Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nieukierunkowana chromatografia cieczowa i analiza metabolomiczna ziarna pszenicy oparta na spektrometrii mas

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60851

⸱

13 marca 2020

 ,  ,  , 
1Research and Innovation, Murdoch University, 2Centre for Digital Agriculture, Curtin University, 3Centre for Integrative Metabolomics and Computational Biology, School of Science, Edith Cowan University, 4Centre for Computational and System Medicine, Health Futures Institute, Murdoch University, 5Department of Primary Industries and Regional Development, 6State Agricultural Biotechnology Centre, Murdoch University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono metodę nieukierunkowanej analizy metabolitów i lipidów w ziarnie pszenicy. Protokół obejmuje metodę ekstrakcji metabolitu acetonitrylu oraz metodologię chromatografii cieczowej z odwróconą fazą i spektrometrią mas, z akwizycją w dodatnich i ujemnych trybach jonizacji elektrorozpylanej.

Streszczenie

Zrozumienie interakcji między genami, środowiskiem i zarządzaniem w praktyce rolniczej mogłoby pozwolić na dokładniejsze przewidywanie i zarządzanie wydajnością i jakością produktów. Dane metabolomiczne umożliwiają odczyt tych interakcji w danym momencie i dostarczają informacji o stanie biochemicznym organizmu. Co więcej, poszczególne metabolity lub panele metabolitów mogą być wykorzystywane jako precyzyjne biomarkery do przewidywania i zarządzania plonami i jakością. Przewiduje się, że metabolom roślinny zawiera tysiące małych cząsteczek o zróżnicowanych właściwościach fizykochemicznych, które dają możliwość biochemicznego wglądu w cechy fizjologiczne i odkrycia biomarkerów. Aby to wykorzystać, głównym celem badaczy metabolomiki jest uchwycenie jak największej różnorodności fizykochemicznej w ramach jednej analizy. W tym artykule przedstawiamy metodę nieukierunkowanej metabolomiki opartą na chromatografii cieczowej i spektrometrii mas do analizy ziarna pszenicy uprawianego w terenie. Metoda wykorzystuje czwartorzędowy menedżer rozpuszczalnika do chromatografii cieczowej w celu wprowadzenia trzeciej fazy ruchomej i łączy tradycyjny gradient odwróconych faz z gradientem podatnym na działanie lipidów. Szczegółowo opisano procesy przygotowania ziarna, ekstrakcji metabolitów, analizy instrumentalnej i przetwarzania danych. Zaobserwowano dobrą dokładność masy i odtwarzalność sygnału, a metoda pozwoliła uzyskać około 500 biologicznie istotnych cech na tryb jonizacji. Ponadto określono istotnie różniące się sygnały dotyczące cech metabolitów i lipidów między odmianami pszenicy.

Wprowadzenie

Zrozumienie interakcji między genami, środowiskiem i praktykami zarządzania w rolnictwie mogłoby pozwolić na dokładniejsze przewidywanie i zarządzanie wydajnością i jakością produktów. Na metabolity roślinne mają wpływ takie czynniki, jak genom, środowisko (klimat, opady deszczu itp.), a w rolnictwie sposób zarządzania uprawami (tj. stosowanie nawozów, fungicydów itp.). W przeciwieństwie do genomu, na metabolom wpływają wszystkie te czynniki, a zatem dane metabolomiczne dostarczają biochemicznego odcisku palca tych interakcji w określonym czasie. Badanie oparte na metabolomice ma zwykle jeden z dwóch celów: po pierwsze, osiągnięcie głębszego zrozumienia biochemii organizmu i pomoc w wyjaśnieniu mechanizmu odpowiedzi na zaburzenia (stres abiotyczny lub biotyczny) w odniesieniu do fizjologii; a po drugie, powiązanie biomarkerów z badanymi zaburzeniami. W obu przypadkach wynikiem posiadania tej wiedzy jest bardziej precyzyjna strategia zarządzania, aby osiągnąć cel, jakim jest poprawa wielkości i jakości plonów.

Przewiduje się, że metabolom roślinny zawiera tysiące1 małych cząsteczek o różnych właściwościach fizykochemicznych. Obecnie żadne platformy metabolomiczne (głównie spektrometria mas i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego) nie są w stanie uchwycić całego metabolomu w jednej analizie. Opracowanie takich technik (przygotowanie próbki, ekstrakcja i analiza metabolitów), które zapewnią jak najdokładniejsze pokrycie metabolomu w ramach jednego cyklu analitycznego, jest kluczowym celem naukowców zajmujących się metabolomiką. Wcześniejsze nieukierunkowane analizy metabolomiczne ziarna pszenicy łączyły dane z wielu separacji chromatograficznych i polaryzacji akwizycji i/lub oprzyrządowania w celu uzyskania większego pokrycia metabolomu. Wymagało to jednak przygotowania i pozyskania próbek oddzielnie dla każdej modalności. Na przykład Beleggia i wsp.2 przygotowali derywatyzowaną próbkę do analizy GC-MS analitów polarnych oprócz analizy GC-MS analitów niepolarnych. Das et al.3 wykorzystali zarówno metody GC, jak i LC-MS, aby poprawić pokrycie w swoich analizach; Podejście to wymagałoby jednak na ogół oddzielnych preparatów próbek, jak opisano powyżej, a także dwóch niezależnych platform analitycznych. Poprzednie analizy ziarna pszenicy przy użyciu GC-MS2,3,4 i LC-MS3,5 platform przyniosło od 50 do 412 (55 zidentyfikowanych) cech dla GC-MS, 409 dla połączonych GC-MS i LC-MS oraz kilka tysięcy dla analizy lipidomicznej LC-MS5. Łącząc co najmniej dwa tryby w jedną analizę, można utrzymać rozszerzony zakres metabolomu, zwiększając bogactwo interpretacji biologicznej, a jednocześnie oferując oszczędność czasu i kosztów.

Aby umożliwić skuteczne rozdzielanie szerokiej gamy gatunków lipidów za pomocą chromatografii z odwróconymi fazami, nowoczesne metodologie lipidomiczne powszechnie używają dużej ilości izopropanolu w rozpuszczalniku elucyjnym6, zapewniając łagodność dla klas lipidów, które w przeciwnym razie mogłyby być nierozwiązane przez chromatografię. Aby zapewnić efektywną separację lipidów, początkowa faza ruchoma ma również znacznie wyższy skład organiczny7 niż typowe metody chromatografii z odwróconymi fazami, które uwzględniają inne klasy cząsteczek. Wysoki skład organiczny na początku gradientu sprawia, że metody te są mniej odpowiednie dla wielu innych klas cząsteczek. Przede wszystkim chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami wykorzystuje binarny gradient rozpuszczalnika, zaczynając od głównie składu wodnego i zwiększając zawartość organiczną wraz ze wzrostem siły elucji chromatografii. W tym celu staraliśmy się połączyć te dwa podejścia, aby osiągnąć separację metabolitów zarówno lipidowych, jak i nielipidowych w ramach jednej analizy.

Tutaj prezentujemy metodę chromatograficzną, która wykorzystuje trzecią fazę ruchomą i umożliwia połączenie tradycyjnej metody chromatografii z odwróconą fazą i odpowiednią dla lipidomiki przy użyciu przygotowania pojedynczej próbki i jednej kolumny analitycznej. Przyjęliśmy wiele środków kontroli jakości i etapów filtrowania danych, które zostały wcześniej wdrożone w badaniach metabolomicznych, głównie klinicznych. Podejścia te są przydatne do określania solidnych cech o wysokiej odtwarzalności technicznej i znaczeniu biologicznym oraz wykluczają te, które nie spełniają tych kryteriów. Na przykład opisujemy powtórną analizę zbiorczej próbki QC8, korekta QC9, filtrowanie danych9,10 i imputacja brakujących cech11.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ta metoda jest odpowiednia dla 30 próbek (około 150 nasion na próbkę). Wykorzystano tu trzy repliki biologiczne dziesięciu różnych odmian pszenicy uprawianych na polu.

1. Przygotowanie ziaren

  1. Pobieranie próbek (całych ziaren) z miejsca przechowywania w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Liofilizacja nasion jest zalecana wkrótce po zbiorach, jeśli próbki są pobierane z wielu sezonów. Minimalizuje to wszelkie zmiany w stężeniu metabolitów, które mogą wystąpić po różnych okresach przechowywania. Aby to zrobić, przenieś nasiona do plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml (około 300 nasion wypełni probówkę) i przykryj folią aluminiową. Przekłuj folię dwa-trzy razy za pomocą szpilki i liofilizuj całe ziarna przez noc (około 24 godzin). Na tym etapie próbki można zawrócić do zamrażarki o temperaturze -80 °C lub przeprowadzić kolejny krok.
  2. Zmielić nasiona za pomocą blendera laboratoryjnego przez dwie serie w trybie wysokim przez 20 s.
    UWAGA: Blender używany do tego protokołu wymaga co najmniej około 150 nasion, aby napełnić blender do wysokości ostrza i dać stosunkowo jednorodnie zmieloną próbkę ziarna.
  3. Zdejmij blender z podstawy i postukaj w bok blendera, aby wydobyć grubo zmielone ziarno na powierzchnię próbki. Gruboziarnisty materiał można wyrzucić lub przechowywać.
  4. Przenieść drobno zmielony materiał w postaci proszku z blendera do plastikowej probówki wirówkowej o pojemności 2 ml.
    UWAGA: Umyj blender wodą dejonizowaną i spłucz MeOH klasy LC-MS między próbkami. Upewnij się, że blender jest całkowicie suchy przed przejściem do następnej próbki.
  5. Drobno zmielone próbki ziarna należy umieścić z powrotem w zamrażarce lub przejść do następnego etapu (ekstrakcji metabolitów).

2. Przygotowanie rozpuszczalnika ekstrakcyjnego

UWAGA: Przygotuj rozpuszczalnik ekstrakcyjny tego samego dnia, w którym przeprowadzasz ekstrakcje.

  1. Przygotuj co najmniej 2 ml po 1 mg/ml każdego wzorca. Użyj acetonitrylu (ACN) do przygotowania 2-aminoantracenu, mikonazolu i kwasu d 6-transcynamonowego. Użyj wody do przygotowania 13C 6-sorbitol.
  2. Pobrać po 2 ml każdego wzorca o stężeniu 1 mg/ml i dodać do kolby miarowej o pojemności 100 ml.
  3. Napełnić kolbę miarową do linii acetonitrylem. Upewnij się, że 100 ml acetonitrylu zawiera 20 μg/ml każdego z wzorców wewnętrznych: 2-aminoantracenu, mikonazolu, 13C 6-sorbitol, d6-kwas transcynamonowy.

3. Ekstrakcja metabolitów

  1. Odważyć 200 mg drobno zmielonego ziarna do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml.
  2. Dodać 500 μl rozpuszczalnika ekstrakcyjnego do 200 mg drobno zmielonej próbki ziarna.
  3. Mieszać za pomocą homogenizatora przez 2 cykle po 20 s przy 6 500 obr./min.
  4. Wirować w temperaturze 4 °C przez 5 minut przy 16 100 x g.
  5. Przenieść supernatant do plastikowej probówki o pojemności 2 ml.
  6. Powtórzyć tę procedurę od kroków 3.1 do 3.5 dwa razy, aby uzyskać całkowitą objętość supernatantu około 1,5 ml.
  7. Wirować, aby wymieszać supernatant.
  8. Przenieść równą objętość (55 μl) każdego ekstraktu do oddzielnej probówki o pojemności 2 ml w celu uzyskania zbiorczej próbki ekstraktu zbożowego.
  9. Przenieść 50 μl porcji ekstraktu do szklanej fiolki.
    UWAGA: W tym momencie ekstrakty można zamrozić (-80 °C) lub przejść do następnego kroku i przejść do analizy LC-MS.

4. Przygotowanie roztworów do analizy LC-MS

UWAGA: Dla stężonego kwasu, zawsze dodawaj kwas do wody/rozpuszczalnika.

  1. Przygotować 50 ml 1 M roztworu podstawowego mrówczanu amonu. Odważyć 3,153 g mrówczanu amonu i przenieść do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Napełnić kolbę miarową do linii preparatem LC-MS klasy H2O.
  2. Przygotować 1 l ruchomej fazy A składającej się z 10 mM mrówczanu amonu, 0,1% kwasu mrówkowego. W tym celu należy dodać około 500 ml wody klasy LC-MS do kolby miarowej o pojemności 1 l. Dodać 10 ml 1 M mrówczanu amonu i 1 ml kwasu mrówkowego. Napełnić kolbę miarową do linii LC-MS klasy H2O. Przenieść do butelki o pojemności 1 l i sonikować przez 15 minut w celu odgazowania.
  3. Przygotować 1 l ruchomej fazy B składającej się z 10 mM mrówczanu amonu w proporcji 79:20:1 acetonitryl:alkohol izopropylowy:woda, 0,1% kwas mrówkowy. Dodać 200 ml izopropanolu do kolby miarowej o pojemności 1 l. Dodać 10 ml 1 M mrówczanu amonu i 1 ml kwasu mrówkowego. Napełnić kolbę miarową do linii acetonitrylem. Przelać do butelki o pojemności 1 l i sonikować przez 15 minut, aby odgazować.
    UWAGA: Rozcieńczyć 1 M mrówczan amonu w alkoholu izopropylowym (IPA) przed dodaniem ACN. Mrówczan amonu jest nierozpuszczalny w CAN.
  4. Przygotować 1 l ruchomej fazy C składającej się z 10 mM mrówczanu amonu w stosunku 89:10:1 alkohol izopropylowy:acetonitryl:woda. W tym celu należy dodać około 500 ml izopropanolu, 10 ml 1 M mrówczanu amonu i 100 ml acetonitrylu do kolby miarowej o pojemności 1 l. Napełnij do linii izopropanolem. Przelać do butelki o pojemności 1 l i sonikować przez 15 minut w celu odgazowania.
  5. Przygotowanie rozpuszczalników do mycia systemu LC-MS
    1. Wymień roztwór do mycia głowicy pompy na świeży roztwór. Użyj 50% metanolu, 10% alkoholu izopropylowego lub innego zgodnie z zaleceniami producenta.
    2. Przygotować mocne i słabe roztwory do płukania igieł do przemywania płynów iniekcyjnych przed i po wstrzyknięciu próbki. Aby uzyskać mocne pranie, dodaj równe objętości ACN i IPA. W przypadku słabego płukania należy przygotować roztwór 10% ACN (wymagający około 500 ml i 1 l każdego z mocnych i słabych płukań odpowiednio dla tego protokołu i liczby próbek) w oddzielnych butelkach.
    3. Ustaw objętość prania igłą na 600 μl i 1800 μl odpowiednio dla mocnych i słabych prań.

5. Przygotowanie próbek do analizy LC-MS

  1. Zgodnie ze standardową procedurą operacyjną producenta dotyczącą przygotowania 400 ng/μl enkefaliny leucyny, należy pobrać pipetą 7,5 ml wody do fiolki 12 ml leucyny-enkefaliny zawierającej 3 mg leucyny-enkefaliny. Zamrażać w temperaturze -80 °C w podwielokrotnościach o objętości 50 μl.
  2. Przygotuj 100 ml 5% ACN zawierającego 200 ng/ml leucyny-enkefaliny (50 μl 400 ng/μL enkefaliny leucyny). Przygotuj się tego samego dnia, co analiza LC-MS.
  3. Dodać 950 μl 5% acetonitrylu zawierającego wzorzec leucyny-enkefaliny do wstrzykiwań do 50 μl próbki podwielokrotności przygotowanej z kroku 3.
  4. Wirować, aby wymieszać przygotowaną próbkę.

6. Ustawienia LC-MS

UWAGA: Szczegółowy opis konfiguracji instrumentu i metody akwizycji jest opisany w instrukcji obsługi producenta. Ogólny przewodnik i szczegóły dotyczące tego protokołu przedstawiono poniżej. Poniższe kroki można wykonać w dowolnym momencie przed uzyskaniem danych.

  1. Otwórz profil sprzętowy LC-MS.
  2. Ustawić metodę chromatograficzną zgodnie z tabelą 1. Upewnij się, że system LC jest wyposażony w czwartorzędowy menedżer rozpuszczalnika, aby ustawić ten gradient.
    UWAGA: IPA jest rozpuszczalnikiem o lepkości. Powinien być wprowadzany przy niskim natężeniu przepływu i należy zastosować wystarczający czas równowagi przed zwiększeniem składu do 98,0%. Te kroki zapobiegną nadmiernemu ciśnieniu i zatrzymaniu systemu LC.
  3. Ustaw metody akwizycji spektrometru mas dla każdego z dodatnich i ujemnych trybów ToF-MS w zakresie m/z 50-1 300,
    UWAGA: Przyrząd używany do prezentowanej tutaj pracy wymaga kalibracji metod dodatnich i ujemnych oraz indywidualnego uruchamiania (tj. przełączanie polaryzacji w ramach metody nie jest możliwe).
  4. Jeśli kolumna LC jest nowa, kondycjonuj kolumnę zgodnie z zaleceniami producenta.
    UWAGA: Poniższe kroki należy wykonać bezpośrednio przed pozyskaniem danych.
  5. W profilu sprzętowym "Tylko MS" skalibrować spektrometr mas zgodnie z zaleceniami producenta. Wykonaj ten krok przed każdym trybem akwizycji, upewniając się, że system ustabilizował się w każdej danej modalności przed kalibracją.
  6. Przedmuchnąć i przepłukać układ fluidyki LC za pomocą rozpuszczalników klasy LC-MS, w tym rozpuszczalników do fazy ruchomej i płukania.
  7. Zrównoważyć układ LC przy użyciu warunków początkowych metody LC, upewniając się, że ciśnienie w kolumnie się ustabilizowało.
  8. Wstrzyknąć mrówczan sodu (0,5 mM w 90% IPA) na początku sekwencji próbki (opisanej poniżej), aby sprawdzić kalibrację urządzenia.
  9. Ustawić tabelę sekwencji przyrządów w taki sposób, aby najpierw analizowane były ślepe próby rozpuszczalnikowe i preparatywne (ekstrakcyjne), a następnie zbiorcze próbki kontroli jakości (6-10) do kondycjonowania systemu; następnie losowa lista próbek z próbkami kontroli jakości przeprowadzana w regularnych odstępach czasu (np. co piąte wstrzyknięcie) jako kontrpróby techniczne. Uruchom dwie próbki kontroli jakości na końcu sekwencji.
    UWAGA: Pomocne jest dołączenie daty i kolejności wstrzyknięcia/pozyskania w nazwie przykładowego pliku, a także w identyfikatorze próbki. Na przykład: YYYY MMDD_Injection number_Variety_Biological replikacji. Przed naciśnięciem przycisku start upewnij się, że ciśnienie w kolumnie LC jest stabilne i że LC jest podłączone do MS.

7. Przetwarzanie danych

UWAGA: Ogólny proces przetwarzania danych jest przedstawiony w Rysunek 1.

  1. Sprawdź jakość danych (dokładność masy wzorca wewnętrznego (obliczenia poniżej) i odtwarzalność sygnału) podczas trwania sekwencji. Aby sprawdzić odtwarzalność sygnału, powinna wystarczyć wizualna kontrola nałożonych widm.
    UWAGA: Błąd masy (ppm) = ((Masa teoretyczna – masa zmierzona) / masa teoretyczna) x 106
  2. Wygeneruj wyrównaną matrycę intensywności piku zawierającą próbki x wzorce wewnętrzne (wyrównane przez czas retencji i wartości m/z).
    1. Otwórz oprogramowanie do przetwarzania danych (patrz tabela materiałów). W obszarze Otwieranie > głównych kliknij pozycję Dane. Przejdź do odpowiedniej lokalizacji pliku i otwórz wszystkie pliki danych.
    2. W obszarze Sekwencja > główna > Typ przetwarzania wybierz opcję Quantitation (Kwantyfikacja) z menu rozwijanego.
    3. W obszarze Home > method > Quan (Metoda główna) kliknij opcję Calibration Components (Składniki kalibracji). Wypełnij każde pole, korzystając z danych podanych w tabeli 2. Kliknij przycisk OK.
    4. W lewym panelu w kolumnach obok plików danych wypełnij typ próbki, klikając prawym przyciskiem myszy komórkę i wybierając opcję Nieznany. Wypełnij poziom jako n/d.
    5. W obszarze Home > Processing (Przetwarzanie domowego) wybierz pozycję Sequence (Sekwencja). Wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać sekwencję, a następnie kliknij przycisk Przetwarzaj.
    6. W obszarze Wyniki > głównej wybierz pozycję Quan. W przeglądarce Quan wybierz pozycję Eksportuj przebiegi do analizatora macierzy.
    7. W przeglądarce wyników analizatora macierzy kliknij opcję Eksportuj do pliku csv. Zapisz plik jako plik arkusza kalkulacyjnego.
    8. W arkuszu kalkulacyjnym oblicz średnią, odchylenie standardowe i względne odchylenie standardowe intensywności (powierzchni piku) każdego wzorca wewnętrznego.
  3. Wygeneruj wyrównaną macierz intensywności piku zawierającą próbki x nieukierunkowane cechy (wyrównane przez czas retencji i wartości m/z).
    1. Otwórz oprogramowanie do analizy odkrywania małych cząsteczek (patrz Tabela materiałów) i wybierz Plik > Nowy, aby utworzyć nowy eksperyment. Nazwij eksperyment i wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać i przechowywać pliki eksperymentu. Kliknij Dalej.
    2. Wybierz typ używanego instrumentu (spektrometr masowy o wysokiej rozdzielczości), format danych (profil) i polaryzację (dodatnia lub ujemna). Kliknij Dalej. Wybierz wszystkie przydukty dostępne w bibliotece i edytuj bibliotekę przyduktów zgodnie z wymaganiami. Kliknij Utwórz eksperyment. Załaduje się nowa strona, na której będzie kontynuowane/odbywa się reszta przetwarzania danych.
    3. Importowanie plików danych. Wybierz format pliku, a następnie wybierz pozycję importuj. Przejdź do lokalizacji danych i wybierz pliki danych, które chcesz zaimportować. Postęp będzie wyświetlany dla każdego pliku w lewym panelu strony.
    4. Po zaimportowaniu plików danych wybierz opcję Rozpocznij przetwarzanie automatyczne. Wybierz metodę wyboru odniesienia linii trasowania. Pozwól oprogramowaniu ocenić wszystkie serie pod kątem odpowiedniości, podaj listę odpowiednich próbek (tj. próbek QC) lub wybierz najbardziej odpowiednie odniesienie, tj. próbkę QC w połowie sekwencji. Wybierz pozycję Tak, automatycznie wyrównaj moje przebiegi > Dalej.
    5. Wybierz pozycję Dalej na stronie projektu eksperymentu (można to skonfigurować później).
    6. Wybierz opcję Wykonaj pobranie szczytowe, a następnie Ustaw parametry. Na karcie Peak Picking Limits (Limity pobierania szczytów) wybierz opcję Absolute Ion Intensity (Bezwzględna intensywność jonów) i wprowadź wartość 100. Wybierz opcję Zastosuj minimalną szerokość piku i wprowadź 0,01 min. Wybierz przycisk OK > zakończ. Po zakończeniu przetwarzania wybierz pozycję Close.
      UWAGA: W razie potrzeby limity pobierania szczytowego można zoptymalizować pod kątem innych typów plików danych.
    7. W prawym dolnym rogu ekranu wybierz opcję Sekcja ukończona. Przejrzyj wyrównane przebiegi i upewnij się, że każda próbka jest wyrównana do odwołania. Wyniki dopasowania wynosiły >90% dla prezentowanych tutaj danych. Wybierz opcję Sekcja ukończona.
    8. Na następnej stronie wybierz jeden z projektów tematycznych. Nazwij projekt. Wybierz opcję Grupuj przebiegi ręcznie i Utwórz projekt. Dodaj warunek, kliknij Warunek 1 i odpowiednio nazwij grupę. Kliknij opcję Sekcja zakończona.
      UWAGA: Kontynuuj dodawanie odpowiednich warunków, aby korzystać ze statystyk w oprogramowaniu. Ponieważ używaliśmy oprogramowania tylko do generowania nieukierunkowanej matrycy, użyliśmy pojedynczego warunku oznaczonego jako "wszystkie".
    9. Na następnej stronie wybierz pozycję Sekcja ukończona. Nie wykonuj ponownie zbierania szczytów.
    10. Przejrzyj dekonwolucję, a następnie kliknij przycisk Sekcja zakończona.
    11. Przejdź do Plik > Eksportuj pomiary złożone. Usuń zaznaczenie wszystkich właściwości, które nie są pożądane w danych wyjściowych. Kliknij przycisk OK. Wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać plik .csv. Kliknij Zapisz > Otwórz plik> otworzyć folder lub zamknąć.
  4. Przefiltruj dane przy użyciu pustych miejsc ekstrakcji, aby usunąć artefakty (oprogramowanie do arkuszy kalkulacyjnych).
    1. Dla każdej cechy RT x m/z w nowej kolumnie oblicz średnią odpowiedź w ślepych próbach ekstrakcji.
    2. Dla każdej cechy RT x m/z należy obliczyć średnią odpowiedź we wszystkich pozostałych próbkach (w tym próbkach kontroli jakości).
    3. Obliczyć % intensywności piku ślepej próby w próbkach (średnia odpowiedź w ślepej próbie/średnia odpowiedź w próbach x 100).
    4. Posortuj kolumnę procentowego udziału od najniższej do najwyższej wartości.
    5. Usuń elementy, które mają >5% udziału intensywności z półfabrykatów.
  5. Filtruj brakujące wartości i koryguj sygnały funkcji do sygnałów w zbiorczych próbkach kontroli jakości.
    1. Otwórz oprogramowanie do przetwarzania danych (Spis materiałów). Kliknij przycisk View MatrixAnalyzer. Kliknij przycisk Otwórz plik danych.
    2. Przejdź do .csv lokalizacji pliku zawierającego szczytową intensywność cech RT x m/z dla każdej próbki (macierz nieukierunkowana). Wybierz pozycję Otwórz.
    3. Na karcie Przykłady kontroli jakości wypełnij każdy parametr zgodnie z wymaganiami. Dla opisanego tutaj zestawu danych użyj QC category=QC, zignoruj kategorie=pusty, typ przypisu=brak, próg pokrycia=80, skaluj za pomocą=brak skalowania, odznacz transformację logarytmiczną, popraw za pomocą=wygładzanie splajnu, wygładzanie=0.25.
    4. W prawym górnym rogu panelu macierzy kliknij przycisk odtwarzania Korekcja kontroli jakości.
    5. Po wykonaniu korekty w prawym górnym rogu panelu macierzy kliknij przycisk Zapisz wyniki. Przejdź do odpowiedniej lokalizacji i zapisz plik z wynikami .csv.
  6. Przefiltruj dane, aby usunąć obiekty, które mają >20% RSD w próbkach kontroli jakości.
    1. Rozmieść dane w taki sposób, aby próbki znajdowały się w wierszach, a obiekty w kolumnach.
    2. W nowej kolumnie oblicz średnią intensywność piku dla próbek kontroli jakości.
    3. W nowej kolumnie oblicz odchylenie standardowe intensywności piku dla próbek kontroli jakości.
    4. Obliczyć względne odchylenie standardowe intensywności piku dla próbek QC: (odchylenie standardowe QC/średnia QC) x 100.
    5. Sortuj obiekty od najniższego do najwyższego %RSD i usuń obiekty, które mają RSD kontroli jakości >20%.
  7. Filtruj dane, aby usunąć obiekty o niskich proporcjachpróbki RSD/kontroli jakości RSD (np. <1).
    1. W nowej kolumnie oblicz średnią intensywność piku dla próbek.
    2. W nowej kolumnie oblicz odchylenie standardowe szczytowej intensywności dla próbek.
    3. Obliczyć względne odchylenie standardowe szczytowej intensywności próbek: (odchylenie standardowe próbki/średnia próbki) x 100.
    4. W nowej kolumnie podziel próbki RSD przez RSD kontroli jakości.
    5. Posortuj wartości (współczynnik RSD sample/RSD QC) od najwyższego do najniższego i usuń obiekty o stosunku <1.
  8. Przypisywanie braków danych (kilka metod dostępnych online).
    1. Sformatuj arkusz kalkulacyjny w taki sposób, aby próbki znajdowały się w wierszach, a obiekty w kolumnach. Pierwsza kolumna powinna zawierać nazwę pliku z próbkami. Utwórz dodatkową kolumnę obok nazw plików i wprowadź przykładowe grupowania. W tym przypadku próbki pogrupowano według odmiany.
    2. Zapisz arkusz kalkulacyjny jako plik .csv.
    3. Przejdź do strony głównej, aby zapoznać się z internetowym potokiem analitycznym dla wysokoprzepustowej metabolomiki (patrz Spis materiałów) i kliknij Kliknij tutaj, aby rozpocząć.
    4. Kliknij opcję Analiza statystyczna. W obszarze Przekaż dane wybierz pozycję Typ danych: tabela intensywności szczytu, Format: próbki w wierszach (niesparowane), a następnie wybierz pozycję Plik.
    5. Przejdź do .csv pliku, wybierz pozycję Otwórz, a następnie wybierz pozycję Prześlij.
    6. Na następnej stronie wybierz pozycję Szacowanie brakującej wartości. Odznacz krok 1 (został wykonany w AnalyzerPro XD). W kroku 2 wybierz metodę szacowania brakujących wartości.
      UWAGA: Dla prezentowanych tutaj danych - wybrano opcję 'oszacuj brakujące wartości' z 'KNN'.
    7. Na tym etapie można pobrać matrycę danych (z lewego panelu strony internetowej wybrać opcję Pobierz lub przejść do wykonywania dalszych analiz statystycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Metabolom rośliny jest kształtowany przez kombinację genomu oraz środowiska, a dodatkowo, w warunkach rolniczych, przez system zarządzania uprawami. Wykazaliśmy, że różnice genetyczne między odmianami pszenicy można zaobserwować na poziomie metabolitów; w niniejszej pracy ponad 500 zmierzonych związków wykazało istotnie różne stężenia między odmianami w samych ziarnach. W obu trybach jonizacji, ujemnej i dodatniej, zaobserwowano dobrą dokładność masy (błąd <10 ppm) oraz powtarzalność s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy metodę nieukierunkowanej metabolomiki opartą na LC-MS do analizy ziarna pszenicy. Metoda łączy cztery tryby akwizycji (odwrócona faza i odwrócona faza podatna na lipidy z jonizacją dodatnią i ujemną) w dwa tryby poprzez wprowadzenie trzeciej fazy ruchomej do odwróconego gradientu fazowego. Połączone podejście pozwoliło uzyskać około 500 biologicznie istotnych cech na polarność jonów, z których około połowa znacznie różni się intensywnością między odmianami pszenicy. Znaczące zmiany w stężeniu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować programowi stypendialnemu Premiera Australii Zachodniej (Departament Pracy, Turystyki, Nauki i Innowacji, Rząd Australii Zachodniej) oraz Premier's Fellow, profesorowi Simonowi Cookowi (Centre for Digital Agriculture, Curtin University i Murdoch University). Próby terenowe i pobieranie próbek zboża były wspierane przez rządowy program Royalties for Regions Australii Zachodniej. Wyrażamy uznanie dla Grantleya Stainera i Roberta Frencha za ich wkład w badania terenowe. Finansowana przez NCRIS organizacja Bioplatforms Australia jest uznawana za organizację finansującą sprzęt.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
13C6-sorbitolMerck Sigma-Aldrich605514
2-aminoantracenMerck Sigma-AldrichA38800-1 g
AcetonitrylThermoFisher ScientificFSBA955-4Optima LC-MS
Mrówczan amonuMerck Sigma-Aldrich516961-100 ml>99.995%
Analityk TFSciexwersja 1.7
Oprogramowanie AnalyzerProSpectralWorks Sp. z o.o.Oprogramowanie do przetwarzania danych użyte w kroku 7.2. Wersja 5.7
Sortware AnalyzerPro XDSpectralWorks Ltd.Oprogramowanie do przetwarzania danych użyte w kroku 7.5. Wersja 1.4
BalanceSartorius. Wagi precyzyjne Sp. z o.o.
kwas d6-transcynamonowyIsotec513962-250 mg
Kwas mrówkowyAjax Finechem Pty. Ltd.A2471-500 mL99%
Liofilizator (Freezone 2.5 Plus)Labconco7670031
Szklane butelki Schott (100 mL, 500 mL, 1 L)
Szklane fiolki (2 mL) i zakrętki (wstępnie nacięte)Velocity Scientific SolutionsVSS-913 (fiolki), VSS-SC91191 (pokrywki)
Zestaw montażowy do Sciex TripleToFSciexp/n 4456736
IsopropanolThermoFisher ScientificFSBA464-4Optima LC-MS
klasa Mieszalnik laboratoryjnyWaring Model komercyjnyHGBTWTS3
Leucyna-enkefalinaWodyp/n 700008842Rozwiązanie tuningowe
Metaboanalysthttps://www.metaboanalyst.ca/ MetaboAnalyst/faces/home.xhtmlWebowypotok analityczny do wysokoprzepustowej metabolomiki. Darmowe narzędzie internetowe. Wersja 4.0.
MetanolThermoFisher ScientificFSBA456-4Optima LC-MS klasy
mikonazolMerck Sigma-AldrichM3512-1 g
Mikrowirówka (Eppendorf 5415R)Eppendorf (dystrybuowana przez Crown Scientific Pty. Ltd.)5426 Nr 0021716
Probówki do mikrowirówek (2 ml)SSIbio1310-S0
Microsoft Office ExcelOprogramowanie Microsoft
Peak ViewSciexwersja 1.2 (64-bitowa)
Końcówki do pipet (200 uL, 100 uL)ThermoFisher ScientificMBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL)
Pipety (200 uL, 1000 uL)TermoFisher Scientific
Plastikowe probówki wirówkowe (15 ml)ThermoFisher ScientificNUN339650
Progenesis QINonlinear DynamicsOprogramowanie do analizy odkrywania cząsteczek Samll. Wersja 2.3 (64-bitowa)
Sciex 5600 potrójny spektrometr masowy ToFSciex
Rurki do lizy z nakrętką śrubową (2 ml) z kulkami ceramicznymiBertin Technologies
Mrówczan soduMerck Sigma-Aldrich456020-25 g
Lizer/homogenizator tkankowyBertin TechnologiesSerial 0001620
Kolby miarowe (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L)
Mikser wirowyIKA Works Inc. (dystrybuowany przez Crown Scientific Pty. Ltd.)001722
WodaThermoFisher ScientificFSBW6-4Optima LC-MS
grade Water's Acquity LC system wyposażony w pompy czwartorzędoweWaters
Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 kolumnaWodyp/n 186005614

Bibliografia

  1. Hall, R., et al. Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype. Plant Cell. 14, (2002).
  2. Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain. Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).
  3. Das, A., Kim, D. -W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status. Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).
  4. Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain. Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).
  5. Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS. Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).
  6. Blazenovic, I., et al. Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics. Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).
  7. Castro-Perez, J. M., et al. Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients. Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).
  8. Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis. Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).
  9. Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
  10. Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72(2018).
  11. Chong, J., et al. MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis. Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).
  12. Du Fall, L. A., Solomon, P. S. The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat. New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).
  13. Bowne, J. B., et al. Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level. Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).
  14. Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
  15. Shahaf, N., et al. The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification. Nature Communications. 7 (1), 12423(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Niemierzone metabolomikaanaliza ziaren pszenicyekstrakcja metabolit wanaliza instrumentalnaprzetwarzanie danychpowtarzalno sygna udok adno masycechy biologiczne
Nieukierunkowana chromatografia cieczowa i analiza metabolomiczna ziarna pszenicy oparta na spektrometrii mas
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.