać opcję w obszarze "Użyj tego sygnału, aby znaleźć". Na przykład "jądra" dla DAPI. Do segmentacji można wybrać wiele znaczników z panelu.
    nuta: W przypadku markerów cytoplazmatycznych lub błonowych wybierz opcję "Użyj tego sygnału, aby wspomóc segmentację jądrową".
  4. Oprogramowanie automatycznie wykrywa i tworzy maskę dla jądra, cytoplazmy i błony na obrazie.
  5. Upewnij się, że wszystkie komórki są "zamaskowane" w celu segmentacji. Aby dostosować, przełącz się na widok patologii dla konkretnego markera wybranego w 7.3. i skorzystaj z opcji konfiguracyjnych w oprogramowaniu.
  6. Kliknij "Podziel wszystko na segmenty", aby podzielić komórki na segmenty.
  7. Po segmentacji komórek przystąp do fenotypowania komórek. W tym kroku wybierz markery potrzebne do fenotypowania i ręcznie wybierz co najmniej pięć komórek, które są jaskrawo zabarwione wybranym markerem. To szkoli oprogramowanie, aby następnie automatycznie wykrywało wszystkie komórki wybarwione wybranym markerem na obrazie.
  8. Tworzona jest mapa fenotypu. Przeanalizuj, aby upewnić się, że komórka zabarwiona markerem jest prawidłowo fenotypowana.
    nuta: Fenotypowanie komórek może być procesem iteracyjnym. Jeśli oprogramowanie nie jest w stanie poprawnie fenotypować komórek, oznacza to, że trening jest nieodpowiedni lub nieprawidłowy. W takim przypadku użytkownik musi ręcznie wybrać więcej komórek i ponownie wytrenować oprogramowanie, a następnie powtarzać ten krok, aż użytkownik będzie zadowolony z treningu.
  9. Utwórz grupę o nazwie "Inne" i dołącz komórki, które nie są zabarwione dla żadnego ze znaczników.
    nuta: Ten krok jest ważny, aby wytrenować oprogramowanie, aby wykluczyć wszystkie niebarwione komórki z fenotypowania.

8. Eksportowanie obrazów i tabel analitycznych

  1. Kliknij przycisk Eksportuj, aby wyświetlić panel Ustawienia eksportu.
  2. W "Eksportuj katalog" kliknij Przeglądaj, aby wybrać lokalizację do wyeksportowania obrazów.
  3. W "Opcjach eksportu obrazu" wybierz format wyjściowy obrazu.
  4. Z listy "Obrazy do eksportu" wybierz obrazy do wyeksportowania. "Obraz kompozytowy" to końcowy pseudokolorowy, niezmieszany obraz. "Widoki patologiczne" to pojedyncze symulowane obrazy w jasnym polu, a "Obrazy składowe (wieloobrazowy TIFF)" to wieloobrazowy plik TIFF z danymi składowymi, który może być używany przez oprogramowanie analityczne innych firm.
  5. Kliknij przycisk "Eksportuj dla wszystkich", aby wyeksportować obrazy.
    nuta: Na tym etapie można również wybrać i wyeksportować tabele z analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykrywanie pojedynczych markerów na zamrożonych skrawkach śledziony
Ponieważ półautomatyczny system obrazowania wykorzystuje system przestrajalnego filtra ciekłokrystalicznego (LCTF), który pozwala na szerszy zakres wykrywania długości fali25, a także dlatego, że nie przeprowadzono tutaj żadnych etapów wzmacniania sygnału, najpierw zoptymalizowaliśmy wykrywanie naszych pierwszorzędowych przeciwciał sprzężonych dla każdego markera na mikroskopie. Przykład jest pokazany w

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zamrożone tkanki są szeroko stosowane do obrazowania mIF w celu tradycyjnego wykrywania trzech do czterech markerów31 na tkance przy użyciu metody bezpośredniej i pośredniej32. W metodzie bezpośredniej przeciwciała są sprzężone z barwnikami fluorescencyjnymi lub kropkami kwantowymi33 w celu znakowania tkanki, podczas gdy w metodzie pośredniej do znakowania tkanki stosuje się niesprzężone przeciwciało pierwszorzędowe, a następnie przeciwciało drugorzę...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wskazówki dotyczące obrazowania i analizy zostały dostarczone przez Centrum Zasobów Badawczych - Badanie Histologii i Obrazowania Tkanek na Uniwersytecie Illinois w Chicago, założone przy wsparciu biura Wicekanclerza ds. Badań. Prace były wspierane przez NIH/NCI RO1CA191317 CLP, przez NIH/NIAMS (grant SBDRC 1P30AR075049-01) dla dr A. Pallera oraz przez wsparcie Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center dla Immunotherapy Assessment Core na Northwestern University.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Aceton (stopień histologiczny)Fisher ScientificA16F-1GALUtrwalanie tkanek
Alexa Fluor 488 anty-mysie CD3BioLegend100212klon - 17A2; pierwszorzędowe przeciwciało sprzężone
Alexa Fluor 488, eBioscience anty-ludzkie CD20ThermoFisher Scientific53-0202-82Klon - L26; pierwszorzędowe przeciwciało sprzężone
Alexa Fluor 555 Mysz anty-Ki-67BD Nauki biologiczne558617Pierwszorzędowe przeciwciało sprzężone
Alexa Fluor 594 anty-ludzkie CD3BioLegend300446klon - UCHT1; pierwszorzędowe przeciwciało sprzężone
Alexa Fluor 594 anty-mysie CD8aBioLegend100758Clone - 53-6,7; pierwszorzędowe przeciwciało sprzężone
Alexa Fluor 647 anty-ludzkie CD8aBioLegend372906klon - C8/144B; pierwszorzędowe przeciwciało
sprzężoneAlexa Fluor 647 anty-mysie CD206 (MMR)BioLegend141711Clone - C068C2; pierwszorzędowe przeciwciało sprzężone
Alexa Fluor 647 przeciwciało anty-mysie CD4BioLegend100426Clone - GK1.5; pierwszorzędowe przeciwciało sprzężone
C57BL/6 MyszCharles River Laboratories27Zamrożone tkanki myszy używane do treningu wielospektralnego
Coplin JarSigma AldrichS6016-6EAPreparaty nawadniające i myjące
Roztwór DAPI BDBiosciences564907Barwienie kwasami nukleinowymi
Diamentowe białe szkło naładowane SzkiełkaDOT ScientificDW7590WPrzylegające skrawki tkanek
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco 1x (bez Ca i Mg)Fisher ScientificMT21031CVMycie i rozcieńczalnik
Gold Seal Szkiełka nakrywkoweThermoFisher Scientific3306Ochrona barwionych tkanek
Ludzki normalny migdałek OCT zamrożony blok tkanekAMSBioAMS6023Ludzka zamrożona tkanka używana do barwienia wielospektralnego
Surowica ludzka 1xGemini Bio-Products100-512Blokowanie i rozcieńczalnik do tkanek ludzkich
inFormAkoya BiosciencesWersja 2.4.1Oprogramowanie do uczenia maszynowego
PerCP / Cyjanina5.5 anty-ludzka CD4Klon BioLegend300529- RPA-T4; pierwszorzędowe przeciwciało sprzężone
PerCP-Cy 5.5 Szczur Anty-CD11bKlon 550993 Nauk Biologicznych- M1/70; pierwszorzędowe przeciwciało sprzężone
PhenochartAkoya BiosciencesWersja 1.0.8Oprogramowanie do skanowania całych slajdów
ProLong Diamond AntifadeMountant ThermoFisher ScientificP36965Podłoże
montażoweKriostat badawczyLeica BiosystemsCM3050 SSekcja tkanek
Superblok 1xThermoFisher Scientific37515Blokowanie tkanek myszy
Rozwiązanie Tissue-Tek OCTSakura Finetek4583Osadzanie tkanek
Vectra 3.0 Zautomatyzowany ilościowy system obrazowania patologii, 6 slajdówAkoya BiosciencesCLS142568Półautomatyczne obrazowanie wielospektralne system
Vectra SoftwareAkoya BiosciencesWersja 3.0.5Oprogramowanie do obsługi mikroskopu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
  2. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: A review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  3. Bian, L., et al. Multispectral imaging using a single bucket detector. Scientific Reports. 6, 24752(2016).
  4. Zhou, L., El-Deiry, W. S. Multispectral fluorescence imaging. Journal of Nuclear Medicine. 50 (10), 1563-1566 (2009).
  5. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).
  6. Wickenhauser, C., et al. Immune Checkpoint Blockade: Methods and Protocols. Pico de Coaña, Y. , Springer. New York. 13-31 (2019).
  7. Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 3 (1), 47(2015).
  8. Manesse, M., Patel, K. K., Bobrow, M., Downing, S. R. The InSituPlex((R)) Staining Method for Multiplexed Immunofluorescence Cell Phenotyping and Spatial Profiling of Tumor FFPE Samples. Methods in Molecular Biology. 2055, 585-592 (2020).
  9. Gamble, L. J., Anderton, C. R. Secondary Ion Mass Spectrometry Imaging of Tissues, Cells, and Microbial Systems. Microscopy Today. 24 (2), 24-31 (2016).
  10. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  11. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nature Medicine. 20 (4), 436-442 (2014).
  12. Tsujikawa, T., et al. Quantitative Multiplex Immunohistochemistry Reveals Myeloid-Inflamed Tumor-Immune Complexity Associated with Poor Prognosis. Cell Reports. 19 (1), 203-217 (2017).
  13. Goltsev, Y., et al. Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging. Cell. 174 (4), 968-981 (2018).
  14. Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 11982-11987 (2013).
  15. Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).
  16. Viegas, M. S., Martins, T. C., Seco, F., do Carmo, A. An improved and cost-effective methodology for the reduction of autofluorescence in direct immunofluorescence studies on formalin-fixed paraffin-embedded tissues. European Journal of Histochemistry. 51 (1), 59-66 (2007).
  17. Sorensen, I. V., et al. Characterization of anti-TIMP-1 monoclonal antibodies for immunohistochemical localization in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 54 (10), 1075-1086 (2006).
  18. Parra, E. R., Villalobos, P., Mino, B., Rodriguez-Canales, J. Comparison of Different Antibody Clones for Immunohistochemistry Detection of Programmed Cell Death Ligand 1 (PD-L1) on Non-Small Cell Lung Carcinoma. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 26 (2), 83-93 (2018).
  19. Boger, C., Kalthoff, H., Goodman, S. L., Rocken, C. Validation and comparison of anti-alphavbeta3 and anti-alphavbeta5 rabbit monoclonal versus murine monoclonal antibodies in four different tumor entities. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (6), 553-560 (2013).
  20. Torigoe, T., et al. Establishment of a monoclonal anti-pan HLA class I antibody suitable for immunostaining of formalin-fixed tissue: unusually high frequency of down-regulation in breast cancer tissues. Pathology International. 62 (5), 303-308 (2012).
  21. Dapson, R. W. Macromolecular changes caused by formalin fixation and antigen retrieval. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 133-140 (2007).
  22. Sompuram, S. R., Vani, K., Hafer, L. J., Bogen, S. A. Antibodies Immunoreactive With Formalin-Fixed Tissue Antigens Recognize Linear Protein Epitopes. American Journal of Clinical Pathology. 125 (1), 82-90 (2006).
  23. Cassetti, M. C., et al. Antitumor efficacy of Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles encoding mutated HPV16 E6 and E7 genes. Vaccine. 22 (3-4), 520-527 (2004).
  24. Kiernan, J. A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice, 3rd Edition. Shock. 12 (6), 479(1999).
  25. Favreau, P., et al. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 011017(2014).
  26. van Kempen, M. J., Rijkers, G. T., Van Cauwenberge, P. B. The immune response in adenoids and tonsils. International Archives of Allergy and Immunology. 122 (1), 8-19 (2000).
  27. Klein, U., Dalla-Favera, R. Germinal centres: role in B-cell physiology and malignancy. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 22-33 (2008).
  28. Eiben, G. L., et al. Establishment of an HLA-A*0201 Human Papillomavirus Type 16 Tumor Model to Determine the Efficacy of Vaccination Strategies in HLA-A*0201 Transgenic Mice. Cancer Research. 62, 5792-5799 (2002).
  29. Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes & Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
  30. Sica, A., Schioppa, T., Mantovani, A., Allavena, P. Tumour-associated macrophages are a distinct M2 polarised population promoting tumour progression: potential targets of anti-cancer therapy. European Jorunal of Cancer. 42 (6), 717-727 (2006).
  31. Au-Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. Journal of Visualized Experiments. (132), e56606(2018).
  32. Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. Journal of Investigative Dermatology. 133 (1), 1-4 (2013).
  33. Xing, Y., et al. Bioconjugated quantum dots for multiplexed and quantitative immunohistochemistry. Nature Protocols. 2 (5), 1152-1165 (2007).
  34. Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nature Biotechnology. 24 (10), 1270-1278 (2006).
  35. de Vries, N. L., et al. High-dimensional cytometric analysis of colorectal cancer reveals novel mediators of antitumour immunity. Gut. , 03(2019).
  36. Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : Official Journal of the Histochemistry Society. 65 (1), 5-20 (2017).
  37. Sorrelle, N., et al. Improved Multiplex Immunohistochemistry for Immune Microenvironment Evaluation of Mouse Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Immunology. 202 (1), 292-299 (2019).
  38. Ackerman, L. V., Ramirez, G. A. The indications for and limitations of frozen section diagnosis; a review of 1269 consecutive frozen section diagnoses. British Journal of Surgery. 46 (198), 336-350 (1959).
  39. Mezheyeuski, A., et al. Multispectral imaging for quantitative and compartment-specific immune infiltrates reveals distinct immune profiles that classify lung cancer patients. The Journal of Pathology. 244 (4), 421-431 (2018).
  40. Feng, Z., et al. Multiparametric immune profiling in HPV- oral squamous cell cancer. JCI insight. 2 (14), 93652(2017).
  41. Yang, L., Liu, Z., Tan, J., Dong, H., Zhang, X. Multispectral imaging reveals hyper active TGF-β signaling in colorectal cancer. Cancer Biology & Therapy. 19 (2), 105-112 (2018).
  42. Blom, S., et al. Systems pathology by multiplexed immunohistochemistry and whole-slide digital image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 15580-15580 (2017).
  43. Roy, S., Axelrod, H. D., Valkenburg, K. C., Amend, S., Pienta, K. J. Optimization of prostate cancer cell detection using multiplex tyramide signal amplification. Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 4804-4812 (2019).
  44. Vickovic, S., et al. High-density spatial transcriptomics arrays for in situ tissue profiling. bioRxiv. , 563338(2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kombinacje fluorofor wtworzenie biblioteki widmowejanaliza uczeniem maszynowymsegmentacja kom rekprotok barwienia przeciwcia amiodmieszanie widmoweskanowanie ca ego preparatumapowanie fenotyp w

Powiązane artykuły