Method Article

Pomiar receptora dopełniacza erytrocytów 1 za pomocą cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/60810

⸱

May 19th, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Oncogeriatric Coordination Unit, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 2Faculty of Medicine, University of Reims Champagne-Ardenne, 3URCACyt, Flow cytometry technical platform, University of Reims Champagne-Ardenne, 4Department of Immunology, Reims University Hospitals, Robert Debre Hospital, 5Department of Internal Medicine and Geriatrics, Reims University Hospitals, Maison Blanche Hospital, 6Faculty of Medicine, University of Reims Champagne-Ardenne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tej metody jest określenie gęstości CR1 w erytrocytach dowolnego podmiotu poprzez porównanie z trzema osobami, których gęstość CR1 erytrocytów jest znana. Metoda wykorzystuje cytometrię przepływową po immunobarwieniu erytrocytów badanych przez przeciwciało monoklonalne anty-CR1 sprzężone z amplifikowanym układem za pomocą fikoerytryny (PE).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CR1 (CD35, Receptor Dopełniacza typu 1 dla C3b/C4b) to glikoproteina błonowa o wysokiej masie cząsteczkowej o masie około 200 kDa, która kontroluje aktywację dopełniacza, transportuje kompleksy immunologiczne i uczestniczy w humoralnej i komórkowej odpowiedzi immunologicznej. CR1 jest obecny na powierzchni wielu typów komórek, w tym erytrocytów, i wykazuje polimorfizmy pod względem długości, struktury (Knops lub KN, grupa krwi) i gęstości. Średnia gęstość CR1 na erytrocyt (CR1/E) wynosi 500 cząsteczek na erytrocyt. Gęstość ta różni się w zależności od osobnika (100-1,200 CR1/E) i od jednego erytrocytu do drugiego u tego samego osobnika. Przedstawiamy tutaj solidną metodę cytometrii przepływowej do pomiaru gęstości CR1/E, w tym u osób wykazujących niską gęstość, za pomocą wzmacniającego systemu barwienia immunologicznego. Metoda ta pozwoliła nam wykazać obniżenie ekspresji erytrocytów CR1 w chorobach takich jak choroba Alzheimera (AD), toczeń rumieniowaty układowy (SLE), AIDS czy malaria.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CR1 (receptor dopełniacza typu 1, CD35) to transbłonowa glikoproteina o masie 200 kDa obecna na powierzchni wielu typów komórek, takich jak erytrocyty1, limfocyty B2, komórki monocytowe, niektóre limfocyty T, pęcherzykowe komórki dendrytyczne3, astrocyty płodowe4 i podocyty kłębuszkowe 5. CR1 zakłócający swoje ligandy C3b, C4b, C3bi6,7,8,9, podjednostka pierwszego składnika dopełniacza, C1q10 i MBL (lektyna wiążąca mannan)11 hamuje aktywację dopełniacza i bierze udział w humoralnej i komórkowej odpowiedzi immunologicznej.

U naczelnych, w tym u ludzi, erytrocyty CR1 biorą udział w transporcie kompleksów immunologicznych do wątroby i śledziony, aby oczyścić krew i zapobiec ich gromadzeniu się w wrażliwych tkankach, takich jak skóra czy nerki12,13,14. To zjawisko adhezji immunologicznej między kompleksami immunologicznymi a erytrocytami zależy od liczby cząsteczek CR115. U ludzi średnia gęstość CR1/E wynosi tylko 500 (tj. 500 cząsteczek CR1 na erytrocyt). Gęstość ta różni się w zależności od osobnika (100-1,200 CR1/E) i od jednego erytrocytu do drugiego u tego samego osobnika. Niektóre osobniki o fenotypie "zerowym" wyrażają mniej niż 20 CR1/E16.

Gęstość CR1/E jest regulowana przez dwa współdominujące autosomalne allele połączone z mutacją punktową w intronie 27 genu kodującego CR1*117,18. Ta mutacja wytwarza dodatkowe miejsce restrykcyjne dla enzymu HindIII. Fragmenty restrykcyjne uzyskane po trawieniu z HindIII w tym przypadku wynoszą 7,4 kb dla allelu związanego z silną ekspresją CR1 (H: wysoki allel) i 6,9 kb dla allelu związanego z niską ekspresją CR1 (L: niski allel). Ten link występuje u osób rasy kaukaskiej i azjatyckiej, ale nie u osób pochodzenia afrykańskiego19.

Poziom ekspresji erytrocytów CR1 jest również skorelowany z obecnością punktowych mutacji nukleotydowych w eksonie 13 kodującym SCR 10 (I643T) i w eksonie 19 kodującym SCR16 (Q981H). Jest wysoki u homozygotycznych osobników 643I/981Q i niski u homozygotycznych osobników 643T/981H20. Tak więc osoby "niskie" wyrażają około 150 CR1/E, osoby "średnie" wyrażają około 500 CR1/E, a osoby "wysokie" wyrażają około 1000 CR1/E.

Oprócz tego polimorfizmu gęstości erytrocytów, CR1 charakteryzuje się polimorfizmem długości odpowiadającym czterem allotypom o różnych rozmiarach: CR1*1 (190 kDa), CR1*2 (220 kDa), CR1*3 (160 kDa) i CR1*4 (250 kDa)21 oraz polimorfizmem antygenowym odpowiadającym grupie krwi KN22.

Przedstawiamy naszą metodę opartą na cytometrii przepływowej do określenia gęstości CR1/E. Korzystając z trzech osób, których gęstość CR1/E jest znana, wyrażając niski poziom gęstości (180 CR1/E), średni poziom gęstości (646 CR1/E) i wysoki poziom gęstości (966 CR1/E), łatwo jest zmierzyć średnią intensywność fluorescencji (MFI) ich erytrocytów lub czerwonych krwinek (RBC), lub RBC MFI, po barwieniu immunologicznym anty-CR1 za pomocą cytometru przepływowego. Następnie można wykreślić standardową linię reprezentującą MIF w funkcji gęstości CR1/E. Mierząc MFI osób, których gęstość CR1/E nie jest znana i porównując ją z tą linią standardową, możliwe jest określenie gęstości CR1/E u tych osób. Technika ta jest stosowana od wielu lat w laboratorium i umożliwiła nam wykrycie zmniejszenia ekspresji erytrocytów CR1 w wielu patologiach, takich jak toczeń rumieniowaty układowy (SLE)23, zespół nabytego niedoboru odporności (AIDS)24, malaria25, a ostatnio choroba Alzheimera (AD)26,27. Opracowanie leków ukierunkowanych na CR1 w celu sprzężenia z erytrocytami, jak w przypadku leków przeciwzakrzepowych28 wymaga oceny gęstości CR1/E oraz dostępności solidnej techniki ilościowego oznaczania CR1.

Przedstawiony protokół działa w trybie pojedynczym. Można go dostosować do określania gęstości CR1/E u wielu osób przy użyciu specjalnych dostępnych na rynku płytek 96-dołkowych (patrz Tabela materiałów). W tym celu łatwo jest dostosować naszą metodę do każdej płytki 96-dołkowej. Dla każdej próbki rozprowadza się zawiesinę komórkową erytrocytów (0,5 x 106–1 x 106 erytrocytów) na studzienkę. Do każdego dołka najpierw dodaje się pierwszorzędowe przeciwciało anty-CR1, następnie streptawidynę PE, drugorzędowe przeciwciało anty-streptawidyny i ponownie streptawidynę PE, stosując te same rozcieńczenia, co w naszej metodzie, ale dostosowując objętości i przestrzegając proporcjonalności.

Próbki krwi od osób z tego zakresu i od osób, które mają być określone ilościowo dla CR1, powinny być pobrane w tym samym czasie, przechowywane w lodówce w temperaturze 4 °C i przetwarzane w temperaturze 4 °C (na lodzie i/lub w lodówce).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół pobierania i obchodzenia się z ludzką krwią został sprawdzony i zatwierdzony przez regionalną komisję etyki (CPP Est II), a numer protokołu to 2011-A00594-37. Ponieważ poniższy protokół opisuje postępowanie z ludzką krwią, należy postępować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi usuwania materiału niebezpiecznego biologicznie. Należy nosić laboratoryjny sprzęt ochronny, taki jak fartuchy i rękawice laboratoryjne.

1. Mycie erytrocytów

UWAGA: Dzień przed użyciem przygotuj bufor PBS-BSA z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) zawierającą 0,15% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i umieść go w lodówce w temperaturze 4 °C. Bufor ten będzie używany jako bufor do przemywania i jako bufor rozcieńczający.

  1. Odpipetować 20 ml PBS-BSA do probówki o pojemności 50 ml.
  2. Odessać 250 μl antykoagulowanej krwi pełnej z kwasem sodowo-etylenodiaminowym (EDTA) z probówek do przechowywania krwi i dodać do probówki zawierającej 20 ml PBS-BSA. Zamknij rurkę, przykręcając nakrętkę. Delikatnie wymieszaj, odwracając rurkę 2x.
  3. Odwirować probówkę przez 10 minut w temperaturze 4 °C przy 430 x g. Usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Zawiesić osad w resztkowej objętości supernatantu przez delikatne i ostrożne pipetowanie.
  4. Dodać 20 ml zimnego PBS-BSA (4 °C) do probówki zawierającej osad. Odwirować probówkę przez 10 minut w temperaturze 4 °C przy 430 x g. Usunąć i wyrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
  5. Dodać 20 ml zimnego PBS-BSA (4 °C) do probówki zawierającej osad. Odwirować probówkę przez 10 minut w temperaturze 4 °C przy 430 x g. Pozostawić probówkę w wirówce w temperaturze 4 °C i przejść do sekcji 2.

2. Rozcieńczenie erytrocytów

  1. Odpipetować 3 ml zimnego PBS-BSA do probówki o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C na ruszcie w lodzie.
  2. Umieścić odwirowaną probówkę zawierającą erytrocyty (krok 1.4) na stojaku umieszczonym w lodzie.
  3. Za pomocą pipety odpipetować 8 μl granulowanych erytrocytów i dodać do 50 ml probówki zawierającej 3 ml PBS-BSA w celu uzyskania rozcieńczenia erytrocytów. Delikatnie wymieszaj probówkę ręcznie, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek erytrocytów.

3. Barwienie immunologiczne erytrocytów

  1. Pobrać pipetą 100 μl rozcieńczenia erytrocytów (otrzymanego w punkcie 4) i dodać do probówek o pojemności 1,4 ml.
  2. Wirować probówki przez 5 minut w temperaturze 4 °C przy 430 x g. Podczas wirowania przygotować rozcieńczenie biotynylowanego przeciwciała anty-CR1 J3D3 o stężeniu 0,05 μg/μL w buforze PBS-BSA.
  3. Po zakończeniu wirowania usunąć i wyrzucić supernatant.
  4. Dodaj 20 μl biotynylowanego anty-CR1 J3D3 bezpośrednio do granulki. Aby przygotować kontrolę ujemną, należy zamiast tego dodać 20 μl buforu PBS-BSA. Delikatnie wymieszać probówki i inkubować przez 45 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Po 45 minutach inkubacji dodać 750 μl PBS-BSA do probówek. Wirować probówki przez 5 minut w temperaturze 4 °C przy 430 x g. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Powtórzyć.
  6. W międzyczasie należy przygotować rozcieńczenie 1:10 streptawidyny-fikoerytryny rozcieńczonej w buforze PBS-BSA. Odpipetować pipetą 20 μl streptawidyny-fikoerytryny w rozcieńczeniu 1:10 i dodać do probówek. Delikatnie wymieszać probówki i inkubować przez 45 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Dodać 750 μl buforu PBS-BSA do probówek. Dobrze wymieszać i wirować przez 5 minut w temperaturze 4 °C przy 430 x g. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Powtórzyć.
  8. Podczas wirowania należy przygotować rozcieńczenie 1:100 biotynylowanego przeciwciała antystreptawidyny rozcieńczonego w buforze PBS-BSA.
  9. Po zakończeniu wirowania usunąć i wyrzucić supernatant.
  10. Odmierzyć pipetą 20 μl biotynylowanej antystreptawidyny w rozcieńczeniu 1:100 do probówek. Delikatnie wymieszaj tubki. Inkubować probówki przez 45 minut w temperaturze 4 °C.
  11. Po 45 minutach inkubacji odpipetować 750 μl buforu PBS-BSA i dodać do probówek. Wirować probówki przez 5 minut w temperaturze 4 °C przy 430 x g. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Powtórzyć.
  12. Pobrać pipetą 20 μl streptawidyny-fikoerytryny w stosunku 1:10 i dodać do probówek. Delikatnie wymieszaj tubki. Inkubować probówki przez 45 minut w temperaturze 4 °C.
  13. Odpipetować 750 μl buforu PBS-BSA i dodać do probówek. Dobrze wymieszać i odwirować probówki przez 5 minut w temperaturze 4 °C przy 430 x g. Usunąć i wyrzucić sklarowany osad. Powtórz ten krok 2 razy.

4. Immunologiczne utrwalenie erytrocytów

  1. Podczas ostatniego wirowania należy przygotować bufor utrwalający, rozcieńczony 37% formaldehydu w stosunku 1:100 za pomocą buforu płuczącego PBS-BSA.
  2. Odpipetować 450 μl buforu utrwalającego i dodać do probówek erytrocytów wybarwionych immunologicznie (od kroku 3.13), wirując przez 5 s.
  3. Odpipetować wszystkie stałe komórki do probówek z okrągłym dnem o pojemności 5 ml i przechowywać w lodówce.
    UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany na okres do 48 godzin.

5. Analiza cytometrii przepływowej barwionych erytrocytów

UWAGA: Zaleca się zapoznanie się z instrukcją obsługi cytometru (patrz Tabela materiałów), aby dowiedzieć się, jak wykonywać odczyty cytometryczne. Poniższe sugerowane parametry odnoszą się do używanego instrumentu i muszą być zoptymalizowane dla każdego cytometru.

  1. Włącz cytometr przepływowy, a następnie włącz komputer. Poczekaj, aż temperatura układu optycznego ustabilizuje się, pozostawiając go włączonego na 30 minut. Sprawdź okienko cytometru w oprogramowaniu, aby upewnić się, że cytometr jest podłączony do stacji roboczej (wyświetlany jest komunikat Cytometer Connected).
  2. Sprawdzić, czy zbiornik buforowy jest pełny i czy pojemnik na odpady jest pusty. Usunąć pęcherzyki powietrza z filtra buforowego i przewodu buforowego za pomocą systemu przedmuchiwania. Napełnić układ fluidyczny, naciskając przycisk Prime na konsoli cytometru. Poczekaj, aż kontrolka zmieni kolor z czerwonego na zielony.
  3. Aby oczyścić fluidykę, zainstaluj probówkę zawierającą 3 ml roztworu czyszczącego w porcie wstrzykiwania próbki i pozwól roztworowi czyszczącemu działać przez 5 minut z dużym natężeniem przepływu próbki. Powtórz to z roztworem do płukania wodą destylowaną. Pozostawić probówkę z wodą w porcie wstrzykiwania próbki.
  4. Aby przygotować kulki kalibracyjne, należy odpipetować 400 μl PBS na dno probówki z okrągłym dnem. Mocno wymieszaj bulwy z koralików, wirując przez 30 sekund. Dodać kroplę do probówki z okrągłym dnem zawierającej PBS. Dokładnie mieszaj, wirując przez 30 sekund.
  5. Uruchom test wydajności. Otwórz moduł konfiguracji i śledzenia cytometru w oprogramowaniu ( Rysunek 1A). Sprawdź, czy konfiguracja cytometru jest prawidłowa dla eksperymentu przy użyciu barwienia immunologicznego PE. Sprawdź, czy partia koralików kalibrujących jest poprawna z konfiguracją.
  6. Zamontuj rurkę perełkową w porcie wtrysku próbki i pozwól jej pracować z niskim natężeniem przepływu próbki. Uruchom test wydajności, który trwa około 5 minut). Po zakończeniu kontroli działania sprawdź, czy działanie cytometru jest zadowalające (Rysunek 1B). Zamknij moduł konfiguracji i śledzenia cytometru w oprogramowaniu.
  7. Aby skonfigurować eksperyment i utworzyć ustawienia aplikacji, kliknij przycisk Nowy eksperyment na pasku narzędzi przeglądarki i otwórz nowy eksperyment. Określ parametry, wybierając odpowiednie ustawienia cytometru: Forward Scatter (FSC), Side Scatter (SSC) i PE z rozwijanego menu eksperymentu (Rysunek 1C). Wybierz Tryb liniowy dla parametru FSC i tryb logarytmu dla parametrów SSC i PE.
  8. W otwartym eksperymencie wybierz Ustawienia cytometru ( Rysunek 1D), a następnie wybierz Ustawienia aplikacji i utwórz globalny arkusz roboczy (Rysunek 1E). Użyj szarych pól i krzyżyka, aby poprowadzić optymalizację.
  9. Załaduj niezabarwioną rurkę kontrolną do cytometru i uruchom akwizycję. Upewnij się, że populacja będąca przedmiotem zainteresowania (tj. RBC) jest na dużą skalę, optymalizując napięcia FSC i SSC. Zoptymalizuj wartość progową FSC, aby wyeliminować zanieczyszczenia bez zakłócania pracy interesującej populacji.
  10. Narysuj bramę wokół RBC na wykresie FSC vs. SSC. Wyświetl populację RBC na wykresie kropkowym fluorescencji PE. W razie potrzeby zwiększ fluorescencję napięcia lampy fotopowielacza (PMT), aby umieścić populację ujemną w szarych polach. Rozładować niezabarwioną probówkę kontrolną z cytometru.
  11. Sprawdź, czy populacje z dodatnim wynikiem są na dużą skalę. Załaduj poplamioną rurkę kontrolną do cytometru i uruchom akwizycję. Obniż napięcie PMT dla populacji dodatniej, jeśli jest poza skalą, dopóki populacja dodatnia nie będzie widoczna w całości na skali. Następnie rozładuj poplamioną próbkę.
  12. Aby rejestrować i analizować próbki, w nowym arkuszu globalnym utwórz następujące wykresy w celu wyświetlenia podglądu danych: 1) FSC a SSC i 2) histogram fluorescencji PE. Załaduj pierwszą próbkę do cytometru i uruchom akwizycję.
  13. Narysuj bramkę RBC wokół erytrocytów na wykresie FSC vs. SSC. Wyświetl populację RBC na histogramie fluorescencji PE. W widoku Statystyki wybierz średnią parametrów fluorescencji PE w populacjach GR (Rysunek 1F).
  14. Na pulpicie nawigacyjnym Akwizycja wybierz wszystkie zdarzenia w bramce zatrzymującej i 10 000 zdarzeń do zarejestrowania (Rysunek 1G). Kliknij przycisk Nagraj dane. Po zakończeniu rejestrowania zdarzenia wyjmij pierwszą probówkę z cytometru. Wykresy globalnego arkusza powinny wyglądać jak te w Rysunek 2.
  15. Załaduj następujące próbki i zapisz je.

6. Oznaczanie gęstości erytrocytów CR1

  1. Weźmy wartości średnich intensywności fluorescencji próbek odpowiadających "niskiemu" badanemu (Rysunek 3, tabela I, RBC MFI), "średniemu" podmiotowi (Rysunek 4, Tabela D, RBC MFI), "wysokiemu" tematowi (Rysunek 4, Tabela I, RBC MFI) oraz próbie kontroli ujemnej (Rysunek 3, Tabela I, RBC MIF).
  2. Na wykresie przedstawiającym średnią intensywność fluorescencji w funkcji gęstości CR1 umieść cztery punkty odpowiadające kontroli negatywnej, "niskiemu" obiektowi, "średniemu" obiektowi i "wysokiemu" obiektowi (niebieskie punkty, Rysunek 6).
  3. Narysuj linię regresji, aby uzyskać linię kalibracji i jej równanie.
  4. Należy przyjąć wartości średniej intensywności fluorescencji próbek odpowiadających badaniom, których gęstość ma być określona. (Rysunek 5, Tabele D i I, RBC MFI).
  5. Uzyskaj równanie, zastępując "Y" wartościami średnich intensywności fluorescencji i oblicz gęstość CR1/E (Rysunek 6).
  6. Sprawdź na wykresie, czy średnie wartości intensywności fluorescencji i wyznaczona gęstość CR1/E odpowiadają punktowi na linii kalibracji (Rysunek 6).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Erytrocyty trzech osób, których gęstość CR1 jest znana ("niska" [180 CR1/E], "średnia" [646 CR1/E] i "wysoka" [966 CR1/E]), oraz dwóch osób, których gęstość CR1 musiała zostać określona, były immunologicznie barwione przez przeciwciało anty-CR1 sprzężone z systemem amplifikacji za pomocą fluorochromu fikoerytryny. Na początku gęstość CR1 u badanych z zakresu niskiego-wysokiego została określona metodą Scatcharda29 przy użyciu przeciwciał znakowanych radioaktywnie. Wyznaczone wzorce (niskie, średni...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostępnych jest kilka technik określania gęstości erytrocytów CR1 (CR1/E). Pierwszymi zastosowanymi technikami była aglutynacja czerwonych krwinek przez przeciwciała anty-CR131 oraz tworzenie rozet w obecności erytrocytów pokrytych C3b32. Te podstawowe techniki zostały szybko zastąpione metodami barwienia immunologicznego z wykorzystaniem znakowanych radioaktywnie przeciwciał anty-CR1 1,33. Możliwe jest również zmie...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy wszystkim członkom URCACyt, platformy technicznej cytometrii przepływowej, personelowi Zakładu Immunologii oraz personelowi Oddziału Chorób Wewnętrznych i Geriatrii, którzy przyczynili się do optymalizacji i walidacji protokołu. Praca ta została sfinansowana przez Szpital Uniwersytecki w Reims (grant nr AOL11UF9156).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Końcówka barierowa 1000EThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Francja2079Epipetowanie próbek
1-100 i mikro; L Skośna, końcówka filtraStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, NiemcyS1120-1840pipetowanie próbek
Biotynylowane przeciwciało monoklonalne anty-CR1 (J3D3)Domowa produkcja niekomercyjnego przeciwciała monoklonalnego, dzięki uprzejmości dr J. CookaBarwienie immunologiczne
Ochrona bluzki
Albumina surowicy Bovin (7,5%)Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, FrancjaWirówkacytometrii
Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Francja11176917 wirowanie
Czysty roztwórBD, F-38801 Le Pont de Claix, FrancjaCytometria340345
Comorack-96Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath944060P
Rack Cytometr Konfiguracja i Zestaw kulek śledzącychBD, F-38801 Le Pont de Claix, Francja655051cytometria
Roztwór formaldehydu 36,5 %Sigma Aldrich, F-38070 Saint Quentin Fallavier, FrancjaF8775-25MLUtrwalenie
10 &mikro; L Stopniowana, końcówka filtraStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, NiemcyS1121-3810pipetowanie próbek
Cytometr przepływowy LSRFORTESSABD, F-38801 Le Pont de Claix, FrancjaCytometria
647788 Microman Tłoki kapilarneDominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath067494pipetowanie próbek
Micronic 1,40 ml probówki z okrągłym dnemDominique DUTSCHER SAS, F-67172 BrumathMP32051mix
Mikropipeta Microman - typ M25 -Dominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath066379pipetowanie próbek
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Francja10010031cytometria
Pipeta PS 325 mm, 10 mLDominique DUTSCHER SAS, F-67172 Brumath391952próbkowanie próbki
bezpudrowe Egzamin na nitryl rękawiceMedline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, USA486802ochrona próbki
Referencyjna pipeta 2, 0,5-10 i mikro; LEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francja4920000024pipeta do pipetowania próbek
Reference 2, 20-100 &mikro; LEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francja4920000059pipetowanie próbek
Referencyjna pipeta 2, 100-1000 i mikro; LEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, FrancjaPipetowanie próbek4920000083
Roztwór do płukaniaBD, F-38801 Le Pont de Claix, FrancjaCytometria340346
Probówka okrągłodennaSarstedt, F-70150 Marnay, FrancjaCytometria55.1579
Probówki Safe-Lock, 1,5 mlEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Francja0030120086mix
streptawidyna R-PETebu Bio, F-78612 Le Perray-en-Yvelines, FrancjaAS-60669barwienie immunologiczne
Stożkowe probówki wirówkowe 50 mlThermo Fischer Scientific, F-67403 Illkirch, Francja10203001mix
Vector anty streptawidyna biotynaEurobio Ingen, F-91953 Les Ulis, FrancjaBA-0500barwienie immunologiczne
Vortex-Genie 2Scientific Industries, Inc, Bohemia, NY 111716, USASI-0236mix
do 15260037

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fearon, D. T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte, and monocyte. Journal of Experimental Medicine. 152 (1), 20-30 (1980).
  2. Ross, G. D., Winchester, R. J., Rabellino, E. M., Hoffman, T. Surface markers of complement receptor lymphocytes. Journal of Clinical Investigation. 62 (5), 1086-1092 (1978).
  3. Reynes, M., et al. Human follicular dendritic cells express CR1, CR2, and CR3 complement receptor antigens. The Journal of Immunology. 135 (4), 2687-2694 (1985).
  4. Gasque, P., et al. Identification and characterization of complement C3 receptors on human astrocytes. The Journal of Immunology. 156 (6), 2247-2255 (1996).
  5. Pascual, M., et al. Identification of membrane-bound CR1 (CD35) in human urine: evidence for its release by glomerular podocytes. Journal of Experimental Medicine. 179 (3), 889-899 (1994).
  6. Fearon, D. T. Regulation of the amplification C3 convertase of human complement by an inhibitory protein isolated from human erythrocyte membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5867-5871 (1979).
  7. Dobson, N. J., Lambris, J. D., Ross, G. D. Characteristics of isolated erythrocyte complement receptor type one (CR1, C4b-C3b receptor) and CR1-specific antibodies. The Journal of Immunology. 126 (2), 693-698 (1981).
  8. Schreiber, R. D., Pangburn, M. K., Muller-Eberhard, H. J. C3 modified at the thiolester site: acquisition of reactivity with cellular C3b receptors. Bioscience Reports. 1 (11), 873-880 (1981).
  9. Ross, G. D., et al. Generation of three different fragments of bound C3 with purified factor I or serum. II. Location of binding sites in the C3 fragments for factors B and H, complement receptors, and bovine conglutinin. Journal of Experimental Medicine. 158 (2), 334-352 (1983).
  10. Klickstein, L. B., Barbashov, S. F., Liu, T., Jack, R. M., Nicholson-Weller, A. Complement receptor type 1 (CR1, CD35) is a receptor for C1q. Immunity. 7 (3), 345-355 (1997).
  11. Ghiran, I., et al. Complement receptor 1/CD35 is a receptor for mannan-binding lectin. Journal of Experimental Medicine. 192 (12), 1797-1808 (2000).
  12. Cornacoff, J. B., et al. Primate erythrocyte-immune complex-clearing mechanism. Journal of Clinical Investigation. 71 (2), 236-247 (1983).
  13. Waxman, F. J., et al. Complement depletion accelerates the clearance of immune complexes from the circulation of primates. Journal of Clinical Investigation. 74 (4), 1329-1340 (1984).
  14. Waxman, F. J., et al. Differential binding of immunoglobulin A and immunoglobulin G1 immune complexes to primate erythrocytes in vivo. Immunoglobulin A immune complexes bind less well to erythrocytes and are preferentially deposited in glomeruli. Journal of Clinical Investigation. 77 (1), 82-89 (1986).
  15. Horgan, C., Taylor, R. P. Studies on the kinetics of binding of complement-fixing dsDNA/anti-dsDNA immune complexes to the red blood cells of normal individuals and patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis & Rheumatology. 27 (3), 320-329 (1984).
  16. Pham, B. N., et al. Analysis of complement receptor type 1 expression on red blood cells in negative phenotypes of the Knops blood group system, according to CR1 gene allotype polymorphisms. Transfusion. 50 (7), 1435-1443 (2010).
  17. Wilson, J. G., et al. Identification of a restriction fragment length polymorphism by a CR1 cDNA that correlates with the number of CR1 on erythrocytes. Journal of Experimental Medicine. 164 (1), 50-59 (1986).
  18. Rodriguez de Cordoba, S., Rubinstein, P. Quantitative variations of the C3b/C4b receptor (CR1) in human erythrocytes are controlled by genes within the regulator of complement activation (RCA) gene cluster. Journal of Experimental Medicine. 164 (4), 1274-1283 (1986).
  19. Herrera, A. H., Xiang, L., Martin, S. G., Lewis, J., Wilson, J. G. Analysis of complement receptor type 1 (CR1) expression on erythrocytes and of CR1 allelic markers in caucasian and african american populations. Clinical Immunology and Immunopathology. 87 (2), 176-183 (1998).
  20. Birmingham, D. J., et al. A CR1 polymorphism associated with constitutive erythrocyte CR1 levels affects binding to C4b but not C3b. Immunology. 108 (4), 531-538 (2003).
  21. Dykman, T. R., Hatch, J. A., Aqua, M. S., Atkinson, J. P. Polymorphism of the C3b/C4b receptor (CR1): characterization of a fourth allele. The Journal of Immunology. 134 (3), 1787-1789 (1985).
  22. Moulds, J. M., Moulds, J. J., Brown, M., Atkinson, J. P. Antiglobulin testing for CR1-related (Knops/McCoy/Swain-Langley/York) blood group antigens: negative and weak reactions are caused by variable expression of CR1. Vox Sanguinis. 62 (4), 230-235 (1992).
  23. Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
  24. Jouvin, M. H., Rozenbaum, W., Russo, R., Kazatchkine, M. D. Decreased expression of the C3b/C4b complement receptor (CR1) in AIDS and AIDS-related syndromes correlates with clinical subpopulations of patients with HIV infection. AIDS. 1 (2), 89-94 (1987).
  25. Waitumbi, J. N., Donvito, B., Kisserli, A., Cohen, J. H., Stoute, J. A. Age-related changes in red blood cell complement regulatory proteins and susceptibility to severe malaria. The Journal of Infectious Diseases. 190 (6), 1183-1191 (2004).
  26. Mahmoudi, R., et al. Alzheimer's disease is associated with low density of the long CR1 isoform. Neurobiology of Aging. 36 (4), 5-12 (2015).
  27. Mahmoudi, R., et al. Inherited and Acquired Decrease in Complement Receptor 1 (CR1) Density on Red Blood Cells Associated with High Levels of Soluble CR1 in Alzheimer's Disease. International Journal of Molecular Sciences. 19 (8), 2175(2018).
  28. Zaitsev, S., et al. Human complement receptor type 1-directed loading of tissue plasminogen activator on circulating erythrocytes for prophylactic fibrinolysis. Blood. 108 (6), 1895-1902 (2006).
  29. Scatchard, G. The attractions of proteins for small molecules and ions. Annals of the New York Academy of Sciences. 51 (4), 660-672 (1949).
  30. Cohen, J. H., et al. Enumeration of CR1 complement receptors on erythrocytes using a new method for detecting low density cell surface antigens by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 99 (1), 53-58 (1987).
  31. Minota, S., et al. Low C3b receptor reactivity on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus detected by immune adherence hemagglutination and radioimmunoassays with monoclonal antibody. Arthritis & Rheumatology. 27 (12), 1329-1335 (1984).
  32. Miyakawa, Y., et al. Defective immune-adherence (C3b) receptor on erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. The Lancet. 2 (8245), 493-497 (1981).
  33. Lida, K., Mornaghi, R., Nussenzweig, V. Complement receptor (CR1) deficiency in erythrocytes from patients with systemic lupus erythematosus. Journal of Experimental Medicine. 155 (5), 1427-1438 (1982).
  34. Tao, K., Nicholls, K., Rockman, S., Kincaid-Smith, P. Expression of complement 3 receptors (CR1 and CR3) on neutrophils and erythrocytes in patients with IgA nephropathy. Clinical Nephrology. 32 (5), 203-208 (1989).
  35. Nickells, M., et al. Mapping epitopes for 20 monoclonal antibodies to CR1. Clinical and Experimental Immunology. 112 (1), 27-33 (1998).
  36. Oi, V. T., Glazer, A. N., Stryer, L. Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules. The Journal of Cell Biology. 93 (3), 981-986 (1982).
  37. Chaiet, L., Wolf, F. J. The properties of streptavidin, a biotin-binding protein produced by streptomyces. Archives of Biochemistry and Biophysics. 20 (106), 1-5 (1964).
  38. Cockburn, I. A., Donvito, B., Cohen, J. H., Rowe, J. A. A simple method for accurate quantification of complement receptor 1 on erythrocytes preserved by fixing or freezing. Journal of Immunological Methods. 20 (271), 59-64 (2002).
  39. Chen, C. H., et al. Antibody CR1-2B11 recognizes a non-polymorphic epitope of human CR1 (CD35). Clinical & Experimental Immunology. 148 (3), 546-554 (2007).
  40. Ripoche, J., Sim, R. B. Loss of complement receptor type 1 (CR1) on ageing of erythrocytes. Studies of proteolytic release of the receptor. Biochemical Journal. 235 (3), 815-821 (1986).
  41. Moldenhauer, F., Botto, M., Walport, M. J. The rate of loss of CR1 from ageing erythrocytes in vivo in normal subjects and SLE patients: no correlation with structural or numerical polymorphisms. Clinical & Experimental Immunology. 72 (1), 74-78 (1988).
  42. Cohen, J. H., Lutz, H. U., Pennaforte, J. L., Bouchard, A., Kazatchkine, M. D. Peripheral catabolism of CR1 (the C3b receptor, CD35) on erythrocytes from healthy individuals and patients with systemic lupus erythematosus (SLE). Clinical & Experimental Immunology. 87 (3), 422-428 (1992).
  43. Nickells, M. W., Subramanian, V. B., Clemenza, L., Atkinson, J. P. Identification of complement receptor type 1-related proteins on primate erythrocytes. The Journal of Immunology. 154 (6), 2829-2837 (1995).
  44. Hebert, L. A., Birmingham, D. J., Shen, X. P., Cosio, F. G. Stimulating erythropoiesis increases complement receptor expression on primate erythrocytes. Clinical Immunology and Immunopathology. 62 (3), 301-306 (1992).
  45. Davis, K. A., Abrams, B., Iyer, S. B., Hoffman, R. A., Bishop, J. E. Determination of CD4 antigen density on cells: Role of antibody valency, avidity, clones, and conjugation. Cytometry. 33 (2), 197-205 (1998).
  46. Pannu, K. K., Joe, E. T., Iyer, S. B. Performance evaluation of QuantiBRITE phycoerythrin beads. Cytometry. 45 (4), 250-258 (2001).
  47. Barnett, D., Storie, I., Wilson, G. A., Granger, V., Reilly, J. T. Determination of leucocyte antibody binding capacity (ABC): the need for standardization. Clinical Laboratory Haematology. 20 (3), 155-164 (1998).
  48. Bikoue, A., et al. Quantitative analysis of leukocyte membrane antigen expression: normal adult values. Cytometry. 26 (2), 137-147 (1996).
  49. Serke, S., van Lessen, A., Huhn, D. Quantitative fluorescence flow cytometry: a comparison of the three techniques for direct and indirect immunofluorescence. Cytometry. 33 (2), 179-187 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Erythrocyte Complement Receptor 1Flow Cytometry AnalysisCR1 Density MeasurementImmunostaining ProtocolAntibody Amplification SystemBlood Cell PreparationFluorescence DetectionReceptor QuantificationDisease Biomarker AnalysisCell Surface Markers

Related Articles