Artykuł metodologiczny

Wpływ preparatów sztucznych łez na aktywność metaboliczną ludzkich komórek nabłonka rogówki po ekspozycji na wysuszenie

DOI:

10.3791/60812

⸱

2 maja 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Alcon Vision, LLC, 2Centre for Ocular Research and Education (CORE), School of Optometry & Vision Science, University of Waterloo

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest ocena, czy różne preparaty sztucznych łez mogą chronić ludzkie komórki nabłonka rogówki przed wysuszeniem za pomocą modelu in vitro. Po wystawieniu na działanie preparatów sztucznych łez i wysuszeniu, ludzkie komórki nabłonka rogówki są oceniane pod kątem aktywności metabolicznej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sztuczne preparaty łez zawierające lipidy są opracowywane w celu zmniejszenia parowania łez poprzez przywrócenie wadliwej warstwy lipidowej łez. Preparaty zapobiegające wysuszaniu komórek, które zapobiegają wysuszaniu komórek, spowodują ochronę powierzchni oka i utrzymanie aktywności metabolicznej komórek. Podczas odwodnienia komórki przechodzą proces utraty aktywności metabolicznej, a następnie śmierci komórki. W pracy opisano metodę oceny skuteczności preparatów na sztuczne łzy. Barwnik metaboliczny (tj. alamarBlue) zmienia się z cząsteczki rezazuryny o niskiej fluorescencji w cząsteczkę fluorescencyjną rezorufinę w żywych komórkach. Wydajność biologiczna preparatu ze sztucznymi łzami jest mierzona jako zdolność preparatu do (a) utrzymania żywotności komórek oraz (b) zapewnienia im ochrony przed wysuszeniem. Pożywki wzrostowe i sól fizjologiczna są używane jako kontrole w testach żywotności/wysuszania komórek. Komórki inkubuje się z roztworami testowymi przez 30 minut, a następnie suszy się przez 0 lub 5 minut w temperaturze 37 °C i wilgotności względnej 45%. Następnie określa się aktywność metaboliczną komórek po początkowej ekspozycji i po wysuszeniu komórek. Wyniki pokazują porównawczy wpływ preparatów kropli do oczu na aktywność metaboliczną komórek i ochronę przed wysuszeniem. Metodę tę można zastosować do testowania preparatów z suchym okiem, które są przeznaczone do leczenia osób z suchym okiem wyparnym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wiele różnych składników w wielodawkowych roztworach okulistycznych jest potrzebnych do utrzymania stabilności, pH, osmolarności i skuteczności. Jednak niektóre substancje chemiczne, takie jak konserwanty lub środki powierzchniowo czynne w roztworach do oczu, mogą powodować uszkodzenie nabłonka rogówki1,2. Testy żywotności komórek z wykorzystaniem ludzkich komórek nabłonka rogówki (HCEC) można przeprowadzić w celu oceny potencjalnych uszkodzeń spowodowanych przez te różne składniki w preparatach okulistycznych. Jednym z testów in vitro, który jest szczególnie przydatny do oceny uszkodzeń komórek, jest test alamarBlue3. W tym teście barwnik metaboliczny (tj. alamarBlue) zawiera rezazurynę, która działa jako wskaźnik żywotności komórek. Podczas oddychania komórkowego rezazuryna jest redukowana do rezorufiny poprzez akceptację elektronów4. Zmniejszenie stężenia rezorufiny powoduje zmianę cząsteczki z niefluorescencyjnej na cząsteczkę fluorescencyjną, którą można wykryć za pomocą spektrofluorometru5.

To badanie wykorzystuje dwie różne metody leczenia komórek nabłonka rogówki, aby określić, jak produkty suchego oka mogą działać w modelu in vitro. W pierwszej ocenie komórki są traktowane tymi produktami przez 30 minut. Po leczeniu komórki są następnie oceniane pod kątem aktywności metabolicznej natychmiast po ekspozycji na produkty z suchym okiem i po okresie rekonwalescencji. Ocena ta określa wpływ tych produktów na komórki przed wysuszeniem w komorze wilgotnościowej. Konserwanty w roztworach, środki powierzchniowo czynne lub w tych roztworach mogą mieć pewne działanie cytotoksyczne na komórki, które można wykryć za pomocą barwnika metabolicznego.

Druga ocena określa aktywność metaboliczną komórek po ekspozycji na produkty suchego oka i wysuszeniu. W tej ocenie, jeśli obróbka produktem zapewnia ochronę komórek przed uszkodzeniem spowodowanym wysuszeniem, aktywność metaboliczna komórek zostanie utrzymana. Ochrona komórek przed szkodliwymi skutkami wysuszenia może wystąpić, jeśli produkt suchego oka może pokryć komórki lipidami lub produkt może wchłonąć płyn z otoczenia, dodając wilgoci do komórek.

Ten protokół jest przeznaczony do symulacji ciężkich warunków stresu środowiskowego na komórkach. W innych badaniach wykorzystano różne modele do stworzenia tego zewnętrznego stresu. Niektóre badania suszyły komórki w okapach z przepływem laminarnym6,7,8, podczas gdy inne używały temperatury pokojowej i różnych wartości wilgotności względnej (RH)9,10,11. Metodą symulacji stanu suchego oka jest zwiększenie osmolarności roztworu inkubacyjnego12,13. Inną metodą in vitro do symulacji niekorzystnych warunków środowiskowych jest dodanie cytokin do pożywki komórkowej w celu symulacji płynu łzowego u pacjentów z zespołem suchego oka14. Chociaż testy te są interesującymi modelami, które mogą ocenić, w jaki sposób substancje chemiczne zmniejszają stres osmotyczny lub stymulują układ odpornościowy, modele te nie pokazują bezpośrednio, w jaki sposób preparaty chemiczne mogą chronić komórki przed stresem wysuszenia.

Model suszenia wykorzystuje komorę temperaturowo-wilgotnościową 37 °C i 45% wilgotności względnej. Symuluje warunki środowiskowe, które mogą powodować parowanie z powierzchni oka. Symulacje innych ekstremalnych warunków środowiskowych, takich jak niska wilgotność występująca w kabinach samolotów15 lub w pomieszczeniach w miesiącach zimowych16 mogą być również wykonywane przy użyciu tej metody.

Modelowanie hodowli komórkowych służy do symulacji wpływu stresu związanego z suszeniem na ludzką rogówkę. W celu wykrycia stresu komórkowego przeprowadza się testy żywotności komórek w celu określenia wpływu na zdrowie komórek. Na komórkach można przeprowadzić kilka różnych testów fizjologicznych, aby określić, czy są zestresowane17. W analizie przeprowadzonej w tej procedurze badawczej wykorzystuje się dostępny w handlu barwnik metaboliczny (tabela materiałów). Ma tę przewagę nad wieloma innymi testami stresu komórkowego, że jest nietoksyczny, rozpuszczalny w pożywkach wzrostowych i może oceniać komórki bez fiksacji komórek18. W tej procedurze komórki są testowane pod kątem aktywności metabolicznej natychmiast po każdym zabiegu, a drugi zestaw komórek umieszcza się z powrotem w pożywce wzrostowej i ocenia po 18 godzinach rekonwalescencji. Powodem natychmiastowego testowania, a następnie po okresie rekonwalescencji jest zidentyfikowanie uszkodzeń komórek, które powodują natychmiastowy wpływ na aktywność metaboliczną oraz uszkodzeń komórek, które powodują opóźnione efekty. Daje również możliwość oceny wpływu tych preparatów na krótkotrwałe i długoterminowe uszkodzenia oraz zdolności preparatów do powrotu do zdrowia/braku rekonwalescencji po początkowej zniewadze.

To badanie służy do porównywania różnych produktów suchego oka zawierających lipidy pod kątem ich wpływu na aktywność metaboliczną HCEC z wysuszeniem i bez wysuszenia. Składniki badanych produktów z zespołem suchego oka są opisane w Tabeli Materiałów. Składnikami w roztworze #1 są sól sodowa karboksymetylocelulozy (0,5%), gliceryna (1%) i polisorbat 80 (0,5%), w roztworze #2 są to lekki olej mineralny (1,0%) i olej mineralny (4,5%), a w roztworze #3 lipid to olej mineralny, a glikol propylenowy jest środkiem łagodzącym. Lipidy te są składnikami preparatu, od których oczekuje się, że zapewnią ochronę HCEC przed wysuszeniem.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hodowla ludzkich komórek nabłonka rogówki

  1. Uprawiaj unieśmiertelnione HCEC19 w pokrytych kolagenem75 cm 2 kolbach z 20 ml zmodyfikowanej mieszanki Eagle / składników odżywczych F-12 firmy Dulbecco (DMEM/F12) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny w temperaturze 37 °C z 5% CO2,
    UWAGA: Potrząsanie nie jest wymagane.
  2. Zmieniaj nośnik co 2-3 dni.

2. Przygotowanie komórek do testowania

  1. Po tym, jak komórki prawie się zlewają, usuń pożywkę hodowlaną.
  2. Dodaj 4-6 ml roztworu dysocjacyjnego komórek do każdych kolb o długości 75 cm2. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C aż do oderwania się komórek (około 20-30 min), okresowo sprawdzając pod mikroskopem.
  3. Dodać 2-6 ml DMEM/F12 zawierającego 10% FBS do każdej kolbyo długości 75 cm2.
  4. Przenieść zawartość kolby do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.
  5. Odwirować komórki przy 450−500 x g przez 5 min. Odpipetować supernatant i ponownie zawiesić komórki w podgrzanym pożywce.
  6. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Oblicz objętość nośnika, który zawiera łącznie 1 x 105 komórek.
  7. Dodaj 1 x 105 komórek do każdej studzienki 48-dołkowej płytki hodowlanej pokrytej kolagenem-1. Dodaj tyle pożywki do studzienki, aby końcowa objętość pożywki w studzience wynosiła 0,5 ml kultury DMEM/F12 z 10% FBS.
    UWAGA: Preparat sztucznego łez może powodować cytotoksyczność, którą można zmierzyć poprzez zmniejszenie aktywności metabolicznej HCEC. Spójność danych zależy od dodania tej samej liczby HCEC do każdego dołka podczas wysiewu. Stężenie kultury zalecane dla płytek 48-dołkowych wynosi 1 x 105. Ponieważ komórki ssaków mogą osadzać się w probówce wirówkowej po ponownym zawieszeniu, zaleca się częste zawieszanie komórek przez mieszanie podczas wysiewania płytek z komórkami, tak aby zawiesina komórkowa miała równomiernie rozłożony HCEC.
  8. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.

3. Brak protokołu osuszania

  1. Procedura kontrolna
    1. Po 24 godzinnej inkubacji usunąć pożywkę hodowlaną z płytki.
    2. Natychmiast poddać działaniu 150 μl preparatu testowego i roztworu kontrolnego pożywki.
    3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut.
    4. Usuń roztwory testowe z komórek.
    5. Dodaj 0,5 ml 10% metabolicznego roztworu barwnika, aby przetestować aktywność metaboliczną. Inkubować komórki przez kolejne 4 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    6. Po 4-godzinnym okresie inkubacji usunąć 100 μl metabolicznego roztworu barwnika z każdej studzienki i umieścić każde 100 μl w studzience z 96-dołkową płytką.
    7. Zmierz fluorescencję każdej studzienki za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych (Tabela materiałów). Ustaw długość fali wzbudzenia na 540 nm, a długość fali emisji na 590 nm.
  2. Brak protokołu osuszania (procedura odzyskiwania)
    1. Powtórz kroki 3.1.1−3.1.4.
    2. Dodaj 0,5 ml pożywki DMEM/F12 do każdej studzienki.
    3. Inkubować jeden zestaw kultur przez 18 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    4. Usuń pożywkę i dodaj 0,5 ml 10% metabolicznego roztworu barwnika. Powtórz kroki 3.1.6 i 3.1.7.

4. Protokół osuszania

  1. Procedura kontrolna
    1. Po 24 godzinnej inkubacji (krok 2.8) usunąć pożywkę hodowlaną z płytki.
    2. Natychmiast poddać działaniu 150 μl preparatu testowego i roztworu kontrolnego pożywki.
    3. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut.
    4. Usuń roztwory testowe z komórek.
    5. Umieść komórki w komorze o temperaturze 37 °C i wilgotności względnej 45% na 5 minut, aby wysuszyć komórki.
    6. Dodaj 0,5 ml 10% roztworu barwnika metabolicznego, aby przetestować aktywność metaboliczną. Inkubować komórki przez kolejne 4 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    7. Po 4-godzinnym okresie inkubacji usunąć 100 μl metabolicznego roztworu barwnika z każdej studzienki i umieścić każde 100 μl w studzience z 96-dołkową płytką.
    8. Zmierz fluorescencję każdej studzienki za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Ustaw długość fali wzbudzenia na 540 nm, a długość fali emisji na 590 nm.
  2. Procedura odzyskiwania należności
    1. Powtórz kroki 4.1.1-4.1.5.
    2. Dodaj 0,5 ml pożywki DMEM/F12 do każdej studzienki.
    3. Inkubować jeden zestaw kultur przez 18 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    4. Usuń pożywkę i dodaj 0,5 ml 10% metabolicznego roztworu barwnika. Powtórz kroki 4.1.7 i 4.1.8.

5. Analiza danych

  1. Obliczyć średnią fluorescencję kontrolnego medium. Obliczyć procentową żywotność próbki, korzystając z następującego wzoru:
    Procent żywotności próbki = fluorescencja próbki testowej/fluorescencja kontrolna pożywki x 100
    UWAGA: Średnia kontrola nośnika to 100% żywotności. Sam barwnik metaboliczny ma związaną z nim niewielką ilość fluorescencji. Fluorescencję odczynnika barwnika metabolicznego można odjąć od fluorescencji próbki kontrolnej i badanej przed obliczeniem % żywotności badanych próbek w stosunku do pożywki kontrolnej.
  2. Przeprowadzić test normalności i test na równe odchylenia w próbkach kontrolnych i testowych.
  3. Jeśli test normalności zakończy się pomyślnie, a wariancje są równe, wykonaj jednokierunkową analizę ANOVA. Aby zidentyfikować znaczące różnice między określonymi grupami, wykonaj test porównań parami post hoc (tj. testy wielokrotnych porównań Tukeya lub Dunnetta).
  4. Jeśli test normalności zakończy się pomyślnie, a wariancje są różne, wykonaj ANOVA firmy Welch. Aby zidentyfikować znaczące różnice między określonymi grupami, należy przeprowadzić test porównań post hoc (tj. testy wielokrotnych porównań Dunnetta lub Gamesa-Howella).
  5. Jeśli test normalności zakończy się niepowodzeniem, należy użyć testu nieparametrycznego (tj. testu Kruskala-Wallisa). Aby zidentyfikować znaczące różnice między określonymi grupami, wykonaj test porównań parami post hoc (tj. test Dunna).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki badania porównującego trzy preparaty na suche oko są pokazane w Rysunek 1. Rysunek ten pokazuje, że istnieją różnice w wpływie trzech produktów, roztworu #1, roztworu #2 i roztworu #3 (Tabela materiałów) na żywotność HCEC. Roztwór #1 i roztwór #2 miały znaczący wpływ na aktywność metaboliczną HCEC przed wysuszeniem. Oznacza to, że w tych produktach znajdują się składniki preparatu, które mogą zakłócać aktywność metaboliczną HCEC. Dodatkowy spadek aktywności metabolicznej komórek, który nastąpił po 18 godzinach odzyskiwania komórek wystawionych na działanie roztworu #1, pokazuje, że HCEC był początkowo uszkodzony, a po 18 godzinach uraz nie został naprawiony. Dla porównania, roztwór #3 miał tylko łagodny wpływ na aktywność metaboliczną HCEC.

Rysunek 2 pokazuje wpływ tych preparatów zawierających lipidy na ochronę komórek. Przy bliskiej 0% aktywności metabolicznej HCEC w 18-godzinnym okresie regeneracji, roztwór #1 i roztwór #2 nie chroniły komórek przed stresem wysuszającym. Rozwiązanie #3 zapewniało jednak pewną ochronę przed stresem związanym z wysuszaniem.

figure-results-1
Rycina 1: Wpływ produktów wzbogaconych lipidami w suche oko na żywotność komórek. Względna żywotność mierzona aktywnością metaboliczną HCEC po leczeniu preparatami suchego oka zawierającymi lipidy. * = istotność statystyczna (p < 0,05) w stosunku do roztworu #3, Δ = istotność statystyczna (p < 0,05) w stosunku do kontroli pożywki dla odpowiedniego okresu odzyskiwania. Wysokość słupka reprezentuje wartość średnią, a słupki błędów to SD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Wpływ produktów wzbogaconych lipidami w suche oko na ochronę przed wysuszeniem. Wpływ preparatów suchego oka zawierających lipidy na ochronę komórek. Roztwór #1 i roztwór #2 nie chroniły komórek przed stresem związanym z wysuszeniem i nie regenerowały się one po efektach wysuszenia w czasie. W przeciwieństwie do tego, rozwiązanie #3 zapewniało pewną ochronę przed stresem związanym z wysuszaniem. * = p < 0,05 w stosunku do roztworu #3, a Δ = p < 0,05 w stosunku do pożywki niepoddanej działaniu substancji (kontrolnej) dla odpowiedniego czasu rekonwalescencji. Wysokość słupka reprezentuje wartość średnią, a słupki błędów to SD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten ma na celu określenie ochronnego działania roztworów sztucznych łez przed wysuszeniem komórek. Początkowo komórki są wystawiane na działanie kropli do suchego oka w celu pokrycia komórek. Następnie komórki są suszone, a aktywność metaboliczna jest monitorowana w celu oceny, czy preparaty mogą złagodzić szkodliwe skutki stresu związanego z wysuszaniem. Kroki te mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia ogólnego wpływu, jaki preparaty suchego oka mogą mieć na ogólną żywotność komórek nabłonka rogówki.

Po usunięciu większości preparatów z suchym okiem z dołków hodowlanych, chemia pozostałych cząsteczek, które mają kontakt z komórkami, będzie miała wpływ na wysuszenie komórek. Niektóre produkty zawierają mikroemulsje olejów, które minimalizują parowanie komórek20. Badanie, w którym oceniano analizę tarcia po płukaniu, wykazało utrzymanie niskiego tarcia w przypadku niektórych preparatów suchego oka, co może być wskaźnikiem wydłużonego czasu przebywania preparatów suchego oka21. Jednym z ograniczeń tego testu jest to, że chociaż ochronę przed wysuszeniem można ocenić w porównaniu z innymi preparatami kropli do oczu, nie można określić czasu trwania tej ochrony ze względu na oceniany krótki czas schnięcia. Dłuższe czasy schnięcia w tym teście in vitro mogą wymagać użycia kultur wielowarstwowych, które mają ogólnie większą zawartość wilgoci niż monowarstwa komórkowa.

W przypadku zmiany wartości temperatury i wilgotności może być konieczne dostosowanie określonych czasów inkubacji preparatów na komórkach oraz czasu trwania suszenia. Wybór temperatury, wilgotności względnej i przepływu powietrza do symulacji warunków stresu środowiskowego, które mogą przyczyniać się do suchego oka, może być trudny, ponieważ sezonowe i lokalne warunki środowiskowe są dość zmienne21. Nowoczesne komory środowiskowe do badań na ludziach mogą zmieniać temperaturę w zakresie od 5 °C do 35 °C, a wilgotność względną od 5% do 95%22. Za pomocą parownika i szczelnie dopasowanych okularów stwierdzono, że przy wilgotności względnej 40−45% szybkość parowania z rogówki wynosiła 0,037 μl/cm2/min, a przy wilgotności względnej 20−25% szybkość parowania wynosiła 0,065 μl/cm2/min23. Jeśli model in vitro analizuje ochronne działanie preparatów w warunkach ekstremalnie niskiej wilgotności względnej, takich jak samoloty15, pustynie lub suche środowiska wewnętrzne16, może być konieczne skrócenie czasu inkubacji, aby dostosować się do zwiększonej szybkości parowania z komórek. W ludzkim płynie łzowym obecne są różne lipidy pochodzące z meiboma i innych gruczołów, które chronią łzy przed parowaniem. Te lipidy mają różne temperatury topnienia24. Zmiany temperatury mogą mieć wpływ na płynność płynu łzowego, dlatego testy przeprowadzone w temperaturze otoczenia mogą charakteryzować się znacznie innymi szybkościami parowania niż testy przeprowadzone w temperaturze 37 °C. Ponieważ średni zakres temperatur powierzchni oka wynosi od 32,9 do 36 °C25, zaleca się wykonanie badania w pobliżu tego zakresu temperatur.

Oprócz barwnika metabolicznego (alamarBlue) stosowanego w tym protokole istnieją inne odczynniki chemiczne, które można wykorzystać do oceny wpływu preparatów produktów na aktywność metaboliczną komórek. Sole tetrazolowe (MTT, XTT, MTS, WST) są alternatywnymi substancjami chemicznymi, które można stosować. Różnica w solach tetrazolowych polega na tym, że MTT jest dodatnio naładowaną cząsteczką, więc może dostać się do cytoplazmy żywych komórek26. MTT staje się nierozpuszczalny po jego zmniejszeniu przez NAD(P)H27. Musi być rozpuszczony przed odczytaniem absorbancji na czytniku płytkowym. Pozostałe sole tetrazolium są naładowane ujemnie28. Muszą być redukowane przez cząsteczki wtórne na zewnątrz żywej komórki, ponieważ nie mogą dostać się do komórki i bezpośrednio oddziaływać z cząsteczkami wewnątrzkomórkowymi29. W przypadku testów XTT, MTS i WST-1 dodanie środka sprzęgającego elektrony 1-metoksy-metasiarczanu fenazyny (PMS) może poprawić wydajność testów30. W przeciwieństwie do testów metabolicznych, które wykorzystują sole tetrazoliowe, alamarBlue nie wymaga dodatkowych środków rozpuszczających lub sprzęgających elektrony. Ponadto, w przeciwieństwie do XTT, MTS lub WST-1, alamarBlue przenika przez błony komórkowe i może być redukowany bezpośrednio przez enzymy komórkowe27,29. Bezpośrednie porównanie alamarBlue z solami tetrazolium wykazało, że alamarBlue jest bardziej czuły na ocenę aktywności metabolicznej różnych linii komórkowych, w tym HCEC 3,27,31,32.

Inne biochemiczne punkty końcowe mogą być również brane pod uwagę przy ocenie ochrony ludzkich komórek nabłonka rogówki przez wysuszenie. Barwniki fluorescencyjne mogą być stosowane do wykrywania przepuszczalności błony komórkowej i aktywności esterazy komórkowej1. Apoptozę można również wykryć poprzez barwienie markerów apoptotycznych na powierzchni komórki lub pomiar aktywności kaspazy 1,33. Inne testy określiły wpływ produktów okulistycznych na połączenia ścisłe HCEC34. Testy te mogą zostać włączone do przyszłych ocen z wykorzystaniem procedur osuszania opisanych w tym artykule.

Istnieje wiele przyczyn suchego oka. Suche oko może być spowodowane zmniejszonym wydzielaniem łez, zwiększonym stanem zapalnym powierzchni oka lub zwiększonym odwodnieniem na powierzchni oka. W przypadku osób, które mają suche oko parujące, stosowanie kropli do suchego oka, która zapobiega wysuszeniu komórek w warunkach wysuszenia, może złagodzić objawy suchego oka. Jednym z problemów w niektórych preparatach suchego oka jest obecność konserwantów, które mogą uszkodzić powierzchnię oka. Uszkodzenie komórek nie jest pomocne dla pacjentów z zespołem suchego oka, ponieważ może spowodować śmierć większej liczby komórek, ponieważ uszkodzone komórki są bardziej podatne na stres związany z wysuszeniem35.

Niedawny artykuł przeglądowy Garrigue i wsp.36 zawiera ocenę aktualnej wiedzy na temat działania produktów na bazie lipidów w celu złagodzenia suchego oka spowodowanego parowaniem. Dodanie lipidów do łez z niedoborem lipidów może zapobiec parowaniu, chroniąc w ten sposób komórki przed wysuszeniem. Ponadto humektanty to cząsteczki, które przyciągają i zatrzymują wodę na powierzchni oka37. Zarówno gliceryna w roztworze #1, jak i glikol propylenowy w roztworze #3 są humektantami. Roztwór #3 wykazał silniejsze działanie ochronne HCEC, które mogło wynikać z właściwości lipidowych i humektantowych składników preparatu.

Protokół ten ma na celu ocenę aktywności metabolicznej HCEC po ekspozycji na preparaty suchego oka i na stres związany z wysuszaniem. Stosując metody opisane w tym artykule, można opracować nowe, niedrażniące i ochronne krople do oczu dla osób cierpiących na suche oko wyparne.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Troje autorów (Rekha Rangarajan, Howard A. Ketelson, Lakshman Subbaraman) jest pracownikami firmy Alcon. Firma Alcon jest jedynym źródłem finansowania i sponsorem tego projektu. Lyndon W. Jones w ciągu ostatnich 3 lat otrzymał wsparcie badawcze lub honoraria wykładowców od następujących firm: Alcon, Allergan, Contamac, CooperVision, GL Chemtec, Inflamax Research, J&J Vision, Menicon, Nature's Way, Novartis, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass i Visioneering. Lyndon Jones jest również konsultantem i/lub zasiada w radzie doradczej firm Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis i Ophtecs. Poniższa lista autorów nie ma nic do ujawnienia: Richard Do, David J. McCanna, Adeline Suko, Daryl Enstone, Jaya Dantam.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują firmie Alcon za wsparcie finansowe dla tych badań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
75 cm2 Kolba wentylowanaCorning354485Jest to 96-dołkowa płytka powlekana kolagenem marki BioCoat
costar3370
alamarBlueFisher Scientificdal 1025
Corning 48 Płytki dołkoweCorning354505Jest to pokryta kolagenem marki BioCoat
Cytation 5BioTekCYT5MPVMoże odczytywać fluorescencję od 280 - 700 nm (do testu 540/590)
DMEM/F12 z L-glutaminą i 15 mM HEPESGibco11039-021W tym podłożu nie ma czerwieni fenolowej
Hyconew surowicy bydlęcej płoduSH30396.03
Ludzkie komórki nabłonka rogówkiUniversity of OttawaN/AUnieśmiertelnione SV40 ludzkie komórki nabłonka rogówki od dr M. Griffitha (Ottawa Eye Research Institute, Ottawa, Kanada) i zostały scharakteryzowane przez Griffith M, Osborne R, Munger R, Xiong X, Doillon CJ, Laycock NL, Hakim M, Song Y, Watsky MA. Funkcjonalne odpowiedniki ludzkiej rogówki zbudowane z linii komórkowych. Nauka. 1999; 286:2169–72.
Komora wilgotnościowo-temperaturowaPowiązane systemy środowiskoweLH-1.5Linia ekonomiczna Komora wilgotnościowa
Penicylina StreptomycynaGibco15140-122100X stężenie więc dodaj 1 ml do każdych 99 ml podłoża
Refresh Optive Advanced (roztwór #1)Allergan, IncKarboksymetyloceluloza Sód (0,5%),Gliceryna (1%),Polisorbat 80 (0,5%),-Smary- Składniki nieaktywne-Kwas borowy; kopolimer karbomeru typu A; olej rycynowy; Erytrytol; lewokarnityna; woda oczyszczona; Puryt (stabilizowany kompleks oksychlorowy) i może zawierać wodorotlenek sodu w celu dostosowania pH.
Ukojenie XP (roztwór #2)Bausch & OlejLight (1,0%), Olej mineralny (4,5%)-emolienty-Składniki nieaktywne-kwas borowy, wersenian disodowy, oktoksynol-40, polyquaternium-1 (konserwant), polisorbat 80, woda oczyszczona, dekahydrat boranu sodu. Może zawierać kwas solny i/lub wodorotlenek sodu (w celu dostosowania pH).
Systane Complete (rozwiązanie #3)Alcon Inc.Glikol propylenowy 0,6% Smar Składniki nieaktywne - kwas borowy, dimyrystoyl fosfatydyloglicerol, edatete disodium, hydroksypropyl guar, olej mineralny, stearynian polioxlu 40, POLYQUAD® (polyquaternium-1) 0,001% konserwantu, tristearynian sorbitanu, sorbitol i woda oczyszczona. Może zawierać kwas solny i/lub wodorotlenek sodu w celu dostosowania pH.
TrypLE Express (roztwór do dysocjacji komórek)Fisher Scientific12605036
mineralny Lomb

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).
  2. Maurer, J. K., et al. Quantitative measurement of acute corneal injury in rabbits with surfactants of different type and irritancy. Toxicology and Applied Pharmacology. 158 (1), 61-70 (1999).
  3. Xu, M. L., McCanna, D. J., Sivak, J. G. Use of the viability reagent PrestoBlue in comparison with alamarBlue and MTT to assess the viability of human corneal epithelial cells. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 71, 1-7 (2015).
  4. Slaughter, M. R., Bugelski, P. J., O'Brien, P. J. Evaluation of alamar blue reduction for the in vitro assay of hepatocyte toxicity. Toxicology in Vitro. 13 (4-5), 567-569 (1999).
  5. Hakkarainen, J. J., et al. Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells. International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).
  6. Paulsen, K., Maile, S., Giebel, J., Tost, F. Lubricating agents differ in their protection of cultured human epithelial cells against desiccation. Medical Science Monitor. 14 (6), 12-16 (2008).
  7. Tost, F., Keiss, R., Grossjohann, R., Jurgens, C., Giebel, J. Effect of different artificial tears against desiccation in cultured human epithelial cells. Medical Science Monitor. 18 (5), 188-192 (2012).
  8. Ubels, J. L., et al. Pre-clinical investigation of the efficacy of an artificial tear solution containing hydroxypropyl-guar as a gelling agent. Current Eye Research. 28 (6), 437-444 (2004).
  9. Hovakimyan, M., et al. Evaluation of protective effects of trehalose on desiccation of epithelial cells in three dimensional reconstructed human corneal epithelium. Current Eye Research. 37 (11), 982-989 (2012).
  10. Zheng, X., Goto, T., Shiraishi, A., Ohashi, Y. In vitro efficacy of ocular surface lubricants against dehydration. Cornea. 32 (9), 1260-1264 (2013).
  11. Matsuo, T. Trehalose protects corneal epithelial cells from death by drying. British Journal of Ophthalmology. 85 (5), 610-612 (2001).
  12. Zheng, Q., et al. Reactive oxygen species activated NLRP3 inflammasomes initiate inflammation in hyperosmolarity stressed human corneal epithelial cells and environment-induced dry eye patients. Experimental Eye Research. 134, 133-140 (2015).
  13. Hua, X., et al. Protective Effects of L-Carnitine Against Oxidative Injury by Hyperosmolarity in Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5503-5511 (2015).
  14. Schulze, U., et al. Trefoil factor family peptide 3 (TFF3) is upregulated under experimental conditions similar to dry eye disease and supports corneal wound healing effects in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 3037-3042 (2014).
  15. Giaconia, C., Orioli, A., Di Gangi, A. Air quality and relative humidity in commercial aircrafts: An experimental investigation on short-haul domestic flights. Building and Environment. 67, 69-81 (2013).
  16. van Setten, G., Labetoulle, M., Baudouin, C., Rolando, M. Evidence of seasonality and effects of psychrometry in dry eye disease. Acta Ophthalmologica. 94 (5), 499-506 (2016).
  17. Valtink, M., Donath, P., Engelmann, K., Knels, L. Effect of different culture media and deswelling agents on survival of human corneal endothelial and epithelial cells in vitro. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (2), 285-295 (2016).
  18. Zachari, M. A., et al. Evaluation of the Alamarblue Assay for Adherent Cell Irradiation Experiments. Dose-Response. 12 (2), 246-258 (2014).
  19. Griffith, M., et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).
  20. Benelli, U. Systane lubricant eye drops in the management of ocular dryness. Clinical Ophthalmology. 5, 783-790 (2011).
  21. Davis, R. E., McGregor, G. R., Enfield, K. B. Humidity: A review and primer on atmospheric moisture and human health. Environmental Research. 144 (Pt A), 106-116 (2016).
  22. Calonge, M., et al. Controlled Adverse Environment Chambers in Dry Eye Research. Current Eye Research. 43 (4), 445-450 (2018).
  23. McCulley, J. P., Uchiyama, E., Aronowicz, J. D., Butovich, I. A. Impact of evaporation on aqueous tear loss. Transactions of the American Ophthalmological Society. 104, 121-128 (2006).
  24. Bron, A. J., Tiffany, J. M., Gouveia, S. M., Yokoi, N., Voon, L. W. Functional aspects of the tear film lipid layer. Experimental Eye Research. 78 (3), 347-360 (2004).
  25. Purslow, C., Wolffsohn, J. S. Ocular surface temperature: a review. Eye & Contact Lens. 31 (3), 117-123 (2005).
  26. Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).
  27. Stockert, J. C., Horobin, R. W., Colombo, L. L., Blazquez-Castro, A. Tetrazolium salts and formazan products in Cell Biology: Viability assessment, fluorescence imaging, and labeling perspectives. Acta Histochemica. 120 (3), 159-167 (2018).
  28. Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
  29. Rampersad, S. N. Multiple Applications of Alamar Blue as an Indicator of Metabolic Function and Cellular Health in Cell Viability Bioassays. Sensors. 12 (9), 12347-12360 (2012).
  30. Li, J., Zhang, D. L., Ward, K. M., Prendergast, G. C., Ayene, I. S. Hydroxyethyl disulfide as an efficient metabolic assay for cell viability in vitro. Toxicology in Vitro. 26 (4), 603-612 (2012).
  31. Koyanagi, M., Kawakabe, S., Arimura, Y. A comparative study of colorimetric cell proliferation assays in immune cells. Cytotechnology. 68 (4), 1489-1498 (2016).
  32. Uzunoglu, S., et al. Comparison of XTT and Alamar blue assays in the assessment of the viability of various human cancer cell lines by AT-101 (-/- gossypol). Toxicology Mechanisms and Methods. 20 (8), 482-486 (2010).
  33. McIlwain, D. R., Berger, T., Mak, T. W. Caspase functions in cell death and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), a026716(2015).
  34. McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
  35. Puhlev, I., Guo, N., Brown, D. R., Levine, F. Desiccation tolerance in human cells. Cryobiology. 42 (3), 207-217 (2001).
  36. Garrigue, J. S., Amrane, M., Faure, M. O., Holopainen, J. M., Tong, L. Relevance of Lipid-Based Products in the Management of Dry Eye Disease. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 33 (9), 647-661 (2017).
  37. Lievens, C., et al. Evaluation of an enhanced viscosity artificial tear for moderate to severe dry eye disease: A multicenter, double-masked, randomized 30-day study. Contact Lens & Anterior Eye. 42 (4), 443-449 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test aktywno ci metabolicznejochrona przed wysychaniembarwnik AlamarBluetest ywotno ci kom rekpreparaty na zesp suchego okap ytki pokryte kolagenempomiar fluorescencjianaliza statystyczna

Powiązane artykuły