Celem tego artykułu jest opisanie wyrafinowanej metody intubacji myszy laboratoryjnej. Metoda jest nieinwazyjna i dlatego idealnie nadaje się do badań, które wymagają seryjnego monitorowania funkcji oddechowych i/lub wkraplania leków do płuc.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wielokrotna intubacja jamy ustnej i tchawicy u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Literatura opisuje kilka metod intubacji myszy, które wymagają albo wizualizacji głośni przez jamę ustną, albo nacięcia w brzusznej szyi w celu bezpośredniego potwierdzenia umieszczenia kaniuli w tchawicy. Względna trudność lub uraz tkanki wywołany u pacjenta przez takie procedury może stanowić przeszkodę dla zdolności badacza do przeprowadzenia badań podłużnych. W artykule przedstawiono technikę, w której fizyczna manipulacja myszą po użyciu depilatora w celu usunięcia włosów z brzusznej szyi pozwala na przezskórną wizualizację tchawicy w celu intubacji ustno-tchawiczej niezależnie od stopnia pigmentacji skóry. Ta metoda jest nieszkodliwa dla tematu i łatwa do osiągnięcia przy ograniczonym zrozumieniu anatomii mysów. To wyrafinowane podejście ułatwia wielokrotną intubację, która może być konieczna do monitorowania postępu choroby lub wkraplania leczenia. Zastosowanie tej metody może skutkować zmniejszeniem liczby zwierząt i umiejętności technicznych wymaganych do pomiaru czynności płuc w mysich modelach chorób układu oddechowego.
Wprowadzenie
Mysz laboratoryjna jest powszechnym zwierzęcym modelem ludzkiej choroby układu oddechowego. W związku z tym istnieje kilka opublikowanych metod intubacji myszy w celu zarówno wkraplania leków, jak i pomiaru mechaniki oddechowej. Większość opisanych procedur wymaga wizualizacji głośni w jamie ustnej za pomocą specjalistycznego sprzętu, takiego jak laryngoskop lub światłowodowe źródło światła1,2,3,4,5,6,7. Może to być jednak trudne, gdy wymagana jest stosunkowo duża kaniula, ponieważ może ona zasłaniać widok badacza. Limjunyawong i wsp.8 rozwiązali ten problem za pomocą metody intubacji, w której wykonuje się małe nacięcie skórne wzdłuż linii środkowej brzusznej szyi, co pozwala na wizualizację tchawicy. Po zabiegu nacięcie zamyka się klejem tkankowym.
Dla badań wymagających częstych powtarzających się intubacji, kolejne nacięcia i zamknięcie tego miejsca wymaga oczyszczenia brzegów skóry i uszkodzenia tkanek brzusznej szyi. Celem przezskórnej wizualizacji tchawicy do intubacji doustnej jest zapewnienie wyrafinowanej, nieinwazyjnej techniki szczególnie odpowiedniej do wielokrotnych badań intubacji, a także pojedynczych przypadków intubacji u myszy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane tutaj działania związane ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Stanowego Ohio i zostały przeprowadzone w obiektach akredytowanych przez AAALAC.
1. Przygotowanie do zabiegu
- Zbuduj platformę do intubacji. Aby uzyskać odpowiednie nachylenie platformy, użyj trzycalowego (7,6 cm) segregatora z 3 pierścieniami. Złóż na pół jedwab 3-0 o długości 15−20 cm lub inny materiał z nici i przyklej końce nici do górnej części pochyłej platformy za pomocą taśmy, aby utworzyć pętlę do zawieszenia (Rysunek 1).
- Wybierz kaniulę o odpowiednim rozmiarze i długości.
nuta: W przypadku myszy o wadze 20−30 g można użyć cewnika o długości 1−1,5 cala (2,5−3,8 cm) o długości do 18 g. W tym badaniu wykorzystano 18-tygodniową samicę BALB/c i 10-tygodniową mysz C57BL/6 (n = 3 z każdego szczepu). Nieprzezroczysta biała osłonka cewnika zapewnia najlepszą wizualizację przezskórną. - Wytnij skos na dystalnej końcówce cewnika i wygładź ciętą powierzchnię papierem ściernym, aby uzyskać zaokrągloną końcówkę skośną. Delikatnie utwórz lekkie zgięcie w kaniuli około 1 cm od skosu (Rysunek 2).
nuta: Dla każdej myszy należy użyć nowego cewnika. - Znieczulić mysz ketaminą (5,4 mg/g masy ciała) i ksylazyną (16 μg/g masy ciała) podawanymi dootrzewnowo. Nałóż sterylną maść okulistyczną na oczy.
nuta: Właściwą głębokość znieczulenia uzyskuje się poprzez brak reakcji myszy na mocne uszczypnięcie palca. - Zawieś mysz w pozycji leżącej na platformie intubacyjnej, zaczepiając górne siekacze o jedwabną nić w górnej części pochylonej powierzchni (Rysunek 3). Gdy mysz znajdzie się prostopadle w pozycji grzbietowej, delikatnie chwyć podstawę ogona i cofnij ogon w kierunku stołu. Umieść kawałek taśmy u podstawy ogona, aby zabezpieczyć mysz.
- Nałóż krem do depilacji (tabela materiałów) na brzuszną część szyjki macicy przez 30−45 s, a następnie usuń cały krem do depilacji z okolicy szyjki macicy za pomocą suchej gazy. W razie potrzeby powtórz proces aplikacji. Dokładnie spłucz skórę solą fizjologiczną lub wodą destylowaną, aby usunąć wszelkie pozostałości, a następnie wytrzyj do sucha.
2. Procedura intubacji
- Użyj prostych, płaskich kleszczy w niedominującej ręce, aby delikatnie cofnąć język w taki sposób, aby wystarczająco otworzyły usta do wprowadzenia kaniuli.
nuta: Nie należy używać kleszczyków do zębów szczurów, ponieważ może to uszkodzić język. - Ręką dominującą wsuń kaniulę do ust tak, aby koniec dystalny do lekkiego zgięcia przylegał do podniebienia badanego.
- Zwolnij język i przesuń płaską krawędź zamkniętych kleszczy doogonowo wzdłuż szyi brzusznej, aż dojdziesz do rękojeści. Ruch ten bocznie przemieszcza gruczoły ślinowe i spłaszcza mięsień pokrywający tchawicę. Tchawica pojawia się przezskórnie jako biała linia (Ryc. 3A). W razie potrzeby obróć kleszcze w kierunku czaszkoczaszkowym, utrzymując napięcie na skórze w kierunku doogonowym, aby spowodować szczyt przemieszczonych bocznie gruczołów ślinowych. Ten manewr tworzy większy kontrast wokół tchawicy (Rysunek 3B).
nuta: Unikaj nadmiernej siły działającej na brzuszną szyję, ponieważ może to spowodować zapadnięcie się tchawicy i upośledzenie oddychania. - Przesuwaj kaniulę, jednocześnie ustawiając dystalną końcówkę kaniuli pod kątem brzusznym, supinując dominującą rękę z jednoczesnym zgięciem nadgarstka.
- Prawidłowe umieszczenie kaniuli jest wskazane przez wizualizację nieprzezroczystej kaniuli w tchawicy (Rysunek 4B,D). Jeśli kaniula została wysunięta poza poziom początku mięśnia żwaczego, a wizualizacja kaniuli w tchawicy nie została potwierdzona, wycofaj kaniulę i spróbuj ponownie wykonać manewr.
- Potwierdź prawidłowe umieszczenie kaniuli, podłączając bańkę do pompowania płuc do kaniuli i obserwując rozszerzanie się klatki piersiowej przy jednoczesnym wciśnięciu urządzenia.
- Nie przesuwając kaniuli, ostrożnie odczep siekacze myszy od platformy intubacyjnej. Przesuń mysz na poziomą platformę (Tabela materiałów) i włóż kaniulę do adaptera na respiratorze. Po głębokim napompowaniu wietrz mysz przez 60 sekund, a następnie zmierz opór oddechowy.
3. Odzyskiwanie
- Po zakończeniu procedury przenieś mysz na rozgrzaną platformę. Zapewnij ciągłą stymulację poprzez lekkie szczypanie palców u nóg lub ogona, aby zachęcić do spontanicznego oddychania.
- Ekstubacja może nastąpić, gdy mysz dopiero zaczyna żuć. Chwyć kaniulę na poziomie piasty i delikatnie pociągnij rurkę czaszkowo i odsuń od myszy, aż kaniula zostanie całkowicie usunięta z ust badanego.
nuta: Zaleca się zapewnienie wsparcia dróg oddechowych za pomocą sztywnej kaniuli tak długo, jak to możliwe podczas procesu rekonwalescencji. - Po ekstubacji przenieś mysz do czystej klatki regeneracyjnej ze wsparciem termicznym. Stale monitoruj mysz, aż będzie w pełni zdolna do chodzenia, a odzyskiwanie zostanie zakończone.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Seryjne monitorowanie podstawowej funkcji płuc
Osiemnastotygodniowe samice myszy BALB/c oraz dziesięciotygodniowe myszy C57BL/6 (n = 3 dla każdego szczepu) poddano intubacji przy użyciu opisanej metody w dniach 0, 3, 10 i 17. Po intubacji w każdym z tych dni zwierzę podłączono do respiratora mechanicznego zasilanego 100% tlenem (Tabela materiałów). Opór dróg oddechowych (Rrs) mierzono metodą wymuszonych oscylacji przez 60 s po głębokiej inflacji do 25 cm H2O utrzymanej prz...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Intubacja z wykorzystaniem techniki przezskórnej wizualizacji tchawicy oferuje wyrafinowane podejście do standardowej metody nacinania skóry. Zwracając szczególną uwagę na kilka kluczowych kroków, intubacja może być łatwo i szybko przeprowadzona. Zwierzę musi być umieszczone prostopadle grzbietowo na platformie intubacyjnej z myszą zabezpieczoną w delikatnym wycofaniu. Spowoduje to wydłużenie zwierzęcia do pionowego wyrównania i właściwej pozycji do intubacji. Ponadto krem do depilacji nie powinien pozostawać w kontakcie...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują Lucii Rosas, Lauren Doolittle, Lisie Joseph i Lindsey Ferguson za pomoc techniczną oraz Uniwersyteckiemu Laboratorium Zasobów Zwierząt za wsparcie w opiece nad zwierzętami. Ta praca jest finansowana przez NIH T35OD010977 i R01-HL102469.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Cewnik dożylny 18 G x 1 1/4", Safelet | Fisher Scientific | #14-841-14 | Kaniula do intubacji |
| 70% etanolu, 10 L | Fisher Scientific | 25467025 | Kaniula czyszcząca Papier |
| ścierny (papier ścierny) | Porter-Cable | 74001201 | Przygotowanie kaniuli |
| AnaSed (sterylny roztwór ksylazyny) do wstrzykiwań (100 mg/mL) | Akorn Animal Health | NDC# 59399-111-50 | etykietowania anestezjologicznego |
| (0,5 cala x 14 jardów) | Fisher Scientific | 15966 | Ograniczenie na platformie intubacyjnej |
| Pleciony jedwabny szew bez igły, niesterylny, (3-0) | Henry Schein | Pozycja #1007842 | Platforma do intubacji |
| Podkładka izotermiczna Deltaphase | Braintree Scientific | 39DP | Termoregulacja i odzyskiwanie myszy |
| Deltaphase Działanie Płyta | Braintree Scientific | 39OP | Odzyskiwanie myszy (przed ekstubacją) |
| Woda destylowana | ThermoFisher | 15230253 | Czyszczenie myszy po depilacji |
| Nożyczki do oczu, kątowe, ostre/ostre | Aparat Harvard | 72-8437 | Przygotowanie kaniuli |
| FlexiVent (FX Module 2) | Scireq | N/A | Rejestruj dane dotyczące czynności płuc (niewymagane do wykonania procedury, wykorzystane w tym badaniu do walidacji procedury) |
| Gąbki z gazy | Fisher scientific | 13-761-52 | Depilacja |
| Wytrzymałe 3-calowe 3-pierścieniowe segregatory | Zszywki | 24690CT | Platforma do intubacji |
| Oprogramowanie | Instat Graphpad | N/A | Oprogramowanie do analizy statystycznej |
| Strzykawka insulinowa (0,5 cm3, U100) | Fisher Naukowe | 329461 | Podawanie znieczulenia |
| Ketamina HCl Wstrzyknięcie, USP (100 mg / mL) | Llyod Laoratories | Nr listy 4871 | Znieczulenie |
| Żarówka do napełniania płuc | Aparat Harvarda | 72-9083 | Potwierdź umieszczenie kaniuli |
| Mikro kleszcze, zakrzywione, gładkie | Aparat Harvard | 72-0445 | Cofnij język i wytwórz napięcie na szyi w celu wizualizacji |
| kaniuliNair (balsam do depilacji), butelka 9 uncji | Church & Dwight | 42010440 | Depilacja |
| Sterylna sól fizjologiczna (0,9%), 10 ml | Fisher Scientific NC9054335 | Anestezjologia, oczyszczanie skóry po depilacji |
Bibliografia
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory Animals. 41 (1), 128-135 (2007).
- Rivera, B., Miller, S. R., Brown, E. M., Price, R. E. A Novel Method for Endotracheal Intubation of Mice and Rats Used in Imaging Studies. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 44 (2), 52-55 (2005).
- Sparrowe, J., Jimenez, M., Rullas, J., Martinez, A. E., Ferrer, S. Refined Intratracheal Intubation Technique in the Mouse, Complete Protocol Description for Lower Airway Models. Global Journal of Animal Scientific Research. 3 (2), 363-369 (2015).
- Deyo, D. J., Wei, J. A Novel Method of Intubation and Ventilation in Mice. Anesthesia & Analgesia. 88 (2), 179(1999).
- Vergari, A., et al. A new method of orotracheal intubation in mice. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 8 (3), 103-106 (2004).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. S., Mitzner, W. A Simple Method of Mouse Lung Intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318(2013).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964(2015).
- Qin, W., Baran, U., Wang, W. Lymphatic response to depilation-induced inflammation assessed with label-free optical lymphangiography. Lasers in Surgery and Medicine. 47 (8), 669-676 (2015).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique. Journal of Visualized Experiments. (75), e50107(2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
