Method Article

Stabilny knockdown genów kodujących białka macierzy zewnątrzkomórkowej w linii komórkowej mioblastów C2C12 przy użyciu małego spinki do włosów (sh)RNA

DOI:

10.3791/60824

⸱

February 12th, 2020

 ,  , 
1Orthopaedic Research Laboratories, Leni & Peter W. May Department of Orthopaedics, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostarczamy protokół do stabilnego niszczenia genów kodujących białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w mioblastach C2C12 za pomocą małego spinki do włosów (sh) RNA. Na przykładzie ADAMTSL2 opisujemy metody walidacji skuteczności knockdown na poziomie mRNA, białka i komórki podczas różnicowania mioblastów C2C12 do miotub.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) są kluczowe dla rozwoju mięśni szkieletowych i homeostazy. Stabilny knockdown genów kodujących białka ECM w mioblastach C2C12 może być zastosowany do badania roli tych białek w rozwoju mięśni szkieletowych. W tym miejscu opisujemy protokół zubożenia białka ECM ADAMTSL2 jako przykład, przy użyciu RNA o małych spinkach do włosów (sh) w komórkach C2C12. Po transfekcji plazmidów shRNA, stabilne komórki zostały wyselekcjonowane partiami przy użyciu puromycyny. Dalej opisujemy utrzymanie tych linii komórkowych i analizę fenotypową poprzez ekspresję mRNA, ekspresję białka i różnicowanie C2C12. Zaletami tej metody są stosunkowo szybkie generowanie stabilnych komórek knockdown C2C12 oraz niezawodne różnicowanie komórek C2C12 w wielojądrowe miotubki po wyczerpaniu surowicy w pożywce do hodowli komórkowej. Różnicowanie komórek C2C12 można monitorować za pomocą mikroskopii jasnego pola i pomiaru poziomów ekspresji kanonicznych genów markerowych, takich jak MyoD, miogenina lub łańcuch ciężki miozyny (MyHC), wskazujących na postęp różnicowania mioblastów C2C12 w miotubach. W przeciwieństwie do przejściowego knockdownu genów z małymi interferującymi (si) RNA, geny, które ulegają ekspresji później podczas różnicowania C2C12 lub podczas dojrzewania miotuby, mogą być skuteczniej ukierunkowane poprzez generowanie komórek C2C12, które stabilnie wyrażają shRNA. Ograniczeniami metody są zmienność skuteczności knockdownu, w zależności od konkretnego shRNA, które można przezwyciężyć za pomocą strategii nokautu genów opartych na CRISPR/Cas9, a także potencjalne skutki shRNA poza celem, które należy wziąć pod uwagę.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) zapewniają strukturalne wsparcie dla wszystkich tkanek, pośredniczą w komunikacji między komórkami i decydują o losie komórki. Tworzenie i dynamiczna przebudowa ECM ma zatem kluczowe znaczenie dla utrzymania homeostazy tkanek i narządów1,2. Patologiczne warianty w kilku genach kodujących białka ECM powodują zaburzenia układu mięśniowo-szkieletowego o fenotypach od dystrofii mięśniowych do budowy rzekomej muśluzy3,4. Na przykład warianty patogenne w ADAMTSL2 powodować niezwykle rzadkie zaburzenie układu mięśniowo-szkieletowego dysplazję geleofizyjną, która objawia się budową pseudomięśniową, tj. pozornym wzrostem masy mięśni szkieletowych5. Wraz z danymi dotyczącymi ekspresji genów u myszy i ludzi sugeruje to rolę ADAMTSL2 w rozwoju mięśni szkieletowych lub homeostazie6,7.

Protokół, który tutaj opisujemy, został opracowany w celu zbadania mechanizmu, za pomocą którego ADAMTSL2 moduluje rozwój mięśni szkieletowych i/lub homeostazę w warunkach hodowli komórkowej. Stabilnie zniszczyliśmy ADAMTSL2 w mysiej linii komórkowej mioblastów C2C12. Mioblasty C2C12 i ich różnicowanie się w miotubki to dobrze opisany i szeroko stosowany model hodowli komórkowej do różnicowania mięśni szkieletowych i bioinżynierii mięśni szkieletowych8,9. Komórki C2C12 przechodzą przez wyraźne etapy różnicowania po odstawieniu surowicy, co powoduje tworzenie się wielojądrowych miotub po 3-10 dniach w hodowli. Te etapy różnicowania można niezawodnie monitorować, mierząc poziomy mRNA różnych genów markerowych, takich jak MyoD, miogenina lub miozyna łańcucha ciężkiego (MyHC). Jedną z zalet generowania stabilnych knockdownów genów w komórkach C2C12 jest to, że geny, które ulegają ekspresji na późniejszych etapach różnicowania C2C12, mogą być skuteczniej ukierunkowane, w porównaniu z przejściowym knockdownem osiąganym przez RNA o małych interferujących (si), który zwykle trwa przez 5-7 dni po transfekcji i zależy od wydajności transfekcji. Drugą zaletą opisanego tutaj protokołu jest stosunkowo szybkie generowanie partii komórek knockdown C2C12 przy użyciu selekcji puromycyny. Alternatywne rozwiązania, takie jak nokaut genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 lub izolacja pierwotnych prekursorów komórek mięśni szkieletowych od myszy ludzkich lub myszy z niedoborem genu docelowego, są technicznie trudniejsze lub wymagają dostępności biopsji mięśni pacjenta lub myszy z niedoborem genu docelowego. Jednak, podobnie jak w przypadku innych podejść opartych na hodowlach komórkowych, istnieją ograniczenia w stosowaniu komórek C2C12 jako modelu różnicowania komórek mięśni szkieletowych, takie jak dwuwymiarowy (2D) charakter hodowli komórkowej i brak mikrośrodowiska in vivo, które ma kluczowe znaczenie dla utrzymania niezróżnicowanych komórek prekursorowych mięśni szkieletowych10.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie plazmidowego DNA shRNA z Escherichia coli

  1. Wytwarzanie klonalnych kolonii bakteryjnych przenoszących plazmidy shRNA
    1. Uzyskać zapasy glicerolu E. coli zawierające specyficzne dla celu plazmidy shRNA i plazmid kontrolny ze źródeł komercyjnych (tabela materiałów).
      UWAGA: Użyto trzech różnych plazmidów shRNA, ukierunkowanych na różne regiony mysiego mRNA Adamtsl2. Wybrano jedno shRNA tak, aby celować w region 3'-nieulegający translacji (3'UTR) Adamtsl2, aby ułatwić eksperymenty ratunkowe z plazmidami ekspresyjnymi kodującymi rekombinowane ADAMTSL2 pełnej długości lub indywidualne domeny białek ADAMTSL2. Ponadto jako kontrolę ujemną włączono zaszyfrowany plazmid shRNA. Szczegółowe informacje na temat sekwencji shRNA znajdują się w Rysunek 1A.
    2. Rozmrozić bakteryjny zapas glicerolu shRNA w temperaturze pokojowej (RT). Przenieść 10 μl bakteryjnego glicerolu na płytkę agarową Luria-Bertani (LB) uzupełnioną 100 μg/ml ampicyliny (LB-Amp).
      UWAGA: Płytki LB-Amp przygotowuje się przez autoklawowanie 1 l pożywki LB (na 1 l: 10 g tryptonu, 5 g ekstraktu drożdżowego, 10 g NaCl należy dostosować pH do 7,0) wraz z 12 g agaru. Pozostawić pożywkę do ostygnięcia do ~50 °C i dodać ampicylinę (roztwór podstawowy: 50 mg/ml w sterylnej wodzie) do końcowego stężenia μg/ml (agar LB-Amp). Natychmiast wlej ~20 ml agaru LB-Amp na 10 cm szalkę Petriego i pozwól agarowi zastygnąć przed użyciem. 1 L agaru LB-Amp wystarcza zazwyczaj na wlanie około 40 10 cm szalek Petriego. Szalki Petriego zawierające agar LB-Amp są stabilne przez co najmniej jeden miesiąc, jeżeli są przechowywane szczelnie zamknięte w temperaturze 4 °C w ciemności.
    3. Rozprowadź bakterie za pomocą sterylnej szpatułki Drygalskiego lub innej odpowiedniej metody, aby uzyskać pojedyncze kolonie bakteryjne. Inkubować płytki bakteryjne do góry nogami przez noc w temperaturze 37 °C.
  2. Przygotowanie plazmidu
    1. Następnego ranka wyjąć szalkę Petriego z poszczególnymi koloniami bakteryjnymi i przechowywać w temperaturze 4 °C, aby uniknąć przerostu kolonii bakteryjnych i tworzenia kolonii satelitarnych. Zamknij szalkę Petriego, jeśli jest przechowywana przez noc lub dłużej.
    2. Po południu dodaj 5 ml pożywki LB-Amp do probówki do hodowli bakterii polipropylenowych. Wybrać pojedynczą kolonię bakteryjną z szalki Petriego hodowaną przez noc za pomocą końcówki pipety i zaszczepić pożywkę LB-Amp, wyrzucając końcówkę pipety do probówki do hodowli bakterii zawierającej pożywkę LB-Amp.
    3. Inkubować kulturę bakteryjną przez noc w wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w temperaturze 37 °C z luźno zamocowaną pokrywką umożliwiającą napowietrzenie.
    4. Następnego ranka wyjmij probówkę do hodowli bakterii i utrzymuj w temperaturze 4 °C, aby uniknąć przerostu bakterii. Po południu ponownie zawiesić bakterie przez wirowanie i przenieść 1 ml nocnej kultury bakteryjnej w 50 ml pożywki LB-Amp w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml. Inkubować przez noc w wytrząsarce z prędkością 250 obr./min w temperaturze 37 °C.
    5. Następnego ranka przenieś bakterie do jednorazowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i odwiruj bakterie przy 6 000 x g przy RT przez 15 minut. Usuń pożywkę i kontynuuj krok 1.2.6.
      UWAGA: Jeśli plazmidowego DNA nie można natychmiast wyizolować, usuń pożywkę LB-Amp po etapie wirowania i przechowuj osad bakteryjny w temperaturze -20 °C.
    6. Postępuj zgodnie z instrukcjami dotyczącymi zestawu do przygotowania plazmidu (skala midi), aby wyekstrahować plazmidowe DNA z bakterii. Oceń jakość DNA plazmidu, mierząc stosunek A260/A280 za pomocą spektrofotometru.
      UWAGA: Stosunek A260/A280 wynoszący >1,8 jest pożądany, co wskazuje na wysoką czystość preparatu plazmidowego DNA. Niższy stosunek A260/A280 sugeruje zanieczyszczenie białkiem lub niewystarczające usunięcie odczynników ekstrakcyjnych. Mogą być wymagane dodatkowe etapy oczyszczania plazmidu.

2. Hodowla i transfekcja komórek C2C12 oraz selekcja puromycyny

  1. Hodowla komórkowa C2C12
    1. Szybko rozmrozić komórki C2C12 (tabela materiałów) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i wlać komórki do sterylnej jednorazowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 8 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 100 jednostkami antybiotyków penicyliny i streptomycyny (DMEM bez surowicy) w kapturze do hodowli komórkowych. Odwirowywać komórki przez 3 minuty przy 160 x g w temperaturze pokojowej.
    2. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml DMEM bez surowicy, uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) (complete DMEM). Przenieś komórki do 10 cm plastikowych naczyń poddanych kulturze tkankowej. Inkubować komórki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2
      3. .
    3. Następnego dnia zastąp pożywkę świeżym, kompletnym DMEM.
    4. Rozwiń komórki C2C12 o niskim przelocie na szalkach 3−4 o średnicy 10 cm. Gdy komórki C2C12 osiągną 50-60% konfluencji, odessać pożywkę i przepłukać komórki C2C12 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    5. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA i inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Monitorować odrywanie komórek pod mikroskopem i w razie potrzeby wydłużyć czas inkubacji, aż większość komórek zostanie oderwana.
      UWAGA: Ostrożne stukanie w naczynie może pomóc w usunięciu komórek.
    6. Gdy większość komórek zostanie odłączona, dodaj 10 ml kompletnego DMEM do naczynia, kilkakrotnie pipetuj objętość w górę i w dół i przenieś zawiesinę komórek do sterylnej jednorazowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przez 3 minuty przy 160 x g w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml pożywki do zamrażania (10% dimetylosulfotlenku [DMSO]/90% FBS).
    7. Przenieść dwie porcje po 1 ml na 10 cm szalkę w kriowialach. Inkubować w pojemniku do zamrażania komórek wypełnionym izopropanolem RT przez co najmniej 24 godziny w zamrażarce o temperaturze -80 °C, co daje szybkość zamrażania około -1 °C na minutę, aby uniknąć tworzenia się kryształków lodu. Przechowuj ogniwa do długotrwałego użytku w fazie gazowej ciekłego azotu.
      UWAGA: Sprzedawca zaleca stosowanie ogniw C2C12 do przejścia numer 15. Doświadczenia autorów wykazały również, że komórki o niższej liczbie pasaży wykazywały bardziej spójne i szybkie różnicowanie się w miotuby. Niezbędne jest utrzymanie komórek C2C12 przy niskiej gęstości komórek (<50% konfluencji), aby uniknąć przedwczesnego początku różnicowania. Różnicujące się lub zróżnicowane komórki C2C12 nie mogą zostać przywrócone do pierwotnego stanu mioblastów i muszą zostać odrzucone.
  2. Przygotowanie komórek C2C12 do transfekcji
    1. Hoduj niezróżnicowane komórki C2C12 w 10-centymetrowym naczyniu, aż osiągną 50−60% konfluencji. Odessać pożywkę, przepłukać komórki C2C12 10 ml PBS i dodać 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, monitorować odklejanie komórek pod mikroskopem i w razie potrzeby wydłużać czas inkubacji, aż większość komórek zostanie odłączona.
      UWAGA: Ostrożne stukanie w naczynie może pomóc w usunięciu komórek.
    2. Gdy większość komórek zostanie odłączona, dodaj 10 ml kompletnego DMEM do naczynia i przenieś zawiesinę komórek do sterylnej jednorazowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przez 3 minuty przy 160 x g w temperaturze pokojowej stężenia. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 4 ml kompletnego DMEM.
    3. Połączyć 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl błękitu trypanowego w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml, mieszać pipetując w górę i w dół, ostrożnie przesuwając probówkę reakcyjną, a następnie przenieść komórki na szkiełko zliczające. Określ liczbę komórek/ml za pomocą automatycznego licznika komórek.
    4. Rozcieńczyć komórki C2C12 do 50 000 komórek / ml i zasiać 100 000 komórek (2 ml) na studzience na płytce 6-dołkowej, aby osiągnąć około 40-50% konfluencji po całonocnej inkubacji. Inkubować komórki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2
      5. .
  3. Transfekcja komórek C2C12 plazmidem shRNA przy użyciu selekcji polietyleneniminy (PEI) i puromycyny
    1. Przygotowanie roztworu podstawowego PEI
      1. Rozpuścić 16 mg PEI w 50 ml sterylnej wody destylowanej (stężenie roztworu podstawowego: 0,32 mg/ml) w szklanej butelce z zakrętką o pojemności 50 ml. Inkubować roztwór w temperaturze 65 °C przez 1 godzinę i energicznie mieszać roztwór kilka razy w okresie inkubacji, aby całkowicie rozpuścić PEI.
      2. Dostosuj do pH 8, dodając 15 μl 1N HCl na 50 ml.
        UWAGA: HCl jest. Skoncentrowany HCl należy obchodzić się pod wyciągiem. Śledczy powinni nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
      3. Zamrozić roztwór PEI w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę z luźno przymocowaną pokrywką i szybko rozmrozić w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej, aby jeszcze bardziej zwiększyć rozpuszczalność. Powtórz cykl zamrażania i rozmrażania 3 razy.
      4. Roztwór podstawowy PEI należy przechowywać w podwielokrotnościach o pojemności 0,5 ml do jednorazowego użycia w temperaturze -20 °C.
    2. Transfekcja komórek C2C12
      1. Połączyć 25,5 μl (8,5 μl/μg plazmidowego DNA) roztworu podstawowego PEI ze 100 μl 25 mM NaCl w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Połączyć 3 μg plazmidowego DNA ze 100 μl 25 mM NaCl i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
      2. Połączyć całą objętość rozcieńczonego odczynnika PEI z rozcieńczonym plazmidem i wymieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół. Inkubować przez 25 minut w temperaturze 37 °C.
      3. W czasie inkubacji należy zmienić pożywkę komórek C2C12 przeznaczonych do transfekcji do DMEM bez FBS lub antybiotyków.
      4. Dodawać mieszaninę transfekcji PEI/DNA do komórek C2C12 kropla po kropli i ciągle mieszać, ostrożnie przesuwając naczynie do hodowli komórkowych. Inkubować w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2. Po 6 godzinach zmień pożywkę na kompletny DMEM.
    3. Wybór puromycyny
      1. 24 godziny po transfekcji zmień pożywkę na pożywkę selekcyjną (kompletny DMEM plus 5 μg/ml puromycyny). Kontynuuj selekcję puromycyny, aż do uzyskania komórek C2C12 opornych na puromycynę, co zwykle trwa 10-14 dni.
      2. Rozszerz komórki C2C12 odporne na puromycynę przy niskiej gęstości komórek (konfluencja <50−60%), tj. w celu utrzymania stanu niezróżnicowanego i kriokonserwacji 6-10 fiolek do przyszłych eksperymentów, jak opisano w krokach 2.1.4−2.1.7.
        UWAGA: Utrzymuj komórki C2C12 odporne na puromycynę w obecności puromycyny 5 μg/ml puromycyny do rutynowej hodowli i ekspansji komórek. Jednak puromycyna została pominięta w eksperymentach różnicujących.

3. Analiza fenotypowa różnicowania C2C12

UWAGA: Opisane poniżej metody można łatwo dostosować do ogólnej analizy fenotypowej różnicowania mioblastów C2C12 w miotubach poprzez zmianę specyficznych przeciwciał stosowanych w Western blotting lub specyficznych dla genów starterów używanych w ilościowej analizie łańcuchowej polimerazy (qPCR).

  1. Protokół różnicowania C2C12 i mikroskopia jasnego pola
    1. Wysiej 150 000 komórek / studzienkę na płytce 12-dołkowej. Hodować odporne na puromycynę stabilne komórki C2C12 na 12-dołkowej płytce w pożywce selekcyjnej w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5%CO2. Hoduj komórki C2C12 w kompletnym DMEM, aż osiągną ~95% konfluencji.
    2. Aby indukować różnicowanie komórek C2C12, zastąp cały DMEM DMEM bez surowicy (dzień 0 różnicowania). Zmieniaj pożywkę co dwa dni i obserwuj powstawanie miotubki C2C12 za pomocą mikroskopu odwróconego jasnego pola z kamerą.
      UWAGA: Wiele protokołów wykorzystuje 2% surowicę końską do różnicowania komórek C2C12 w miotuby. W rękach autorów podobny efekt przyniosło całkowite usunięcie serum. Insulina jest opisywana jako dodatek do pożywki do hodowli komórkowych w celu przyspieszenia różnicowania C2C12. Jednak w obecnym protokole komórki C2C12 niezawodnie różnicowały się w miotube'y w ciągu 3-5 dni po tym, jak pozbawienie surowicy i dodanie insuliny uznano za niepotrzebne.
  2. Barwienie immunologiczne miozyny łańcucha ciężkiego (MyHC) w celu wizualizacji miotub
    1. Wysiewaj 50 000 odpornych na puromycynę komórek C2C12 na komorę w 8-dołkowym szkiełku w 500 μl kompletnego DMEM. Hoduj komórki, aż osiągną 95% konfluencji w pełnym DMEM (około 24 godzin).
    2. Aby wywołać różnicowanie, należy zmienić z pełnego DMEM na 500 μl DMEM bez surowicy (dzień 0 różnicowania). W żądanym punkcie czasowym odessać pożywkę i przepłukać komórki 3x 0,5 ml PBS.
      UWAGA: Wykonaj wszystkie poniższe kroki w RT.
    3. Napraw komórki 0,2 ml 4% paraformaldehydu (PFA) rozcieńczonego w PBS przez 15 min. Przepłucz komórki 0,5 ml PBS 3x po 5 minut każda.
      UWAGA: PFA jest niebezpieczny. Podejmij odpowiednie środki ostrożności i wyrzuć roztwór paraformaldehydu jako odpad niebezpieczny.
    4. Ugasić PFA 0,2 ml 0,5 M glicyny w PBS przez 5 minut. Przepłukać komórki 0,5 ml PBS 3x przez 5 minut każda.
    5. Inkubować komórki z 0,2 ml 0,1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego/detergentu (tabela materiałów) w PBS przez 10 minut, aby przeniknąć przez błonę komórkową. Blok z 0,2 ml 5% albuminy surowicy bydlęcej w PBS przez 1 godzinę. Płucz komórki 0,5 ml PBS 3x przez 5 minut każda.
    6. Inkubować komórki z 0,2 ml przeciwciała MyHC (1:200 w PBS) przez 2 godziny. Płukać komórki 0,5 ml PBS 3x przez 5 minut każda.
    7. Inkubuj komórki z 0,2 ml koziego przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z krwionośną krwią przeciwko mysiej rodaminie (1:200 w PBS). Płucz komórki 0,5 ml PBS 3x przez 5 minut każda.
    8. Po ilościowym usunięciu PBS dodać jedną kroplę podłoża montażowego zawierającego 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) na komorę. Szkiełko nakrywkowe i utwardzić podłoże montażowe zgodnie z instrukcją producenta. Uszczelnij lakierem do paznokci.
    9. Obserwuj komórki C2C12 za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy użyciu odpowiedniego zestawu filtrów.
  3. Ocena skuteczności knockdown za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)
    1. Hodowla komórek C2C12 w warunkach różnicowania na płytkach 12-dołkowych, jak opisano w sekcji 3.1.
    2. W żądanym punkcie czasowym (punktach) czasowym usuń pożywkę różnicującą, przepłucz komórki raz 1 ml PBS i dodaj 0,5 ml odczynnika do ekstrakcji RNA (tabela materiałów) do dołka. Poddać komórki lizie, ostrożnie pipetując w górę i w dół, a następnie przenieść lizat komórkowy do sterylnej probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml. Wyizoluj RNA, dokładnie postępując zgodnie z protokołem producenta.
      UWAGA: Odczynnik do ekstrakcji RNA zawiera fenol. Powinien być używany pod wyciągiem. Zebrać odpady odczynnika do ekstrakcji RNA i zutylizować jako odpady niebezpieczne. Śledczy powinni nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
    3. Rozpuść końcowe osady RNA w 20 μl wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC). Określić ilość i jakość preparatu RNA za pomocą spektrofotometru i określić stosunek A260/A280 jako miarę jakości.
      UWAGA: Typowa wydajność z 1 dołka z płytki 12-dołkowej wynosi 5−7 μg całkowitego RNA przy stosunku A260/A280 wynoszącym 1,8−2.
    4. Aby strawić resztki wspólnie oczyszczonego genomowego DNA, rozcieńczyć 1 μg RNA w całkowitej objętości 8 μl wody uzdatnionej DEPC w probówce PCR. Dodać 1 μl 10x buforu reakcyjnego i 1 μl DNazy I (1 jednostka/μl) (tabela materiałów) i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 1 μl roztworu zatrzymującego (25 mM EDTA) i inkubować w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
    5. Aby wygenerować cDNA, połącz 10 μl RNA traktowanego DNazą z 10 μl 2x głównej mieszaniny odwrotnej transkryptazy, zawierającej odwrotną transkryptazę, losowe startery, 4 mM mieszaninę dNTP (po 1 mM dATP, dTTP, dGTP i dCTP) i bufor reakcji odwrotnej transkryptazy. Inkubuj reakcję w termocyklerze za pomocą programu zgodnie z zaleceniami producenta. Rozcieńczyć cDNA wodą w stosunku 1:5.
    6. Aby przygotować reakcję qRT-PCR, należy połączyć 5 μl zielonej mieszanki głównej qPCR SYBR z 0,5 μl specyficznych dla genu starterów do przodu i do tyłu (zapas: 10 μM) i 2 μl wody uzdatnionej DEPC na reakcję. Odpipetować reakcję qPCR w jednym dołku z 96-dołkowej płytki qRT-PCR i dodać 2 μl rozcieńczonego cDNA. Skonfiguruj trzy kontrpróby techniczne dla każdej kontrpróby biologicznej i uwzględnij gen porządkowy, taki jak Gapdh lub Hprt1.
    7. Amplifikować produkt PCR za pomocą termocyklera qRT-PCR przy użyciu następującego programu: 50 °C przez 2 minuty (aktywacja glikozylazy uracylo-DNA [UDG]), 95 °C przez 2 minuty (aktywacja polimerazy DNA z podwójną blokadą), 40 cykli po 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 1 min.
    8. Określ ilościowo wyniki qRT-PCR za pomocą metody DDCt, normalizując do genu porządkowego, takiego jak Gapdh lub Hprt1.
  4. Ocena skuteczności knockdown za pomocą Western blotting
    1. Wysiewaj 300 000 komórek C2C12 odpornych na puromycynę na studzienkę w 6-dołkowej płytce do analizy Western blot. Po 24 godzinach zmień pożywkę na DMEM bez surowicy, aby zainicjować różnicowanie (dzień 0 różnicowania).
    2. W żądanym punkcie czasowym zebrać dwie pożywki o pojemności 1 ml kondycjonowanej bez surowicy w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml i wirować przez 5 minut przy 500 x g w temperaturze pokojowej w celu usunięcia oderwanych komórek i resztek komórek.
      UWAGA: Ten etap jest konieczny tylko wtedy, gdy badane są białka ECM lub inne białka wydzielane w kondycjonowanej pożywce. Jeśli białko będące przedmiotem zainteresowania jest zlokalizowane w cytoplazmie lub jest związane z błoną, odessać pożywkę do hodowli komórkowej i kontynuować etapy lizy komórek (3.4.7−3.4.12). Liza komórek powinna być przeprowadzana równolegle do wytrącania białka z pożywki kondycjonowanej bez surowicy, aby zminimalizować degradację proteolityczną i inne niezamierzone konsekwencje długotrwałego przechowywania warstwy komórkowej.
    3. Po odwirowaniu przenieść 1 ml kondycjonowanej pożywki do nowej probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml i wytrącić białka, dodając 0,391 ml mieszaniny kwasu trichlorooctowego (TCA) i niejonowego środka powierzchniowo czynnego/detergentu. Krótko zmieszać mieszaninę i inkubować przez 10 minut na lodzie.
      UWAGA: Przygotować mieszaninę wytrącania białek bezpośrednio przed użyciem, mieszając 0,252 ml 55% TCA i 0,139 ml 1% niejonowego środka powierzchniowo czynnego/detergentu na ml kondycjonowanej pożywki i krótko wirować. Roztwór staje się mętny.
      UWAGA: TCA jest i należy się z nim odpowiednio obchodzić.
    4. Wytrącone białka osadzać w temperaturze 16 000 x g o > przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
      UWAGA: Supernatant zawiera TCA i powinien być zbierany oddzielnie i utylizowany jako materiał niebezpieczny.
    5. Przemyć osad białkowy 3x lodowatym acetonem i odwirować za każdym razem w temperaturze 16 000 x g > przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Wysuszyć na powietrzu osad białkowy przez 3-4 minuty w temperaturze pokojowej i rozpuścić w 50 μl 1x buforu próbki do elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) (50 mM Tris pH 6,8, 2% SDS, 6% glicerolu i 0,004% błękitu bromofenolowego, uzupełnionego 5% β-merkaptoetanolem). Gotować próbkę przez 5 minut w temperaturze 95 °C i użyć do Western blot w celu wykrycia pożądanego białka docelowego przy użyciu standardowych procedur.
      UWAGA: β-merkaptoetanol jest nieprzyjemny i toksyczny i należy się z nim obchodzić w dygestorium.
    7. W przypadku białek wewnątrzkomórkowych i błonowych należy przepłukać warstwę komórkową raz 2 ml PBS.
    8. Dodać 1 ml PBS i usunąć komórki, zeskrobując je ze studzienki za pomocą skrobaka do komórek. Zebrać komórki w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 3,420 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Przemyć osad komórkowy 3x 1 ml PBS i odwirować przy 3,420 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C za każdym razem.
    9. Aby zlizować komórki, ponownie zawieś osad komórkowy w 0,2 ml buforu do lizy (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP40, 1% deoksycholan sodu, 2,5 mM pirofosforan sodu, 1 mM β-glicerofosforan i 1 mM orthovanadan sodu) uzupełniony 1x odczynnikiem koktajlowym inhibitora proteazy bez EDTA i inkubuj przez 30 minut na lodzie.
    10. Ultradźwięki przez 15 s na lodzie z ustawieniem mocy wyjściowej 10 przy częstotliwości roboczej 23 kHz.
    11. Usunąć resztki komórek przez odwirowanie przy 13 680 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant w nowej probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml i oznaczyć stężenie białka za pomocą dostępnego w handlu testu Bradforda lub innej odpowiedniej metody.
    12. Dla każdej próbki należy połączyć 100 μg białka z 5 próbki SDS-PAGE o łącznej objętości 60 μl i gotować przez 5 minut w temperaturze 95 °C. Próbki należy analizować za pomocą standardowych procedur Western blot na obecność pożądanego białka docelowego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Selekcja C2C12 opornego na puromycynę może być osiągnięta w ciągu 10−14 dni po transfekcji dzięki skutecznej eliminacji nieopornych, tj. nietransfekowanych komórek (Rysunek 1B). Zazwyczaj ponad 80% komórek odłącza się od naczynia do hodowli komórkowej i komórki te są usuwane podczas rutynowej konserwacji komórek. Oporne na puromycynę komórki C2C12 wykazujące ekspresję kontrolnego (zaszyfrowanego) shRNA zachowują wrzecionowaty, wydłużoną morfologię komórek przy niskiej gęstości komórek...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano tutaj protokół stabilnego knockdown białek ECM w mioblastach C2C12 oraz analizy fenotypowej różnicowania mioblastów C2C12 w miotuby. O wyniku eksperymentu decyduje kilka czynników, które należy dokładnie rozważyć. Utrzymanie komórek C2C12 w fazie proliferacji jest kluczowym krokiem do utrzymania komórek C2C12 w stanie prekursorowym mioblastów. Zachowanie zdolności komórek C2C12 do konsekwentnego różnicowania się w miotubki zależy od i) liczby pasaży komórek, ii) gęstości hodowanych komórek podczas rutynowej konse...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.H. jest wspierany przez National Institutes of Health (National Institute for Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, NIAMS, grant numer AR070748) oraz fundusze zalążkowe z Leni & Peter W. May Department of Orthopaedics, Icahn School of Medicine w Mt. Sinai.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonFisher Chemical191784
AgarFisher BioreagentsBP1423
AmpicillinFisher BioreagentsBP1760-5
Automatyczny licznik komórek Countesse IIInvitrogenA27977
Bradford OdczynnikThermo ScientificP4205987
Komórki C2C12ATCCCRL-1772
Szkiełka komoroweInvitrogenC10283
ChloroformFisher Chemical183172
DMEMGIBCO11965-092
DMSO Fisher BioreagentsBP231-100
DNase I (stopień amplifikacji)Invitrogen18068015
Surowica bydlęcapłodu VWR97068-085
GAPDHEMD MilliporeMAB374
GlicynaVWR Life Sciences19C2656013
Kozie przeciwciało wtórne przeciwko myszom (IRDYE 800CW)Li-CorC90130-02
Przeciwciało wtórne przeciwko myszom (rodamina-czerwień)Jackson Immune Research133389
HClFisher ChemicalA144S
Inkubator (wytrząsarka)Denville Scientific Corporation1704N205BC105
MerkaptoetanolAmresco, VWR Life Sciences2707C122
Zestaw do ekstrakcji plazmidu MidiprepQiagen12643
Myosin 4 (łańcuch ciężki miozyny)Invitrogen14-6503-82
Podłoże montażoweInvitrogen2086310
NaClVWR Life Sciences241
niejonowy środek powierzchniowo czynny/detergentVWR Life Sciences18D1856500
ParaformaldehydMP199983
PBSFisher BioreagentsBP399-4
PEIPolysciences23966-1
Penicylina/streptomycyna AntybiotykiGIBCO15140-122
PetridishCorning353003
Rurki polipropylenoweFisherbrand149569C
Inhibitor proteazy w tabletkach koktajlowychRoche33576300
PuromycinFisher ScientificBP2956100
PCR (Real Time)Biosystemy stosowane4359284
reakcji probówki Eppendorf22364111
Reverse Transcription Master MixApplied Biosystems4368814
Bufor RIPAThermo ScientificTK274910
plazmid kontrolny shSigma-Aldrich07201820MN
sh 3086 plazmidSigma-AldrichTRCN0000092578
sh 972 plazmidSigma-Aldrich
sh 1977 plazmidSigma-AldrichTRCN0000092582
Spektrofotometr (Nanodrop)Thermo ScientificNanoDrop One C
SYBR Green Reagent Master MixApplied Biosystems743566
Kwas trichlorooctowyAcros Organics30145369
Odczynnik TrizolAmbion
Błękit trypanowyGIBCO15250-061
TryptonFisher BioreagentsBP1421
Trypsyna EDTA 0,25%Gibco-Life Technology Corporation2085459
Woda (poddana działaniu DEPC i wolna od nukleaz)Odczynniki Fisher186163
Aparat do blottinguWestern BioradMini Protean Tetra Cell
Ekstrakt drożdżowyFisher BioreagentsBP1422
TRCN0000092579254707

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tanzer, M. L. Current concepts of extracellular matrix. Journal of Orthopaedic Science: Official Journal of the Japanese Orthopaedic Association. 11 (3), 326-331 (2006).
  2. Hubmacher, D., Apte, S. S. The biology of the extracellular matrix: novel insights. Current Opinion in Rheumatology. 25 (1), 65-70 (2013).
  3. Sakai, L. Y., Keene, D. R. Fibrillin protein pleiotropy: Acromelic dysplasias. Matrix Biology. 80, 6-13 (2019).
  4. Iozzo, R. V., Gubbiotti, M. A. Extracellular matrix: The driving force of mammalian diseases. Matrix Biology. 71-72, 1-9 (2018).
  5. Le Goff, C., et al. ADAMTSL2 mutations in geleophysic dysplasia demonstrate a role for ADAMTS-like proteins in TGF-beta bioavailability regulation. Nature Genetics. 40 (9), 1119-1123 (2008).
  6. Dubail, J., Apte, S. S. Insights on ADAMTS proteases and ADAMTS-like proteins from mammalian genetics. Matrix Biology. 44-46, 24-37 (2015).
  7. Koo, B. H., et al. ADAMTS-like 2 (ADAMTSL2) is a secreted glycoprotein that is widely expressed during mouse embryogenesis and is regulated during skeletal myogenesis. Matrix Biology. 26 (6), 431-441 (2007).
  8. Khodabukus, A., Baar, K. The effect of serum origin on tissue engineered skeletal muscle function. Journal of Cellular Biochemistry. 115 (12), 2198-2207 (2014).
  9. Bajaj, P., et al. Patterning the differentiation of C2C12 skeletal myoblasts. Integrative Biology. 3 (9), 897-909 (2011).
  10. Mashinchian, O., Pisconti, A., Le Moal, E., Bentzinger, C. F. The Muscle Stem Cell Niche in Health and Disease. Current Topics in Developmental Biology. 126, 23-65 (2018).
  11. Hindi, L., McMillan, J. D., Afroze, D., Hindi, S. M., Kumar, A. Isolation, Culturing, and Differentiation of Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult Mice. Bio-protocol. 7 (9), 2248(2017).
  12. Krauss, R. S., Joseph, G. A., Goel, A. J. Keep Your Friends Close: Cell-Cell Contact and Skeletal Myogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (2), 029298(2017).
  13. Lawson, M. A., Purslow, P. P. Differentiation of myoblasts in serum-free media: effects of modified media are cell line-specific. Cells Tissues Organs. 167 (2-3), 130-137 (2000).
  14. Fujita, H., Endo, A., Shimizu, K., Nagamori, E. Evaluation of serum-free differentiation conditions for C2C12 myoblast cells assessed as to active tension generation capability. Biotechnology and Bioengineering. 107 (5), 894-901 (2010).
  15. Cheng, C. S., et al. Conditions that promote primary human skeletal myoblast culture and muscle differentiation in vitro. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 306 (4), 385-395 (2014).
  16. Conejo, R., Valverde, A. M., Benito, M., Lorenzo, M. Insulin produces myogenesis in C2C12 myoblasts by induction of NF-kappaB and downregulation of AP-1 activities. Journal of Cellular Physiology. 186 (1), 82-94 (2001).
  17. Dodds, E., Dunckley, M. G., Naujoks, K., Michaelis, U., Dickson, G. Lipofection of cultured mouse muscle cells: a direct comparison of Lipofectamine and DOSPER. Gene Therapy. 5 (4), 542-551 (1998).
  18. Balcı, B., Dinçer, P. Efficient transfection of mouse-derived C2C12 myoblasts using a matrigel basement membrane matrix. Biotechnology Journal. 4 (7), 1042-1045 (2009).
  19. Xia, D., et al. Overexpression of chemokine-like factor 2 promotes the proliferation and survival of C2C12 skeletal muscle cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research. 1591 (1), 163-173 (2002).
  20. Tapia, O., Gerace, L. Analysis of Nuclear Lamina Proteins in Myoblast Differentiation by Functional Complementation. Methods in Molecular Biology. 1411, 177-194 (2016).
  21. Yamano, S., Dai, J., Moursi, A. M. Comparison of transfection efficiency of nonviral gene transfer reagents. Molecular Biotechnology. 46 (3), 287-300 (2010).
  22. Luo, J., et al. An efficient method for in vitro gene delivery via regulation of cellular endocytosis pathway. International Journal of Nanomedicine. 10, 1667-1678 (2015).
  23. Sandri, M., Bortoloso, E., Nori, A., Volpe, P. Electrotransfer in differentiated myotubes: a novel, efficient procedure for functional gene transfer. Experimental Cell Research. 286 (1), 87-95 (2003).
  24. Yi, C. E., Bekker, J. M., Miller, G., Hill, K. L., Crosbie, R. H. Specific and potent RNA interference in terminally differentiated myotubes. Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 934-939 (2003).
  25. Antolik, C., De Deyne, P. G., Bloch, R. J. Biolistic transfection of cultured myotubes. Science's STKE. 2003 (192), 11(2003).
  26. Shintaku, J., et al. MyoD Regulates Skeletal Muscle Oxidative Metabolism Cooperatively with Alternative NF-kappaB. Cell Reports. 17 (2), 514-526 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

C2C12 MyoblastsshRNA KnockdownExtracellular Matrix ProteinsPuromycin SelectionCell DifferentiationWestern Blot AnalysisMyosin Heavy ChainSerum Free DMEMBright Field MicroscopyGene Expression Analysis

Related Articles