Method Article

Szybka metoda wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego zamrożonych skrawków tkanek

DOI:

10.3791/60806

⸱

March 30th, 2020

 ,  ,  , 
1Robert Lurie Comprehensive Cancer Center and Department of Dermatology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Pathology, University of Illinois at Chicago, 3Department of Microbiology and Immunology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy metodę szybkiego barwienia do wykonywania obrazowania wielospektralnego na zamrożonych tkankach.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wielospektralne obrazowanie fluorescencyjne na tkankach zatopionych w parafinie (FFPE) w formalinie umożliwia wykrycie wielu markerów w pojedynczej próbce tkanki, które mogą dostarczyć informacji o koekspresji antygenu i przestrzennym rozkładzie markerów. Jednak brak odpowiednich przeciwciał dla tkanek utrwalonych w formalinie może ograniczyć charakter markerów, które można wykryć. Ponadto metoda barwienia jest czasochłonna. W tym miejscu opisujemy szybką metodę wykonywania wielospektralnego obrazowania fluorescencyjnego na zamrożonych tkankach. Metoda obejmuje zastosowane kombinacje fluoroforów, szczegółowe etapy barwienia zamrożonych tkanek myszy i człowieka oraz procedury skanowania, akwizycji i analizy. Do analizy barwienia stosuje się dostępny na rynku półautomatyczny wielospektralny system obrazowania fluorescencyjnego. Dzięki tej metodzie wybarwiono do sześciu różnych markerów i wykryto je w jednym zamrożonym skrawku tkanki. Oprogramowanie do analizy uczenia maszynowego może fenotypować komórki, które można wykorzystać do analizy ilościowej. Opisana tutaj metoda dla tkanek zamrożonych jest przydatna do wykrywania markerów, których nie można wykryć w tkankach FFPE lub dla których przeciwciała nie są dostępne dla tkanek FFPE.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatnie postępy w technikach obrazowania mikroskopowego znacznie poszerzyły naszą wiedzę i zrozumienie procesów biologicznych i stanów chorobowych. Wykrywanie in situ białek w tkankach za pomocą immunohistochemii chromogennej (IHC) jest rutynowo wykonywane w patologii. Jednak wykrywanie wielu markerów za pomocą chromogennego barwienia IHC jest wyzwaniem1 i opracowywane są nowsze metody barwienia multipleksowego immunofluorescencji (mIF), w których wiele markerów biologicznych jest znakowanych na jednej próbce tkanki. Wykrywanie wielu markerów biologicznych jest przydatne, ponieważ informacje związane z architekturą tkanki, dystrybucją przestrz....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mysia śledziona i mysie tkanki nowotworowe HLF1623 zostały uzyskane z naszego laboratorium. Ludzka tkanka migdałków została zakupiona od komercyjnego sprzedawcy. Szczegóły znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Osadzanie tkanek

  1. Zanurz świeżą tkankę w roztworze OCT (optymalna temperatura cięcia) i zamroź błyskawicznie przy użyciu suchego lodu lub ciekłego azotu.
  2. Przechowywać tkanki w temperaturze -80 °C.

2. Kriosekcja

  1. Wyciąć odcinki o grubości 8 μm w kriostacie o temperaturze -25 °C.
    nuta: Preferowaną grubość pr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykrywanie pojedynczych markerów na zamrożonych skrawkach śledziony
Ponieważ półautomatyczny system obrazowania wykorzystuje system przestrajalnego filtra ciekłokrystalicznego (LCTF), który pozwala na szerszy zakres wykrywania długości fali25, a także dlatego, że nie przeprowadzono tutaj żadnych etapów wzmacniania sygnału, najpierw zoptymalizowaliśmy wykrywanie naszych pierwszorzędowych przeciwciał sprzężonych dla każdego markera na mikroskopie. Przykład jest pokazany w

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zamrożone tkanki są szeroko stosowane do obrazowania mIF w celu tradycyjnego wykrywania trzech do czterech markerów31 na tkance przy użyciu metody bezpośredniej i pośredniej32. W metodzie bezpośredniej przeciwciała są sprzężone z barwnikami fluorescencyjnymi lub kropkami kwantowymi33 w celu znakowania tkanki, podczas gdy w metodzie pośredniej do znakowania tkanki stosuje się niesprzężone przeciwciało pierwszorzędowe, a następnie przeciwciało drugorzę.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wskazówki dotyczące obrazowania i analizy zostały dostarczone przez Centrum Zasobów Badawczych - Badanie Histologii i Obrazowania Tkanek na Uniwersytecie Illinois w Chicago, założone przy wsparciu biura Wicekanclerza ds. Badań. Prace były wspierane przez NIH/NCI RO1CA191317 CLP, przez NIH/NIAMS (grant SBDRC 1P30AR075049-01) dla dr A. Pallera oraz przez wsparcie Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center dla Immunotherapy Assessment Core na Northwestern University.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Aceton (stopień histologiczny)Fisher ScientificA16F-1GALUtrwalanie tkanek
Alexa Fluor 488 anty-mysie CD3BioLegend100212klon - 17A2; pierwszorzędowe przeciwciało sprzężone
Alexa Fluor 488, eBioscience anty-ludzkie CD20ThermoFisher Scientific53-0202-82Klon - L26; pierwszorzędowe przeciwciało sprzężone
Alexa Fluor 555 Mysz anty-Ki-67BD Nauki biologiczne558617Pierwszorzędowe przeciwciało sprzężone
Alexa Fluor 594 anty-ludzkie CD3BioLegend300446klon - UCHT1; pierwszorzędowe przeciwciało sprzężone
Alexa Fluor 594 anty-mysie CD8aBioLegend100758Clone - 53-6,7; pierwszorzędowe przeciwciało sprzężone
Alexa Fluor 647 anty-ludzkie CD8aBioLegend372906klon - C8/144B; pierwszorzędowe przeciwciało
sprzężoneAlexa Fluor 647 anty-mysie CD206 (MMR)BioLegend141711Clone - C068C2; pierwszorzędowe przeciwciało sprzężone
Alexa Fluor 647 przeciwciało anty-mysie CD4BioLegend100426Clone - GK1.5; pierwszorzędowe przeciwciało sprzężone
C57BL/6 MyszCharles River Laboratories27Zamrożone tkanki myszy używane do treningu wielospektralnego
Coplin JarSigma AldrichS6016-6EAPreparaty nawadniające i myjące
Roztwór DAPI BDBiosciences564907Barwienie kwasami nukleinowymi
Diamentowe białe szkło naładowane SzkiełkaDOT ScientificDW7590WPrzylegające skrawki tkanek
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco 1x (bez Ca i Mg)Fisher ScientificMT21031CVMycie i rozcieńczalnik
Gold Seal Szkiełka nakrywkoweThermoFisher Scientific3306Ochrona barwionych tkanek
Ludzki normalny migdałek OCT zamrożony blok tkanekAMSBioAMS6023Ludzka zamrożona tkanka używana do barwienia wielospektralnego
Surowica ludzka 1xGemini Bio-Products100-512Blokowanie i rozcieńczalnik do tkanek ludzkich
inFormAkoya BiosciencesWersja 2.4.1Oprogramowanie do uczenia maszynowego
PerCP / Cyjanina5.5 anty-ludzka CD4Klon BioLegend300529- RPA-T4; pierwszorzędowe przeciwciało sprzężone
PerCP-Cy 5.5 Szczur Anty-CD11bKlon 550993 Nauk Biologicznych- M1/70; pierwszorzędowe przeciwciało sprzężone
PhenochartAkoya BiosciencesWersja 1.0.8Oprogramowanie do skanowania całych slajdów
ProLong Diamond AntifadeMountant ThermoFisher ScientificP36965Podłoże
montażoweKriostat badawczyLeica BiosystemsCM3050 SSekcja tkanek
Superblok 1xThermoFisher Scientific37515Blokowanie tkanek myszy
Rozwiązanie Tissue-Tek OCTSakura Finetek4583Osadzanie tkanek
Vectra 3.0 Zautomatyzowany ilościowy system obrazowania patologii, 6 slajdówAkoya BiosciencesCLS142568Półautomatyczne obrazowanie wielospektralne system
Vectra SoftwareAkoya BiosciencesWersja 3.0.5Oprogramowanie do obsługi mikroskopu

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van der Loos, C. M. Chromogens in Multiple Immunohistochemical Staining Used for Visual Assessment and Spectral Imaging: The Colorful Future. Journal of Histotechnology. 33 (1), 31-40 (2010).
  2. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Multispectral Fluorescence ImagingFrozen Tissue SectionsFluorophore CombinationsSpectral Library CreationMachine Learning AnalysisCell SegmentationAntibody Staining ProtocolSpectral UnmixingWhole Slide ScanPhenotype Mapping

Related Articles