Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Metoda kohodowli do badania przerostu neurytów w odpowiedzi na sygnały parakrynne miazgi zębowej

6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60809

⸱

14 lutego 2020

 ,  , 
1Cell, Developmental and Integrative Biology Department, University of Alabama at Birmingham

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy izolację, dyspersję i powlekanie komórek pierwotnych miazgi zębowej (DP) z neuronami trójdzielnymi (TG) hodowanymi na nałożonych na nich filtrach transwell. Odpowiedzi komórkowe komórek DP można analizować za pomocą immunofluorescencji lub analizy RNA/białka. Immunofluorescencja markerów neuronalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej pozwala na analizę odpowiedzi na przerost neurytów.

Streszczenie

Unerwienie zębów pozwala zębom wyczuwać ciśnienie, temperaturę i stan zapalny, które są kluczowe dla użytkowania i utrzymania narządu zęba. Bez unerwienia czuciowego codzienne czynności oralne spowodowałyby nieodwracalne uszkodzenia. Pomimo swojego znaczenia, rola unerwienia w rozwoju i utrzymaniu zębów została w dużej mierze przeoczona. Kilka badań wykazało, że komórki DP wydzielają białka macierzy zewnątrzkomórkowej i sygnały parakrynne, aby przyciągać i kierować aksony TG do zęba i przez niego. Jednak niewiele badań dostarczyło szczegółowych informacji na temat wzajemnych oddziaływań między mezenchymą DP a neuronalnymi aferentami. Aby wypełnić tę lukę w wiedzy, naukowcy zaczęli wykorzystywać współkultury i różne techniki do badania tych interakcji. Tutaj pokazujemy wiele etapów związanych ze współhodowlą pierwotnych komórek DP z neuronami TG rozproszonymi na leżącym nad nim filtrze transwell z porami o dużej średnicy, aby umożliwić wzrost aksonów przez pory. Pierwotne komórki DP z genem będącym przedmiotem zainteresowania otoczonym miejscami loxP wykorzystano w celu ułatwienia delecji genu przy użyciu systemu rekombinazy Adenovirus-Cre-GFP. Wykorzystanie neuronów TG z myszy Thy1-YFP pozwoliło na precyzyjne obrazowanie aferentne, z ekspresją znacznie przekraczającą poziomy tła za pomocą mikroskopii konfokalnej. Odpowiedzi DP można badać poprzez zbieranie i analizę białek lub RNA, lub alternatywnie, poprzez barwienie immunofluorescencyjne komórek DP podanych na usuwalnych szklanych szkiełkach nakrywkowych. Pożywki można analizować przy użyciu technik takich jak analizy proteomiczne, chociaż będzie to wymagało wyczerpania albuminy ze względu na obecność płodowej surowicy bydlęcej w pożywce. Protokół ten zapewnia prostą metodę, którą można manipulować w celu zbadania morfologicznych, genetycznych i cytoszkieletowych odpowiedzi neuronów TG i komórek DP w odpowiedzi na kontrolowane środowisko testu kohodowlanego.

Wprowadzenie

Unerwienie zębów pozwala zębom wyczuwać ciśnienie, temperaturę i stan zapalny, które są kluczowe dla użytkowania i utrzymania narządu zęba. Brak wyczucia bólu zęba związanego z próchnicą i urazem prowadzi do postępu choroby. Tak więc prawidłowe unerwienie jest warunkiem prawidłowego wzrostu, funkcjonowania i pielęgnacji zębów.

Podczas gdy większość organów jest w pełni funkcjonalna i unerwiona w momencie narodzin, rozwój zębów trwa do dorosłego życia, a unerwienie i mineralizacja zębów następują jednocześnie w okresie poporodowym1,2. Co ciekawe, mezenchyma miazgi zębowej (DP) początkowo wydziela sygnały odstraszające podczas embriogenezy, aby zapobiec przedostawaniu się aksonów do rozwijającego się narządu zęba, który później przechodzi do wydzielania czynników wabiących, gdy ząb zbliża się do wyrzynania3,4. W stadiach pourodzeniowych aksony aferentne z nerwu trójdzielnego (TG) wnikają do zęba i przez niego w czasie, gdy zaczyna się odkładanie zębiny (recenzja w Pagella, P. et al.5). Kilka badań in vivo wykazało, że interakcje neuronalno-mezenchymalne kierują unerwieniem zębów u myszy (recenzja w Luukko, K. et al.6), ale dostępnych jest niewiele szczegółów na temat mechanizmów molekularnych.

Współhodowle komórek zapewniają kontrolowane środowisko, w którym badacze mogą manipulować interakcjami między populacjami neuronalnymi i mezenchymalnymi. Eksperymenty z kokulturą umożliwiają głębsze zagłębienie się w szlaki sygnałowe kierujące unerwieniem i rozwojem zębów. Jednak kilka konwencjonalnych metod stosowanych do badania komórek w kokulturze stanowi wyzwanie techniczne. Na przykład, barwienie fioletem krystalicznym wyrostu neurytów może niespecyficznie zabarwić komórki Schwanna zawarte w dyspersjach wiązek TG i mogą występować szczyty intensywności koloru przy stosunkowo małych reakcjach7. Komory mikroprzepływowe stanowią atrakcyjną opcję, ale są znacznie droższe niż filtry transwellowe8,9 i pozwalają jedynie na badanie odpowiedzi neuronów na wydzieliny DP. Aby rozwiązać te problemy, opracowaliśmy protokół, który pozwala na: a) precyzyjne barwienie i obrazowanie wyrostu neurytów TG w odpowiedzi na wydzieliny DP, b) modyfikację genetyczną komórek DP i/lub neuronów TG w celu zbadania specyficznych szlaków sygnałowych oraz c) badanie odpowiedzi komórek DP na czynniki wydzielane przez neurony TG. Protokół ten zapewnia możliwość precyzyjnego zbadania kilku cech unerwienia zębów w kontrolowanym środowisku testu kohodowli in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z udziałem myszy zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (IACUC) UAB.

1. Przygotowanie płytek

UWAGA: Do obrazowania komórek DP na koniec analizy można użyć szkiełek nakrywek. Należy upewnić się, że pokrywa płytki jest zamknięta podczas wszystkich etapów inkubacji i płukania poza sterylną komorą do hodowli tkanek, aby zapobiec kontaminacji podczas przetwarzania próbek.

  1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych
    1. Autoklawować okrągłe szkiełka nakrywkowe.
    2. Przefiltrować wodę ultrapure w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
    3. Przenieść szkiełka nakrywkowe do płytki 24-dołkowej i pokryć każde z nich 400 μL roztworu poly-D-lysine o stężeniu 0,1 mg/mL.
    4. Pozostawić szkiełka do namoczenia na 5 min na kołysarce przy 12 rpm lub wytrząsarce orbitalnej przy 40-50 rpm. Należy upewnić się, że pokrywa jest zamknięta, aby zapobiec kontaminacji.
    5. Płukać szkiełka nakrywkowe przefiltrowaną wodą ultrapure przez około 5 min na kołysarce przy 12 rpm lub wytrząsarce przy 50 rpm. Powtórzyć czynność.
    6. Pozostawić szkiełka do wyschnięcia na co najmniej 2 h w komorze z laminarnym przepływem powietrza przy zdjętej pokrywie płytki, aby ułatwić odparowanie. Szkiełka nakrywkowe należy wykorzystać w ciągu 48 h.
    7. Wysiać komórki DP na szkiełka nakrywkowe i przetworzyć pod koniec analizy do immunofluorescencji (sekcja 3.3).
  2. Powlekanie filtrów
    1. Rozcieńczyć lamininę do stężenia 10 μg/mL. Przefiltrować rozcieńczoną lamininę w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
    2. Pipetować 450-500 μL lamininy o stężeniu 10 μg/mL do każdego dołka płytki 24-dołkowej.
    3. Umieścić filtr transwell o porowatości 3 μm w dołku w taki sposób, aby stykał się z roztworem lamininy, i pozostawić w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 2 h lub przez noc. Pory filtra powinny umożliwić dyfuzję części roztworu i powleczenie zarówno górnej, jak i dolnej strony filtra. Filtry należy wykorzystać w ciągu 48 h lub przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C do 1 tygodnia.

2. Wysiew komórek z opcjonalną manipulacją genetyczną

  1. Myszy: W celu zbadania interakcji mezenchymalno-neuronalnych można przeprowadzić modyfikację genetyczną komórek DP (choć nie jest ona wymagana). Sugerowane warianty genetyczne opisano w sekcjach 2.3 i 2.4.
  2. Disekcja, dyspersja i wysiew DP (Rycina 1)
    UWAGA: Do disekcji DP należy używać ultraprecyzyjnych pęset o prostych krawędziach. Ultraprecyzyjne krawędzie pozwolą użytkownikowi wsunąć końcówkę pęsety między strukturę zmineralizowaną a tkankę DP.
    1. Pobrać myszy w wieku P5-P8. Na tym etapie zęby powinny ulegać mineralizacji, a korzeń pozostaje otwarty.
    2. Zanestezjować noworodki poprzez hipotermię, umieszczając je w naczyniu w lodówce w temperaturze 4 °C do czasu, aż przestaną się poruszać lub reagować na dotyk. Uśmiercić noworodki poprzez dekapitację zgodnie z procedurami IACUC w wyznaczonym ośrodku.
    3. Przygotować w probówce stożkowej 50 mL alikwot 3-5 mL 0,25% trypsyny-EDTA do pobrania DP od każdej myszy. Ułatwi to trawienie miazgi zębowej myszy postnatalnych. W przypadku trawienia tkanek od więcej niż 10 myszy postnatalnych należy użyć więcej niż 3 mL.
    4. Umieścić głowę na jednorazowej podkładce tak, aby pysk był skierowany do góry, a podstawa szyi płasko przylegała do powierzchni roboczej. Używając żyletki ruchami piłującymi, oddzielić żuchwę od szczęki.
    5. Opcjonalnie usunąć język za pomocą nożyczek lub pęsety, aby ułatwić dostęp do trzonowców.
    6. Umieścić otwartą głowę w naczyniu na sterylnej gazie i poddać badaniu pod mikroskopem dissectingowym (Rycina 1D).
    7. Usunąć tkankę kości jamistej otaczającą pierwsze trzonowce. Zęby dolne nie są w tym momencie w pełni wyrżnięte. Wsunąć pęsetę w otwór jamisty i odsunąć tkankę od zęba w stronę policzka (strona boczna) lub języka (strona językowa). W przypadku zębów górnych wymagane będzie całkowite usunięcie wcięcia wokół zęba, aby go odsłonić i wyekstrahować.
    8. Ostrożnie przenieść pierwsze trzonowce (M1) dolne i górne do oddzielnego naczynia do hodowli komórkowych z 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS).
    9. Powtarzać kroki 2.2.4-2.2.8, aż do zebrania wszystkich M1. Naczynie z M1 należy przechowywać w lodzie podczas pobierania.
    10. Usunąć zewnętrzny organ szkliwa (EOE) otaczający zewnętrzną część każdego M1. Można to zrobić alternatywnie po kroku 2.2.11.
    11. Za pomocą pęsety obrócić M1 tak, aby guzki były skierowane w dół, a otwarty korzeń był odsłonięty. Na spodzie zęba widoczny będzie owalny otwór oraz nieprzezroczysta tkanka DP zamknięta w cienkiej warstwie dentyny i szkliwa.
    12. Używając końcówki pęsety, delikatnie poluzować DP, prowadząc jedno ramię pęsety wzdłuż wewnętrznego obwodu zmineralizowanej tkanki. Wyjąć tkankę DP ze struktury zmineralizowanej i przenieść ją do trzeciego naczynia zawierającego 1x PBS. Usunąć EOE, jeśli nie zostało to zrobione wcześniej (Rycina 1E).
    13. Przenieść całą tkankę DP do 0,25% trypsyny-EDTA w probówce stożkowej 50 mL. Wymieszać mieszaninę na wirówce typu vortex i inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 10 min. Można to wykonać tą samą pęsetą lub długą pęsetą do probówek. Tkanka będzie trudna do rozproszenia i będzie wymagać mieszania w vortexie co 3-4 min. NIE przekraczać 10 min trypsynizacji, ponieważ trypsyna może uszkodzić błony komórkowe.
    14. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza dodać podgrzane medium do kokultury (Tabela 1) w końcowym stosunku co najmniej 1:1 (medium do trypsyny), aby inaktywować enzym. Wyższe proporcje są dopuszczalne, jeśli pożądana jest większa dyspersja tkanki.
    15. Wielokrotnie pipetować medium w górę i w dół za pomocą pipety 10 mL, aby dodatkowo rozproszyć DP w medium. Należy uważać, aby nie tworzyć dużych pęcherzyków powietrza. Pełna dyspersja jest niemal niemożliwa ze względu na lepkość tkanki. Nie jest ona jednak konieczna, ponieważ po wysiewie komórki będą migrować na zewnątrz z tkanki.
    16. Przenieść 1 mL zdyspergowanego DP do każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkanek (Rycina 1F).
    17. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i pozwolić komórkom przytwierdzić się oraz migrować z niedyspergowanej tkanki przez 48 h przed zmianą medium. Komórki pierwotne muszą być wysiewane w stosunkowo wysokich stężeniach, aby osiągnąć 85-90% konfluencji w ciągu 1 tygodnia. Jeśli nie zostanie to osiągnięte po tygodniu, należy zutylizować płytkę.
  3. Opcjonalna manipulacja genetyczna komórek DP
    1. Aby zmienić szlaki sygnalizacji komórkowej, pobrać komórki DP z myszy z nokautem genetycznym lub z myszy, w których interesujący gen jest flankowany przez miejsca loxP. W tym drugim przypadku gen można usunąć przy użyciu rekombinazy Adenowirus-Cre-GFP (Ad-Cre-GFP), aby wyciąć flankowany gen, jak opisano poniżej. Jako wirusa kontrolnego należy użyć Adenowirus-eGFP (Ad-eGFP), aby upewnić się, że infekcja wirusowa nie wywołuje odpowiedzi komórkowej.
      UWAGA: Ad-eGFP jest kontrolowany przez wzmacniacz promotora CMV, który jest bardzo silny. Ad-Cre-GFP jest regulowany przez IRES, wewnętrzny region regulacyjny między Cre a GFP, który nie jest zbyt silny. Skutkuje to silniejszą fluorescencją w komórkach Ad-eGFP niż w komórkach Ad-Cre-GFP. Równoważny poziom infekcji należy potwierdzić na podstawie całkowitej liczby komórek fluorescencyjnych, a nie na podstawie poziomu fluorescencji komórkowej.
    2. Przygotować dla każdego dołka 500 μL medium zawierającego wirusa i 10 μg/mL polybrene. Polybrene wspomaga infekcję wirusową w komórkach bliskich konfluencji10. Protokół ten opiera się na wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 100 dla Ad-eGFP i 200 dla Ad-Cre-GFP w celu wydajnej infekcji genetycznej przy niewielkim lub braku wpływu na żywotność komórek. Szacowana liczba komórek to 4 x 104 komórek/dołek w płytce 24-dołkowej:
      Wzór rozcieńczania wirusa do przygotowania medium, przedstawiony jako równanie dla zastosowań w hodowli komórkowej.
    3. Wymieszać medium krótkim mieszaniem w vortexie lub pipetowaniem i dodać 500 μL do każdego dołka.
    4. Po 24 h dodać dodatkowe 500 μL medium do kokultury, które nie zawiera dodatkowego polybrene ani wirusa.
    5. Po łącznie 48 h odessać medium zawierające wirusa i zastąpić je świeżym medium do kokultury. Na tym etapie na filtry transwell można dodać neurony TG.
  4. Disekcja, dyspersja i wysiew neuronów trójdzielnych
    UWAGA: W tym protokole obrazowanie wzrostu neurytów w kokulturze z komórkami DP zostało zoptymalizowane przy użyciu młodzieńczych (6-tygodniowych) myszy B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J. Ośrodkowy i obwodowy układ nerwowy myszy Thy1-YFP posiada znacznik żółtego białka fluorescencyjnego (YFP), którego ekspresja w neuronach rozpoczyna się około P6-P10 i wzrasta wykładniczo w całym układzie nerwowym w okresie postnatalnym i w życiu dorosłym11,12. YFP i GFP mają konserwowane sekwencje, które pozwalają na barwienie tych nerwów przeciwciałami anty-GFP, co skutkuje barwieniem pan-neuronalnym. Ostatecznie myszy te pozwalają na lepszą wizualizację i kwantyfikację neuronów wykorzystywanych i hodowanych w kulturze komórkowej.
    1. Uśmiercić młodziencze myszy za pomocą dwutlenku węgla, a następnie przeprowadzić zwichnięcie szyi.
    2. Zdekapitować myszy i usunąć skórę z czaszki. Należy zapewnić równą liczbę samców i samic.
    3. Wsunąć końcówkę mikro-nożyczek do disekcji w podstawę czaszki. Przeciąć wzdłuż szwu strzałkowego czaszki (Rycina 1A).
    4. Wykonać cztery małe cięcia poziome: dwa wzdłuż szwów wieńcowych przy uszach i dwa wzdłuż szwów jagodowych u podstawy czaszki. Powinno to stworzyć dwie płaty kości.
    5. Za pomocą pęsety odchylić dwa płaty kości. Powinno to odsłonić mózg.
    6. Usunąć mózg. Przenieść głowę do naczynia do hodowli tkanek z 1x PBS i umieścić pod mikroskopem.
    7. Zlokalizować zwoje TG, które są łatwo widoczne u gryzoni13, znajdujące się w oponie twardej między mózgiem a kością wyrostka szczękowego (Rycina 1B).
    8. Przeciąć trzy gałęzie biegnące do oczu, szczęki i żuchwy, a następnie przenieść zwoje do zimnego 1x PBS za pomocą precyzyjnych pęset o prostych krawędziach. Naczynie zawierające zwoje TG należy przechowywać w lodzie podczas pobierania.
    9. Po zebraniu wszystkich pęczków TG, przenieść zwoje do probówki stożkowej 50 mL zawierającej 5 mg/mL sterylnie filtrowanej kolagenazy typu II za pomocą pęsety do probówek.
    10. Wymieszać kolagenazę z pęczkiem TG w vortexie i umieścić probówkę w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C na 25-30 min. W tym czasie należy wyjmować probówkę stożkową z łaźni wodnej, mieszać w vortexie i ponownie umieszczać w łaźni co 5-10 min.
    11. Wirować roztwór kolagenazy z neuronami TG przez 2 min przy 643 x g.
    12. W komorze do hodowli tkanek delikatnie odessać kolagenazę za pomocą mikropipety.
    13. Dodać 5 mL 1% sterylnie filtrowanej trypsyny typu II i wymieszać w vortexie. Umieścić probówkę stożkową w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C na 5 min.
    14. Wirować mieszaninę trypsyny i TG przez 5 min przy 643 x g. Usunąć górną część trypsyny za pomocą mikropipety w taki sposób, aby nie usunąć neuronów TG. W probówce nadal pozostanie ciecz.
    15. Dodać odpowiednią ilość medium, aby zneutralizować pozostałą trypsynę (w stosunku trypsyny do medium 1:1 lub niższym).
    16. Policzyć liczbę komórek i rozcieńczyć roztwór do stężenia 200 000 komórek/mL (250 μL zawierających 50 000 komórek).
    17. Umieścić powlekane filtry transwell z sekcji 1.2 w dołkach z DP.
    18. Rozcieńczyć roztwór z komórkami tak, aby uzyskać stężenie 200 000 komórek/mL. Nanieść 250 μL na filtr transwell i hodować komórki w temperaturze 37 °C przez noc (Rycina 1F).
    19. Następnego dnia zastąpić medium 1 mL medium do kokultury z 1 μM urydyny i 15 μM 5'-fluor-2'deoksyurydyny, aby zatrzymać nadmierną proliferację komórek mezenchymalnych, która może utrudniać wzrost neurytów. Opcjonalnie: dodać czynniki wzrostu lub inhibitory do tego medium w przypadku prób dalszej manipulacji.
    20. Hodować komórki przez dodatkowy, pożądany czas. Protokół ten został zoptymalizowany na łącznie 5 dni hodowli, przy czym medium zmieniano tylko w dniu 2., aby dodać inhibitory mitotyczne. Dłuższe okresy będą wymagały dodatkowych zmian medium.

3. Pobieranie i przetwarzanie próbek

  1. Barwienie nerwu trójdzielnego
    1. Pod dygestorium do hodowli tkanek pipetować aliquoty 1 mL sterylnego 1x PBS do płytki 24-dołkowej dla każdego filtra transwell przeznaczonego do obróbki.
    2. Usunąć ciecz znajdującą się nad filtrem za pomocą pipety 200-1000 μL, uważając, aby nie uszkodzić warstw komórek. Komórki przytwierdzone powinny pozostać na miejscu, natomiast komórki nieprzylegające zostaną usunięte podczas tego delikatnego pipetowania. Filtr próżniowy może uszkodzić warstwę komórek i nie jest zalecany do aspiracji.
    3. Przenieść filtr do płytki z 1x PBS, upewniając się, że wierzchnia warstwa medium została usunięta, zgodnie z opisem w poprzednim kroku.
    4. Umieścić płytkę ze wszystkimi filtrami transwell i przykrywkami na kołysce przy 12 rpm lub na wytrząsarce orbitalnej przy 40-50 rpm na 10 min.
    5. Aspirować PBS, w tym wierzchnią warstwę, jak opisano powyżej, dodać 500 μL 1x PBS i pozostawić na kołysce lub wytrząsarce orbitalnej na dodatkowe 5-10 min w celu przemycia.
    6. Aspirować 1x PBS ponownie i zastąpić go 4% paraformaldehydem (PFA). Użyć co najmniej 500 μL, aby cała powierzchnia filtra była zanurzona. Umieścić płytkę na kołysce przy 12 rpm lub wytrząsarce orbitalnej przy 40-50 rpm w temperaturze pokojowej na 1 h.
    7. Usunąć PFA i przemyć płytki dwukrotnie po 5-10 min każdorazowo na kołysce, używając 500 μL 1x PBS.
    8. Zablokować za pomocą 10% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) + 5% surowicy koziej/osła, w zależności od zwierzęcia, w którym wytworzono przeciwciało wtórne, w 0,05% Tween-1x PBS (PBST). Użyć 450-500 μL roztworu, aby filtr był zanurzony w cieczy.
      UWAGA: Na tym etapie płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy w celu późniejszej obróbki. Użyć parafilmu do uszczelnienia płytki, aby zapobiec parowaniu, i regularnie sprawdzać poziom cieczy, aby powierzchnie filtrów pozostawały zanurzone.
    9. Usunąć roztwór blokujący i dodać 450-500 μL przeciwciała pierwszorzędowego w 1% BSA-PBST bez dodatkowego przemywania. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc, delikatnie kołysząc.
    10. Usunąć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć 500 μL 1x PBST na kołysce, 3 razy, w temperaturze pokojowej.
    11. Usunąć PBST, dodać przeciwciało wtórne i inkubować na kołysce przez noc w temperaturze 4 °C, owinąwszy płytkę folią aluminiową, aby chronić fluorofory przed degradacją pod wpływem światła. Przemyć ponownie, 3 razy, 1x PBST na kołysce w temperaturze pokojowej. Zastąpić 1x PBS.
      UWAGA: Na tym etapie płytkę można przechowywać przez kilka miesięcy w temperaturze 4 °C, jeśli jest owinięta folią aluminiową w celu zapobiegania degradacji fluoroforów. Użyć parafilmu do uszczelnienia płytki, aby zapobiec parowaniu, i regularnie sprawdzać poziom cieczy, aby powierzchnie filtrów pozostawały zanurzone. Zaleca się wykonanie obrazowania w ciągu jednego miesiąca.
    12. W celu uzyskania optymalnego obrazowania należy wykorzystać neurony mysie Thy1-YFP z przeciwciałem anty-GFP, aby specyficznie zabarwić aferencje neuronalne znacznie powyżej poziomu tła. W przypadku braku myszy Thy1-YFP należy użyć przeciwciała anty-neurofilament 200 do precyzyjnego zabarwienia struktur aksonalnych.
    13. Wykonać obrazowanie według uznania. Filtry nie muszą być osadzone na płytkach; mogą zostać umieszczone na szkiełku nakrywkowym lub podstawce do obrazowania za pomocą mikroskopu odwróconego.
      UWAGA: Niektóre obszary filtra nie będą zawierały struktur aferentnych. Należy wykonać kilka zdjęć z głębokością stosu z (z-stack), która obejmuje wszystkie struktury aferentne. Użyć oprogramowania do składania obrazów (stitching), aby zwizualizować wzrost neurytów na dużych obszarach lub (preferencyjnie) w obrębie całych regionów filtra.
  2. Zbiór RNA, białek i mediów
    1. Podczas obróbki filtrów transwell zebrać media do probówek wolnych od RNazy/DNazy i zamrozić do późniejszych analiz (ELISA, proteomika itp.).
    2. Bezpośrednio po zebraniu mediów, dodać do dołków aliquoty buforu do lizy lub buforu RIPA (Radio Immuno Precipitation Assay) z inhibitorami proteinaz i fosfataz. Protokół ten został zoptymalizowany dla objętości 100 μL/dołek w płytce 24-dołkowej.
    3. Pozostawić bufory na 5 min w celu lizy komórek, następnie zeskrobać zawartość każdego filtra nową końcówką pipety i zebrać próbki komórek do probówek wolnych od RNazy/DNazy. Zamrozić lizaty do przyszłych analiz (półilościowa i/lub ilościowa PCR, Western blot itp.).
  3. Opcjonalna immunofluorescencja komórek miazgi zębowej:
    1. Delikatnie unieść szkiełka nakrywkowe z sekcji 1.1 za pomocą pęsety i przenieść je do innych dołków z 4% PFA na 1 h przy jednoczesnym kołysaniu.
    2. Aspirować PFA i dwukrotnie przemyć szkiełka nakrywkowe 1x PBS. Następnie przeprowadzić permeabilizację, blokowanie i immunofluorescencję dla wybranych markerów z zastosowaniem standardowych technik immunofluorescencyjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyniki te pokazują, że wzrost neurytów TG był zwiększony w obecności pierwotnych komórek DP w dolnej studzience w porównaniu z kontrolą w postaci monokultury neurytów TG (Rycina 2A,C). Występuje pewna zmienność w obrębie poszczególnych testów w zakresie wzrostu neurytów. Dlatego w każdym teście należy uwzględnić monokulturę neuronów TG jako kontrolę w celu wykrycia podstawowych poziomów wzrostu neurytów. W niniejszym protokole wykorzystano pierwotne komórki myszy Tgfbr2...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Codzienne czynności w jamie ustnej wymagają, aby zęby wyczuwały bodźce zewnętrzne i wewnętrzne stany zapalne, aby umożliwić prawidłowe użytkowanie i konserwację. Jednak dostępne są tylko ograniczone informacje na temat sygnałów, które kierują procesami rozwojowymi unerwienia zębów. Protokół ten zapewnia metodę izolacji i wspólnej hodowli pierwotnych komórek DP i neuronów TG w celu zbadania wzajemnej komunikacji między tymi dwiema populacjami. Kilka zmiennych zostało zoptymalizowanych i pozostawia otwarte dalsze ścieżki b...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez: a) National Institutes of Health/NIAMS (granty o numerach R01 AR062507 i R01 AR053860 do RS), b) grant University of Alabama at Birmingham Dental Academic Research Training (DART) (numer T90DE022736 (kierownik projektu MacDougall)) dla SBP z National Institute of Dental and Craniofacial Research/National Institutes of Health, c) UAB Global Center for Craniofacial, Stypendium pilotażowe i grantowe na rzecz Chorób Jamy Ustnej i Zębów (GC-CODED) dla SBP oraz d) Narodowy Instytut Badań Stomatologicznych i Czaszkowo-Twarzowych/Narodowe Instytuty Zdrowia K99 DE024406 grant dla SBP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
5-Fluoro-2'-deoksyurydynaSigma-AldrichF0503Stosowany jako inhibitor mitotyczny w 15 μ Stężenie M w pożywkach do kohodowli, Dzień 2
24 Płytka do hodowli komórkowych Well Corning3524Płytka do wspólnej hodowli
Alexa-546 anty-kurczakInvitrogenA-11040Wtórne do wyrostu neurytów barwnikowych znakowanych przeciwciałem anty-GFP, rozcieńczenie 1:500
Przeciwciało anty-GFPAves Lab, IncGFP-1010Pierwszorzędowe przeciwciało do znakowania neuronów Thy1-YFP, rozcieńczenie 1:200
Anty-Neurofilament 200 przeciwciałoSigma-AldrichNO142Monoklonalne przeciwciało pierwszorzędowe do znakowania neuronów, rozcieńczenie 1:1000, alternatywa, jeśli myszy YFP nie są dostępne
B6; 129- Tgfbr2tm1Karl/JJackson Laboratory12603Tgfbr2f/f model myszy używany do komórek miazgi zębowej w zoptymalizowanym protokole
B6. Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/JLaboratorium Jacksona3709Genotyp mysiego modelu Thy1-YFP stosowany do neuronów trójdzielnych
Kolagenaza typu IIMilipory234155-100MGSłuży do dyspersji neuronów trójdzielnych
Surowica bydlęcapłodu Gibco10437Dodatek do pożywek do kohodowli
Cienkie kleszczeFine Science Tools11413-11Cienkie kleszcze do rozwarstwiania TG
LamininSigma-AldrichL2020Powleka wkładki transwell w końcowym stężeniu 10 μ g/ml, przyjmuje się, że roztwór podstawowy ma 1,5 mg/ml
Bufor do lizy (bufor RLT)Qiagen79216Ekstrakty RNA z komórek miazgi zęba po kokulturze
L-glutaminaGibco25030081Dodatek do pożywek do
mikrohodowli Nożyczki do mikropreparacjiSigma-AldrichS3146-1EANożyczki preparacyjne do otwierania czaszki
Szkło osłonowe mikroskopuFisherbrand12-545-81Okrągłe szkiełko nakrywkowe do opcjonalnego hodowli komórek i przetwarzania immunofluorescencyjnego
Minimalna niezbędna pożywka aGibco12571063Baza pożywki do wspólnej hodowli
Penicylina-StreptomycynaGibco15070063Dodatek antybiotykowy do pożywek kokulturowych
Inhibitor fosfatazySigma-Aldrich04 906 837 001Dodatek do RIPA Bufor do ekstrakcji białka z komórek miazgi zęba po kokultura
PolybreneMilliporeTR-1003-GStosowany do pomocy w transfekcji komórek miazgi zębowej
Poli-D-LizynaSigma-AldrichP7280Powłoka nakrywkowa wspomagająca adhezję komórkową miazgi zębowej
Inhibitory proteazyMillipore05 892 791 001Dodatek do buforu RIPA do ekstrakcji białka z komórek miazgi zęba po kokulturze
RNAz/DNAzy wolnych od RNAzy / DNAzy probówek eppendorfaDenvilleC-2172Wstępnie sterylizowane probówki o pojemności 1,7 ml do pobierania RNA, DNA lub białka na końcu testu
Wkładka do hodowli komórkowych ThinCert WkładkiGreiner Bio-One662631Transwell do neuronów trójdzielnych w testach kohodowlanych
Trypsyna-EDTA (0,25%)Gibco25200056Używany do dyspersji komórek miazgi zębowej
Trypsyna Typ IISigma-AldrichT-7409Służy do dyspersji neurony trójdzielne
Ultra cienkie kleszczeFine Science Tools11370-40Ultra cienkie kleszcze do preparacji
UridineSigma-AldrichU3750Stosowany jako inhibitor mitotyczny w 1 μ Stężenie M w pożywkach do kohodowli,
system filtracji próżniowejMilliporeSCNY00060Filtr jednorazowy Steriflip, 50 μ m Filtr z siatki nylonowej
Kleszczyki do fiolekFine Science Tools110006-15Długie kleszcze do przenoszenia tkanek na stożkowe
dnia 2

Bibliografia

  1. Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).
  2. Kollar, E. J., Lumsden, A. G. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
  3. Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).
  4. Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp. Physiology & Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).
  5. Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).
  6. Luukko, K., Kettunen, P. Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A. Cell Adhesion & Migration. , 1-9 (2016).
  7. Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. Assay for neurite outgrowth quantification. BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).
  8. de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism. Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).
  9. Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices. Journal of Visualized Experiments. (102), e53114(2015).
  10. Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV. Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).
  11. Caroni, P. Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice. Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).
  12. Alić, I., et al. Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology. Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).
  13. Howroyd, P. C. Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies. Toxicologic Pathology. , (2019).
  14. Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons. Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).
  15. Liu, R., Lin, G., Xu, H. An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment. PLoS ONE. 8 (4), 60558(2013).
  16. Burry, R. W. Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures. Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).
  17. Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in molecular biology. 1656, Clifton, N.J. 229-251 (2017).
  18. Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).
  19. Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro. Neuroscience. 119 (2), 443-451 (2003).
  20. Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).
  21. Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
  22. Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth. Scientific reports. 6, 31799(2016).
  23. Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in Physiology. 5, 326(2014).
  24. Miura, T., Yokokawa, R. Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices. Development, Growth & Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

komórki miazgi zębaneurony trójdzielnefiltr TranswellAdenowirus-Cre-GFPmysz Thy1-YFPmikroskopia konfokalnabarwienie immunofluorescencyjneanaliza proteomiczna
Metoda kohodowli do badania przerostu neurytów w odpowiedzi na sygnały parakrynne miazgi zębowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.