Ukierunkowana ewolucja endonukleazy restrykcyjnej in vitro o bardziej rygorystycznej swoistości

Podsumowanie

Endonukleazy restrykcyjne o nowej specyficzności sekwencji mogą być rozwijane z enzymów rozpoznających częściowo zdegenerowaną sekwencję. Tutaj przedstawiamy szczegółowy protokół, który z powodzeniem wykorzystaliśmy do zmiany specyficzności sekwencji enzymu NlaIV. Kluczowymi składnikami protokołu są podział in vitro na przedziały reakcji transkrypcji/translacji oraz wybór wariantów o nowej specyficzności sekwencji.

Streszczenie

Inżynieria specyficzności endonukleazy restrykcyjnej (REazy) jest niezwykle trudna. Tutaj opisujemy wieloetapowy protokół, który pomaga wytwarzać warianty REazy, które mają bardziej rygorystyczną specyficzność niż enzym macierzysty. Protokół wymaga stworzenia biblioteki kaset selekcyjnych ekspresji (ESC) dla wariantów REazy, najlepiej ze zmiennością pozycji, która może wpływać na wiązanie DNA. ESC jest otoczony z jednej strony sekwencją dla pożądanej aktywności miejsca restrykcji i znacznikiem biotyny, a z drugiej strony przez miejsce restrykcji dla niepożądanej aktywności i miejsce wyżarzania startera. ESC są transkrybowane i translowane w emulsji typu woda w oleju, w warunkach, które sprawiają, że obecność więcej niż jednej cząsteczki DNA na kroplę jest mało prawdopodobna. Dlatego DNA w każdej cząsteczce kasety jest poddawane tylko aktywności translowanego, kodowanego enzymu. Warianty REazy o pożądanej specyficzności usuwają znacznik biotyny, ale nie miejsce wyżarzania podkładu. Po rozbiciu emulsji cząsteczki DNA poddawane są ściąganiu biotyny i tylko te znajdujące się w supernatancie są zatrzymywane. Ten krok zapewnia, że zachowywane są tylko ESC dla wariantów, które nie utraciły pożądanej aktywności. Te cząsteczki DNA są następnie poddawane pierwszej reakcji PCR. Rozszczepienie w niepożądanej kolejności odcina miejsce wiązania podkładu dla jednego ze starterów. Dlatego PCR amplifikuje tylko ESC z kropelek bez niepożądanej aktywności. Następnie przeprowadza się drugą reakcję PCR w celu ponownego wprowadzenia miejsca restrykcji dla pożądanej specyficzności i znacznika biotyny, tak aby można było powtórzyć etap selekcji. Wybrane otwarte ramki odczytu mogą ulegać nadekspresji w komórkach bakteryjnych, które również wyrażają pokrewną metylotransferazę macierzystej REazy, ponieważ nowo wyewoluowana REaza celuje tylko w podzbiór miejsc docelowych metylotransferazy.

Wprowadzenie

Inżynieria specyficzności sekwencji jest niezwykle trudna dla klas II. W tej klasie endonukleaz rozpoznawanie sekwencji i kataliza są ze sobą ściśle powiązane, najprawdopodobniej jako ewolucyjne zabezpieczenie przed powstaniem endonukleazy o szerszej specyficzności niż pokrewna metylotransferaza, która uszkodziłaby DNA gospodarza. Ukierunkowana ewolucja nowych specyficzności w komórkach jest dodatkowo skomplikowana ze względu na konieczność ochrony DNA gospodarza przed nowo zmodyfikowaną aktywnością endonukleazy. W związku z tym zgłoszono tylko kilka udanych prób inżynierii REase i wszystkie z nich wykorzystują unikalne cechy konkretnego enzymu^{1,2,3,4,5,6,7}.

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół inżynierii specyficzności, który może być wykorzystany do generowania wariantów endonukleazy o węższej specyficzności niż enzym macierzysty, który jest oparty na naszej udanej inżynierii endonukleazy NlaIV⁸. Dla każdego takiego enzymu z dowolną sekwencją rozpoznawania można wprowadzić dodatkową specyficzność dla zasad w bokach. W przypadku enzymów rodzicielskich, które rozpoznają częściowo zdegenerowane sekwencje (takie jak NlaIV z celem GGNNCC), w sekwencji rozpoznawania można również wprowadzić dodatkową specyficzność. Ponieważ dodatkowa specyficzność będzie prawdopodobnie wymagała kontaktów białko-DNA, nowo rozpoznane zasady powinny leżeć w śladzie endonukleazy rodzicielskiej na DNA. Zasadniczo schematy wyboru można ustawić dla dowolnej specjalizacji sekwencji rozpoznawania. Jednak większość REaz, które rozpoznają palindromiczne i prawie palindromiczne sekwencje docelowe, to funkcjonalne dimery, które rozpoznają tylko połowę miejsca palindromu. W związku z tym selekcja nowych specyficzności, które naruszają symetrię oddziaływań nukleinowych białek, prawdopodobnie nie zadziała. Na przykład dla dimerycznego NlaIV sekwencję GGNNCC można teoretycznie zawęzić do GGATCC, ale oczekuje się, że zawężenie specyficzności do GGAACC będzie trudniejsze. Nasz schemat obejmuje zarówno selekcję pozytywną, jak i negatywną.

Proces jest bardziej wydajny, gdy selekcja negatywna jest również używana do usuwania specyficzności, które są w stanie rozszczepić wszystkie sekwencje inne niż preferowana węższa specyficzność. Na przykład, selekcja dla GGATCC może być połączona z antyselekcją przeciwko GGBVCC (gdzie B jest dowolną bazą inną niż A, a V jest dowolną bazą inną niż T). Gdy niektóre z możliwych sekwencji docelowych nie są uwzględnione, wynik eksperymentu selekcyjnego zależy od skuteczności selekcji pozytywnej i negatywnej. W naszej pracy NlaIV dokonaliśmy selekcji dla GGATCC i przeciwko GGSSCC (gdzie S jest G lub C) i uzyskaliśmy specyficzność, która, ignorując cele łamiące symetrię, może być opisana jako GGWWCC (gdzie W to A lub T), sugerując, że w tym konkretnym przypadku selekcja negatywna była ważniejsza niż selekcja pozytywna.

Nasze podejście zaczyna się od stworzenia kasety wyboru wyrażeń (ESC). ESC składa się z sekcji. W wewnętrznej części rdzenia znajdują się warianty otwartej ramki odczytu (ORF) REazy, pod kontrolą promotora T7. Ta podstawowa sekcja ESC nie może zawierać żadnego pokrewnego miejsca dla zaprojektowanej REazy. Rdzeń jest umieszczony pomiędzy dwoma pokrewnymi miejscami dla dzikiej typu REazy: miejscem rozszczepienia dla niepożądanej aktywności (licznik wybranej sekwencji, GGSSCC w tym przykładzie) i miejscem rozszczepienia dla pożądanej aktywności (wybrana sekwencja, GGATCC w przykładzie). Ostatnim etapem przygotowania ESC w PCR jest dodanie biotyny w pobliżu pożądanej aktywności na końcu 5' i tworzenie różnorodnych sekwencji wybranych przez licznik (w przykładzie GGSSCC). Strategia selekcji opiera się na zastosowaniu starannie zaprojektowanych starterów w protokole reamplifikacji ESC po protokole transkrypcji/translacji/selekcji in vitro (ryc. 1A). Biblioteka ESC jest wyrażona w translacji transkrypcyjnej in vitro emulsji woda w oleju^9,10,11. W obrębie każdej kropli specyficzność eksprymowanego enzymu wpływa na stan ESC (Rysunek 1B, krok I). W opisanym układzie pożądana aktywność rozszczepienia translowanego białka usuwa znacznik biotyny DNA, ale nie wpływa na drugi koniec ESC z przeciwnie wybraną sekwencją. Gdy emulsja zostaje rozbita, biotynylowane fragmenty są usuwane przez ściąganie powinowactwa do streptawidyny, tak że pozostają tylko fragmenty kropelek o pożądanej aktywności (Rysunek 1B, krok II). Ten krok usuwa nieaktywne warianty REase. Frakcja supernatantowa etapu pull-down jest następnie amplifikowana metodą PCR. W pierwszej reakcji PCR stosuje się startery F2 i R1 (Figura 1A, B, krok III). Starter F2 wiąże się z sekcją ESC między wybraną sekwencją licznika a końcem cząsteczki. W związku z tym ESC wyrażające warianty, które są zdolne do rozszczepienia wybranej sekwencji licznika (a zatem rozdzielenia miejsc wiązania starterów F2 i R1 na dwie różne cząsteczki DNA) nie są amplifikowane i są w ten sposób usuwane z biblioteki. Starter R1 wiąże się między wybranym miejscem a rdzeniem ESC, tak że nie ma na niego wpływu stan rozszczepienia wybranego miejsca i przywraca miejsce rozszczepienia dla pożądanej aktywności (GGATCC). Cykl zamyka się drugim PCR (ze starterami F1 i R2), który dodaje biotynę na końcu 5' w pobliżu wybranego miejsca i przywraca zaprojektowaną zmienność w przeciwstawnym wybranym miejscu w pobliżu przeciwległego końca ESC (Figura 1B, krok IV). Otrzymana mieszanina DNA jest gotowa do kolejnej rundy selekcji.

Sukces protokołu selekcji zależy w dużej mierze od właściwego wyboru nowej, bardziej rygorystycznej sekwencji rozpoznawania celów oraz od starannego zaprojektowania strategii mutagenezy i jej skutecznego wdrożenia. Ponieważ o wiele łatwiej jest poprawić nieznacznie istniejące wcześniej preferencje REazy niż je przezwyciężyć, zalecamy rozpoczęcie od kinetycznego badania wszelkich istniejących wcześniej preferencji. Konieczność starannego projektowania mutagenezy wynika z ograniczonej wielkości biblioteki mutantów, która może być przetwarzana przez prezentowany protokół (10,⁹ klonów w jednym eksperymencie). Dlatego wszystkie 20 możliwych podstawień aminokwasów może być skutecznie przetestowanych tylko w kilku pozycjach (patrz Dyskusja). Mutageneza losowa, taka jak podatna na błędy PCR (EP-PCR) przedstawiona jako metoda alternatywna, doprowadzi do głębokiego niedopróbkowania istniejącej złożoności. Jeśli dostępne są jakiekolwiek informacje na temat potencjalnych pozycji aminokwasów biorących udział w kontaktach z DNA (lub nawet znajdujących się w bliskim sąsiedztwie zdegenerowanych nukleotydów w sekwencji pokrewnej), z pewnością powinny one zostać wykorzystane do wyselekcjonowania kilku aminokwasów do mutagenezy nasycenia sterowanej oligonukleotydami (kroki protokołu 1.6-3.10).

Protokół

1. Przygotowanie ESC

1. Klonować metylotransferazę systemu restrykcyjno-modyfikującego, która ma być zaprojektowana w plazmidzie o niskiej liczbie kopii (np. pACYC184 lub pACYC174 lub ich pochodne).
   nuta: Szczep bakteryjnego gospodarza musi być w stanie tolerować metylację wprowadzoną przez sklonowany enzym i zapewniać indukowaną ekspresję polimerazy RNA T7. Zaleca się stosowanie szczepu ER2566 (przenoszącego mutacje McrA, McrBC i Mrr).
2. Potwierdzić, że rekombinowany plazmidowy DNA jest chroniony przed rozszczepieniem przez pokrewną endonukleazę, traktując 0,5 μg plazmidowego DNA 10 jednostkami pokrewnej REazy w buforze i temperaturze zalecanej przez dostawcę enzymu przez 2 godziny.
3. Przygotuj kompetentne komórki tego szczepu.
   nuta: Można użyć dowolnej metody. W projekcie inżynieryjnym NlaIV wykorzystano prostą metodę chlorku wapnia¹².
4. Skonstruuj rekombinowany plazmid z ORF dla REazy pod kontrolą promotora T7 z innej grupy wykluczenia i z innym markerem selekcyjnym niż ten, który zawiera gen metylotrafazy w kroku 1.1. Można stosować wektory pET28 i pET30.
5. Usuń wszystkie miejsca rozpoznawania zmodyfikowanego enzymu z sekcji rekombinowanego plazmidu między promotorem T7 a kodonem stop enzymu ORF, wprowadzając ciche mutacje (Rysunek 2, Tabela 1A).
   UWAGA: Jeśli więcej niż jedno takie miejsce musi zostać usunięte, konieczne będzie przeprowadzenie wielu rund mutacji (kroki 1.5.1–1.5.7).
   1. Użyj reakcji PCR od wewnątrz na lewą stronę, która amplifikuje plazmid na całej długości z zaprojektowanymi zmianami wprowadzonymi na końcach 5' starterów (tabela 2A).
   2. Usunąć matrycowy DNA, dodając 10 j. endonukleazy DpnI do 50 μl reakcji PCR i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
   3. Rozpuścić produkty za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Wytnij pasmo odpowiadające plazmidowi o pełnej długości i oczyść go za pomocą komercyjnego zestawu.
   4. Dodać 10x bufor ligacyjny (do 1x stężenia) i uzupełnić ATP (do 1 mM). Dodać 10 j. kinazy polinukleotydowej T4 i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Dezaktywować enzym przez ogrzewanie w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
   5. Dodaj PEG 4000 do 5%, ponownie uzupełnij ATP (do 1 mM) i dodaj 5 U ligazy DNA T4. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT).
   6. Przekształć się w kompetentny szczep bakteryjny przenoszący pokrewną metylotransferazę (krok 1.1).
   7. Wyizoluj plazmidowe DNA w małej skali i potwierdź wprowadzenie zmian sekwencji przez sekwencjonowanie dideoksy.
6. Wprowadź unikalne miejsca restrykcyjne w pobliżu sekwencji (sekwencji) docelowej mutagenezy sterowanej oligonukleotydami (Rysunek 2, Tabela 1B). Wykonaj kroki 1.5.1–1.5.7 dla każdej lokacji.
   nuta: Ten etap jest wykonywany tylko wtedy, gdy stosowana jest mutageneza celowana. Jeśli wykonujesz mutagenezę losową, pomiń kroki 2-3 i przejdź do sekcji 3. W przedstawionym przykładzie wszystkie lokalizacje zostały wprowadzone przed regionami docelowymi, ale można je również wprowadzić poniżej.
7. Zaprojektuj startery do wzmocnienia ESC (tabela 1C).
   1. Zaprojektuj odwrotne wiązanie startera za endonukleazą ORF, które wprowadzi wybrane miejsce rozpoznawania (R1) i jego krótszą wersję (R2), która wiąże się poza wybraną sekwencją NlaIV i zawiera biotynę na końcu 5' (patrz Rysunek 1).
   2. Zaprojektuj starter do przodu (F1) wiążący się z ESC przed promotorem T7. Ten starter powinien również wprowadzić kontrwybrany wariant(y) oryginalnej sekwencji rozpoznawania (tj. maksymalną liczbę wariantów sekwencji rozpoznawanych przez oryginalny enzym, z wyjątkiem wybranej sekwencji odwrotnej).
      nuta: Krótsza wersja tego startera (F2), która obejmuje sekwencję dystalną do przeciwwybranej sekwencji, zostanie użyta później w selektywnym PCR (krok 5.9).

2. Synteza starterów mutagennych metodą split-and-mix

UWAGA: Ten krok jest używany tylko dla projektów, które wymagają mutagenezy subsaturacji na więcej niż jednym miejscu. Wymagany jest syntezator z wieloma kolumnami syntezy. Przypisz kolumny do syntezy losowych trojaczków kodonów NNS i trojaczków kodonów typu dzikiego zgodnie z częstościami mutagenezy. Na przykład, jeśli dostępnych jest siedem kolumn syntezy o równej objętości, a współczynnik mutagenezy wynoszący 0,3 jest pożądany w danym miejscu, dodaj losowe kodony NNS w ~0,3 x 7 lub dwóch kolumnach, a kodony typu dzikiego w ~0,7 x 7 lub pięciu kolumnach (Rysunek 3).

1. Zdecyduj o miejscach do mutagenezy subsaturacji. Częstość występowania mutagenezy należy wybierać zgodnie z hipotetycznym znaczeniem miejsc (tj. im ważniejsza strona, tym wyższa częstotliwość), mając na uwadze ograniczenia dotyczące ogólnej złożoności biblioteki (patrz Dyskusja).
2. Zsyntetyzuj oligonukleotydy we wszystkich kolumnach, aż do trypletu bezpośrednio poprzedzającego drugie miejsce mutagenezy przesycenia, licząc od końca 3'. Nie usuwaj grupy ochronnej 5'-trytylu w ostatnim cyklu syntezy (użyj opcji trityl-on w syntezatorze). Grupa chroniąca zostanie usunięta na początku następnego cyklu syntezy (krok 1 w Rysunek 3).
3. Otwórz kolumny syntezy. Zbierz nośnik syntezy szkła o kontrolowanych porach (CPG) do suchej probówki o pojemności 1,5 ml i wymieszaj przez wirowanie. Ponownie podziel zmieszaną żywicę CPG na nowe kolumny syntezy. Unikaj wprowadzania wilgoci, ponieważ zmniejszy to ogólny plon (kroki 2 i 4 w Rysunek 3).
4. Kontynuować syntezę, zaczynając od trypletu miejsca mutagenezy przesycenia. Przypisz kolumny do losowych trojaczków NNS lub trojaczków typu dzikiego zgodnie z pożądaną częstością mutagenezy (patrz uwaga powyżej). Jeśli obecne są dodatkowe miejsca podnasycenia, należy przejść tylko do trypletu poprzedzającego następne miejsce mutagenezy podnasycenia. Ponownie, pozostaw włączoną grupę 5'-trityl na końcu (opcja 5'-trityl-on w syntezatorze) (krok 3 w Rysunek 3). Następnie przejdź do kroku 2.3.
5. Jeśli poniżej nie ma już miejsc nasycenia, zakończ syntezę, pozostawiając na końcu grupę 5'-trytylową (opcja 5'-trytylu na syntezatorze) (krok 5 w Rysunek 3).
6. Odbezpiecz i oczyść bibliotekę oligonukleotydów zgodnie z instrukcjami producenta wkładu oczyszczającego.
   nuta: Oligonukleotydy uwolnione w wyniku deprotekcji CPG mogą być również oczyszczane w wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z trytylonem w odwrotnej fazie, a następnie ręcznym usuwaniu grupy trytylowej (1 godzina traktowania 80% kwasem octowym w temperaturze pokojowej) i drugim oczyszczaniu HPLC.
7. Sprawdź jakość biblioteki oligonukleotydów w żelu mocznikowym-PAGE.

3. Generowanie bibliotek wariantów

UWAGA: Użyj rekombinowanego plazmidu z kroku 1.6.

1. Wygeneruj biblioteki według ukierunkowanej mutagenezy oligonukleotydowej.
   UWAGA: Alternatywnie można użyć protokołu EP-PCR (krok 3.2).
   1. Amplifikuj odcinek od promotora T7 do unikalnego miejsca enzymu restrykcyjnego flankującego sekwencję docelową mutagenezy (w przypadku NlaIV: SalI, EcoRI lub Eco52I) (Tabela 1B-C, Tabela 2B, Rysunek 4). Amplifikuj drugą część od unikalnego miejsca enzymu restrykcyjnego do końca 3' ESC.
   2. Wymieszać oddzielnie 5 μl reakcji PCR (z kroku 3.1.1) z 8 μl wody, 1,5 μl 10-krotnego buforu enzymu restrykcyjnego i 5 jednostkami odpowiednich enzymów restrykcyjnych (SalI, EcoRI lub Eco52I) i inkubować w odpowiedniej temperaturze przez 2 godziny.
   3. Rozpuścić produkty obu reakcji za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Wytnij oczekiwane pasma rozmiarów i oczyść za pomocą komercyjnego zestawu.
   4. Umieścić do 1/3 oczyszczonych produktów w żelu agarozowym i zmierzyć stężenie każdego oczyszczonego prążka za pomocą densytometrii.
   5. Ustawić ligację dwóch części ESC w stosunku molowym 1:1 z 1x buforem ligazy i 1 U ligazy DNA T4 i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
   6. Rozpuść produkty reakcji w żelu agarozowym. Wytnij produkty o oczekiwanym rozmiarze i oczyść je za pomocą komercyjnego zestawu.
   7. Amplifikować oczyszczone produkty ligacji w reakcji PCR za pomocą starterów F1 i R2 (tabela 1C i tabela 2A). Nie uruchamiaj więcej niż 20 ampcykle lifikacji.
   8. Frakcjonować reakcje PCR w żelu agarozowym. Wytnij produkty i oczyść je za pomocą komercyjnego zestawu.
   9. Uruchomić 5 μl podwielokrotności oczyszczonej biblioteki z poprzedniego kroku w żelu agarozowym i zmierzyć stężenie za pomocą densytometrii.
   10. Sklonuj małą próbkę z biblioteki (do 5 μl) i zsekwencjonuj >15 klonów, aby sprawdzić częstotliwość i rozkład mutacji (Tabela 3). Przejdź do kroku 4.
       nuta: Alternatywnie można zastosować sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości małej próbki ESC.
2. Wykonaj EP-PCR.
   1. Amplifikować ESC z plazmidu otrzymanego w kroku 1.5.7 za pomocą starterów F1 i R1. Uruchomić 20 cykli z polimerazą Taq I (Tabela 1B).
   2. Żel oczyszcza produkt PCR.
   3. Skonfiguruj EP-PCR z 2 ng oczyszczonego produktu PCR z poprzedniego kroku i uruchom 15 cykli EP-PCR (Tabela 1C) ze starterami F1 i R1.
   4. Żel oczyścić produkt i oznaczyć go ilościowo za pomocą densytometrii żelowej.
      nuta: Ze względu na niskie stężenie oczyszczonego produktu EP-PCR należy użyć około 1/3 do oznaczania ilościowego.
   5. Sklonuj małą próbkę biblioteki (do 1/5) i zsekwencjonuj >15 klonów, aby sprawdzić częstotliwość i dystrybucję mutacji (Tabela 4).
      >nuta: Alternatywnie można przeprowadzić sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości małej próbki ESC.

4. Przeprowadzanie przedziałowej reakcji transkrypcji-translacji in vitro

1. Zbadaj ekspresję endonukleazy i aktywność enzymatyczną w translacji transkrypcji in vitro.
   1. Przygotuj krótki (200–500 pz) substrat z pojedynczym miejscem rozpoznawania endonukleazy znajdującym się blisko środka cząsteczki, aby można było łatwo wykryć reakcję rozszczepienia.
      nuta: Najprostszym sposobem przygotowania substratu jest amplifikacja PCR odpowiedniego fragmentu dowolnej cząsteczki DNA. Podłoże może być znakowane radioaktywnie lub fluorescencyjnie, aby uprościć wykrywanie rozszczepienia.
   2. Ustawić 50 μl reakcji transkrypcja-translacja z 0,5 μg ESC typu dzikiego zgodnie z zaleceniami producenta. Dodać sól magnezu (MgCl₂,_MgSO4 i octan magnezu można przebadać) do 1,5 mM i odpowiedniej ilości substratu z poprzedniego etapu (co najmniej 0,5 μg w przypadku nieznakowanego DNA).
      nuta: Można użyć dowolnego zestawu do transkrypcji/translacji, który nie zawiera nukleazy aktywowanej przez magnez. Niektórzy sprzedawcy zestawów używają nukleaz do usuwania zanieczyszczenia DNA podczas produkcji, a następnie dodają chelatory jako inhibitory nukleazy. Takie zestawy nie są kompatybilne z tą metodą.
   3. Inkubować reakcję transkrypcja-translacja zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie przenieść mieszaninę reakcyjną do temperatury optymalnej dla enzymu restrykcyjnego na 2 godziny.
   4. Przeanalizuj rozszczepienie substratu w żelu agarozowym, a następnie odpowiednie wykrycie (np. barwienie DNA, wizualizacja fluorescencji lub autoradiografia) (Rysunek 5).
      nuta: Przed przystąpieniem do podziału na przedziały konieczne jest przynajmniej częściowe rozszczepienie podłoża. Jeśli nie zostanie to osiągnięte, konieczna jest dalsza optymalizacja formy chemicznej magnezu lub jego stężenia.
2. Przygotować mieszaninę oleju i środka powierzchniowo czynnego, dodając 225 μl Span 80 i 25 μl Tween 80 do 5 ml oleju mineralnego w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Dokładnie wymieszaj, delikatnie obracając tubkę 15x.
3. Dla każdej biblioteki przenieść 950 μl mieszaniny oleju i środka powierzchniowo czynnego do 2 ml okrągłej fiolki kriogenicznej, oznaczyć etykietą z nazwą biblioteki i przenieść do lodu. Umieścić po jednym małym cylindrycznym mieszadle (5 x 2 mm²) do każdej fiolki.
4. Przygotować mieszaninę reakcji transkrypcji i translacji in vitro (50 μl na każdą bibliotekę) zgodnie z zaleceniami producenta. Uzupełnić mieszaninę chlorkiem magnezu do końcowego stężenia 1,5 mM (patrz krok 4.1.4).
5. Dozować 50 μl porcji do probówek o pojemności 1,5 ml na lodzie.
6. Dodać 1,7 fmola biblioteki (z sekcji 3) do mieszaniny reakcyjnej na lodzie.
   nuta: Nie należy używać większej ilości biblioteki wyrażeń w celu zwiększenia wydajności selekcji. Bardzo ważne jest zminimalizowanie częstości występowania kropelek wodnych zawierających więcej niż jedną cząsteczkę DNA.
7. Przygotuj kolejno emulsję typu woda w oleju dla każdej biblioteki.
   1. Umieść małą zlewkę (lub dużą butelkę) wypełnioną lodem na mieszadle magnetycznym z prędkością mieszania ustawioną na 1 150 obr./min.
   2. Przenieść fiolkę kriogeniczną z 950 μl mieszaniny oleju i środka powierzchniowo czynnego oraz małym mieszadłem z kroku 4.3 do lodowatej zlewki na mieszadle magnetycznym. Sprawdź, czy pręt mieszający się obraca.
   3. Dodać pięć 10 μl porcji mieszaniny biblioteka-transkrypcja-translacja in vitro przez okres 2 minut w odstępach 30 s i kontynuować mieszanie przez dodatkową minutę. Przenieść fiolkę z emulsją do pojemnika na lód. Przejdź do następnej biblioteki, zaczynając od kroku 4.7.2.
   4. Po przetworzeniu wszystkich bibliotek rozpocznij inkubację wszystkich bibliotek zgodnie z zaleceniami producenta zestawu.
8. Przenieś fiolki do temperatury optymalnej dla zmodyfikowanej endonukleazy na dodatkowe 2 godziny, a następnie umieść je na lodzie na co najmniej 10 minut.

5. Ciągłe przetwarzanie bibliotek i selekcja

1. Przenieś emulsje z fiolek kriogenicznych do zimnych probówek o pojemności 1,5 ml, dodaj 1 μl 0,5 M EDTA i odwiruj je przy 13 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
2. Usuń górną fazę olejową za pomocą pipety. Jeżeli interfaza olej-woda nie jest widoczna, należy inkubować probówkę przez co najmniej 5 minut w temperaturze -20 °C w celu zamrożenia fazy wodnej, a następnie natychmiast odpipetować ciekłą fazę olejową.
3. Dodać 100 μl 10 mM Tris HCl pH 8,0 i natychmiast przeprowadzić ekstrakcję 150 μl fenolu:chloroformu (1:1 v/v) przez krótkie wirowanie, a następnie separację faz przez 30-sekundowe wirowanie przy 13 000 x g. Zebrać górną fazę wodną.
4. Wytrącić DNA, dodając 0,1 obj. (15 μl) 3 M octanu sodu (pH = 5,2), 2,5–5 μg glikogenu i 2,5 obj. (375 μl) etanolu. Inkubować w temperaturze -20 °C przez 1 godzinę i wirować przez 15 minut w temperaturze 13 000 x g, 4 °C. Odrzucić supernatant i krótko przemyć osad 1 ml zimnego 70% etanolu.
5. Wysuszyć osad DNA/glikogenu w speedvacu lub wysuszyć na powietrzu przez >5 minuty.
6. Rozpuścić osad w 50 μl 10 mM Tris-HCl (pH = 7,5). Dodać 5 μL kulek magnetycznych streptawidyny przygotowanych zgodnie z zaleceniami producenta i mieszać przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, najlepiej w mieszalniku karuzelowym lub przez delikatne wirowanie.
7. Oddziel koraliki na stojaku magnetycznym i zbierz płyn wzbogacony w DNA bez biotyny.
8. Zagęścić DNA przez wytrącanie etanolu (kroki 5.4–5.5).
9. Rozpuść skoncentrowane DNA z poprzedniego etapu w 5 μl wody i użyj jako matrycy w reakcji PCR ze starterami F2 i R1 (Tabela 1A).
   nuta: Aby uniknąć problemów z zanieczyszczeniem matrycy i zminimalizować artefakty PCR, należy użyć polimerazy Taq (nie Pfu lub Phusion) i przeprowadzić 18–20 cykli z czasem wydłużenia proporcjonalnym do wielkości matrycy (1 kb = 1 min) (patrz tabela 2B).
10. Frakcjonować produkt PCR w żelu agarozowym i wycinać produkt o oczekiwanej wielkości. Pewne rozmazywanie wskazuje, że istnieją produkty o różnych rozmiarach (patrz Rysunek 6). Oczyść DNA z płyty żelowej za pomocą komercyjnego zestawu.
11. Przeprowadź drugą reakcję PCR z maksymalnie 50 ng DNA z kroku 5.10 i starterami F1 i R2, używając tego samego protokołu, co w kroku 5.9. Kontynuować oczyszczanie produktu zgodnie z opisem w ppkt 5.10. Oczyszczone DNA po kwantyfikacji za pomocą densytometrii w żelu agarozowym (nie spektroskopii UV) można wykorzystać w następnej rundzie selekcji in vitro (krok 4.6).

6. Warianty ekranu dla specyfiki zmienionej sekwencji

1. Sklonuj wybrane warianty.
   1. Trawić produkt opisany w kroku 5.10 przez 2 godziny za pomocą 10 j. enzymów restrykcyjnych odpowiednich do klonowania ORF do wektora ekspresji (dla NlaIV: NcoI i XhoI) w temperaturze i buforze zalecanym przez dostawcę enzymu. Rozpuść produkty za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i wyizoluj fragment o oczekiwanej wielkości.
   2. Przygotować wektor plazmidowy (np. pET28) przez podwójne rozszczepienie za pomocą tych samych enzymów, co w kroku 6.1.1 i oczyścić produkt żelem za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania żelu DNA.
   3. Oszacuj stężenia wektora i wstawki za pomocą densytometrii z elektroforezą w żelu agarozowym.
   4. Ustaw ligację z 1-5 U ligazy DNA T4 i stosunkiem molowym wektor:wstaw 1:3-1:5 w buforze ligazy 1x zalecanym przez dostawcę enzymu. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej i wprowadzić do odpowiedniego organizmu gospodarza (od kroku 1.3) przez transformację lub elektroporację¹².
   5. Na płytkach LB należy wybrać ekstransformanty zawierające odpowiedni antybiotyk (50 μg/ml kanamycyny dla wektorów pET28 lub pET30) i 1% glukozy.
2. Ekspresja wariantów białkowych.
   1. Zaszczepić pojedyncze kolonie z transformacji (do 24 klonów można łatwo przetworzyć w jednym przebiegu) do 2 ml LB z kanamycyną (50 μg/ml) i 1% glukozy i rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
   2. Zaszczepić 15 ml ciepłego (37 °C) LB zawierającego 100 μg kanamycyny i bez glukozy 0,75 ml nocnej kultury i inkubować w temperaturze 37 °C z energicznym wstrząsaniem.
      nuta: Można użyć probówek wirówkowych o pojemności 50 ml lub kolb Erlenmayera o pojemności 100 ml.
   3. Dodać 176 μl glicerolu do 1 ml nocnej kultury (końcowe stężenie glicerolu = 15%), dokładnie wymieszać i zamrozić w temperaturze -70 °C.
   4. Po 2–3 godzinach uzupełnij 15 ml kultury (od kroku 6.2.1) za pomocą IPTG do 1 mM i hoduj przez dodatkowe 5 godzin.
   5. Zebrać osad bakteryjny przez odwirowanie (10 000 x g, 4 °C, 10 min) i zamrozić w temperaturze -70 °C.
3. Oczyść warianty białkowe.
   1. Przenieść 20 μl zawiesiny żywicy o powinowactwie do niklu do 200 μl buforu B1 w probówce o pojemności 1,5 ml z końcówką pipety o szerokim otworze, delikatnie wymieszać i odwirować (5 000 x g, 30 s, 4 °C). Usunąć supernatant za pomocą pipetowania i pozostawić probówkę na lodzie.
   2. Zawiesić osad bakteryjny z kroku 6.2.5 w 300 μl witaminy B1 poprzez energiczne wirowanie. Przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 1,5 ml.
   3. Dodać 3 μl 100x koktajlu inhibitorów proteazy i roztworu lizosomów w B1 (końcowe stężenie 1 mg/ml). Dezintegruj komórki za pomocą sonikacji za pomocą sondy wyposażonej w końcówkę. Użyj sześciu 10-sekundowych serii na próbkę z czasem chłodzenia końcówki >15 s w lodzie pomiędzy nimi. Utrzymuj zawiesiny komórkowe na lodzie przez cały czas.
   4. Resztki komórek osadu przez odwirowanie (2 min, 12 000 x g, 4 °C) i przenieść 250 μl supernatantu do podwielokrotności żywicy z kroku 6.3.1.
   5. Mieszaj przez 15 minut w chłodnym pomieszczeniu, najlepiej w mikserze karuzelowym lub delikatnie wirując.
   6. Odwirować (5 000 x g, 30 s, 4 °C) i odessać supernatant za pomocą pipety.
   7. Dodać 500 μl buforu W i delikatnie zawiesić żywicę. Odwirować (5 000 x g, 30 s, 4 °C) i odessać supernatant za pomocą pipety.
   8. Powtórz krok 6.3.7.
   9. Dodać 20 μl buforu E, delikatnie zawiesić żywicę i pozostawić próbkę na lodzie na 2–5 minut. Odwirować (5 000 x g, 30 s, 4 °C) i zebrać supernatant.
   10. Powtórz krok 6.3.9. Supernatanty basenowe.
   11. Analizuj próbki białek za pomocą SDS-PAGE (5–10 μL) (Rysunek 7).
4. Ekran dla wariantów ze zmienioną specyfiką.
   1. Oznaczenie aktywności rozszczepienia DNA bakteriofaga lambda. Próbka białka może stanowić do 10% końcowej objętości reakcji. Dobrym punktem wyjścia jest łącznie 2 μl próbki białka na 0,5 μg DNA i 2 h czas reakcji.
   2. Analizuj produkty reakcji metodą elektroforezy w żelu agarozowym wraz z produktami wytwarzanymi przez enzym typu dzikiego. Do dalszej analizy należy wybrać klony generujące wzorce rozszczepienia, które można wyraźnie odróżnić od tego generowanego przez enzym typu dzikiego (Rysunek 8).

Wyniki

Ten protokół jest tylko narzędziem do zwiększenia częstotliwości pożądanych wariantów zmodyfikowanej REazy poprzez zubożenie (ale nie wyeliminowanie) dwóch niepożądanych klas: nieaktywnych enzymów i endonukleaz o niezmienionej specyficzności sekwencji typu dzikiego. Z drugiej strony, ponieważ zmiana swoistości REazy jest niezwykle trudna, znalezienie nawet jednego takiego wariantu wytwarzającego wzór rozszczepienia, który różni się od enzymu typu dzikiego, w pojedynczym badaniu przesiewowym 24 klonów, należy uznać za sukces. W naszych rękach najlepsze ekrany mogą zidentyfikować do 20% obiecujących wariantów (Rysunek 8A).

Pozytywny wynik zdecydowanie zależy od jakości biblioteki (tj. ograniczonej częstotliwości podstawiania i ich losowego rozkładu) oraz efektywnego przechwytywania biotynylowanej populacji członków biblioteki (kroki 3.6–3.7). Oba problemy można wykryć. Jakość biblioteki powinna być sprawdzona przed wyborem poprzez sekwencjonowanie jak największej liczby klonów (>15) lub poprzez bezpośrednie sekwencjonowanie biblioteki poprzez sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości (krok 3.10, Tabela 3). Jeśli większość wybranych klonów nie jest aktywna, jest to wyraźna oznaka niepowodzenia selekcji wychwytywania streptawidyny. Podobny efekt obserwuje się w przypadku bibliotek, które przechodzą wiele cykli selekcyjnych, ponieważ takie biblioteki są najprawdopodobniej zdominowane przez nieaktywne warianty, które uniknęły etapu selekcji wychwytywania streptawidyny (Rysunek 8B). W związku z tym zaleca się przeprowadzanie badań przesiewowych po każdym cyklu selekcji i dalsze rozwijanie ręcznie wybranych obiecujących wariantów, a nie poleganie na iteracji selekcji.

Rysunek 1: Selekcja in vitro nowej specyficzności sekwencji w oparciu o inżynierię NlaIV. (A) Organizacja kasety ekspresji/selekcji (ESC) obejmuje dwa miejsca rozpoznawania REazy, 1) wybraną sekwencję (GGATCC) znajdującą się blisko prawego końca i 2) sekwencję wybraną przez licznik (GGSSCC) znajdującą się blisko lewego końca, a także promotor T7p i T7t-T7 oraz terminator T7. Miejsca wiązania podkładu pokazano poniżej. Dekolt według typu dzikiego i wybranych wariantów NlaIV jest pokazany odpowiednio jako czerwony i zielony trójkąt. (B) Etapy cyklu selekcji: I) Emulgacja mieszanin reakcji transkrypcja-translacja-rozszczepienie za pomocą biblioteki ESC; II) Całe biotynylowane DNA jest wychwytywane na cząstkach magnetycznych pokrytych streptawidyną i usuwane, usuwając w ten sposób kodujące nieaktywne warianty; III) ESC kodujące REazy o aktywności typu dzikiego (tj. te, które są zdolne do rozszczepienia sekwencji GGSSCC) są eliminowane, ponieważ rozszczepienie sekwencji oddziela miejsca wiązania starterów do przodu i do tyłu. W związku z tym nie dochodzi do amplifikacji tych ESC; IV) Dane wejściowe do następnej rundy selekcyjnej są tworzone przez dodanie biotyny po prawej stronie i ponowne wprowadzenie wariacji sekwencji licznika wybranych po lewej stronie. Przedruk z Czapinska et al.⁸ za zgodą Elsevier. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przygotowanie ESC. Fragment pochodzący z oryginalnego konstruktu w wektorze ekspresji zawierającym NlaIV ORF pod kontrolą promotora T7 został zmodyfikowany tak, aby nadawał się do ekspresji/selekcji. Miejsce NlaIV znajdujące się poniżej NlaIV ORF zostało usunięte, a unikalne miejsca (SalI, EcoRI i Eco52I), które zostały wykorzystane do mutagenizacji wybranych pozycji, zostały wprowadzone do NlaIV ORF jako ciche mutacje. Ostateczny konstrukt został wzmocniony za pomocą flankujących starterów, które wprowadziły dwa flankujące miejsca NlaIV: sekwencję kontrselekcjonowaną (GGSSCC) po lewej stronie i wybraną sekwencję (GGATCC) po prawej. Odwrócony podkład wprowadził również biotynę. Startery używane do tworzenia zmutowanych ECS są pokazane jako niebieskie strzałki i oznaczone poniżej (patrz Tabela 1B,C). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Schemat syntezy split i mix. Przykład odnosi się do syntezy starterów MutB, w której sekwencja NNS została wprowadzona z częstotliwością 0,8 w czterech pozycjach (patrz również Tabela 3). Należy zauważyć, że synteza chemiczna jest przeprowadzana od 3' do 5', ale wszystkie sekwencje są pokazane w kanonicznej orientacji 5'-3' (tj. w tym schemacie przebiega od prawej do lewej). Sekwencje typu dzikiego w pozycjach mutagennych są pokazane na zielono, podczas gdy sekwencje mutagenne NNS są na czerwono. Podkreślono miejsce rozpoznawania SalI, które jest później wykorzystywane do wprowadzania mutacji w ESC. Wskazane są punkty etapów mieszania i rozdzielania (2 i 4). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Wykorzystanie unikalnych miejsc enzymów restrykcyjnych w mutagenezie ukierunkowanej na oligonukleotydy. Strategia wprowadzania mutacji jest pokazana na przykładzie budowy bibliotek A-C (patrz kroki 3.1–3.7). Przedruk z Czapinska et al.⁸ za zgodą Elsevier. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Rozszczepienie endonukleolityczne w translacji transkrypcji in vitro. (A) Rozszczepienie badanego substratu w optymalnym buforze REazy: 1) Substrat, produkt PCR 612 pz z pojedynczym miejscem rozpoznawania NlaIV; 2) Produkty rozszczepienia, 355 pz i 257 pz. (B) Rozszczepienie w reakcji transkrypcji-translacji in vitro (zawierające 0,5 μg ESC): 1–2) 15 μl podwielokrotności translacji transkrypcji in vitro bez substratu (linia 2: reakcja uzupełniona 1,5 mM MgCl₂); 3–4) 15 μl podwielokrotności translacji transkrypcji in vitro z 1 μg badanego substratu; (linia 4: reakcja uzupełniona 1,5 mM MgCl₂). Marker wielkości S-DNA (pBR322 trawiony przez MspI). Próbki zostały rozwiązane w 6% natywnej PAGE. DNA barwiono bromkiem etydyny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Produkty pierwszego PCR w cyklu selekcji. Patrz rysunek 1B, krok III; Krok 5.10 protokołu. Zestawy kolumn 1 i 2 są podwielokrotnościami dwóch różnych bibliotek załadowanych w trzech egzemplarzach. Wzorzec wielkości S-DNA (lambda DNA trawione za pomocą HindIII i EcoRI). Strzałka wskazuje położenie pełnowymiarowego ESC (1 050 pz). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 7: Warianty NlaIV oczyszczone do dalszych badań przesiewowych w skali mini. Patrz krok 6.3.11. Każdy wiersz zawiera 10 μl podwielokrotności innego wariantu. Wzorzec masy cząsteczkowej białka S. Masa cząsteczkowa podjednostki REazy NaIV wynosi 29.9 kDa. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 8: Przykłady badań przesiewowych wariantów NlaIV pod kątem zmiany specyficzności sekwencji. Patrz krok 6.4.2. (A) Udane badania przesiewowe z dużą częstotliwością obiecujących wariantów. S = marker wielkości DNA, lambda DNA rozszczepione za pomocą HindIII i EcoRI; typ dziki (wt) = DNA lambda rozszczepione dzikim typem NlaIV; λ = substrat DNA lambda, nierozszczepiony; inne kolumny=warianty o bardzo niskiej aktywności. Warianty są oznaczone jako ! = obiecujące warianty, które wytwarzają wzór rozszczepienia odmienny od enzymu typu dzikiego; ? = warianty, które również mogą mieć zmienione preferencje sekwencji. (B) Nieudane badania przesiewowe, przy czym większość wariantów jest nieaktywna, a jeden wariant wydaje się niezmieniony w stosunku do rozkładu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Alternatywny wybór przez podwiązanie. Ta alternatywa może być używana dla wszystkich REaz generujących lepkie końce. Poniżej przedstawiamy przykładowy protokół dla schematu selekcji dla enzymu MwoI (niepublikowany). I) Wybrana sekwencja (znajdująca się na prawym końcu ESC) ze zdefiniowanymi resztami pokazanymi na czerwono i wybraną odmianą sekwencji pokrewnej pokazaną na niebiesko. W nawiasach poniżej pokazana jest licznik wybrana sekwencja, która ma być umieszczona po lewej stronie ESC; II) Produkt rozszczepienia MwoI; III) Po zakończeniu transkrypcji/translacji in vitro produkty są oczyszczane, a ligacja jest wykonywana z nadmiarem adaptera. W podwiązaniu mogą uczestniczyć tylko produkty rozszczepienia, które zostały rozszczepione w wybranej sekwencji. W związku z tym nieaktywne warianty są eliminowane, a krok rozwijany jest niepotrzebny. Produkt rozszczepienia w sekwencji wybranej przez licznik (na lewym końcu ESC, nie pokazano) nie może uczestniczyć w tej ligacji, ponieważ wystający koniec adaptera nie jest komplementarny do sekwencji wybranej przez licznik; IV) Selektywny PCR wykorzystuje tę samą strategię, co w głównym protokole, w celu wyeliminowania wariantów o specyficzności sekwencji zdegenerowanej typu dzikiego (starter F1 wiążący się dystalnie z przeciw wybranemu miejscu), podczas gdy nieaktywne warianty są eliminowane przez selektywny starter odwrotny, który nie może związać się z nienaruszonym (a zatem nie zmodyfikowanym przez ligację adaptera) prawym końcem. W następnym cyklu proces ten można powtórzyć przy użyciu adaptera, który jest identyczny z produktem rozszczepienia w poprzednim kroku (tj. "kaseta rozszczepiona" w panelu III) i odpowiedniego selektywnego startera odwrotnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Podkłady używane w inżynierii NlaIV. Sekwencje miejsc objętych ograniczeniami wymienionych w komentarzach są podkreślone. Małe litery oznaczają sekwencje, które nie mają dopełnień w matrycach DNA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić tę tabelę (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Tabela 2: Warunki reakcji PCR, które mają być użyte w protokole. T_m = temperatura topnienia podkładu (jeśli T_m jest różne dla podkładów, należy użyć niższego T_m). Kliknij tutaj, aby wyświetlić tę tabelę (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Tabela 3: Wyniki kontroli jakości dwóch mutagennych starterów zsyntetyzowanych za pomocą strategii split-and-mix. Mutagenizowane kodony są oznaczone symbolem [XXX]. Niższy numer indeksu wskazuje pozycję zakodowanego aminokwasu. Na podstawie Czapinska et al.⁸ za zgodą Elsevier. Kliknij tutaj, aby wyświetlić tę tabelę (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Tabela 4: Wyniki EP-PCR. Główne parametry uzyskane z analizy sekwencji 22 klonów ECS. Kliknij tutaj, aby wyświetlić tę tabelę (kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Dyskusja

Opisany tutaj protokół selekcji został przetestowany dla NlaIV⁸, dimerycznej sekwencji rozpoznawania fałd PD-(D / E)XK, która rozpoznaje palindromiczne miejsce docelowe z centralnymi zasadami NN i katalizuje cięcie końca między zasadami NN. NlaIV został wybrany, ponieważ rozszczepienie między zasadami NN sugeruje, że zasady te są zbliżone do białka w kompleksie. Zasadniczo protokół może być stosowany do dowolnej endonukleazy restrykcyjnej specyficznej dla sekwencji, monomerycznej lub dimerycznej, dowolnej grupy fałdowej, katalizującej pęknięcia dwuniciowe dowolnego zataczania, niezależnie od tego, czy domeny katalityczne i specyficzności pokrywają się (jak w przykładzie NlaIV), czy są oddzielne (np. FokI). Co więcej, protokół ten jest w zasadzie przydatny nie tylko do generowania nowej, węższej specyficzności enzymatycznej, ale może być również wykorzystany do eliminacji aktywności gwiazd lub do tworzenia endonukleaz o wysokiej wierności. Jednak wszystko to nie zostało jeszcze przetestowane. W szczególności celowana eliminacja aktywności gwiazdy może być skomplikowana, ponieważ te same reszty aminokwasowe mogą być zaangażowane w wiązanie się z pożądanymi i niepożądanymi zasadami. Etapy in vitro opisane w niniejszym protokole nie ograniczają się do wyboru zawężonych swoistości, ale mogą być również wykorzystane do wybrania swoistości zmienionych w inny sposób. Istnieje jednak problem z endonukleazami wariantowymi: jeśli spektrum substratów obejmuje nowe cele, które nie zostały rozszczepione przez endonukleazę rodzicielską, na ogół nie ma dobrego sposobu ochrony komórek przed szkodliwymi skutkami tej aktywności. W przeciwieństwie do tego, jeśli swoistość endonukleazy jest tylko zawężona, cele są podzbiorem celów typu dzikiego, a zatem już dostępna pokrewna metylotransferaza powinna być w pełni ochronna.

Nasz protokół różni się pod kilkoma względami od wielu protokołów ukierunkowanej ewolucji. Różnorodność otwartych ramek odczytu jest generowana raz na początku eksperymentu, a nie w każdej iteracji. Co więcej, jest tworzony w procesie syntezy typu split-and-mix, a nie przez EP-PCR. Dla podstawień NNS kodonów, użytych w tej pracy, istnieje (4 x 4 x 2)⁶ ~ 1,07 x 10⁹ kombinacji dla sześciu pozycji. W związku z tym każdy wariant występuje średnio raz na 1,7 mola ESC. Zdolność tę można zwiększyć do siedmiu pozycji, stosując syntezę z mieszaniną 20 prekursorów trinukleotydów, która jest oferowana przez Glen Research lub zmniejszając częstotliwość mutacji w mniej obiecujących pozycjach za pomocą syntezy oligonukleotydów typu split-and-mix. Jeśli to możliwe, zaleca się ograniczenie zakresu zmienności do sześciu pozycji. Oczywiście, takie ukierunkowanie na mutagenezę wymaga pewnej istniejącej wcześniej wiedzy na temat przynajmniej regionów REazy zaangażowanych w wiązanie substratu. Protokół split-and-mix do generowania różnorodności ma wyraźne zalety w porównaniu z EP-PCR. Za pomocą EP-PCR uzyskaliśmy niezmienione warianty i sekwencje niosące osiem podstawień dla ESC NlaIV w tym samym EP-PCR (Tabela 4). Biblioteka z EP-PCR zawiera znaczną część klonów, których należy unikać (sekwencje typu dzikiego, wielokrotne podstawienia, mutacje z przesunięciem ramki i nonsensem oraz mutacje w miejscach, w których jest mało prawdopodobne, aby wpływały na specyficzność sekwencji).

Nasz protokół różni się również od wielu innych protokołów ukierunkowanej ewolucji obecnością dwóch sekwencyjnych etapów selekcji. Selekcja pozytywna zapewnia, że pożądana aktywność zostanie zachowana, w przeciwnym razie znacznik biotyny nie zostanie usunięty, a sekwencję kodującą można usunąć przez pociągnięcie w dół. Jest technicznie możliwe, że przypadkowe pojawienie się nowej, nienakładającej się na siebie specyficzności (np. GCATGC) może również prowadzić do zerwania znacznika biotyny, jeśli odpowiednie miejsce rozszczepienia jest obecne w pobliżu pożądanego rozszczepienia, ale nie gdzie indziej. Powinno to być jednak bardzo mało prawdopodobne. Selekcja ujemna usuwa otwarte ramki odczytu, które kodują enzymy, które nadal mają niepożądaną aktywność. Ten krok nie jest ściśle obowiązkowy, ponieważ protokół nadal wzbogaci bibliotekę wyjściową o warianty, które są w stanie rozszczepić sekwencję wyboru, ale nie są w stanie rozszczepić w innym miejscu ESC, co czyni ją nieodpowiednią do amplifikacji PCR. Oczekuje się jednak, że skuteczność selekcji będzie niższa, ponieważ enzymy o pierwotnej specyficzności sekwencji nie zostaną usunięte z wyników i będą konkurować z obiecującymi wariantami o zmienionej specyficzności, ale także zmniejszonej aktywności enzymatycznej. Należy zauważyć, że na poziomie populacji zarówno pożądane, jak i niepożądane sekwencje docelowe mogą, ale nie muszą, ulegać degeneracji. W przykładzie NlaIV anty-cel był zdegenerowany, a cel nie-zdegenerowany. Nawet jeśli występuje degeneracja na poziomie populacji, w pojedynczej kropli obecny jest tylko jeden (niezdegenerowany) cel lub anty-cel. W naszym protokole sekwencje docelowe i anty-docelowe są ponownie wprowadzane przy każdym powtórzeniu kroków selekcji. W związku z tym, otwarta ramka odczytu musi kodować enzym zdolny do rozszczepienia wszystkich możliwych celów i niezdolny do rozszczepienia żadnego z anty-celów, aby przetrwać wiele rund selekcji. Zwróć uwagę, że konieczność ponownego wprowadzenia celu antyselekcji w każdej iteracji protokołu wymusza dwa sekwencyjne PCR. Pierwszy PCR wykorzystuje starter, który wyżarza się na zewnątrz anty-celu, dzięki czemu rozszczepienie anty-celu zapobiega reakcji PCR. Drugi PCR wymaga startera, który wykracza poza anty-cel i ponownie wprowadza anty-cel, aby upewnić się, że podczas wielu rund selekcji każda otwarta ramka odczytu jest testowana pod kątem wszystkich wariantów anty-celu.

W przypadku enzymów, które generują lepkie końce, można zastosować powiązany alternatywny protokół oparty na wcześniej opisanej metodzie izolacji REazy^{ORF 10} . Zubożenie nieaktywnych wariantów przez wychwytywanie biotyny, które jest stosowane w naszych eksperymentach, jest zastępowane w alternatywnym protokole przez ligację kompatybilnego adaptera z sekwencją, która jest używana jako miejsce wiązania startera w selektywnym PCR (Figura 9). Tylko ESC, które wytwarzają enzymy o wybranej specyficzności, generują końce zdolne do ligacji i dlatego zostaną wybrane. Sekwencja lepkiego końca licznika ewybranej sekwencji musi być zaprojektowana w taki sposób, aby nie mogła uczestniczyć w podwiązywaniu za pomocą adapterów. Iterację procesu selekcji można łatwo osiągnąć, przełączając się między dwoma różnymi adapterami, a co za tym idzie, dwoma różnymi odwróconymi starterami w selektywnym PCR.

Nawet przy nowych protokołach zadanie opracowania nowych specyfików in vitro jest nadal bardzo trudne. W przypadku typowych REaz typu II specyficzność sekwencji i aktywność endonukleolityczna zależą od tych samych regionów białka. Dlatego trudno jest zmienić jedno bez wpływu na drugie. Sukces jest bardziej prawdopodobny dzięki strategii, która bierze pod uwagę ślad enzymu, szanuje symetrię interakcji białko-DNA i opiera się na istniejących wcześniej preferencjach enzymatycznych, które powinny być określone z góry w eksperymentach biochemicznych, tak jak to miało miejsce w przypadku przykładu^{NlaIV 8}.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1000Å Obsługa CPG (dA, dT, dC, dG)	Biosset	45-1000-050	Można również użyć innych dostawców
ASM-800 DNA/RNA	Biosset	800-001-000
Zestaw do ekstrakcji żelu GeneJET	Thermo Scientific	K0691	Można użyć dowolnego innego zestawu
Wkład oczyszczający DNA Glen-Pak	Glen Research	60-5200
HIS-Select Żel powinowactwa do niklu	Sigma	P6611
		pET 28a	Zamiast tego można użyć dowolnego innego wektora z promotorem T7 przed miejscem klonowania
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Scientific	F530S	Zamiast tego można użyć dowolnego innego termofilnego polimetru o wysokiej wierności i wysokiej jakości
Porowata folia	stalowa Biosset	40-063
System szybkiego tłumaczenia RTS 100, E.coli HY Zestaw	Roche	3 186 148
Endonukleazy restrykcyjne	Thermo Scientific		Oczywiście można stosować innych dostawców, enzymy Kulki
magnetyczne Streptawidyny	New England Biolabs	S1420S	Można również użyć innych dostawców. Pozytywnie przetestowaliśmy złoża chemiczne Sigma
Synthesis, w tym fosforamidy,	Carl Roth		Można również użyć innych dostawców:
Kolumny syntezy (różne rozmiary)	Biosset
T4, ligaza DNA	Thermo Scientific	EL0011	Można użyć dowolnej innej ligazy