Method Article

Skuteczne różnicowanie zazwojowych neuronów współczulnych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach hodowli bez karmienia i zdefiniowanych chemicznie

DOI:

10.3791/60843

⸱

May 24th, 2020

 , 
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, 3Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole opisujemy stabilną, wysoce efektywną strategię różnicowania do generowania postganglionowych neuronów współczulnych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Model ten sprawi, że neurony będą dostępne do wykorzystania w badaniach nad wieloma zaburzeniami autonomicznymi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) stały się potężnym narzędziem do modelowania chorób i badania rozwoju ludzkiego embrionalnego in vitro. Wcześniej przedstawiliśmy protokół różnicowania do wyprowadzania autonomicznych neuronów o charakterze współczulnym, który został zastosowany u pacjentów z neuropatią autonomiczną. Jednak protokół został zbudowany w oparciu o wymianę surowicy nokautującej (KSR) i warunki hodowli opartej na karmieniu, a aby zapewnić wysoką wydajność różnicowania, konieczne było sortowanie komórek. Czynniki te powodują dużą zmienność, wysoki koszt i niską odtwarzalność. Co więcej, dojrzałe właściwości współczulne, w tym aktywność elektryczna, nie zostały zweryfikowane. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół, w którym hodowla i różnicowanie PSC są przeprowadzane w warunkach hodowli bez karmnika i zdefiniowanych chemicznie. Zidentyfikowano markery genetyczne identyfikujące grzebień nerwowy tułowia. Dalsze różnicowanie w pozazwojowe neurony współczulne uzyskuje się po 20 dniach bez konieczności sortowania komórek. Zapis elektrofizjologiczny dodatkowo pokazuje funkcjonalną tożsamość neuronu. Wyzwalanie wykryte przez nasze zróżnicowane neurony może być wzmocnione przez nikotynę i stłumione przez antagonistę receptora adrenergicznego propranolol. Pośrednie współczulne neuronalne komórki progenitorowe w tym protokole mogą być utrzymywane jako sferoidy nerwowe przez okres do 2 tygodni, co pozwala na ekspansję kultur. Podsumowując, nasz zaktualizowany protokół różnicowania neuronów współczulnych wykazuje wysoką wydajność różnicowania, lepszą odtwarzalność, większą elastyczność i lepsze dojrzewanie neuronów w porównaniu z poprzednią wersją. Protokół ten dostarczy naukowcom komórek niezbędnych do badania ludzkich zaburzeń, które wpływają na autonomiczny układ nerwowy.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postganglioniczne neurony współczulne (symNs) należą do autonomicznego układu nerwowego (ANS) i pełnią wiele ważnych ról w reagowaniu i regulowaniu homeostazy ciała niezależnie od świadomości. Na przykład stres stymuluje symN i wywołuje reakcję walki lub ucieczki, która prowadzi do wzrostu częstości akcji serca, ciśnienia krwi i pocenia się. SymN są dotknięte wieloma zaburzeniami u ludzi z powodu genetyki, toksyczności/urazu lub jako towarzysze innych chorób. Przykładem neuropatii genetycznej jest zaburzenie rodzinne w dzieciństwie (FD), w którym ciężka dysregulacja symN powoduje kryzys dysautonomiczny, objawiający się poceniem się, plamami na skórze, atakami wymiotów....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Linia reportera H9 PHOX2B:GFP została dostarczona przez Oh et al.19. Niektóre startery qPCR użyte w tym artykule zostały uzyskane z OriGene Technologies, podczas gdy kilka sekwencji uzyskano z Frith et al.20,30.

1. Przygotowanie potraw, przygotowanie podłoża i konserwacja hPSC

  1. Panierowanie naczyń
    1. Powłoka z witronektyną (VTN)
      1. Umieścić fiolki z VTN w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do całkowitego rozmrożenia, a następnie dokładnie wymieszać.
      2. W przypadku szalki Petriego o średnicy 100 mm....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole podajemy instrukcje, jak generować symbole z hPSC. Zademonstrowane tutaj warunki hodowli zostały ulepszone w stosunku do wcześniej opublikowanego protokołu23,24 (Rysunek 1A) do warunków wolnych od feedera i zdefiniowanych chemicznie (Rysunek 1B). Dostępne są dwie opcje, jedna, w której symN są tworzone w ciągu 20 dni, a druga, w której NCC mogą być rozszerzane przez 2 tygodnie, aby wygenerować więcej komórek.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niedawno opublikowaliśmy dwa przeglądy, z których jeden omawia zastosowanie symN pochodzących z hPSC do modelowania choroby31 , a także dogłębne porównanie dostępnych protokołów różnicowania22. Dlatego tutaj skupiamy się na rozwiązywaniu problemów z obecnym protokołem, aby pomóc zainteresowanemu badaczowi odnieść sukces w tworzeniu symN. Podczas całego procesu różnicowania, w celu uzyskania spójnych danych, a także zdrowych zróżnicowanych komórek, zanieczyszczenie na wszyst.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Heidi Ulrichs za krytyczne przeczytanie i zredagowanie rękopisu.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Szalki do hodowli komórkowych 100 mmFalcon353003
15 ml stożkowe probówki do hodowli tkankowychVWR/Corning89039-664
24-dołkowe płytki do hodowli tkankowychFalcon353047
24-dołkowe płytki o bardzo niskim mocowaniuCorning07 200 601 i 07 200 602
5% CO2/20% O2Thermo Fisher/Life TechnologieHeracell VIOS 160i
tkankowychVWR/Corning89039-656
6-dołkowe płytki do hodowli tkankowychCostar3516
AccutaseInnovation Technologie komórkoweAT104500Roztwór do dysocjacji komórek
Przeciwciało anty-AP2aAbcamab108311Gospodarz: Królik; Rozcieńczenie
1:400Przeciwciało anty-Ascl1BD Pharmingen556604Gospodarz: mysz IgG1; Rozcieńczenie 1:200
Przeciwciało anty-CD49DBioLegend304313Gospodarz: Mysz IgG1; 5 μ l / milion komórek w 100 μ l objętość
przeciwciała anty-CD49D (izotyp)BioLegend400125Gospodarz: mysz IgG1; 5 μ l / milion komórek w 100 μ l objętość
barwnika DAPISigmaD95421:1000 rozcieńczenie
Przeciwciało anty-DBHImmunostar22806Gospodarz: Królik; Rozcieńczenie 1:500
Przeciwciało anty-GFPAbcamab13970Gospodarz: Kurczak; Rozcieńczenie 1:1000
Przeciwciało anty-HOXC9Abcamab50839Gospodarz: Mysz; Rozcieńczenie 1:100
Przeciwciało anty-NET1MabNET17-1Gospodarz: Mysz; Rozcieńczenie 1:1000
Przeciwciało anty-PRPHSanta Cruz BiotechnologySC-377093/H0112Gospodarz: Mysz IgG2a; Rozcieńczenie 1:200
Przeciwciało anty-SOX10Santa Cruz Biotechnologysc-365692Gospodarz: Mysz IgG1; Rozcieńczenie 1:100
Przeciwciało anty-THPel-FreezP40101-150Gospodarz: Królik; Rozcieńczenie 1:500
Kwas askorbinowySigmaA8960-5GStężenie w magazynie: 100 mM
suplement B27Thermo Fisher/Life Technologies12587-010Stężenie w magazynie: 50x
BDNFR& D Systems248-BDStężenie zapasów: 10 μ g/ml
BMP4R& D Systems314-BPStężenie zapasów: 6 mM
Licznik komórekThermo Fisher/Life TechnologiesHrabina II
Szkiełka komory do liczenia komórekInvitrogenC10312
WirówkaEppendorf57021& 5424R
CHIR99021R& D Systems4423Stężenie w magazynie: 6 mM
KriofiolkaThermo Fisher/Life Technologies375353
dbcAMPSigmaD0627Stężenie w magazynie: 100 mM
DMEMThermo Fisher/Life Technologies10829-018Stężenie w magazynie: 1x
DMEM/F12Thermo Fisher/Life Technologies11330-057Stężenie w magazynie: 1x
DMSOThermo Fisher/Life TechnologiesBP231-100
E6 średnigibcoA15165-01
E8 średnigibcoA15169-01Stężenie w magazynie: 1x
suplement E8gibcoA15171-01Stężenie w magazynie: 50x
EDTASigmaED2SSStężenie w magazynie: 0,5 M
Płytki elektrofizjologiczne (AXION cytoview MEA96)Axion BioSystemsM768-tMEA-96W
Maszyna FACSBeckman CoulterCytoFLEX (do FACS)
Maszyna FACSBeckman CoulterMoFlo Astrios EQ (do sortowania)
Rurki FACS (niebieska nasadka filtra)LampyFalcon 352235
(biała nasadka)Falcon352063
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
GDNFPeproTech450Stężenie zapasów: 10 μ g/ml
GeltrexInvitrogenA1413202Matryca błony podstawnej; Stężenie magazynowe: 100x
hPSCThomson i wsp., (1998)WA09
hPSCsOh i wsp. (2016)H9-PHOX2B::eGFP
Ludzka fibronektyna (FN)VWR/Corning47743-654Stężenie zapasowe: 1 mg/ml
L-glutaminaThermo Fisher/Gibco25030-081Stężenie magazynowe: 200 mM
zbiornik LNNiestandardowe systemy biogenneV-1500AB
Czytnik MEAAxion BioSystemsMaestro Pro
Mouse laminin I (LM)R& D Systems3400-010-01Stężenie magazynowe: 1 mg/ml
suplement N2Thermo Fisher/Life Technologies17502-048Stężenie magazynowe: 100x
Podłoże neuropodstawowegibco21103-049Stężenie magazynowe: 1x
NGFPeproTech450-01Stężenie magazynowe: 25 μ g / ml
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco14190-136Stężenie magazynowe: 1x
bromowodorek poli-L-ornityny (PO)SigmaP3655Stężenie podstawowe: 15 mg / ml
Primocin (antybiotyki)InvivoGenANTPM1Stężenie magazynowe: 50 mg / ml
maszyna qPCRBio-Rad LaboratoriesC1000 Touch
qPCRBio-Rad LaboratoriesHSP9601
rekombinowany FGF2R& D Systems233-FB/CFStężenie w magazynie: 10 μ g/ml
Kwas retinowySigmaR2625Stężenie magazynowe: 1 mM
SB431542Tocris/R& D Systems1614Stężenie magazynowe: 10 mM
Trypan niebieskiCorningMT-25-900-CI
Vitronectin (VTN)Thermo Fisher/Life TechnologiesA14700Stężenie magazynowe: 0,5 mg/ml
Łaźnia wodnaVWR/Corning706308
Y27632R& D Systems1254Koncentracja magazynowa: 10 mM
Inkubator kultur tkankowych 50 ml stożkowe probówki do hodowli FACS

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-ind....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Pluripotent Stem CellsSympathetic Neuron DifferentiationFeeder free CultureChemically Defined ConditionsNeural Crest MarkersElectrophysiological RecordingRetinoic Acid TreatmentSpheroid Culture ExpansionPostganglionic Sympathetic NeuronsAutonomic Nervous System

Related Articles