Artykuł metodologiczny

Identyfikacja zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofilowych w zatopionych w parafinie zakrzepach tętniczych kotów przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej

8.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60834

⸱

29 marca 2020

 ,  ,  , 
1Veterinary Medical Teaching Hospital, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 2Department of Veterinary Surgical and Radiological Sciences, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis, 3Department of Veterinary Medicine and Epidemiology, School of Veterinary Medicine, University of California, Davis

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy metodę identyfikacji zewnątrzkomórkowych pułapek neutrofili (NET) w kardiogennych zakrzepach tętniczych kotów utrwalonych formaldehydem i parafinie, wykorzystując indukowane ciepłem pobieranie antygenu i protokół podwójnego znakowania immunologicznego.

Streszczenie

Pułapki zewnątrzkomórkowe (NET), składające się z bezkomórkowego DNA (cfDNA) i białek takich jak histony i elastaza neutrofilowa (NE), są uwalniane przez neutrofile w odpowiedzi na ogólnoustrojowe zapalenie lub patogeny. Chociaż wcześniej wykazano, że NET zwiększają tworzenie się skrzepów i hamują fibrynolizę u ludzi i psów, rola NET u kotów z kardiogenną tętniczą chorobą zakrzepowo-zatorową (CATE), zagrażającym życiu powikłaniem wtórnym do kardiomiopatii przerostowej, jest nieznana. Ustandaryzowana metoda identyfikacji i ilościowego oznaczania NET w kardiogennych skrzeplinach tętniczych u kotów pogłębi naszą wiedzę na temat ich patologicznej roli w CATE. W tym miejscu opisujemy technikę identyfikacji NET w skrzeplinach utrwalonych w formaldehydzie i zatopionych w parafinie w obrębie bifurkacji aorty, ekstrahowanych podczas sekcji zwłok. Po deparafinowaniu ksylenem odcinki aorty uległy pośredniemu pobraniu antygenu wywołanemu ciepłem. Skrawki następnie zablokowano, przepuścino i ex vivo NET zidentyfikowano poprzez kolokalizację bezkomórkowego DNA (cfDNA), cytrulinowanego histonu H3 (citH3) i elastazy neutrofilowej (NE) przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej. Aby zoptymalizować immunodetekcję NET w skrzeplinach, autofluorescencję elementów tkankowych ograniczono poprzez zastosowanie procesu wygaszania autofluorescencji przed mikroskopią. Technika ta może być użytecznym narzędziem do badania NET i zakrzepicy u innych gatunków i oferuje nowe informacje na temat patofizjologii tego złożonego schorzenia.

Wprowadzenie

Koty z kardiomiopatią przerostową są narażone na zagrażające życiu powikłania zakrzepowo-zatorowe1,2. Pomimo wysokiej zachorowalności i śmiertelności związanej z kardiogenną tętniczą chorobą zakrzepowo-zatorową kotów (CATE), patofizjologia leżąca u podstaw CATE u kotów jest słabo poznana. Istnieją również ograniczone narzędzia diagnostyczne i terapeutyczne do leczenia i identyfikacji kotów zagrożonych tą wyniszczającą chorobą3.

Oprócz swojej roli w odporności wrodzonej, wykazano, że neutrofile odgrywają rolę w zakrzepicy poprzez uwalnianie neutrofili zewnątrzkomórkowych pułapek (NET), które są sieciami przypominającymi sieć bezkomórkowego DNA (cfDNA) inkrustowaną histonami i ziarnistymi białkami, takimi jak elastaza neutrofilowa (NE) i mieloperoksydaza. Neutrofile ulegają powstawaniu NET w odpowiedzi na ogólnoustrojowy stan zapalny, bezpośrednie spotkanie z patogenami i interakcję z aktywowanymi płytkami krwi4,5,6,7. Wykazano, że u psów DNA pochodzące z neutrofili hamuje lizę skrzepów, podczas gdy białka NET przyspieszają tworzenie skrzepów. Zdolność sieci NET do wychwytywania krążących komórek i składników krzepnięcia jest również kluczem do ich właściwości zakrzepowych8,9,10,11,12.

NET są wykrywane przez kolokalizację zewnątrzkomórkowych białek neutrofilowych, histonów i cfDNA. Z tego powodu identyfikacja i kwantyfikacja NET w utrwalonych tkankach za pomocą immunofluorescencji tkanek odparafinowanych jest lepsza niż tradycyjne barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) przy użyciu mikroskopii jasnego pola4,5. Kilka badań na ludziach z wykorzystaniem mikroskopii immunofluorescencyjnej zidentyfikowało NET jako składniki strukturalne skrzeplin tętnic wieńcowych, skrzeplin po udarze mózgu, miażdżycy i zakrzepów żylnych13,14,15,16,17. Do tej pory nie opisano znormalizowanej metody wykrywania i ilościowego oznaczania NET w skrzeplinach kotów. Ponieważ identyfikacja NET w kardiogennych skrzeplinach tętniczych kotów może ułatwić przyszłe badania translacyjne nad NETs i zakrzepicą, opisujemy techniki identyfikacji i oceny NET w zakrzepach tętniczych zatopionych w parafinie u kotów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały wykonane zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis. Sekcje zwłok i biopsje tkanek wykonywano za zgodą właścicieli.

1. Utrwalanie, osadzanie i cięcie tkanek

  1. Wypreparuj rozwidlenie aorty, w tym aortę zstępującą, tętnicę udową i tętnice biodrowe wspólne (Ryc. 1A), wkrótce po humanitarnej eutanazji lub śmierci. Tępo rozetnij powięź (Rysunek 1B) przed całkowitym zanurzeniem jej w 10% neutralnie buforowanej formalinie na minimum 24 godziny i nie dłużej niż 48 godzin.
  2. Aby odwodnić próbkę, należy najpierw zanurzyć ją w 10% neutralnie buforowanej formalinie podgrzanej do temperatury 37 °C na 1 godzinę. Następnie zanurzyć w rosnących stężeniach etanolu podgrzanego do 37 °C (70%, 95%, 100%) 2x po 1 godzinę. Na koniec, bez spłukiwania, zanurzyć 2x w 100% toluenie podgrzanym do 37 °C na 1 godzinę każdy.
  3. Dodać parafinę podgrzaną do temperatury 62 °C i pozostawić parafinę do całkowitego zestalenia się przez noc.
  4. Przekrój 2–3 μm tkanki zatopionej w parafinie za pomocą mikrotomu i umieścić na dodatnio naładowanych szkiełkach szkiełkowych. Pocięte tkanki przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy.

2. Deparafinizacja, nawodnienie i odzyskiwanie antygenu pod wpływem ciepła

  1. Aby przeprowadzić deparafinowanie i ponowne uwodnienie skrawków na szkiełkach podstawowych, należy umieścić szkiełka w stojakach i przetwarzać w następującej kolejności:
    1. Zanurz całkowicie w 100% ksylenie na 3 minuty. Powtórz ten krok 2x. Nie spłukiwać między krokami.
    2. Zanurzyć całkowicie w malejących stężeniach etanolu (100%, 95%, 70%) w temperaturze pokojowej (RT), 3x na 3 minuty każdy. Nie spłukiwać między krokami.
    3. Zanurz całkowicie w wodzie dejonizowanej na 2 minuty. Powtórz
      4. .
  2. Umieść skrawki soli fizjologicznej z 0,1 % Tween (TBST, pH = 7,6) na 2–3 minuty.
  3. Napełnij zbiornik wodą dejonizowaną podgrzaną do 100 °C. Pozwól, aby komora gotowania na parze wyrównała się przez 20 minut.
    UWAGA: Pobieranie antygenu pod wpływem ciepła najlepiej wykonywać za pomocą ogrzewania pośredniego generowanego przez parowar z zaprogramowanym ustawieniem temperatury, taki jak parowar do żywności.
  4. Podgrzać dostępny w handlu roztwór do pobierania antygenu zawierający Tris i EDTA (pH = 9) do temperatury 95–97 °C na płycie grzejnej o kontrolowanej temperaturze, ciągle mieszając. Upewnij się, że się nie gotuje.
    UWAGA: Po podgrzaniu roztwór powinien stać się mętny.
  5. Wlej podgrzany roztwór do pobierania antygenu do szkiełkowego pojemnika i umieść pojemnik w komorze parowaru. Pozostawić, aby roztwór pobierający antygen zrównoważył się z temperaturą naczynia do gotowania na parze przez 3–4 minuty. Upewnij się, że temperatura komory wynosi ~95 °C.
  6. Zanurz całkowicie szkiełka w podgrzanym roztworze do pobierania antygenu i kontynuuj ogrzewanie zewnętrzne za pomocą parowca przez 20 minut.
  7. Wyjąć pojemnik na szkiełka z naczynia do gotowania na parze i pozostawić szkiełka oraz roztwór do pobierania antygenu do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Rozcieńczony roztwór do pobierania antygenu należy przechowywać w temperaturze 4 °C i w razie potrzeby użyć ponownie do 2 razy.
  8. Myć szkiełka 3x łyżką TBST przez 5 min.

3. Znakowanie immunologiczne i gaszenie autofluorescencji

UWAGA: Tabela 1 szczegółowo opisuje skład blokujących używanych w następujących krokach.

  1. Inkubuj sekcje w buforze blokującym 1 przez 2 godziny przy suchym natężeniu prądu przy delikatnym kołysaniu (30–50 obr./min). Uszczelnij folią parafinową, aby uniknąć wyschnięcia.
  2. Bez mycia natychmiast nanieść 100 μl rozcieńczonego króliczego poliklonalnego przeciwciała przeciwko ludzkiemu cytrulinowanemu histonowi H3 (citH3) (0,03 mg/ml rozcieńczone w buforze blokującym 1) bezpośrednio na szkiełko.
  3. Umieść szkiełko nakrywkowe (24 mm x 40 mm x 0,13–0,17 mm) na każdej sekcji, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie mieszaniny przeciwciał.
  4. Inkubować przez 12–16 godzin w temperaturze 4 °C, delikatnie kołysząc (30–50 obr./min). Uszczelnij folią parafilmową, aby uniknąć wyschnięcia.
  5. Myć 3x TBST przez 5 min.
  6. Zastosuj 100 μl koziego przeciwciała anty-królika sprzężonego z Alexa Fluor 488 (rozcieńczonego do końcowego stężenia 0,04 mg/ml lub 1:50 w buforze blokującym 1), jak opisano w kroku 3.3. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przy delikatnym kołysaniu (30–50 obr./min). Chroń slajdy przed światłem.
  7. Myć TBST 3x przez 5 min.
  8. Inkubować sekcje w buforze blokującym 2 przez noc w temperaturze 4 °C przy delikatnym kołysaniu (30–50 obr./min). Chronić przed światłem.
  9. Myć TBST 3x przez 5 min.
  10. Zablokuj sekcje w buforze blokującym 3 zgodnie z opisem w kroku 3.3 przy wilgotności względnej przez 2 godziny przy delikatnym kołysaniu (30–50 obr./min).
  11. Inkubować skrawki z biotynylowanym poliklonalnym króliczym przeciwciałem przeciwko ludzkiemu przeciwciału NE (stężenie końcowe = 0,2 μg/ml w buforze blokującym 3) w temperaturze 4 °C przez 12–16 godzin, jak opisano w krokach 3.2–3.4.
  12. Myć TBST 3x przez 5 min.
  13. Inkubować ze sprzężonym streptawidyną Alexa Fluor 594 (rozcieńczyć do 1:100 lub 0,02 mg/ml w buforze blokującym 3) zgodnie z opisem w krokach 3.2–3.3 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Chronić przed światłem i uszczelnić parafiną, aby zapobiec wysuszeniu.
  14. Myć z TBST 1x przez 5 min.
  15. Nanieść 100 μl mieszaniny roztworu gaszącego autofluorescencję bezpośrednio na sekcje przez 1 minutę zgodnie z instrukcją producenta.
  16. Szkiełka należy natychmiast myć środkiem TBST 6x przez 10 minut.
  17. Przykryj każde szkiełko 100 μl 300 nM DAPI przez 5 minut w ciemności.
  18. Myć TBST przez 3 minuty. Powtórz to w sumie 5 razy.
  19. Nanieś kroplę (~50 μl) środka do gaszenia zapobiegającego blaknięciu, będącego częścią zestawu do hartowania autofluorescencji, bezpośrednio na szkiełko podstawowe otaczające sekcję. Delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe (24 mm x 40 mm x 0,13–0,17 mm) na sekcję, nie tworząc żadnych pęcherzyków.
  20. Pozostawić próbki do utwardzenia przez noc w ciemności w temperaturze 4 °C, aż podłoże mocujące stwardnieje do analizy mikroskopowej za pomocą soczewek zanurzeniowych.

4. Identyfikacja pułapki zewnątrzkomórkowej neutrofili

UWAGA: Poniższy protokół wykorzystuje odwrócony mikroskop epifluorescencyjny z cyfrową kamerą CCD 1,280 x 960 (patrz Tabela materiałów).

  1. Aby zlokalizować skrzepliny, skanuj czaszkowo lub doogonowo wzdłuż długości aorty, rozwidlenia aorty i każdej tętnicy udowej za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym z obiektywem 10x. Skrzeplina to konglomerat tkanek zawierających czerwone krwinki, białe krwinki i płytki krwi przylegające do śródbłonka w mikroskopii kontrastu fazowego i jasnego pola (Rysunek 2A, Figura 2B).
  2. Najpierw zbadaj sekcje dla NET przy użyciu kanału DAPI (wzbudzenie = 357/44 nm) z obiektywami 10x i 20x (Rysunek 2C). Należy zauważyć, że cfDNA wydaje się być zdekondensowanym DNA, które nie znajduje się w granicach cytoplazmy komórki, gdy jest widziane w kontraście fazowym lub mikroskopii jasnego pola.
  3. Zidentyfikuj zewnątrzkomórkowy kanał białkowy NE i citH3 na kanałach Texas Red (wzbudzenie = 585/29 nm, emisja = 628/32 nm) i zielonym kanale białkowym fluorescencyjnym (wzbudzenie = 470/22 nm, emisja = 525/50 nm), odpowiednio z obiektywami 10, 20 i 40x.
  4. Oceń i przeanalizuj NET w skrzeplinie za pomocą dostępnego oprogramowania, takiego jak Image J (NIH). Tworzenie NET jest identyfikowane na podstawie kolokalizacji cfDNA, zewnątrzkomórkowego citH3 i NE, jak opisano wcześniej18. Utrzymuj stały czas ekspozycji i wzmocnienia każdego kanału przez cały czas pozyskiwania obrazów, aby uniknąć nasycenia intensywności pikseli.
  5. Zmapuj każdą skrzeplinę na podstawie jej bliskości do aorty zstępującej, dzieląc ją na trzy równe strefy, przy czym strefa 1 znajduje się najbliżej aorty, strefa 3 jest najbardziej oddalona od aorty, a strefa 2 między strefami 1 i 3). Gdy operator jest ślepy na stan zdrowia każdego z testerów, zajmij co najmniej dziesięć losowych pól w każdej strefie. Scharakteryzuj rozkład NET w skrzeplinach, uśredniając liczbę pól z NET w każdej strefie lub obliczając średni obszar zajmowany przez NET na strefę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Korzystając z tego protokołu do deparafinowania, indukowanego ciepłem odzyskiwania antygenu i podwójnego immunoznakowania skrzeplin zatopionych w parafinie, po raz pierwszy zidentyfikowaliśmy NET u kotów CATE. Skrzepliny w obrębie rozwidlenia aorty zlokalizowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i mikroskopii jasnego pola przy użyciu standardowego barwienia H&E i mikroskopii kontrastu fazowego. W mikroskopii jasnego pola skrzepliny tętnicze kotów składały się z czerwonych krwinek, leukocytów, fibryny i płytek kr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisujemy protokół identyfikacji NET w utrwalonych kardiogennych skrzeplinach tętniczych kotów przy użyciu protokołu podwójnego znakowania immunologicznego i mikroskopii immunofluorescencyjnej. Chociaż wybarwione były tylko kardiogenne skrzepliny tętnicze, teoretycznie protokół ten może być stosowany w przypadku innych typów skrzeplin i innych gatunków weterynaryjnych. Identyfikacja NET w skrzeplinach tętniczych kotów sugeruje, że NET mogą odgrywać rolę w zakrzepicy u kotów.

Wykrywanie NET za ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badanie było wspierane przez fundusze z University of California, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Autorzy chcieliby podziękować dr Kevinowi Woolardowi za użycie mikroskopu fluorescencyjnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4,6-diamidyno-2-fenylina (DAPI)Life Technologies CorporationD1306
Alexa Fluor 594 Koniugat streptawidynyKatalog naukowyThermoFisher # S11227
Przeciwciało przeciwcytrulinowane histonem H3AbcamAb5103
System obrazowania komórek EVOS FLThermoFisher ScientificAMEFC4300
Obrazowanie EVOS Obiektyw systemowy 10xThermoFisher ScientificAMEP4681NA 0,25, WD 6,9/7,45 mm
System obrazowania EVOS Obiektyw 20xThermoFisher ScientificAMEP4682NA 0,40, WD 6,8 mm
System obrazowania EVOS Obiektyw 40xThermoFisher ScientificAMEP4699NA 0,75, WD 0,72 mm
Kozie przeciwciało anty-królikowe Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificCatalog # A32723
Surowica koziaJackson Immuno Research LabsKatalog # NC9660079. Część producenta # 005-000-121
Przeciwciało elastazy neutrofilowejPrzeciwciała BiossBs-6982R-BiotynaPrzeciwciało poliklonalne królika, Biotyna sprzężona
z NP40PierceProduct # 28324. Część # EJ64292
Dodatnio naładowane szkiełka mikroskopoweThomas ScientificProducent nr 1354W-72
Surowica królikówtechnologii życia# 10510
Roztwór do odzyskiwania celuAgilent DakoS2367TRIS/EDTA, pH 9 (10x)
TrueVIEW Zestaw do hartowania autofluorescencjiVector LaboratoriesSP-8400
Katalog

Bibliografia

  1. Maron, B. J., Fox, P. R. Hypertrophic cardiomyopathy in man and cats. Journal of Veterinary Cardiology: The Official Journal of the European Society of Veterinary Cardiology. 17, Suppl 1 6-9 (2015).
  2. Payne, J. R., et al. Prognostic indicators in cats with hypertrophic cardiomyopathy. Journal of Veterinary Internal Medicine. 27 (6), 1427-1436 (2013).
  3. Borgeat, K., Wright, J., Garrod, O., Payne, J. R., Fuentes, V. L. Arterial Thromboembolism in 250 Cats in General Practice: 2004-2012. Journal of Veterinary Internal Medicine. 28 (1), 102-108 (2014).
  4. Brinkmann, V., Zychlinsky, A. Beneficial suicide: why neutrophils die to make NETs. Nature Reviews. Microbiology. 5 (8), 577-582 (2007).
  5. Goggs, R., Jeffery, U., LeVine, D. N., Li, R. H. L. Neutrophil-extracellular traps, cell-free DNA and immunothrombosis in companion animals: A review. Veterinary Pathology. , 300985819861721(2019).
  6. de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H & E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
  7. Li, R., Tablin, F. A Comparative Review of Neutrophil Extracellular Traps in Sepsis. Frontiers in Veterinary Sciences. 5 (291), (2018).
  8. Borissoff, J. I., et al. Elevated levels of circulating DNA and chromatin are independently associated with severe coronary atherosclerosis and a prothrombotic state. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (8), 2032-2040 (2013).
  9. Moschonas, I. C., Tselepis, A. D. The pathway of neutrophil extracellular traps towards atherosclerosis and thrombosis. Atherosclerosis. 288, 9-16 (2019).
  10. Perdomo, J., et al. Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia. Nature Communications. 10 (1), 1322(2019).
  11. Li, B., et al. Neutrophil extracellular traps enhance procoagulant activity in patients with oral squamous cell carcinoma. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 145 (7), 1695-1707 (2019).
  12. Li, R. H. L., Tablin, F. In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (138), e58083(2018).
  13. de Boer, O. J., Li, X., Goebel, H., van der Wal, A. C. Nuclear smears observed in H&E-stained thrombus sections are neutrophil extracellular traps. Journal of Clinical Pathology. 69 (2), 181-182 (2016).
  14. Farkas, ÁZ., et al. Neutrophil extracellular traps in thrombi retrieved during interventional treatment of ischemic arterial diseases. Thrombosis Research. 175, 46-52 (2019).
  15. Qi, H., Yang, S., Zhang, L. Neutrophil Extracellular Traps and Endothelial Dysfunction in Atherosclerosis and Thrombosis. Frontiers in Immunology. 8, 928(2017).
  16. Laridan, E., et al. Neutrophil extracellular traps in ischemic stroke thrombi. Annals of Neurology. 82 (2), 223-232 (2017).
  17. Laridan, E., Martinod, K., Meyer, S. F. D. Neutrophil Extracellular Traps in Arterial and Venous Thrombosis. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 45 (1), 86-93 (2019).
  18. Li, R. H. L., Johnson, L. R., Kohen, C., Tablin, F. A novel approach to identifying and quantifying neutrophil extracellular trap formation in septic dogs using immunofluorescence microscopy. BMC Veterinary Research. 14 (1), 210(2018).
  19. Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in Paraffin-Embedded Tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513(2016).
  20. Moelans, C. B., Oostenrijk, D., Moons, M. J., van Diest, P. J. Formaldehyde substitute fixatives: effects on nucleic acid preservation. Journal of Clinical Pathology. 64 (11), 960-967 (2011).
  21. Rait, V. K., Xu, L., O'Leary, T. J., Mason, J. T. Modeling formalin fixation and antigen retrieval with bovine pancreatic RNase A II. Interrelationship of cross-linking, immunoreactivity, and heat treatment. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (3), 300-306 (2004).
  22. Willingham, M. C. An alternative fixation-processing method for preembedding ultrastructural immunocytochemistry of cytoplasmic antigens: the GBS (glutaraldehyde-borohydride-saponin) procedure. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 31 (6), 791-798 (1983).
  23. Davis, A. S., et al. Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 62 (6), 405-423 (2014).
  24. Banerjee, B., Miedema, B. E., Chandrasekhar, H. R. Role of basement membrane collagen and elastin in the autofluorescence spectra of the colon. Journal of Investigative Medicine: The Official Publication of the American Federation for Clinical Research. 47 (6), 326-332 (1999).
  25. Hirsch, R. E., Zukin, R. S., Nagel, R. L. Intrinsic fluorescence emission of intact oxy hemoglobins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 93 (2), 432-439 (1980).
  26. Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
  27. Mosiman, V. L., Patterson, B. K., Canterero, L., Goolsby, C. L. Reducing cellular autofluorescence in flow cytometry: an in-situ method. Cytometry. 30 (3), 151-156 (1997).
  28. Ducroux, C., et al. Thrombus Neutrophil Extracellular Traps Content Impair tPA-Induced Thrombolysis in Acute Ischemic Stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tkanka zatopiona w parafiniecytrulinowana histona H3elastaza neutrofilowawolne DNAwygaszanie autofluorescencjiods anianie antygenuzatorowo sercogenna

Powiązane artykuły