Metoda kohodowli do badania przerostu neurytów w odpowiedzi na sygnały parakrynne miazgi zębowej

Podsumowanie

Opisujemy izolację, dyspersję i powlekanie komórek pierwotnych miazgi zębowej (DP) z neuronami trójdzielnymi (TG) hodowanymi na nałożonych na nich filtrach transwell. Odpowiedzi komórkowe komórek DP można analizować za pomocą immunofluorescencji lub analizy RNA/białka. Immunofluorescencja markerów neuronalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej pozwala na analizę odpowiedzi na przerost neurytów.

Streszczenie

Unerwienie zębów pozwala zębom wyczuwać ciśnienie, temperaturę i stan zapalny, które są kluczowe dla użytkowania i utrzymania narządu zęba. Bez unerwienia czuciowego codzienne czynności oralne spowodowałyby nieodwracalne uszkodzenia. Pomimo swojego znaczenia, rola unerwienia w rozwoju i utrzymaniu zębów została w dużej mierze przeoczona. Kilka badań wykazało, że komórki DP wydzielają białka macierzy zewnątrzkomórkowej i sygnały parakrynne, aby przyciągać i kierować aksony TG do zęba i przez niego. Jednak niewiele badań dostarczyło szczegółowych informacji na temat wzajemnych oddziaływań między mezenchymą DP a neuronalnymi aferentami. Aby wypełnić tę lukę w wiedzy, naukowcy zaczęli wykorzystywać współkultury i różne techniki do badania tych interakcji. Tutaj pokazujemy wiele etapów związanych ze współhodowlą pierwotnych komórek DP z neuronami TG rozproszonymi na leżącym nad nim filtrze transwell z porami o dużej średnicy, aby umożliwić wzrost aksonów przez pory. Pierwotne komórki DP z genem będącym przedmiotem zainteresowania otoczonym miejscami loxP wykorzystano w celu ułatwienia delecji genu przy użyciu systemu rekombinazy Adenovirus-Cre-GFP. Wykorzystanie neuronów TG z myszy Thy1-YFP pozwoliło na precyzyjne obrazowanie aferentne, z ekspresją znacznie przekraczającą poziomy tła za pomocą mikroskopii konfokalnej. Odpowiedzi DP można badać poprzez zbieranie i analizę białek lub RNA, lub alternatywnie, poprzez barwienie immunofluorescencyjne komórek DP podanych na usuwalnych szklanych szkiełkach nakrywkowych. Pożywki można analizować przy użyciu technik takich jak analizy proteomiczne, chociaż będzie to wymagało wyczerpania albuminy ze względu na obecność płodowej surowicy bydlęcej w pożywce. Protokół ten zapewnia prostą metodę, którą można manipulować w celu zbadania morfologicznych, genetycznych i cytoszkieletowych odpowiedzi neuronów TG i komórek DP w odpowiedzi na kontrolowane środowisko testu kohodowlanego.

Wprowadzenie

Unerwienie zębów pozwala zębom wyczuwać ciśnienie, temperaturę i stan zapalny, które są kluczowe dla użytkowania i utrzymania narządu zęba. Brak wyczucia bólu zęba związanego z próchnicą i urazem prowadzi do postępu choroby. Tak więc prawidłowe unerwienie jest warunkiem prawidłowego wzrostu, funkcjonowania i pielęgnacji zębów.

Podczas gdy większość organów jest w pełni funkcjonalna i unerwiona w momencie narodzin, rozwój zębów trwa do dorosłego życia, a unerwienie i mineralizacja zębów następują jednocześnie w okresie poporodowym^1,2. Co ciekawe, mezenchyma miazgi zębowej (DP) począt....

Protokół

Wszystkie eksperymenty z udziałem myszy zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) UAB.

1. Przygotowanie płytek

UWAGA: Do obrazowania komórek DP na koniec analizy można użyć szkiełek nakrywek. Należy upewnić się, że pokrywa płytki jest zamknięta podczas wszystkich etapów inkubacji i płukania poza sterylną komorą do hodowli tkanek, aby zapobiec kontaminacji podczas przetwarzania próbek.

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych
   1. Autoklawować okrągłe szkiełka nakrywkowe.
   2. Przefiltrować wodę ultrapure w komorze z laminar....

Wyniki

Wyniki te pokazują, że wzrost neurytów TG był zwiększony w obecności pierwotnych komórek DP w dolnej studzience w porównaniu z kontrolą w postaci monokultury neurytów TG (Rycina 2A,C). Występuje pewna zmienność w obrębie poszczególnych testów w zakresie wzrostu neurytów. Dlatego w każdym teście należy uwzględnić monokulturę neuronów TG jako kontrolę w celu wykrycia podstawowych poziomów wzrostu neurytów. W niniejszym protokole wykorzystano pierwotne komórki myszy Tgfbr2^.......

Dyskusja

Codzienne czynności w jamie ustnej wymagają, aby zęby wyczuwały bodźce zewnętrzne i wewnętrzne stany zapalne, aby umożliwić prawidłowe użytkowanie i konserwację. Jednak dostępne są tylko ograniczone informacje na temat sygnałów, które kierują procesami rozwojowymi unerwienia zębów. Protokół ten zapewnia metodę izolacji i wspólnej hodowli pierwotnych komórek DP i neuronów TG w celu zbadania wzajemnej komunikacji między tymi dwiema populacjami. Kilka zmiennych zostało zoptymalizowanych i pozostawia otwarte dalsze ścieżki b.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5-Fluoro-2'-deoksyurydyna	Sigma-Aldrich	F0503	Stosowany jako inhibitor mitotyczny w 15 μ Stężenie M w pożywkach do kohodowli, Dzień 2
24 Płytka do hodowli komórkowych Well Corning		3524	Płytka do wspólnej hodowli
Alexa-546 anty-kurczak	Invitrogen	A-11040	Wtórne do wyrostu neurytów barwnikowych znakowanych przeciwciałem anty-GFP, rozcieńczenie 1:500
Przeciwciało anty-GFP	Aves Lab, Inc	GFP-1010	Pierwszorzędowe przeciwciało do znakowania neuronów Thy1-YFP, rozcieńczenie 1:200
Anty-Neurofilament 200 przeciwciało	Sigma-Aldrich	NO142	Monoklonalne przeciwciało pierwszorzędowe do znakowania neuronów, rozcieńczenie 1:1000, alternatywa, jeśli myszy YFP nie są dostępne
B6; 129- Tgfbr2tm1Karl/J	Jackson Laboratory	12603	Tgfbr2f/f model myszy używany do komórek miazgi zębowej w zoptymalizowanym protokole
B6. Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J	Laboratorium Jacksona	3709	Genotyp mysiego modelu Thy1-YFP stosowany do neuronów trójdzielnych
Kolagenaza typu II	Milipory	234155-100MG	Służy do dyspersji neuronów trójdzielnych
Surowica bydlęca	płodu Gibco	10437	Dodatek do pożywek do kohodowli
Cienkie kleszcze	Fine Science Tools	11413-11	Cienkie kleszcze do rozwarstwiania TG
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Powleka wkładki transwell w końcowym stężeniu 10 μ g/ml, przyjmuje się, że roztwór podstawowy ma 1,5 mg/ml
Bufor do lizy (bufor RLT)	Qiagen	79216	Ekstrakty RNA z komórek miazgi zęba po kokulturze
L-glutamina	Gibco	25030081	Dodatek do pożywek do
mikrohodowli Nożyczki do mikropreparacji	Sigma-Aldrich	S3146-1EA	Nożyczki preparacyjne do otwierania czaszki
Szkło osłonowe mikroskopu	Fisherbrand	12-545-81	Okrągłe szkiełko nakrywkowe do opcjonalnego hodowli komórek i przetwarzania immunofluorescencyjnego
Minimalna niezbędna pożywka a	Gibco	12571063	Baza pożywki do wspólnej hodowli
Penicylina-Streptomycyna	Gibco	15070063	Dodatek antybiotykowy do pożywek kokulturowych
Inhibitor fosfatazy	Sigma-Aldrich	04 906 837 001	Dodatek do RIPA Bufor do ekstrakcji białka z komórek miazgi zęba po kokultura
Polybrene	Millipore	TR-1003-G	Stosowany do pomocy w transfekcji komórek miazgi zębowej
Poli-D-Lizyna	Sigma-Aldrich	P7280	Powłoka nakrywkowa wspomagająca adhezję komórkową miazgi zębowej
Inhibitory proteazy	Millipore	05 892 791 001	Dodatek do buforu RIPA do ekstrakcji białka z komórek miazgi zęba po kokulturze
RNAz/DNAzy wolnych od RNAzy / DNAzy probówek eppendorfa	Denville	C-2172	Wstępnie sterylizowane probówki o pojemności 1,7 ml do pobierania RNA, DNA lub białka na końcu testu
Wkładka do hodowli komórkowych ThinCert Wkładki	Greiner Bio-One	662631	Transwell do neuronów trójdzielnych w testach kohodowlanych
Trypsyna-EDTA (0,25%)	Gibco	25200056	Używany do dyspersji komórek miazgi zębowej
Trypsyna Typ II	Sigma-Aldrich	T-7409	Służy do dyspersji neurony trójdzielne
Ultra cienkie kleszcze	Fine Science Tools	11370-40	Ultra cienkie kleszcze do preparacji
Uridine	Sigma-Aldrich	U3750	Stosowany jako inhibitor mitotyczny w 1 μ Stężenie M w pożywkach do kohodowli,
system filtracji próżniowej	Millipore	SCNY00060	Filtr jednorazowy Steriflip, 50 μ m Filtr z siatki nylonowej
Kleszczyki do fiolek	Fine Science Tools	110006-15	Długie kleszcze do przenoszenia tkanek na stożkowe

dnia 2