Artykuł metodologiczny

Skuteczne różnicowanie zazwojowych neuronów współczulnych przy użyciu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach hodowli bez karmienia i zdefiniowanych chemicznie

15.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60843

⸱

24 maja 2020

 , 
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, 3Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

W tym artykule

Podsumowanie

W tym protokole opisujemy stabilną, wysoce efektywną strategię różnicowania do generowania postganglionowych neuronów współczulnych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Model ten sprawi, że neurony będą dostępne do wykorzystania w badaniach nad wieloma zaburzeniami autonomicznymi.

Streszczenie

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) stały się potężnym narzędziem do modelowania chorób i badania rozwoju ludzkiego embrionalnego in vitro. Wcześniej przedstawiliśmy protokół różnicowania do wyprowadzania autonomicznych neuronów o charakterze współczulnym, który został zastosowany u pacjentów z neuropatią autonomiczną. Jednak protokół został zbudowany w oparciu o wymianę surowicy nokautującej (KSR) i warunki hodowli opartej na karmieniu, a aby zapewnić wysoką wydajność różnicowania, konieczne było sortowanie komórek. Czynniki te powodują dużą zmienność, wysoki koszt i niską odtwarzalność. Co więcej, dojrzałe właściwości współczulne, w tym aktywność elektryczna, nie zostały zweryfikowane. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół, w którym hodowla i różnicowanie PSC są przeprowadzane w warunkach hodowli bez karmnika i zdefiniowanych chemicznie. Zidentyfikowano markery genetyczne identyfikujące grzebień nerwowy tułowia. Dalsze różnicowanie w pozazwojowe neurony współczulne uzyskuje się po 20 dniach bez konieczności sortowania komórek. Zapis elektrofizjologiczny dodatkowo pokazuje funkcjonalną tożsamość neuronu. Wyzwalanie wykryte przez nasze zróżnicowane neurony może być wzmocnione przez nikotynę i stłumione przez antagonistę receptora adrenergicznego propranolol. Pośrednie współczulne neuronalne komórki progenitorowe w tym protokole mogą być utrzymywane jako sferoidy nerwowe przez okres do 2 tygodni, co pozwala na ekspansję kultur. Podsumowując, nasz zaktualizowany protokół różnicowania neuronów współczulnych wykazuje wysoką wydajność różnicowania, lepszą odtwarzalność, większą elastyczność i lepsze dojrzewanie neuronów w porównaniu z poprzednią wersją. Protokół ten dostarczy naukowcom komórek niezbędnych do badania ludzkich zaburzeń, które wpływają na autonomiczny układ nerwowy.

Wprowadzenie

Postganglioniczne neurony współczulne (symNs) należą do autonomicznego układu nerwowego (ANS) i pełnią wiele ważnych ról w reagowaniu i regulowaniu homeostazy ciała niezależnie od świadomości. Na przykład stres stymuluje symN i wywołuje reakcję walki lub ucieczki, która prowadzi do wzrostu częstości akcji serca, ciśnienia krwi i pocenia się. SymN są dotknięte wieloma zaburzeniami u ludzi z powodu genetyki, toksyczności/urazu lub jako towarzysze innych chorób. Przykładem neuropatii genetycznej jest zaburzenie rodzinne w dzieciństwie (FD), w którym ciężka dysregulacja symN powoduje kryzys dysautonomiczny, objawiający się poceniem się, plamami na skórze, atakami wymiotów, nadciśnieniem i lękiem1. Przykładem toksyczności jest chemioterapia, która według doniesień ma toksyczne skutki uboczne na neurony autonomiczne2. Wiadomo, że autonomiczne odnerwienie i nadunerwienie mogą prowadzić do chorób takich jak choroba Parkinsona lub nadciśnieniowa choroba nerek lub im towarzyszyć3,4. W związku z tym możliwość prowadzenia badań i zrozumienia mechanizmów biologii symN i defektów w kontekście choroby jest korzystna dla poszukiwania nowych i skutecznych metod leczenia.

Anatomia
Obwodowy układ nerwowy rozgałęzia się na podziały czuciowe i autonomiczne. Nerwy doprowadzające czuciowego układu nerwowego są odpowiedzialne za odczuwanie bólu i dotyku, podczas gdy ANS jest odpowiedzialny za przekazywanie informacji ze wszystkich narządów do mózgu. ANS dzieli się na jelitowy układ nerwowy, unerwienie przewodu pokarmowego, przywspółczulny układ nerwowy, który jest ważny dla relaksacji, oraz współczulny układ nerwowy (SNS), który jest ważny dla aktywacji/regulacji narządów. SNS adaptuje system dwuneuronowy5. Przedzwojowe współczulne aksony nerwowe w rdzeniu kręgowym najpierw rzutują do zwojów współczulnych, gdzie znajdują się zazwojowe ciała komórek symN. Neurony te następnie wysyłają długie projekcje, aby unerwić tkanki docelowe każdego narządu w ciele. Sygnały przekazywane przez neurony przedzwojowe są cholinergiczne, podczas gdy objawy pozwojowe są adrenergiczne, a zatem wyrażają noradrenalinę (NE) jako główny neuroprzekaźnik. Istnieje kilka godnych uwagi wyjątków od neuronów zazwojowych, współczulnych, które są cholinergiczne, w tym te unerwiające naczynia krwionośne. Neurony zazwojowe adrenergiczne wyrażają enzymy hydroksylazę tyrozyny (TH), dekarboksylazę L-aminokwasów aromatycznych (AAAD), dopaminę β-hydroksylazę (DBH) i oksydazę monoaminową (MAO-A), wszystkie odpowiedzialne za wytwarzanie i metabolizowanie NE. Ponadto wykazują ekspresję transporterów i/lub receptorów recyklingu NE: receptora α-adrenergicznego (ADRA2), receptora β-adrenergicznego (ADR2B), transportera noradrenaliny (NET1) i pęcherzykowego transportera monoamin (VMAT1/2).

Rozwój
Podczas rozwoju embrionalnego symN pochodzą z grzebienia nerwowego (NC), który wyłania się między cewą nerwową a nakładającą się ektodermą6 i może różnicować się w wiele linii komórkowych, w tym melanocyty, osteoblasty, adipocyty, glej, neurony jelitowe, neurony czuciowe i neurony autonomiczne7. Komórki grzebienia nerwowego (NCC) są komórkami silnie migrującymi, które pokonują kilka tras przez zarodek. Na tym wczesnym etapie rozwoju NC komórki wyrażają markery SNAIL1/2, FOXD3 i SOX108,9,10,11. Trasa migracji wraz z przyjętym przez nie położeniem osiowym określa podtyp NC, w który będą się rozwijać. Te podtypy NC można rozróżnić na podstawie specyficznej ekspresji genu HOX: NCC czaszkowe nie wyrażają genów HOX, NCC nerwu błędnego wyrażają HOX 1-5, NCC tułowia wyrażają HOX 6-9, a NCC krzyżowe wyrażają HOX 10-1112. Wśród nich NCC tułowia są uznawane za główne źródło symN. Prekursory SymN wyrażają czynnik transkrypcyjny MASH1/ASCL113, który promuje ekspresję PHOX2B14 i INSM115. Rodzina czynników transkrypcyjnych GATA ulega ekspresji podczas późnego rozwoju współczulnego. GATA2 i GATA3 są wyrażane w symN, co z kolei aktywuje DBH16. Czynnik transkrypcyjny HAND2 jest również ważny dla ekspresji i utrzymania DBH i TH17.

HPSC (np. embrionalne i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste) są potężnym narzędziem18 do podsumowania paradygmatów rozwojowych i generowania symN, które mogą być następnie wykorzystane do modelowania chorób różnych zaburzeń u ludzi. W związku z tym, podczas generowania symN z hPSC, kluczowe znaczenie ma przestrzeganie wytycznych rozwojowych i ocena ekspresji odpowiednich markerów w procesie różnicowania.

Poprzedni protokół symN
Kilka grup badawczych wcześniej zgłosiło generowanie symN z hPSCs19,20,21. Bezpośrednie porównanie tych protokołów ze sobą i z naszymi zostało niedawno przejrzane22. W 201623 opublikowaliśmy protokół różnicowania do generowania autonomicznych neuronów o charakterze symN (Rysunek 1A). W protokole tym wykorzystano pożywkę opartą na KSR, która była wykorzystywana zarówno do utrzymywania niezróżnicowanych hPSC, jak i różnicowania komórek. Ponadto hPSC utrzymywano na mysich fibroblastach embrionalnych (komórkach żywiciela MEF). Zastosowaliśmy ten protokół i PSC od pacjentów z FD do modelowania zaburzenia23. W 2019 roku opisaliśmy bardziej szczegółową wersję tego starszego protokołu24. Podsumowując, los neuronalny został wywołany przez podwójne hamowanie SMAD25 w celu zablokowania sygnalizacji TGF-β i BMP w ciągu pierwszych 2 dni. Aktywacja WNT za pomocą CHIR99021 promowała neuronalne komórki progenitorowe, aby stały się komórkami NC. W dniu 11 komórki zostały posortowane według FACS dla populacji CD49D+ lub SOX10+26,23, co dało około 40% wydajności generowania NC. W związku z tym konieczne było sortowanie, aby zapewnić wydajność i czystość dla kolejnych etapów różnicowania. NCC utrzymywano i amplifikowano jako sferoidy z połączonym traktowaniem FGF2 i CHIR. Po 4 dniach sferoidy NC utrzymania zostały posiane i podano BDNF, GDNF i NGF, aby zakończyć dojrzewanie symN. Chociaż te symN wyrażały silne markery symN, takie jak ASCL1, TH, DBH i PHOX2A, markery bardziej dojrzałych symN, w tym ekspresja nikotynowego receptora acetylocholiny (CHRNA3 / CHRNB4) i transportera pęcherzyków (VMAT1 / 2), były niskie nawet po 70 dniach różnicowania. Geny HOX w tym protokole nie zostały formalnie przebadane, a właściwości dojrzałych neuronów, w tym aktywność elektrofizjologiczna komórek, nie zostały zweryfikowane.

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół do generowania symN (Rysunek 1B). HPSC są utrzymywane w warunkach wolnych od podajnika, na szalkach pokrytych witronektyną (VTN), przy użyciu pożywki Essential 8 (E8) 27. Wzór podłoża różnicującego był modyfikowany na każdym etapie, zwiększając w ten sposób odsetek populacji NC28. Dojrzewanie symN można przeprowadzić na posortowanych lub niesortowanych masowych populacjach NCC CD49D+/SOX10+. Oba wykazują wysoki poziom ekspresji markera symN do 30 dnia. Co więcej, symN generowane za pomocą tego protokołu reagują na zapis elektrofizjologiczny oraz na leczenie związkami aktywującymi i hamującymi symN.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Linia reportera H9 PHOX2B:GFP została dostarczona przez Oh et al.19. Niektóre startery qPCR użyte w tym artykule zostały uzyskane z OriGene Technologies, podczas gdy kilka sekwencji uzyskano z Frith et al.20,30.

1. Przygotowanie potraw, przygotowanie podłoża i konserwacja hPSC

  1. Panierowanie naczyń
    1. Powłoka z witronektyną (VTN)
      1. Umieścić fiolki z VTN w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C do całkowitego rozmrożenia, a następnie dokładnie wymieszać.
      2. W przypadku szalki Petriego o średnicy 100 mm zmieszaj 7 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) z 0,5 mg/ml VTN, dodaj roztwór VTN do naczynia i inkubuj w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 godzinę.
    2. Powłoka matrycy membrany podstawnej
      1. Rozmrozić fiolki z matrycą błony podstawnej (patrz tabela materiałów) na lodzie w temperaturze 4 °C przez noc.
      2. W przypadku jednego dołka na płytce 6-dołkowej wymieszać 2 ml DMEM/F12 z 20 μl 100-krotnej matrycy membrany podstawnej, dodać roztwór matrycy błony podstawnej do naczynia, owinąć naczynie folią parafinową i przechowywać w czystym pojemniku w temperaturze 4 °C przez noc. Pracuj tak szybko, jak to możliwe. Naczynia powlekane można przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
    3. Powłoka z poliornityny (PO)/lamininy (LM)/fibronektyny (FN)
      1. Pierwszego dnia, w przypadku jednego dołka z 24-dołkowej płytki, zmieszać 15 μg/ml PO z 1 ml 1x PBS, inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc. Rozmrozić zarówno LM, jak i FN w temperaturze -20 °C przez noc i przechowywać w temperaturze 4 °C aż do całkowitego rozmrożenia.
      2. Drugiego dnia odessać roztwór PO, przemyć studzienki 2x 1x PBS, dodać 1 ml 1x PBS zawierającego 2 μg/ml LM i 2 μg/ml FN i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez noc. W tym momencie naczynie z roztworem LM/FN można przechowywać w inkubatorze przez wiele miesięcy, o ile nie wyschnie. Dodaj więcej 1x PBS, aby zapobiec wysychaniu naczynia.
  2. Przygotowanie podłoża
    1. Przygotuj pożywkę Essential 8 (E8), rozmrażając jedną butelkę suplementu E8 w temperaturze 4 °C przez noc. Wymieszaj suplement z 500 ml pożywki E8 i antybiotykami, jeśli to konieczne.
      UWAGA: Roztwór roboczy E8 należy zużyć w ciągu 2 tygodni.
    2. Przygotować pożywkę do zamrażania hPSC, mieszając 90 ml kompletnej pożywki E8 z 10 ml DMSO, aby uzyskać całkowitą objętość 100 ml. Filtruj sterylizację.
    3. Przygotować pożywkę różnicującą dnia 0 do dnia 1, mieszając 100 ml pożywki essential 6 (E6) z 10 μM SB431542, 1 ng/ml BMP4, 300 nM CHIR99021 i 10 μM Y27632 do całkowitej objętości 100 ml.
    4. Przygotować pożywkę różnicującą dnia 2 do dnia 10, mieszając 100 ml pożywki E6 z 10 μM SB i 0,75 μM CHIR99021 uzyskać całkowitą objętość 100 ml.
    5. Przygotuj pożywkę sferoidalną z dnia 10 do dnia 14, mieszając pożywkę neuropodstawową z 2 ml witaminy B27 (50x), 1 ml N2 (100x), 2 mM L-glutaminianu, 3 μM CHIR99021 i 10 ng/ml FGF2, aby uzyskać całkowitą objętość 100 ml.
    6. Przygotuj pożywkę od dnia 14 do dnia 28 do długotrwałego utrzymania sferoidy, dodając 0,5 μM świeżego RZS do pożywki sferoidalnej z dnia 10 do dnia 14 przy każdym karmieniu.
      UWAGA: Zawsze utrzymuj RS w temperaturze -80 °C.
    7. Przygotuj pożywkę do dojrzewania SymN, mieszając pożywkę neuropodstawową z 2 ml witaminy B27 (50x), 1 ml N2 (100x), 2 mM L-glutaminianu, 25 ng/ml GDNF, 25 ng/ml BDNF, 25 ng/ml NGF, 200 μM kwasu askorbinowego i 0,2 mM dbcAMP, aby uzyskać całkowitą objętość 100 ml. Roztwór należy zużyć w ciągu 2 tygodni. Przed każdym karmieniem dodaj 0,125 μM świeżego RA. Roztwór ten stosuje się od 14 dnia (opcja 1) lub 28 dnia (opcja 2).
    8. Przygotuj bufor FACS, mieszając DMEM z 2% FBS, 2 mM L-glutaminianu i antybiotykami, jeśli to konieczne, do całkowitej objętości 100 ml.
  3. Utrzymanie hPSC
    1. Rozmrażanie i przechowywanie hPSC
      1. Przygotuj jedno naczynie z powłoką VTN o średnicy 100 mm.
      2. Aby rozmrozić fiolkę z hPSC bezpośrednio z ciekłego azotu, należy umieścić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, ostrożnie obracając probówkę w wodzie, aż do rozmrożenia. Przenieść rozmrożone hPSC do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml 1x PBS i odwirować przy 200 x g przez 4 min.
      3. Odrzucić supernatant i dodać 1 ml pożywki E8 do probówki. Odpipetować kilka razy, aby całkowicie zawiesić osad, a następnie dodać kolejne 9 ml pożywki E8, aby uzyskać łącznie 10 ml.
      4. Odessać roztwór VTN z szalki o średnicy 100 mm.
      5. Przenieś hPSC do naczynia o średnicy 100 mm, delikatnie potrząśnij (góra-dół i lewo-prawo, nie w kółko), aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w naczyniu
      6. Inkubować w temperaturze 37 °C, w 5% CO2 .
      7. Następnego dnia odessać całe podłoże i podawać 10 ml E8.
      8. Karm w ten sposób codziennie przez następne 3-4 dni, a następnie przygotuj się do podziału.
    2. Podział hPSCs
      UWAGA: hPSC w momencie podziału powinny być w 80%–90% zlewne. Należy obserwować duże kolonie o gładkich i jasnych krawędziach. Należy jednak unikać kontaktu między każdą rodziną (Rysunek 2B, dzień 0 i Rysunek 6B).
      1. W razie potrzeby przygotuj naczynia 100 mm powlekane VTN.
      2. Zassać E8 i umyć naczynie, które ma zostać podzielone 1x za pomocą 1x PBS.
      3. Odessać 1x PBS i dodać 4 ml 0,25 M EDTA. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
        UWAGA: Komórki hPSC należy podzielić/ponownie pokryć jako małe kolonie. Nie należy leczyć EDTA dłużej niż 2 minuty, aby zapobiec rozdzieleniu na pojedyncze komórki. Komórki powinny być nadal przymocowane do powierzchni naczynia po 2-minutowym zabiegu.
      4. Odessać EDTA, odłączyć kolonie przez silne pipetowanie 10 ml pożywki E8 na powierzchnię naczynia i zebrać całą pożywkę i komórki w probówce o pojemności 15 ml.
      5. Przy zbieżności hPSC na poziomie 80%–90% podziel kolonie na 1:15-1:20. Na przykład, aby rozdzielić hPSC w stosunku 1:20 na jedno naczynie o średnicy 100 mm, weź 500 μl roztworu E8/hPSC i wymieszaj z 9,5 ml świeżej pożywki E8.
      6. Płytki hPSC w szalkach 100 mm z powłoką VTN.
        UWAGA: Zaleca się ustalenie idealnego współczynnika podziału dla każdego badacza i linii komórkowej niezależnie.
    3. Zamrażanie komórek komórek zakaźnych
      1. Na jedną 100-milimetrową szalkę hPSC, która jest gotowa do podziału, przygotuj trzy kriowiale i 3,5 ml pożywki do zamrażania.
        UWAGA: Pożywki i fiolki należy przechowywać w temperaturze 4 °C lub na lodzie do czasu użycia.
      2. Odessać E8 i umyć naczynie 2x za pomocą 1x PBS.
      3. Odessać 1x PBS i dodać 4 ml 0,25 M EDTA, inkubować przez 2 minuty w temperaturze 37 °C, w 5% CO2,
        UWAGA: hPSC powinny być zamrożone jako małe kolonie w czasie, gdy miałyby zostać podzielone. Nie należy traktować komórek EDTA dłużej niż 2 minuty, aby zapobiec rozdzieleniu na pojedyncze komórki. Po 2 minutowym zabiegu komórki powinny być nadal przyczepione do powierzchni naczynia.
      4. Odessać EDTA, odłączyć kolonie przez silne pipetowanie 10 ml 1x PBS na powierzchni naczynia i zebrać całą pożywkę i komórki w probówce o pojemności 50 ml.
      5. Dodaj 20 ml 1x PBS i odwiruj przy 200 x g przez 4 minuty, aby wypłukać pozostały EDTA.
      6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml pożywki zamrażającej.
      7. Rozprowadzić hPSC równomiernie w trzech kriowiałach po 1 ml każdy.
      8. Przechowywać w temperaturze -80 °C przez noc w kontrolowanym zamrażalniku lub styropianowej kanapce, aby zapewnić powolny spadek temperatury, a następnie przenieść do zbiornika z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.

2. Wysiewanie hPSC w celu rozpoczęcia różnicowania (dzień 0)

UWAGA: hPSC powinny być gotowe do różnicowania po ustabilizowaniu (tj. rozszczepieniu 2-3x po rozmrożeniu). Upewnij się, że kolonie są zdrowe, z gładkimi, błyszczącymi krawędziami i minimalnym zróżnicowaniem (Rysunek 2B).

  1. W razie potrzeby przygotuj naczynia pokryte matrycą z membraną podstawną (24 dołki lub 6 dołków) dzień przed dniem 0. Przynieś naczynia do RT na początku różnicowania.
  2. W razie potrzeby przygotuj pożywkę różnicującą 0–1 na dzień.
  3. Odessać E8 z konfluentu, gotowego do rozszczepienia hPCS, i umyć naczynie 2x za pomocą 1x PBS.
  4. Dodać 7 ml 0,25 M EDTA na 100 mm szalkę, inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2, przez 15 min.
    UWAGA: W tym momencie leczenie EDTA jest przedłużane, aby rozproszyć się na pojedyncze komórki.
  5. Odpipetować wszystkie hPSC (powinny być pływające) i przenieść do probówki o pojemności 50 ml. Dodaj taką samą ilość lub więcej 1x PBS jako roztworu EDTA, aby rozcieńczyć EDTA.
  6. Wirować przy 200 x g przez 4 min.
  7. Odrzucić supernatant, dodać 1 ml pożywki różnicującej dnia 0–1 i pipetować w celu homogenizacji komórek. Następnie dodaj więcej pożywki, a następnie wymieszaj, aby rozcieńczyć roztwór komórek do stężenia idealnego do policzenia komórek.
    UWAGA: Nie należy nadmiernie rozcieńczać roztworu komórkowego. Na początek komórki z jednej pełnej płytki o średnicy 100 mm należy rozcieńczyć w 5 ml pożywki.
  8. Policz liczbę komórek za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.
  9. Rozcieńczyć roztwór komórek w razie potrzeby, aby osiągnąć 125 000 komórek/cm2 w małej objętości końcowej (np. 2 ml na dołek dla naczynia 6-dołkowego lub 500 μl na dołek dla naczynia 24-dołkowego).
    UWAGA: Mała głośność pomaga ogniwom szybciej się przyczepiać.
  10. Odessać cały roztwór matrycy błony podstawnej z powlekanych naczyń i umieścić roztwór komórkowy w studzienkach.
  11. Inkubować w temperaturze 37 °C, w 5% CO2 .

3. Indukcja komórek grzebienia nerwowego (dzień 1 do dnia 10, Rysunek 2A)

  1. W dniu 1 nakarm komórki pożywką różnicującą dnia 0-1 (3 ml na dołek na 6 dołków i 1 ml na dołek na 24 dołki).
  2. W dniu 2 nakarm komórki pożywką różnicującą dnia 2–10 (3 ml na dołek na 6 dołków i 1 ml na dołek na 24 dołki).
  3. Od tej pory komórki powinny być karmione co drugi dzień aż do 10 dnia (tj. następny dzień karmienia będzie dniem 4).
    UWAGA: Od 6 dnia powinny być wykrywane grzbiety NC (Rysunek 2B). Aby sprawdzić, czy zachodzi różnicowanie, zaleca się przeprowadzenie równoległej kultury różnicowania w mniejszych studzienkach (tj. 24 dołkach), które można wybarwić na obecność SOX10 / AP2a i wykorzystać do ekspresji genów markerowych w czasie różnicowania (Rysunek 2B, C).
  4. Jeśli sortujesz komórki, przejdź do sekcji 4. W przeciwnym razie przejdź do sekcji 5.

4. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) dla markera grzebienia nerwowego CD49D i agregacja komórek NC w sferoidach

UWAGA: Do sortowania metodą FACS, próbki powinny być trzymane na lodzie i nie powinny być wystawiane na działanie światła po barwieniu aż do momentu sortowania.

  1. Przygotuj bufor FACS, jeśli komórki są posortowane.
  2. Przygotować pożywkę sferoidalną z dnia 10–14.
  3. W dniu 10 usuń pożywkę i przemyj 1x 1x PBS.
  4. Dodać roztwór dysocjacyjny (patrz tabela materiałów) w ilości 2 ml na studzienkę dla płytki 6-dołkowej lub 1 ml na studzienkę dla płytki 24-dołkowej i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 20 minut.
  5. Odpipetować wszystkie hPSC i przenieść do probówki o pojemności 50 ml.
  6. Napełnij pozostałą część probówki buforem FACS i odwiruj przy 200 x g przez 4 min.
    UWAGA: Każda probówka o pojemności 50 ml może pomieścić do 20 ml lub mniej roztworu komórkowego. Objętość buforu FACS powinna być wystarczająco duża, aby zneutralizować roztwór dysocjacyjny.
  7. Odrzuć supernatant, ponownie zawieś komórki odpowiednią ilością buforu FACS (~ 2 ml na dołek płytki 6-dołkowej) i policz w celu określenia liczby komórek.
  8. Przygotuj następujące próbki.
    1. Próbka 1 (niebarwiona kontrola): 1 x 106 komórek w 400 μl buforu FACS. Przefiltruj komórki przez nasadkę sitka o średnicy 20 μm i trzymaj probówkę na lodzie.
    2. Próbka 2 (tylko kontrola DAPI): 1 x 106 komórek w 400 μl buforu FACS zawierającego 0,5 ug/ml DAPI. Przefiltruj komórki przez probówkę FACS z nasadką sitka i trzymaj probówkę na lodzie.
    3. Próbka 3 (znakowana CD49d): Zawiesić pozostałe komórki za pomocą buforu FACS zawierającego przeciwciało CD49D sprzężone z PE/Cy7 (5 μl dla 1 x 106 komórek na 100 μl buforu FACS) w probówce o pojemności 15 ml i inkubować na lodzie przez 20 minut.
  9. Napełnij probówki buforem FACS i odwiruj przy 200 x g przez 4 minuty.
  10. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić co 5–10x 10 6 komórek w 1 ml buforu FACS zawierającego 0,5 ug/ml DAPI zgodnie z instrukcjami producenta.
  11. Przefiltruj komórki przez probówkę FACS za pomocą nasadki sitka i utrzymuj probówkę na lodzie.
  12. Przygotować probówki zbiorcze FACS zawierające 2 ml buforu FACS.
  13. Sortuj maszynę FACS za pomocą laserów, które mogą wykrywać DAPI i PE-Cy7 w celu wyizolowania populacji CD49D+.
  14. Po posortowaniu policz posortowane komórki.
  15. Odwirować wszystkie posortowane komórki i ponownie zawiesić w dniu 10–14 pożywkę sferoidalną do końcowego stężenia 0,5 x 106 komórek na 500 μl pożywki.
  16. Płytka 0,5 x 106 komórek na dołek do 24-dołkowych płytek o bardzo niskim mocowaniu.
  17. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, w 5% CO2 .

5. Agregacja komórek NC w sferoidach

  1. Jeśli nie używasz FACS do izolowania komórek NC, a zamiast tego agregujesz je bezpośrednio w sferoidy, najpierw przygotuj komórki zgodnie z opisem w krokach 4.2–4.5.
  2. Napełnij resztę probówki 1x PBS i odwiruj przy 200 x g przez 4 minuty.
  3. Odrzuć supernatant, ponownie zawieś komórki odpowiednią ilością pożywki sferoidalnej z dnia 10-14 (np. ~ 2 ml pożywki na dołek dla płytki 6-dołkowej) i policz w celu określenia liczby komórek.
  4. Rozcieńczyć komórki w pożywce sferoidalnej dnia 10–14 do 0,5 x 106 komórek na 500 μl pożywki.
  5. Płytka: 500 μl zawiesiny komórek na dołek na płytkach 24-dołkowych o bardzo niskim mocowaniu.
  6. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, w 5% CO2 .

6. Utrzymanie sferoidów NC i indukcja współczulnych progenitorów (dzień 10 do dnia 14, Rysunek 4A)

  1. Opcja 1: Minimalna hodowla sferoidów
    1. W dniu 11 dodać 500 μl pożywki sferoidalnej dnia 10–14 do sferoid NC bez zasysania istniejącej pożywki od 10 dnia. Inkubować w temperaturze 37 °C, w 5% CO2 .
    2. W dniu 12 przechyl płytkę, aby zgromadzić sferoidy NC po jednej stronie studzienek. Ostrożnie odessać i wyrzucić jak najwięcej pożywki i nakarmić 1 ml pożywki sferoidalnej z dnia 10–14.
    3. Kontynuuj karmienie komórek codziennie do 14 dnia.
    4. Opcjonalnie: Jeśli sferoidy agregują się i tworzą dużą grudkę, użyj pipety, aby rozbić sferoidalne grudki. Gwarantuje to również, że poszczególne sferoidy nie stają się zbyt duże.
      UWAGA: Idealny zakres rozmiarów sferoidów powinien wynosić około 100–500 μm. W tym zakresie wielkość poszczególnych sferoid nie jest krytyczna. Jednak morfologia, taka jak gładkie i wyraźne krawędzie (Rysunek 3 i Rysunek 6) jest ważna dla dalszego sukcesu. W dniu 14 każda 24-dołkowa płytka zawiera idealnie około 50-60 sferoid o różnych rozmiarach w wyżej wymienionym zakresie rozmiarów.
  2. Opcja 2: Rozszerzona hodowla sferoidów
    1. W dniu 15, aby utrzymać sferoidy NC, nakarm 1,5 ml sferoidalnej pożywki z dnia 10–14 zawierającej 0,5 μM RA. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
      UWAGA: RZS należy dodawać świeże do każdego karmienia i zawsze przechowywać w temperaturze -80 °C.
    2. Od tej pory karmić co drugi dzień do 28 dnia, a następnie kontynuować posiewanie sferoid (sekcja 7.1).
      UWAGA: Rosnące sferoidy są dzielone około 1 razy w tygodniu, pipetując je pipetą o pojemności 1 ml w celu ich rozdrobnienia. Są one dzielone w przybliżeniu w stosunku 1:2–1:4. W ciągu 2-tygodniowego okresu ekspansji liczba komórek powinna wzrosnąć około czterokrotnie.

7. Różnicowanie i dojrzewanie SymN (Opcja 1: po 14 dniu; Opcja 2: po 28 dniu)

  1. Sferoidy galwaniczne w zwykłych naczyniach
    1. Przygotuj 24-dołkowe płytki powlekane PO/LM/FM.
    2. Przygotuj pożywkę symN zawierającą 0,125 μM RA (dodawać świeże przy każdej karmie) i 10 μM Y27632 (tylko dzień 14).
    3. W dniu 14 przechyl płytkę, aby zgromadzić sferoidy NC po jednej stronie studzienek. Ostrożnie odessać i wyrzucić jak najwięcej pożywki i nakarmić 1 ml pożywki symN.
    4. Usuń LM/FN z powlekanych płyt.
    5. Podziel i płytkuj każdą studzienkę z płytki 24-dołkowej do 4 oddzielnych dołków nowej, powlekanej płytki 24-dołkowej. Każda oryginalna studzienka będzie miała 1 ml, zawierającą ~50-60 sferoid. Daje to 250 μl, zawierających około 10–15 sferoid na każdą studzienkę na nowej płytce.
    6. Dodać 250 μl dodatkowej pożywki na dołek.
      UWAGA: To jest podział 1:4; Upewnij się, że sferoidy są prawidłowo rozmieszczone w roztworze, tak aby podział był w miarę równy. Liczba sferoid nie jest zliczana, ponieważ ostateczna liczba nie ma wpływu na powodzenie generowania symN.
    7. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    8. W dniu 15 (lub dniu 29 w przypadku opcji 2) karmić, zastępując całą pożywkę 1 ml pożywki symN zawierającej 0,125 μM RA. Od tej pory neurony powinny być karmione co 2 dni do 20 dnia (lub 35 dnia w przypadku opcji 2).
    9. Po 20 dniu (lub 35 dniu dla opcji 2) neurony powinny być karmione, ostrożnie wymieniając tylko połowę istniejącego podłoża (500 μl). Od teraz karm co tydzień, chyba że podłoże szybko żółknie.
    10. Kontynuuj karmienie co tydzień, aż do pożądanego punktu czasowego.
      UWAGA: symN mają tendencję do agregacji w strukturach podobnych do zwojów i są podatne na odrywanie się od szalek hodowlanych. Aby temu zapobiec, zaleca się karmienie w połowie i minimalne obchodzenie się z nim.
  2. Ogniwa galwaniczne do rejestracji elektrofizjologicznej
    1. Przygotuj 96-dołkowe płytki elektrofizjologiczne z powłoką PO / LM / FM.
    2. Przygotuj pożywkę symN zawierającą 0,125 μM RA (dodawać świeże przy każdej karmie) i 10 μM Y27632 (tylko dzień 14).
    3. W dniu 14 zbierz wszystkie sferoidy, a następnie odwiruj je przy 200 x g przez 4 minuty.
    4. Odrzucić supernatant, dodać 2 ml roztworu dysocjacyjnego i przenieść mieszaninę z powrotem do jednego z dołków płytki mocującej o bardzo niskim poziomie. Inkubować w temperaturze 37 °C, w 5% CO2 przez 20–45 min.
      UWAGA: W zależności od wielkości sferoid okres dysocjacji może być dłuższy niż 20 minut. Sprawdzaj dysocjację komórki co 10 minut do 45 minut. Opcjonalnie można dodać 0,1 mg/ml DNazy z roztworem dysocjacyjnym, aby zapobiec powstawaniu wolnego DNA z martwych komórek, co powoduje, że roztwór jest lepki. Jest to opcjonalne w tym protokole, ponieważ sferoidy nie będą się agregować, gdy zostaną w pełni zdysocjowane.
    5. Pipetować do całkowitego rozdzielenia sferoid, a następnie odwirowywać przy 200 x g przez 4 minuty.
    6. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki odpowiednią ilością pożywki symN i policzyć liczbę komórek.
    7. Umieść komórki w studzienkach elektrofizjologicznych pokrytych 100 000/cm2 w PO / LM / FN w całkowitej objętości 200 μl na studzienkę.
    8. W dniu 15 (lub w dniu 29 w przypadku opcji 2) należy postępować zgodnie z tymi samymi procesami karmienia, co w punkcie 7.1. Całkowita objętość po 15 dniu (lub dniu 29 dla opcji 2) powinna wynosić 300 μl na studzienkę.
    9. Zmierz sygnały elektryczne za pomocą maszyny z matrycą wieloelektrodową po 20 dniu (lub dniu 35 dla opcji 2).
      UWAGA: W wariancie 2 sferoidy można posiewać w dowolnym momencie między 14 dniem a 28 dniem. Pierwsze pomiary sygnałów elektrycznych można przeprowadzić po 1 tygodniu od poszycia sferoid.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym protokole przedstawiamy instrukcje dotyczące generowania symN z hPSC. Warunki hodowli zaprezentowane w tej metodzie zostały ulepszone w stosunku do wcześniej opublikowanego protokołu23,24 (Rycina 1A>) i zmienione na warunki bez karmionek oraz chemicznie zdefiniowane (Rycina 1B). Przedstawiono dwie opcje: pierwszą, w której symN powstają w ciągu 20 dni, oraz drugą, w której NCC mogą być namna...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Niedawno opublikowaliśmy dwa przeglądy, z których jeden omawia zastosowanie symN pochodzących z hPSC do modelowania choroby31 , a także dogłębne porównanie dostępnych protokołów różnicowania22. Dlatego tutaj skupiamy się na rozwiązywaniu problemów z obecnym protokołem, aby pomóc zainteresowanemu badaczowi odnieść sukces w tworzeniu symN. Podczas całego procesu różnicowania, w celu uzyskania spójnych danych, a także zdrowych zróżnicowanych komórek, zanieczyszczenie na wszyst...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Heidi Ulrichs za krytyczne przeczytanie i zredagowanie rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szalki do hodowli komórkowych 100 mmFalcon353003
15 ml stożkowe probówki do hodowli tkankowychVWR/Corning89039-664
24-dołkowe płytki do hodowli tkankowychFalcon353047
24-dołkowe płytki o bardzo niskim mocowaniuCorning07 200 601 i 07 200 602
5% CO2/20% O2Thermo Fisher/Life TechnologieHeracell VIOS 160i
tkankowychVWR/Corning89039-656
6-dołkowe płytki do hodowli tkankowychCostar3516
AccutaseInnovation Technologie komórkoweAT104500Roztwór do dysocjacji komórek
Przeciwciało anty-AP2aAbcamab108311Gospodarz: Królik; Rozcieńczenie
1:400Przeciwciało anty-Ascl1BD Pharmingen556604Gospodarz: mysz IgG1; Rozcieńczenie 1:200
Przeciwciało anty-CD49DBioLegend304313Gospodarz: Mysz IgG1; 5 μ l / milion komórek w 100 μ l objętość
przeciwciała anty-CD49D (izotyp)BioLegend400125Gospodarz: mysz IgG1; 5 μ l / milion komórek w 100 μ l objętość
barwnika DAPISigmaD95421:1000 rozcieńczenie
Przeciwciało anty-DBHImmunostar22806Gospodarz: Królik; Rozcieńczenie 1:500
Przeciwciało anty-GFPAbcamab13970Gospodarz: Kurczak; Rozcieńczenie 1:1000
Przeciwciało anty-HOXC9Abcamab50839Gospodarz: Mysz; Rozcieńczenie 1:100
Przeciwciało anty-NET1MabNET17-1Gospodarz: Mysz; Rozcieńczenie 1:1000
Przeciwciało anty-PRPHSanta Cruz BiotechnologySC-377093/H0112Gospodarz: Mysz IgG2a; Rozcieńczenie 1:200
Przeciwciało anty-SOX10Santa Cruz Biotechnologysc-365692Gospodarz: Mysz IgG1; Rozcieńczenie 1:100
Przeciwciało anty-THPel-FreezP40101-150Gospodarz: Królik; Rozcieńczenie 1:500
Kwas askorbinowySigmaA8960-5GStężenie w magazynie: 100 mM
suplement B27Thermo Fisher/Life Technologies12587-010Stężenie w magazynie: 50x
BDNFR& D Systems248-BDStężenie zapasów: 10 μ g/ml
BMP4R& D Systems314-BPStężenie zapasów: 6 mM
Licznik komórekThermo Fisher/Life TechnologiesHrabina II
Szkiełka komory do liczenia komórekInvitrogenC10312
WirówkaEppendorf57021& 5424R
CHIR99021R& D Systems4423Stężenie w magazynie: 6 mM
KriofiolkaThermo Fisher/Life Technologies375353
dbcAMPSigmaD0627Stężenie w magazynie: 100 mM
DMEMThermo Fisher/Life Technologies10829-018Stężenie w magazynie: 1x
DMEM/F12Thermo Fisher/Life Technologies11330-057Stężenie w magazynie: 1x
DMSOThermo Fisher/Life TechnologiesBP231-100
E6 średnigibcoA15165-01
E8 średnigibcoA15169-01Stężenie w magazynie: 1x
suplement E8gibcoA15171-01Stężenie w magazynie: 50x
EDTASigmaED2SSStężenie w magazynie: 0,5 M
Płytki elektrofizjologiczne (AXION cytoview MEA96)Axion BioSystemsM768-tMEA-96W
Maszyna FACSBeckman CoulterCytoFLEX (do FACS)
Maszyna FACSBeckman CoulterMoFlo Astrios EQ (do sortowania)
Rurki FACS (niebieska nasadka filtra)LampyFalcon 352235
(biała nasadka)Falcon352063
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
GDNFPeproTech450Stężenie zapasów: 10 μ g/ml
GeltrexInvitrogenA1413202Matryca błony podstawnej; Stężenie magazynowe: 100x
hPSCThomson i wsp., (1998)WA09
hPSCsOh i wsp. (2016)H9-PHOX2B::eGFP
Ludzka fibronektyna (FN)VWR/Corning47743-654Stężenie zapasowe: 1 mg/ml
L-glutaminaThermo Fisher/Gibco25030-081Stężenie magazynowe: 200 mM
zbiornik LNNiestandardowe systemy biogenneV-1500AB
Czytnik MEAAxion BioSystemsMaestro Pro
Mouse laminin I (LM)R& D Systems3400-010-01Stężenie magazynowe: 1 mg/ml
suplement N2Thermo Fisher/Life Technologies17502-048Stężenie magazynowe: 100x
Podłoże neuropodstawowegibco21103-049Stężenie magazynowe: 1x
NGFPeproTech450-01Stężenie magazynowe: 25 μ g / ml
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco14190-136Stężenie magazynowe: 1x
bromowodorek poli-L-ornityny (PO)SigmaP3655Stężenie podstawowe: 15 mg / ml
Primocin (antybiotyki)InvivoGenANTPM1Stężenie magazynowe: 50 mg / ml
maszyna qPCRBio-Rad LaboratoriesC1000 Touch
qPCRBio-Rad LaboratoriesHSP9601
rekombinowany FGF2R& D Systems233-FB/CFStężenie w magazynie: 10 μ g/ml
Kwas retinowySigmaR2625Stężenie magazynowe: 1 mM
SB431542Tocris/R& D Systems1614Stężenie magazynowe: 10 mM
Trypan niebieskiCorningMT-25-900-CI
Vitronectin (VTN)Thermo Fisher/Life TechnologiesA14700Stężenie magazynowe: 0,5 mg/ml
Łaźnia wodnaVWR/Corning706308
Y27632R& D Systems1254Koncentracja magazynowa: 10 mM
Inkubator kultur tkankowych 50 ml stożkowe probówki do hodowli FACS

Bibliografia

  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).
  3. Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
  4. Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).
  5. Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).
  6. Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. , Cambridge University Press. (1999).
  7. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).
  8. Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).
  9. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).
  10. Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. Developmental Biology. 244 (2), 329-341 (2002).
  11. Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139 (22), Cambridge, England. 4220-4231 (2012).
  12. Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).
  13. Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75 (3), 463-476 (1993).
  14. Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
  15. Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135 (3), Cambridge, England. 473-481 (2008).
  16. Trainor, P. Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , Academic Press. (2013).
  17. Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. Developmental Biology. 277 (2), 271-286 (2005).
  18. Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
  19. Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).
  20. Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
  21. Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8 (1), 12865(2018).
  22. Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92(2019).
  23. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).
  24. Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78(2019).
  25. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  26. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
  29. Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).
  30. Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81(2019).
  31. Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).
  32. Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

R nicowanie neuron w wsp czulnychhodowla bez kom rek karmionekwarunki chemicznie zdefiniowanemarkery grzebienia neuronalnegorejestracja elektrofizjologicznatraktowanie kwasem retinowymekspansja hodowli sferoid wautonomiczny uk ad nerwowy

Powiązane artykuły